KR920010391B1 - 핵자기 공명 조영제의 제조 방법 - Google Patents

핵자기 공명 조영제의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

핵자기 공명 조영제의 제조 방법
제1도는 첨가된 상자성 이온 농도의 함수로서의 완화율을 종축에 나타낸 도표.
제2도는 첨가된 여러가지 상태의 Gd 이온에 대한 1/T1의 의존도를 나타낸 도표.
제3도는 1/T1및 1/T2에 대한 내부 상자성 이온 착물의 농도효과를 나타낸 도표.
제4도는 마우스의 조직 및 종양의 완화율을 나타낸 도표.
제5도는 Gd-DTPA용액의 완화율에 대한 첨가된 폴리-L-리신의 효과를 나타낸 도표.
제6도는 마우스의 종양에 대한 1/T1의 시간 경과를 나타낸 도표.
본 발명은 상자성 물질을 인지질 소포(小胞)와 같은 미셀 입자와 함께 사용하여 핵자기 공명(NMR)영상에 있어서 영상 대비(contrast)를 증대시키는 조영제에 관한 것이다.
이출원은 “NMR 영상 표시용 조영제”라는 명칭으로 1994년 4월 27일자로 출원된 미합중국 특허 출원 제604,721호의 일부 계속 출원이다.
사람의 NMR 영상 표시는 급속도로 주요한 진단 도구가 되어가고 있다. 현재의 해결 방법은 X선 CT영상표시와 마찬가지이지만, NMR의 주요한 장점은 서로 다른 NMR완화시간인 T1및 T2에 기초하여 조직 형태들을 식별(대비)할 수 있다는 점이다. 핵 완화 시간은 Mn(II) 및 Gd(III)또는 안정한 자유 라디칼과 같은 상자성 이온들에 의하여 크게 영향받을 수 있기 때문에, 이들 물질들이 보다 나은 영상 대비를 제공할 수 있는지를 판별하기 위하여, 특히 이들이 절제(切除)된 동물 기관과 살아 있는 동물 중의 물의 프로톤의 T1및 T2값을 변경할 수 있는지 여부를 시험하기 위하여 이들 물질에 대한 연구가 진행되어 왔었다. [멘돈카 다이아스(Mendonca Dias)등의 “The Use of Paramagnetic Contrast Agents in NMR Imaging,” Absts. Soc. Mag. Res. Med., 1982년, 제103 및 104페이지 ; 브라디(Brady)등의 “Proton Nuclear Magnetic Resonance Imaging of Regionally Ischemic Canine Hearts : Effects of Paramagnetic Proton Signal Enhancement, “Radiology, 1982년, 제144호, 제343-347페이지, 브라쉬(Brasch)등의 “Evaluation of Nitroxide Stable Free Radicals for Contrast Enhancement in NMR Imaging,”Absts. Soc. Mag. Res.Med., 1982년, 제25 및 26페이지 ; 브라쉬의 “Work in Progress. Methods of Contrast Enhancement for NMR Imaging and Potential Applications,” Radiology, 1983년, 제147호, 제781-788페이지, 그로스맨(Grossman)등의 “Gadolinium Enhanced NMR Image of Experimental Brain Abscess,” J.Comput Asst Tomogr., 1984년 제8호, 제204-207페이지 참조]. 상기 문헌들에 보고된 결과들은 영상대비가 각종 상자성 물질에 의하여 증대되는 것으로 기재되어 있다.
그러나, 사용하고자 하는 상자성 물질들의 특성 때문에, 추적의 효과를 요하는 농도에서 유용한 화합물이 독성을 나타낼 수 있으므로, 궁극적으로 의료 진단에 사용할 수 있을 정도로 독성이 충분히 낮은 조영제를 발견해 내는 것이 이 기술 분야에서 가장 중요하고 어려운 문제로 여겨지고 있다[멘돈카 다이아스 등의 “The Use of Paramagnetic Contrast Agents in NMR Imaging,” Absts. Soc. Mag. Res. Med., 1982년, 제105 및 106페이지 참조]. 따라서, 본 발명은 상자성 물질은 NMR영상의 독특한 요구에 알맞는 특성들을 갖는 미셀 입자와 결합시킴으로써 독성이 감소되고, 유용성이 증대된 NMR조영제의 제조 방법에 관한 것이다.
