-
Die
Erfindung betrifft Bläschen, insbesondere Vesikel oder
Flüssigkeitszellen, Verfahren zur Herstellung und Manipulation
der Bläschen und eine Anordnung zur Manipulation der Bläschen.
-
Durch
die rasante Entwicklung in der Biotechnologie werden Techniken nachgefragt,
mit denen kleinste Flüssigkeitsmengen manipulierbar werden
können. Die Tendenz zur Miniaturisierung wird dabei vor
allem durch folgende Vorteile getrieben: Kleine Stoffmengen sind
billiger und weniger giftig, oft sind biologische Substanzen auch
nur in kleinsten Mengen verfügbar. Darüber hinaus
sind hierbei die Reaktions- und Analysezeiten um Größenordnungen kleiner
und die Spezifität und Effizienz ist deutlich höher.
Daher werden mikrofluidische Systeme heute schon verwendet in so
genannten Lab-on-a-Chip Systemen, μ-TAS (Total Analysis
System) und MEMS (Micro-Electro-Mechanical-System). Wichtige Bestandteile
auf derartigen Plattformen sind Pumpen, Ventile und integrierte
Mischer. Bei solchen mikrofluidischen Systemen handelt man sich
auch Nachteile ein: das Durchmischen ist aufgrund der laminaren Strömung
nur noch diffusiv möglich. Der Übergang von dem
laminaren, schwer zu mischenden System zum turbulenten System wird
durch die sogenante Reynoldszahl charakterisiert, die Trägheitskräfte
und viskose Kräfte ins Verhältnis setzt. Ist die
Reynoldszahl kleiner als etwa 1000 so spricht man vom laminaren
Regime, in dem benachbarte Flüssigkeitsschichten „nebeneinander"
fließen und sich nur diffusiv durchmischen können.
Ist die Reynoldszahl hingegen groß, so treten Turbulenzen
auf, die Durchmischungen dramatisch beschleunigen. Zur Mischung solcher
kleinster Flüssigkeitsmengen wird z. B. das Mischen mit
Oberflächenwellen (SAW) verwendet (Wixforth A.,
Acoustically driven planar microfluidics, Superlattices Microstruct
2003; 33: 389–396). Prinzip dabei ist gezielt
Wirbel in der Flüssigkeit zu erzeugen, die bei makroskopischen
Flüssigkeiten viel leichter, quasi automatisch entstehen,
mit dem Ziel eine möglichst große Grenzfläche
zwischen den zu mischenden Flüssigkeiten zu erzeugen. Weiterhin
ist das unabhängige Positionieren einzelner Reagenzien äußerst
schwierig. Die kontrollierte Manipulation ist aber insbesondere
für Anwendungen von immenser Bedeutung. Beispielsweise
werden bei so genannten "drug delivery"-Systemen verschiedene Substanzen
in Vesikel eingeschlossen (Szostak J. W., Bartel D. P.,
Luisi P. L., Synthesizing life, Nature 2001; 409: 387–390).
Diese werden dann beispielsweise mit Hilfe von Spritzen an der gewünschten Stelle
im Körper injiziert.
-
Es
ist Aufgabe der Erfindung, Bläschen, Bläschen
in Trägerflüssigkeit und ein Verfahren zur Herstellung
und Manipulation von Bläschen bereitzustellen, mit dem
kleinsten Flüssigkeitsmengen möglichst kontrollierbar
manipuliert werden können.
-
Diese
Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale des Anspruchs 1,
17, 21, 29 bzw. 43.
-
Bevorzugte
Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
-
Gemäß Anspruch
1 wird ein Bläschen, insbesondere ein Vesikel oder eine
Flüssigkeitszelle, bereitgestellt mit einer Hülle
und zumindest einer in der Hülle eingeschlossenen Flüssigkeit,
wobei die Hülle zumindest ein magnetisches Partikel einschließt. Vorzugsweise
sind eine Vielzahl von magnetischen Partikeln in der Hülle
eingeschlossen. Die zumindest eine Flüssigkeit kann eine
reine Flüssigkeit oder ein Flüssigkeitsgemisch
sein. Beispielsweise eine Suspension, eine Emulsion oder eine Lösung.