주목해야 할 중요한 다른 문제점은 소포와 같은 미셀이 차지하는 조직 내 최대 용적이 일반적으로 약 0.1%를 초과해서는 안된다는 것인데, 이것은 그 미셀이 매우 작은 용적 백분률로 영상 표시를 할 수 있어야 하는 것을 의미한다. 그러나, 이 점에 관하여, 상자성 NMR조영제는 징후, 또는 감쇠가 단순히 단위 용적당 수효에 비례하는 기타 영상 표시에 있어서 X선 흡수제, 감마선 방출제등으로서 사용되는 조영제와는 근본적으로 다르고, 그 조영제가 어떻게 화학적으로 결합되었는가 또는 NMR 포획되었는가 하는 것은 문제가 아니다. NMR에 있어서, 조영제(이온 또는 안정한 자유 라디칼)는 유리 전자 스핀을 둘러싸고 있는 혼합수(混合水, bulk water)의 프로톤의 완화율을 증가시키도록 작용한다. 이 현상은 물(간혹 이온)의 신속한 교환이나 또는 유기 자유 라디칼을 통한 물의 신속한 확산에 좌우된다. 이와 같은 경우에 있어서, 순수한 완화율은 유리수 및 결합수에 대하여 측정한 평균값이다.
본 발명의 양호한 하나의 실시방법에서와 같이, 인지질 소포내에 상자성 물질을 피포시키면(encapsulation), 상자성 물질은 전체의 물, 그러나, 통상 전체 용적의 0.1%미만의 물에 대해 접근하지 못하는 것으로 보인다. 이와 같은 조건하에서, 소포로 피포시킨 조영제의 존재에 의하여 NMR 영상이 감지할 수 있을 정도로 변화되지는 않는다. 물이 이중층을 통해 충분히 신속하게 교환되는 경우에만, 혼합수의 완화율이 증대된다.[안드라스코(Andrasko)등의 “NMR Study of Rapid Water Diffusion Across Lipid Bylayers in Dipalymitoyl Lecithin Vesicles”, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1974년, 제60호, 제813-819 페이지 참조]. 본 발명은 미셀의 안정성을 극대화하는 동시에 적당한 교환율의 물이 막을 통과하는 미셀과 상자성 물질로 구성된 제형을 제공함으로써 이 문제를 해결한다.
인지질 소포는 일정의 조직 내에 집중되는 것으로 알려져 있으므로 추가의 증대는 조직 특이성에서 유래된다. 예를들어, 인지질 소포는 마우스의 이식된 종양에 축적되는 것으로 관찰되었다. [프로피트(proffitt)등의 “Liposomal Blockade of the Reticuloendothelial System : Improved Tumor Imaging With Small Unilamellar Vesicles”, Science, 1983년, 제220호, 제502-505페이지 ; 프로피트등의 “Tumor-Imaging Potential of Liposomes Loaded With In-111-NTA : Biodistribution in Mice”, Journal of Nuclear Medicine, 1983년, 제24호, 제45-51페이지 참조].
또한, 본 발명은 미셀 입자를 조영제의 담체로 하여 미셀이 항체에 결합되는 용도에 사용하는 것을 포함하며, 절제된 심장의 T1완화 시간의 선택적인 감소는 망간 표지를 붙인 모노클로날 안티미오신 항체를 사용하여 얻을 수 있는 것으로 보고되어 있으나[브래디(Brady)등의 “Selective Decrease in the Relaxation Times of Infrared Myocardium with the Use of a Manganese-Labelled Monoclonal Antibody”, Soc. Magn. Res. Med., Works in Progress, 제2차 연례회의, 1983년, 제10페이지 참조], 지금까지는 전술한 독성 등의 많은 고려 사항들 때문에, 그러한 항체의 실질적 사용에는 크게 제약을 받아왔다. 그러나, 본 발명에 의하면, 미셀 입자의 표면에 항체를 결합시킴으로써 감도가 증가되고 특이성이 유지되었다. 이들 항체는 세포형 또는 조직형에 대하여 높은 특이성을 제공하는 한편, 결합된 소포제담체는 항체 단독에 결합된 이온에 의하여 성취할 수 있는 것 보다 더 NMR영상대비의 증대를 확대시킨다.
본 발명은 작은 단층의 소포와 같은 미셀 입자에 상자성 물질을 결합시킨 미셀 입자, 통상 그 소포 내에 상자성 화합물을 피포시킨 미셀 입자의 제조 방법에 관한 것이다. 이들 소포는 그 표면에는 안티미오신 또는 안티피브린과 같은 항체를 결합시키거나, 또는 일정의 조직 내에 특이한 세포 수용체가 있는 기타 표면 변형을 포함하여도 좋다.