Durch die Hülle wird die eingeschlossene Flüssigkeit
abgeschirmt bzw. separiert, z. B. von einer die Hülle umgebende
Flüssigkeit, um eine unerwünschte Durchmischung
mit der Umgebung zu verhindern.
-
Ein
magnetisches Partikel kann ein einzelnes magnetisches sein oder
aus mehreren Komponenten bestehen, die insgesamt ein magnetisches Teilchen
ergeben.
-
Bevorzugt
ist die Hülle des Bläschens aus Polymeren ausgebildet
oder weist Polymere auf. Dabei müssen Polymermoleküle
nicht oder nicht vollständig polymerisiert vorliegen.
-
Alternativ
oder in Ausgestaltung ist die Hülle aus oder im Wesentlichen
aus amphiphilen Molekülen aufgebaut. Insbesondere aus Lipiden
oder amphiphilen Polymeren. Das heißt, das Ausgangsmaterial
bzw. die "Bausteine" der Hülle weisen zumindest einen polaren
und einen unpolaren Teilbereich bzw. einen hydrophilen und eine
hydrophoben Teilbereich auf. Aufgrund der anziehenden und abstoßenden Kräfte
dieser Bausteine, ordnen sich diese zu selbstorganisierten Strukturen
wie Bläschen, (z. B. Vesikel, Zellen) oder Membranen an.
Beispielsweise kann eine Hülle aus den Lipiden Sphingomyelin,
Phosphatidylcholin und Cholesterol aufgebaut sein, welche auch Hauptbestandteile
von roten Blutkörperchen sind. Ein weiteres Ausgangsmaterial
für eine Hülle können Block-Polymere
sein, d. h. Polymere, die im Unterschied zu Homopolymeren aus mindestens zwei
verschiedenen Monomerbausteinen A und B aufgebaut sind. Je nach
Verteilung der Monomere A und B in der Polymerkette unterscheidet
man zwischen statistischen (AABABBBAABB), alternierenden (ABABABAB)
oder Block-(AAAABBBB)Copolymeren, wobei mindestens eines der Monomere
unpolar und mindestens ein anderes polar ist, um die oben beschriebene
Strukturen auszubilden.
-
Bevorzugt
weist die Hülle eine oder mehrere Schichten auf. Insbesondere
bei Vesikeln sind eine Vielzahl verschiedener Anzahlen von Schichten
möglich. Bevorzugt sind Vesikel mit mehreren konzentrisch
angeordneten Schichten. Weiter bevorzugt weisen die Vesikel eine
Doppelschicht auf, d. h. sie sind unilamellar. Insbesondere bei
kleinsten eingeschlossenen Flüssigkeitsmengen liegt eine
einzelne Schicht vor, d. h. eine Mizelle.
-
Bevorzugt
schließt die Hülle ein Volumen in der Größenordnung
von bis zu 10 Mikroliter ein, vorzugsweise bis zu 1 Mikroliter,
weiter bevorzugt bis zu 100 Femtoliter. Damit können durch
ein Bläschen kleinste Flüssigkeitsmengen von einem
umgebenden Medium separiert werden.
-
Bevorzugt
weist die Hülle zumindest einen funktionalisierten Baustein
auf, z. B. um einen Kanal in der Hülle zu bilden. Vorzugsweise
ist die Hülle eine Membran, insbesondere eine flüssigkeitsdurchlässige
Membran wie z. B. eine Zellwand. Beispielsweise weist die Hülle
spezielle, in die Hülle eingebettete Proteine auf, um membranartig
nur spezifische Stoffe durch die Hülle durchtreten zu lassen.
Das Bläschen stellt ein Depot für den spezifische
Stoff, z. B. Arzneimittel, bereit, der eine bestimmte Dosis dieses
Stoffes durch die permeable Hülle abgeben kann. Beispielsweise
kann eine Dosis erhöht werden durch Erhöhung der
Anzahl der Kanäle, so dass mehr Arzneimittel von innerhalb
eines Bläschens durch die Hülle an eine Umgebung
freigegeben wird.