소포 성분들의 예로서는, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 및 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC)과 같은 인지질이 있다. 상자성 물질의 예로서는, 천이 금속염 및 Gd(III), Mn(II), Cu(II), Cr(III), Fe(II), Fe(III), CO(II), Er(III), Ni(II)등의 주기율표 상의 란타니드족 및 악티니드족의 이온과, 이들 이온과 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 기타 리간드들(ligands)과의 착물(錯物)들이 있다. 기타 상자성 화합물로서는 유기 질소 산화물과 같은 안정한 자유 라디칼이 있다.
소포로 피포시킨 조영제는 초음파 처리, 균질화, 킬레이트 투석등의 적당한 방법에 의하여 상자성 물질을 함유하는 수성 매질 중에서 지질 소포를 형성시킨 다음, 한외 여과, 겔 여과 또는 이와 유사한 방법으로 외부 물질의 소포를 제거함으로써 제조할 수 있다. 더우기, 상자성 물질의 내부 용액은 용이하게 변경되어, 예를들면 폴리-L-리신등의 하전된 중합체 물질들을 사용하여 제제화함으로써, 조영제 단위당 완화율이 극대화되도록 할 수 있다.
본 명세서에 사용된 “미셀 입자” 및 “미셀”은 양친매성(兩親媒性)분자의 응집으로부터 생긴 입자를 기르키는 것이다. 본 발명에 있어서, 바람직한 양친매성 물질은 생물학적 지질이다.
“소포”라 함은 이중막을 형성하는 지질로부터 흔히 얻을 수 있고 “리포좀(liposome)”이라 부르는 통상 구형(求刑)의 미셀을 가르키는 것이다. 이제까지 이 분야에서는 이들 소포의 형성 방법이 극히 잘 알려져 있다. 일반적으로, 이들 소포는 인지질, 예를들면 디스테아로일 포스파티딜콜린이나 레시틴으로부터 제조될 수 있으며, 중성 지질과 같은 다른 물질 뿐만아니라, 양하전 또는 음하전된 화합물과 같은 표면 개질제를 포함할 수도 있다. 이들의 제조 기법에 따라, 그 외피는 단순히 이중으로 된 구형 외피(단층 소포)로 되거나, 또는 그 외피 내에 복수층(다층 소포)이 있을 수도 있다. 아래에 약자들의 정의를 기재한다.
DSPC=디스테아로일포스파티딜콜린, Ch=콜레스테롤, DPPC=디팔미 토일포스파티딜콜린, DMPC=디미리스토일포스파티딜콜린, DTPA =디에틸렌트리아민펜타아세트산, EDTA=에틸렌디아민테트라아세트산, SUV=소형 단층 소포
[미셀의 저장 용액 및 그의 제조 방법]
상자성 화합물의 착물을 탈이온수 중에서 제조하거나 또는 4.0mM N2HPO4, NaCl 0.9 중량%, pH 7.4의 완충액(PBS)중에서 조제하였다.
Gd(III)-시트르산염 : 탈이온수 9ml에 GdCl3·6H2O[99.999%, 알드리치(Aldrich)제품]10.0μ몰을 용해시키고, 여기에 시트르산 나트륨[분석품, 몰린크로트(Mallinckrodt)제품]100μ몰을 첨가하여 1.0mM Gd(III)-10.0mM시트르산염의 저장 용액을 조제하였다. 이 용액의 pH를 중성으로 조정하고, 용적은 용적 측정용 플라스크로 10.0ml가 되도록 하였다.
Mn(II)-시트르산염 : 물 9ml에 MnCl2·4H2O[베이커(Baker)제품, 분석품]10.0μ몰과 시트르산나트륨 100μ몰을 첨가해서 1.0mM Mn(II)-10.0mM시트르산염의 저장 용액을 조제했다. 이 용액을 중화시키고, 용적 측정용 플라스크로 용적이 10.0ml가 되도록 하였다.
Gd(III)-DTPA : 10ml의 용적 측정용 플라스크중에서 최소량의 6N NaOH에 DTPA 2.10밀리몰을 용해시켜서 200mM Gd(III)-210mM DTPA의 저장 용액을 조제하였다. 여기에, GdCl3·6H2O 2.0밀리몰을 첨가하고, 6N NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정한 다음, 샘플을 상기 플라스크 내에서 용적이 10.0ml로 되도록 만들었다.