-
Besonders
bevorzugt können in der Hülle eingebaute funktionalisierte
Bausteine zur Markierung der Bläschen verwendet werden.
Beispielsweise können durch Einbau von Antikörpern
oder von adhäsiven Molekülen Bläschen
an spezifische Zellen gebunden werden. Beim Transport der Bläschen
in einer Trägerflüssigkeit binden diese funktionalisierten Bausteine
an die spezifische Zellen (mit Rezeptoren für die funktionalisierten
Bausteine) und ein in dem Bläschen enthaltener Wirkstoff
kann lokal deponiert werden.
-
Bevorzugt
ist die eingeschlossene Flüssigkeit eine wässrige
Lösung oder enthält eine solche. Beispielsweise
eine Zuckerlösung oder eine ionische Lösung, wie
eine Kochsalzlösung. Weiter bevorzugt ist die eingeschlossene
Flüssigkeit eine Suspension oder eine Emulsion. Beispielsweise
sind in der Hülle Feststoffe wie z. B. Arzneimittel eingeschlossen.
Zusätzlich oder alternativ ist die eingeschlossene Flüssigkeit
eine Emulsion aus einer polaren und einer unpolaren Flüssigkeit
wie z. B. Wasser und Öl, wobei der Emulsion vorzugsweise
ein Emulgator zugegeben wird.
-
Vorzugsweise
sind zumindest zwei Bläschen vorgesehen, die jeweils unterschiedliche
Flüssigkeiten bzw. Wirkstoffkomponenten oder Reaktanden einschließen,
insbesondere Wirkstoffkomponenten, die bei Wechselwirkung reagieren
und/oder aktiviert werden.
-
Bei
einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist innerhalb der Hülle
zumindest ein weiteres Bläschen eingeschlossen, insbesondere
zumindest ein weiteres Vesikel. Vorzugsweise sind mehrere Vesikel
in der Hülle eingeschlossen. Das heißt innerhalb des
Bläschens, das für sich ein separiertes Volumen darstellt,
ist ein weiteres separiertes Volumen angeordnet.
-
Vorzugsweise
ist zumindest in einem der weiteren Bläschen eine weitere
Flüssigkeit eingeschlossen, insbesondere eine von der das
weitere Bläschen umgebenden Flüssigkeit unterschiedliche Flüssigkeit.
Diese weitere Flüssigkeit kann einen Wirkstoff oder eine
Wirkstoffkomponente enthalten. Durch das oder die weiteren Bläschen
innerhalb der Hülle können mehrere Wirkstoffkomponenten
oder Reaktanden abgeschirmt voneinander in der Hülle deponiert
werden. Insbesondere bei Wirkstoffkomponenten, die durch Kontakt
miteinander aktiviert werden, wird so ein Bläschen bereitgestellt,
das zu einem gewünschten Zeitpunkt Wirkstoffe aktiviert und/oder
aktivierte Wirkstoffe freisetzt, beispielsweise durch Zerstören
der Hülle des Bläschens und der Hülle
der weiteren Bläschen zu diesem gewünschten Zeitpunkt,
wodurch die Wirkstoffe in Kontakt miteinander kommen.
-
Bevorzugt
ist das zumindest eine magnetische Partikel paramagnetisch, insbesondere
superparamagnetisch. D. h. bei Anlegen eines äußeren Feldes
tritt eine Magnetisierung der Partikel in Richtung des Feldes auf.
Zudem lagert sich zumindest ein Teil der Vielzahl von magnetischen
Partikeln bei Anlegen eines äußeren Magnetfeldes
aneinander an und bilden insbesondere zumindest ein Aggregat oder
einen Cluster innerhalb der Hülle. Insbesondere bei Vorliegen
eines inhomogenen Magnetfeldes werden die magnetischen Partikel
in Gebiete mit höherer Feldstärke gezogen, d.
h. die Partikel folgen einem Gradienten des inhomogenen Magnetfeldes.