La(III)-DTPA : LaCl3·7H2O[99.999%, 알드리치(Aldrich)제품]을 사용하여, Gd(III)-DTPA저장용액의 조제방법과 유사한 방법으로 200mM La(III)-210mM DTPA의 저장 용액을 조제하였다.
Er(III)-EDTA : 저장 용액을 Gd(III)-DTPA보존 용액의 조제방법과 유사한 방법으로 조제하였다.
평균 분자량이 약 25,000 및 4,000인 폴리-L-리신 브롬화 수소산염은 시그마 케미컬 캄파니(Sigma Chemical Co.)의 제품을 사용하였다.
콜레스테롤(98%)은 몰린크로트(Mallinckrodt)제품을 사용하였다. DSPC는 칼-바이오켐(Cal-Biochem)의 합성품을 사용하였다.
DSPC/콜레스테롤 소포-피포 NMR 조영제 : DSPC 16mg 및 콜레스테롤 4mg을 CHCl32ml중에 용해시켰다. 최종 제제중의 지질 농도를 정량하기 위하여, CHCl3중의 0.16mM 콜레스테롤[u-l4C](56.5mCi/밀리몰)의 용액 10μl를 첨가하였다. 이 지질 용액을 진공 데시케이터 중에서 증발 건조시키고, 즉시 사용하지 않는 경우에는 데시케이터에 보관하였다.
작은 단층 소포(SUV)는 건조시킨 지질 튜브에 이온 착물 저장용액 2.0ml를 첨가하여 200mM Gd(III)-DTPA의 용액 중에서 형성했다. 이 혼합물을 마이크로팁이 구비된 울트라소닉스, 인크(Ultrasonic, Inc.)제품의 탐침을 사용하여 56W의 전력으로 초음파 처리하였다. 이 튜브를 수조에 부분적으로 침지시켜 냉각시키고, 초음파 처리 중에 시료에 Na가스를 유입시켰다. 초음파 처리 시간은 용액이 다소 유백색으로 될때까지 총 15분 이상 소요되었다.
소포 외부의 상자성 물질을 PBS중에서 팽윤시킨 세파덱스 G-50의 컬럼에 통과시켜 SUV들로부터 분리시키고, 이것을 3ml의 플라스틱 제주사기에 넣어서 미리 원심 분리시켰다. 이 소포 용액을 주사기 최상부에 넣고, 용출액을 모으기 위하여 배치시킨 유리관으로 원심 분리시켰다. PBS 300ml를 하여 컬럼으로부터 소포를 용출시켰다. 이 공정을 총 3회 반복 실시하여 유리 물질(free agent)의 외부 농도를 감소시키고, 이것을 PBS로 교환하였다.
최종 제제중의 소포의 농도는 표준 칵테일을 사용하여 신틸레이션 계수기(scintillation counter)에서 용액의 분취량을 산출함으로써 측정하였다. 소포의 평균 입도는 레이저 입도기 모델 200(Nicomp Instruments제품)으로 측정하였다. 소포의 입도는 모든 실험에서 600±100Å인 것으로 측정되었다.
[NMR완화시간측정]
달리 기재가 없는 한, T1및 T2의 측정은 마이크로컴퓨터(IBM PC)에 접속된 펄스 NMR 스펙트로미터(IBM PC/20)를 사용하여 20MHz에서 측정하였다. T1은 역전 회수법[파라, 티.씨.(Farrar, T.C.), 벡커, 이. 디(Becker, E.D)의 “Pulse and Fourier Transform NMR”, 1971년, Academic Press. 뉴욕]으로 측정하고, T2는 카르-퍼셀 서열법[카르 에이취. 와이.(Carr, H.Y)와 퍼셀 이.에이취.(Purcell, E. H.)의 “Effects of Diffusion on Free Precession in NMR Experiments”, Phys. Rev., 1954년 제94호, 제630-633페이지에 기재되었으며, 이것은 메이붐 에스(Meiboom, S.)와 질 디.(Gill, D.)의 “Modified Spin-Echo Method for Measuring Nuclear Relaxation Times”, Rev. Sci. Instrum., 1958년, 제29호, 제688-691페이지에 기재된 것의 변형임]으로 측정하였다. 단일 지수 회수에 대한 데이타의 최소 제곱 최상 적합도를 컴퓨터에 의해서 자동으로 측정하였다. 얻은 T1및 T2값은 38℃의 탐침 온도에 대한 것이다. T1값들은 ±10%의 실험상의 부정확도 및 ±5%의 재생도를 갖는 것으로 평가되었다. T2값들은 일반적으로 ±20% 내의 부정확도 및 ±5%의 재생도를 갖는다. 이 정밀도는 주장된 효과를 증명하기에 충분한 것이다. T1의 어떤 값들은 10MHz에서 작동하는 프락시스(Praxis) IINMR스펙트로미터와 25℃의 탐침온도를 사용하여 측정하였다.
[동물시험]
EMT6종양 조직을 숫컷 Balb/c마우스의 옆구리살에 피하이식시키고, 10일동안 생장시켰다. 제10일 째에, 마우스에 소포용액 또는 대조 완충액 20μl를 정맥내로 주사하였다. 마우스들을 시간 간격을 두고 치사시키고, 종양들을 절제하였다. 어떤 실험에서는, 간장과 비장도 역시 절제하였다. 조직을 PBS중에서 세정하여, 가볍게 블로팅(blotting)시키고, 칭량한 다음, 기밀 플라스틱제 포대 중에 포장하였다. 수분 손실과 그에 따른 T1및 T2의 변동을 제한하기 위하여, 절개한 후 1/2시간 이내에 NMR완화 측정을 행하였다.
이하 본 발명을 첨부 도면에 의하여 상세히 설명한다.
제1도는 첨가된 상자성 이온 농도의 함수로서의 완화율을 종축에 나타낸 도표이다. 저장 용액의 분취량을 PBS 완충액에 첨가하였다. T1측정은 90°- -90°법을 사용하여 10MHz에서 행하였다. 탐침온도는 25℃이었다. Er-EDTA에 대한 농도의 단위는 mM이고, Mn-시트르산염에 대한 농도의 단위는 μM이다.
제2도는 첨가된 여러가지 상태의 Gd이온에 대한 1/T1의 의존도를 나타낸 것이다. 저장 용액의 분취량을 물(Gd/시트르산염) 또는 PBS(Gd/DTPA와 소포 내의 Gd/DTPA)이 첨가하여 소정의 총이온 농도를 얻었다.
제3도는 1/T1및 1/T2에 대한 내부 상자성 이온 착물 농도의 효과를 나타낸 것이다. 내부에 피포된 PBS중의 Gd/DTPA의 농도를 증대시켜서 DSPC/콜레스테롤 소포를 제조하였다. 지질(소포)농도는 /PBS를 사용하여 전체 지질의 최종 농도가 8.3mg/ml와 같아지도록 조정하였다.
제4도는 마우스의 조직 및 종양의 완화율을 나타낸 것이다.
Balb/c마우스에 DSPC/콜레스테를 소포(10mg/ml지질)중의 200mM Gd-DTPA(Gd 소포)200μl, DSPC/콜레스테롤 소포 중의 200mM La-DTPA(La 소포), PBS(Gd완충액) 또는 PBS(완충액)중의 2.0mM Gd-DTPA를 주사하였다. 16시간 후에, 이들 마우스를 죽여서 조직을 절제하였다. 완화 시간은 적어도 3마리 이상의 동물에 대한 평균 값이다.
제5도는 Gd-DTPA용액의 완화율에 대한 첨가된 폴리--L-리신의 효과를 나타낸 것이다. 칭량된 건조폴리-L-리신의 분취량을 2.0mM Gd-DTPA수용액 2.0ml중에 용해시켰다. T1및 T2는 명세서에 기재된 바와 같이 측정하였다.
제6도는 마우스의 종양에 대한1/T1의 시간 경과를 나타낸 것이다. EMT6종양을 미리 이식시킨지 10일이 된 Balb/c마우스의 꼬리 정맥에, 내부에 200mM Gd-DTPA가 함유된 지질 소포의 제제 10mg/ml를 주사하였다(200μl) 마우스를 시간 간격을 두고 죽여서, 절제 직후에 종양의 T1을 측정하였다. 대조물은 주사하지 않거나(○), 또는 PBS중의 0.2mM Gd-DTPA 200μl로 주사했다(□). 이 그래프에는 3회의 별개 실험 결과를 나타내었다. 데이타“○” 및 “□”에 대하여 각 점들은 단일 종양에 대한 T1을 나타낸 것이다. 데이타“△”에 대해서, 단일 종양에 대한 2 또는 3개의 T1값들이 측정된 경우도 있었다.