Weiterhin können ferromagnetische Partikel verwendet werden.
-
Das
zumindest eine oder die Vielzahl der magnetischen Partikel haben
vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 5 Nanometer und 2 μm,
bevorzugt einen maximalen Durchmesser von 10 μm vorzugsweise
von maximal 1 μm oder 50 Nanometer. Die magnetischen Partikel
können eine beliebige Form aufweisen. Vorzugsweise sind
die magnetischen Partikel kugelförmig oder im Wesentlichen
kugelförmig.
-
Besonders
bevorzugt sind die magnetischen Partikel biokompatibel. D. h. bei
Verwendung der Partikel, haben diese z. B. im menschlichen oder
tierischen Körper keinen schädlichen Einfluß auf
diesen Körper und können z. B. von diesem problemlos
wieder ausgeschieden werden. Alternativ oder zusätzlich
ist die magnetische Substanz oder Elemente des Partikels in einer
Hülle oder einer Matrix eingeschlossen. Beispielsweise
in Latex, Kohlenstoff oder dergleichen.
-
Gemäß einer
Ausgestaltung sind innerhalb der Hülle des Bläschens
weitere Partikel eingeschlossen und die Hülle bildet ein
Transportmittel für die weiteren Partikel, insbesondere
für Arzneimittel oder Arzneimittelkomponenten. Weitere
Partikel sind beispielsweise Krebsmarker, Antikörper oder
Impfstoffe.
-
Gemäß Anspruch
17 ist eine Kombination aus zumindest einer Trägerflüssigkeit
und zumindest einem in der zumindest einen Trägerflüssigkeit
enthaltenen Bläschen vorgesehen, wobei das zumindest eine
Bläschen wie oben beschrieben ausgebildet sein kann. Bevorzugt
enthält das Bläschen einen Wirkstoff, der mit
der Trägerflüssigkeit in Wechselwirkung tritt,
insbesondere reagiert. Bevorzugt wird durch die Wechselwirkung der
Wirkstoff aktiviert. Eine Wechselwirkung kann einerseits durch ein
Austreten des Wirkstoffs aus dem Bläschen durch oben beschriebene
Kanäle entstehen oder durch ein Öffnen oder zumindest
teilweises Zerstören der Hülle des Bläschens.
-
Dabei
ist der Begriff "Trägerflüssigkeit" als die die
Bläschen tragende bzw. enthaltende Flüssigkeit
zu verstehen. Das bedeutet, dass einerseits eine Flüssigkeit
zur "Lagerung" von Bläschen – d. h. ohne dass
diese Flüssigkeit Bestandteile enthält, die zur Wechselwirkung
mit einem Wirkstoff der Bläschen vorgesehen sind – als
Trägerflüssigkeit bezeichnet wird. Andererseits
kann ebendiese Trägerflüssigkeit mit den Bläschen
beispielsweise einer Blutprobe zugegeben werden, wobei dann das
Blut der Blutprobe die Trägerflüssigkeit für
die Bläschen bildet.
-
Besonderes
bevorzugt enthält die Trägerflüssigkeit
Untereinheiten mit denen eine in dem oder den Bläschen
enthaltener Wirkstoff in Wechselwirkung tritt, insbesondere reagiert.
Beispielsweise mit zellulären Bestandteilen wie Blutkörperchen
bei der Verwendung von Blut als Trägerflüssigkeit.
-
Weiter
bevorzugt enthalten in der Trägerflüssigkeit vorliegende
Bläschen jeweils unterschiedliche Wirkstoffe oder Komponenten,
die miteinander in Wechselwirkung treten oder reagieren, insbesondere bei
Wechselwirkung miteinander aktiviert werden.
-
Die
Trägerflüssigkeit ist bevorzugt eine wässrige
Lösung oder enthält eine solche, insbesondere
eine oder mehrere der Folgenden: eine Zuckerlösung, ionische
Lösung, Blut, Blutplasma.
-
Gemäß Anspruch
20 wird ein Verfahren zur Herstellung zumindest eines Bläschens,
insbesondere eines Bläschens wie oben beschrieben vorgesehen.