상기 도면들을 더욱 구체적으로 참조하면서, 본 발명의 개선된 결과를 설명한다. 제1도에 Er-EDTA와 Mn-시트르산염 용액의 완화율을 나타냈다. 1/T1값들은 10MHz 및 25℃에서의 이온 농도의 함수로 작도하였다. 마우스의 연조직에 대한 1/T1의 평균 값을 도면에 나타냈다. Er-EDTA에 대한 농도 단위는 mM이지만, Mn-시트르산염에 대한 것은 μM이다. PBS용액에 18mM Er-EDTA착물을 첨가하면 마우스 조직에 대한 1/T1값은 2.4S-1로 증가한다. 동일한 완화율을 0.17mM Mn-시트르산염 착물만을 첨가하여 얻었다. 약하게 착화된 Mn착물은 강하게 착화된 착물 ER-EDTA보다 완화율이 100배 이상 효율적이며, 이는 Mn(II)이온이 고유하게 갖는 보다 강력한 완화력은 물론, 물에 대한 Mn의 접근성이 보다 큼을 반영하는 것이다.
제2도는 Gd(III)의 완화 효과를 나타내었다. 20MHz에서, H2O에 Gd-시트르산염을 첨가하면 1.0mM에서 1/T1값이 8.1 S-1로 증가한다. 이를 DTPA에 착화시키면, 이온의 완화 효과는 반감된다. 이러한 감소 현상은 착물의 회전상관 시간이 증가되어 물의 결합 부위가 부분적으로 균형을 이루는 DTPA기능기로 대체되기 때문이다. DSPC-콜레스테롤 소포 중에 피포시킨 Gd-DTPA착물을 사용하면 1.0mM의 전체 Gd-DTPA에 대한 용액의 1/T1값은 여전히 2.5 S-1로 증가된다. 소포는 단위 이온당 유리 Gd-DTPA보다는 효율이 낮지만, 여전히 물 완화에 대하여 실질적인 효과를 가는다.
소포로 피포시킨 Gd-DTPA에 대한 완화율에 관한 내부 상자성 이온 착물의 효과를 제3도에 나타내었다. 소포 용액에 대한 1/T1및 1/T2값은 최대 150mM의 내부 Gd-DTPA농도까지 선형으로 증가하였다.
다음의 방정식을 사용하면 T1b값이 τb 또는 그 미만으로 될 때까지 상자성 이온 농도에 관한 1/T1의 선형 의존도를 예측할 수 있다.
Figure kpo00001
여기서, b = 소포 내부, a = 소포 외부, τb = 내부의 물 프로톤의 수명시간, T1b = 내부의 물(상자성 물질에 의하여 소량 생김)의 순완화 사간, Pb=소포 중의 물의 분치분.
제3도에 나타낸 결과들은, 150mM이하의 Gd-DTPA농도에서, 소포 내의 T1이 교환 수명시간 τb보다 크다는 것을 암시하고 있다.
마우스의 조직 및 종양에 대한 완화 효과는 제4도에 나타내었다. Balb/c마우스의 간장, 비장, 신장 및 EMT6종양 조직의 T1값들은 상자성 물질 또는 대조물의 주사 투여 16시간 후에 비교하였다. 소포로 피포시킨 Gd-DTPA는 소포(비장) 또는 PBS 완충액 및 PBS 완충액과 2.0mM Gd-DTPA중에서의 La-DTPA의 반상자성 란타니드 이온 착물의 대조물에 비하여 비장 및 EMT6 종양에 대한 T1값에 있어서 현저한 감소를 유도한다. Gd/DTPA소포로 처리한 마우스의 경우에 있어서, T1값들은 약제를 주사하지 않은 대조물보다 평균 17%가 낮았다.
상기 데이타들에 의하여 영상 대비를 증대시키는 소포 내부의 Gd/DTPA 또는 다른 상자성 물질의 최소 농도를 평가할 수 있다. 종양 세포의 막을 통과하는 프로들 교환율, 지질 소포로부터 유리된 Gd/DTPA의 세척 손실율 및 거대 분자 주위에서의 착물의 변화된 회전상관 시간(T1프로톤 완화율과 이어서 조영 증대에 기여함)과 같은 복잡한 일련의 상관 인자들이 있다. 영상으로 표시될 특정의 조직중에 축적된 소포의 양은 피포시킨 상자성 물질의 최소 농도를 나타낸다. 이 쥐의 종양 모델에 대하여 손상되지 않은 소포는 종양 용적의 거의 0.1%를 차지한다는 결론을 얻었다.
한편, 피포시킬 상자성 물질의 양은 사용한 특이 물질과 상기 인자들에 따라 변하게 되지만, 일반적으로 상자성 물질은 소포 중에 적어도 약 50mM이 존재하게 될 것이다. 최대량은 가격, 독성 및 소포 제형을 고려하여 정하는 것이지만, 일반적으로 약 1M피포 농도 이상으로는 되지 않는다.
제5도는 중합체의 첨가로 증대된 완화율을 설명하는 것이다. Gd-DTPA의 완화 효과는 양하전된 중합체인 폴리-L-리신을 첨가하여 증대시킬 수 있다. 제5도는 평균 분자량(MW)이 25,000인 폴리-L-리신을 2.0mM Gd-DTPA의 수용액에 첨가한 결과를 나타낸 것이다. 1/T1에서 완화율 40%증가와 1/T2에서 30%증가를 얻었다. 폴리-L-리신의 첨가 효과는 “약한 결합”상태를 나타내는 3mg/ml이상에서 고평부(高平部)를 이룬다. 이러한 평준화는 또한 폴리-L-리신의 첨가 효과가 전체 농도 범위에 걸쳐 일정하기 때문에, 증대된 완화율이 점도 증가에 기인한 것이 아니라는 것을 나타내는 것이다. 분자량이 적은 폴리-L-리신일수록 중량 기준에 대해 덜 효과적이다. Gd-DTPA는 음하전된 착물이며, 이것은 폴리-L-리신의 양하전에 그 반대로 결합한다. 거대 분자의 대형의 크기 및 그에 따른 거대 분자의 관속한 텀블링은 상자성 이온의 완화를 더욱 효율적으로 만들어 주었다. 이 효과는 Gd-DTPA와 폴리-L-리신 또는 이와 유사한 양하전된 거대 분자를 동시에 피포시킴으로써 Gd의 단위 이온당 효과를 증대시키고, 따라서 제제의 총독성을 감소시키는 데 이용될 수 있다.
EMT6 종양에 대한 시간 경과에 따른 완화 효과를 제6도에 나타내었다. 소포로 피포시킨 Gd-DTPA의 최대 효과는 약제주사후 3-4시간 만에 얻어졌다. 4시간 만에 얻은 평균 효과는 주사후 16시간 만에 얻은 효과와 거의 동등하며, 이것은 종양에 의한 흡수율과 순환에 의한 약제의 손실이 일치하는 경우에 정상 상태의 조건이 얻어진다는 것을 의미하는 것이다.
세가지의 상이한 리포좀 제형은 Balb/c마우스에 피하 이식시킨 EMT6 종양에 대한 완화 효과에 관한 것인 제6도의 데이타에서 사용한 것보다 많은 투여량으로 시험하였다. 마우스에 약제를 정맥내 주사한 다음, 그 마우스를 시간 간격을 두고 치사시켰다. 종양 및 간장 T1값은 동물을 치사시킨 후 1/2시간 내에 측정하였다. 종양에 대한 결과는 다음의 표 1에 기재하고, 간장에 대한 결과는 다음의 표2에 기재하였다. 완충액 만으로 처리한 동물의 종양 T1값은 960±41ms(n=25)이고, 평균 간장 T1값은 392±31ms(n=24)이었다. 종양완화 시간은 DSPS/CHOL(1 : 1)제형의 주사 후 24시간 만에 665±28ms(n=4)로 감소하였으나, 이들 동물들의 간장의 평균 T1값은 370±13ms(n=4)이었다. 종양의 T1변화율 44%는 실질적으로 간장의 (6%)보다 큰 것이다.
통상 사용중인 다수의 리포좀 제형들을 사용하면, 간장(및 비장)은 소포 투여량의 최대 분취분을 축적시킨다. 따라서, 본발명의 특별한 제형은 적어도 NMR영상 완화시간에 대한 효과에 있어서 종양에 대하여 훨씬 더 특이적이다. 그러므로, 본 발명에 의한 소포로 피포시킨 상자성 착물은 NMR영상 조영제의 요건을 충족시킨다. 즉, 이것은 선택된 조직의 T1값들을 감소시켜 준다. 이 경우에 있어서, 조영제(평균 960ms)의 투입 전 종양 원래의 긴T1은 NMR영상 내의 종양을 어둡게 만들지만, 조영제의 투입 후에는 종양이 스캔에서 더욱 밝게 나타나게 된다.