Zunächst werden magnetische Partikel und zumindest ein
Ausgangsmaterial für eine Hülle bereitgestellt.
Ein Ausgangsmaterial sind z. B. amphiphile Polymere. Den magnetischen
Partikeln und dem Ausgangsmaterial wird zumindest eine Flüssigkeit hinzugefügt.
Die Hülle eines sich ausbildenden Bläschens schließt
zumindest einen Teil der Flüssigkeit und zumindest eines
der magnetischen Partikel ein. Nach dem Ausbilden liegt somit ein
von der umgebenden Flüssigkeit separiertes Volumen vor.
-
Bevorzugt
weist das zumindest eine Ausgangsmaterial zumindest einen Polymerbildner
auf. Insbesondere können die oben beschriebenen Polymere
eingesetzt werden.
-
Besonders
bevorzugt wird nach dem Hinzufügen der zumindest einen
Flüssigkeit zum Ausgangsmaterial eine elektrische Spannung,
insbesondere eine Wechselspannung, angelegt, um die Bildung von
Bläschen zu unterstützen.
-
Bei
einer besonders bevorzugten Ausgestaltung werden die magnetischen
Partikel und das zumindest eine Ausgangsmaterial bereitgestellt
durch Aufbringen einer Vielzahl magnetischer Partikel auf ein Trägersubstrat
und eines das Ausgangsmaterial enthaltenden Lösungsmittels
auf das Trägersubstrat. Nach dem Abziehen, Abdampfen und/oder
Verdunstenlassen des Lösungsmittels, bleibt das Ausgangsmaterial
für die zumindest eine Hülle auf dem Trägersubstrat
zurück. Vorzugsweise weist das Trägersubstrat
Elektroden auf und/oder das Trägersubstrat ist eine Elektrode,
um wie oben beschrieben eine Spannung an die Flüssigkeit
anzulegen. Die Elektroden sind vorzugsweise korrosionsfrei und/oder
biokompatibel, insbesondere bioinert. Vorzugsweise werden Elektroden
durch Aufbringen einer Schutzschicht (z. B. Quarz) vor Korrosion
geschützt, wobei die aufgebrachte Schicht das Trägersubstrat
bildet.
-
Zur
Unterstützung des Ausbildens von Bläschen wird
beim Bilden der Bläschen die Temperatur der Flüssigkeit
in einem Bereich gehalten, in der insbesondere die amphiphilen Moleküle
in einer fluiden Phase vorliegen. In der fluiden Phase ist z. B.
eine aus diesen Molekülen ausgebildete Membran "flüssig",
d. h. leicht verformbar. Damit ist gewährleistet, dass
sich z. B. ausgehend von einer ebenen Membranfläche diese
Membran ausreichend krümmen bzw. verformen kann, um ein
Bläschen auszubilden.
-
Vorzugsweise
weist die hinzugefügte Flüssigkeit weitere Partikel
wie funktionalisierte Partikel und/oder Wirkstoffsubstanzen auf
oder es werden auf das Trägersubstrat weitere Partikel
aufgebracht. Dabei werden die weiteren Partikel beim Bilden der Bläschen
in das Bläschen eingeschlossen und/oder in die Hülle
mit eingebaut. Beispielsweise sind die funktionalisierten Partikel
Krebsmarker, wie oben beschrieben.
-
Gemäß Anspruch
28 wird ein Verfahren zur Manipulation zumindest eines von einer
Trägerflüssigkeit umgebenen Bläschens
bereitgestellt. Vorzugsweise ist das Bläschen ein Bläschen
wie oben beschrieben oder nach dem oben beschriebenen Verfahren
hergestellt. Insbesondere weist das Bläschen eine Hülle
auf mit zumindest einer darin eingeschlossenen Flüssigkeit
und zumindest einem darin eingeschlossenen magnetischen Partikel.
Das Verfahren sieht das Anlegen eines äußeren
Magnetfelds vor, so dass auf das zumindest eine magnetische Partikel
innerhalb der Hülle des Bläschens eine Kraft ausgeübt
wird.
-
Vorzugsweise
lagert sich durch das Anlegen eines Magnetfeldes zumindest ein Teil
der Vielzahl magnetischer Partikel aneinander an und bildet insbesondere
eine Vielzahl von Aggregaten oder Cluster, insbesondere mit länglicher
Form.
-
Bevorzugt
wird das Magnetfeld zeitlich geändert und zusätzlich
oder alternativ räumlich geändert, wodurch das
zumindest eine magnetische Partikel oder ein Aggregat von magnetischen
Partikeln beeinflusst wird, insbesondere bewegt wird. Bevorzugt weist
das Magnetfeld einen räumlichen Gradienten und/oder eine
Magnetfelddichteänderung auf, um räumlich oder
zeitlich veränderliche Kräfte auf den oder die
magnetischen Partikel auszuüben.
-
Weiter
bevorzugt ist das Magnetfeld ein rotierendes Magnetfeld, mit dem
ein magnetisches Partikel ein Cluster von magnetischen Partikeln
zur Rotation angeregt wird. Eine solche Rotation der magnetischen
Partikel bzw. Aggregate kann durch räumlich rotierende
Permanentmagneten oder Spulen erzeugt werden. Ein weitere Möglichkeit
ist das Anordnen mehrere Spulen nebeneinander, wobei durch alternierendes
oder sukzessives Schalten der Spulen ebenfalls ein bewegtes (z.
B. ein rotierendes Magnetfeld) erzeugt wird.
-
Insbesondere
wird durch Anlegen eines Magnetfeldes das zumindest eine magnetische
Partikel innerhalb der Hülle bewegt oder relativ zur Trägerflüssigkeit
bewegt. Damit ergibt sich die Möglichkeit ein Bläschen
mittels der innerhalb des Bläschens enthaltenen magnetischen
Partikel zu bewegen. Insbesondere kann durch die auf die magnetischen
Partikel übertragene Kraft ein Bläschen unabhängig
von oder sogar entgegen außerhalb des Bläschens
vorliegenden Strömungen bewegt werden. Beispielsweise kann
ein Bläschen auf diese Weise im Blutkreislauf unabhängig
von der Blutströmung an eine bestimmte Stelle transportiert
bzw. dort plaziert oder festgehalten werden. Weiterhin kann beispielsweise auf
diese Weise ein Bläschen auf einem fluidischen Analysechip
unabhängig von einer Flußrichtung auf dem Chip
positioniert bzw. transportiert werden.
-
Bevorzugt
ist die Bewegung des Partikels durch ein Magnetfeld eine Linearbewegung,
eine Rotations- oder Kreisbahnbewegung oder eine Kombination von
Linear- und Kreisbahnbewegung. D. h. das magnetische Partikel kann
durch ein Magnetfeld auf einer vorgegebenen oder vorgebbaren Bahn
bewegt werden. Insbesondere kann z. B. durch das Anregen einer Rotation
und/oder Vibration des magnetischen Partikels ein Mischen von mehreren
innerhalb der Hülle vorhandenen Flüssigkeiten
verbessert bzw. beschleunigt werden.
-
Beim
Vorsehen zumindest eines weiteren Bläschen innerhalb der
Hülle kann durch eine Bewegung der magnetischen Partikel,
beispielsweise durch deren Rotation, die Hülle des einen
weiteren Bläschen zerstört werden oder zumindest
teilweise zerstört werden. So kann beispielsweise eine
Flüssigkeit oder ein Wirkstoff dieses weiteren Bläschens freigesetzt
werden. Dieser Wirkstoff kann nun wiederum mit der Flüssigkeit
innerhalb der Hülle reagieren oder diese aktivieren. Dies
ist insbesondere von Vorteil, wenn ein zu aktivierender Wirkstoff
nur für kurze Zeit nach der Aktivierung wirksam ist. Somit können
in den Bläschen kleinste Mengen verschiedener Wirkstoff-
oder Reaktionskomponenten gelagert werden, um erst bei Bedarf zur
Reaktion gebracht zu werden.