[표 1]
Figure kpo00002
[표 2]
Figure kpo00003
NMR영상표시 조영제를 가장 유용하게 하려면, 조영제는 독성이 최소이면서, 1/T1증대량은 최대이어야 하며, 또한 조직 형태에 대한 특이성이 있어야 한다. 본 발명은 이러한 특징들을 제공한다. Gd-DTPA용액의 1/T1및 1/T2에 대한 폴리-리신의 첨가 효과로 중명된 바와 같이(제5도), 거대분자의 집합체는 단위 이온당 완화 효과를 증대시킬 수 있다. 거대 분자 집합체 중에서 독성이 있는 상자성 이온을 강화 킬레이트와 혼합(예컨데, 소포중에 피포)시켜 이온이 순환되지 못하도록 함으로써 독성을 낮출수 있다. NMR완화는 이온에 대한 H2O프로톤의 접근이 최대가 되도록 소포를 제제화함으로써 증대된다. 이것은 피포된 Gd-DTPA의 강화 완화 효과에 의하여 나타나는 바와 같이 달성된다.(제2도). 조직 특이성은 미세 집합체의 착물 특성에 의하여 제공되는데, 이에 대한 생물학적 인식 과정은 거대 분자가 특정 부위로 분포되도록 한다. 이것은 조직 완화율에 대한 인지질 소포의 상이한 영향(제4도, 표1 및 표2) 및 용액 중 거의 동일한 유리 Gd-DTPA의 총농도에 대한 소포 중 피포된 Gd-DTPA의 종양 완화에 대한 인지질 소포의 특이 효과에 의해서 증명되었다.(제4도 및 제6도)
본 발명의 명세서에서 조직 특이성을 얻기 위하여 소포에 항체를 결합시킬 수 있다는 것을 기재하였다. [마틴(Martin)등의 논문, “Immunospecific Targeting of Liposomes to Cells”, Biochemistry, 1981년, 제20호 제4229-4238페이지 참조]. 안티미오신은 경색된 심근의 NMR 영상표시에 유용하다. 또한, 안티피브린의 제조법이 최근에 보고되었다[휘(Hui)등의 논문, “Monoclonal Antibodies to a Synthetic Fibrin-Like Peptide Bind to Human Fibrin but not Fibrinogen”, Science, 1983년, 제222호, 제1129-1131페이지 참조]. 이 항체는 피브린이 형성되는 혈병(血餠)부위에 집중되는 것으로 예상된다. 안티피브린에 부착된 소포제 운반체는 헐관내의 혈병 및 트롬빈의 영상을 표시하기 위한 NMR 조영제를 제공할 수 있다. 그러나, 소포의 생체내 분포를 변경시키는 것으로 알려져 있는 세포 인식을 제공하는 기타 표면 변화들이 있다.
예를들면, 소포 표면에 결합된 탄수화물 수용체의 유사체들은 소포들을 표적화하는 것으로 나타났다. [마우크(Mauk)등의 논문“Targeting of Lipid Vesicles : Specificity of Carbohydrate Receptor Analogues for Leukocytes in Mice, Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA, 제77호, 제4430-4434페이지(1980년) ; 마우크 등의 논문, “Vesicle Targeting : Timed Release for Leukocytes in Mice by Subcutaneous Injection”, Science, 제207호, 제309-311페이지(1980년) 참조] 표면 변형에 의한 이와 같은 표적화는 상자성 이온의 생체 내 분포를 변경시키는 데 직접 응용할 수 있다.

Claims (11)

  1. 소포(小胞)가 생체 내에 분포되기에 충분한 시간 동안 소포 안정성을 촉진시키고 물이 소포 이중층을 통과하여 교환될 수 있는 물질로 제제화된 소포 내에 상자성 물질을 피포시키는 것이 특징인 핵자기 공명 조영제의 제조 방법.
  2. 제1항에서, 소포가 콜레스테롤로 제제화된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 소포에 항체, 탄수화물 또는 기타 세포인식 표적제를 부착시켜 특이적인 표적을 제공하는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상자성 물질이 천이 금속의 염 또는 주기율표의 란타니드족이나 또는 악티니드족의 염인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상자성 물질이 망간, 구리, 가돌리늄, 에르븀, 크롬, 철, 코발트 및 니켈로부터 선택된 상자성 이온의 염인 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상자성 물질이 안정한 자유라디칼을 포함한 상자성 화합물인 것인 방법.
  7. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상자성 물질이 상자성 이온 및 킬레이트의 상자성 화합물인 것인 방법.
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상자성 물질이 약 50mM이상의 농도로 존재하는 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상자성 물질이 약 50mM 내지 1M의 농도로 존재하는 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상자성 물질에 하전된 중합체를 첨가하여 상자성 물질의 효능을 증대시키는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 하전된 중합체가 폴리-L-리신인 것인 방법.
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