-
Bevorzugt
kann die Hülle des Bläschens und/oder die weitere
Hülle der oder der weiteren Bläschen zumindest
teilweise zerstört werden, um die darin enthaltene Flüssigkeiten
und/oder Wirkstoffe, z. B. die oben beschriebenen aktivierten Wirkstoffe,
in die Trägerflüssigkeit freizusetzen. Vorzugsweise
wird die Hülle mittels zumindest eines magnetischen Impulses
zumindest teilweise zerstört. Weitere Möglichkeiten
zur Zerstörung oder Öffnung der Hülle (Hüllen)
sind das Anlegen eines elektrischen Feldes oder Ultraschall und
zusätzlich oder alternativ Mikrowellenstrahlen. Energie
von Mikrowellenstrahlen wird dabei hauptsächlich von den
magnetischen Partikeln absorbiert und haben insbesondere kaum Einfluß auf eine
wässrige Trägerflüssigkeit. Alternativ
kann der Trägerflüssigkeit ein Lösungsmittel
zugefügt werden, das die Hülle des oder der Bläschen
auflöst.
-
Bevorzugt
wird die nach dem Öffnen oder zumindest teilweisen Zerstören
der Hülle freigesetzte Flüssigkeit mit der Trägerflüssigkeit
mittels der ebenfalls freigesetzten magnetischen Partikel wie oben beschrieben
vermischt, indem ein Magnetfeld angelegt wird oder das Magnetfeld
angelegt bleibt. Insbesondere wird eine Rotation der freigesetzten
magnetischen Partikel angeregt. Somit wird ein Vermischen der freigesetzten
Flüssigkeit mit der Trägerflüssigkeit verbessert
bzw. beschleunigt und eine effiziente und schnelle Reaktion oder
Aktivierung eines freigesetzten Wirkstoffes wird insbesondere am
Ort der Freisetzung ermöglicht.
-
Besonders
bevorzugt reagiert die freigesetzte Flüssigkeit mit in
der Trägerflüssigkeit enthaltenen Untereinheiten.
Beispielsweise bei der Verwendung von Blut als Trägerflüssigkeit
reagiert die freigesetzte Flüssigkeit mit zellulären
Blutbestandteilen, wie Blutplättchen. Diese Reaktion wird
durch das oben beschriebene Vermischen mittels der magnetischen Partikel
ebenfalls verbessert bzw. beschleunigt. Insbesondere kann durch
das Verfahren eine im Bläschen enthaltene Flüssigkeit
gezielt mit beispielsweise bestimmten Organen oder Gefäßwänden
(z. B. Adern) in Kontakt gebracht werden und damit eine gewünschte
Reaktion der freigesetzten Flüssigkeit mit diesen verbessern
bzw. beschleunigen.
-
Bei
einer weiter bevorzugten Ausgestaltung werden erste Bläschen
mit zumindest einer ersten Wirkstoffkomponente und zweite Bläschen
mit zumindest einer zweiten Wirkstoffkomponente in einer Trägerflüssigkeit
bereitgestellt. Die zumindest eine erste Wirkstoffkomponente ist
dabei zur Reaktion mit der zumindest einen zweiten Wirkstoffkomponente bestimmt.
Beispielsweise können die Bläschen mit den jeweiligen
Wirkstoffkomponenten getrennt voneinander hergestellt und anschließend
zusammengeführt werden, um eine Trägerflüssigkeit
mit Bläschen bereitzustellen, die jeweils unterschiedliche Wirkstoffkomponenten
enthalten. Die Wirkstoffe in den Bläschen können
auf die zuvor beschriebene Weise freigesetzt werden, insbesondere
nach einer Positionierung bzw. Transport der Bläschen,
wobei eine Reaktion der ersten mit der zweiten Wirkstoffkomponente
durch das oben beschriebene Verfahren bzw. Vermischen mittels der
magnetischen Partikel verbessert wird.
-
Durch
das beschriebene Verfahren kann somit ein Wirkstoff oder ein Reagenz
gezielt positioniert werden und an dieser Position gezielt aktiviert
und freigesetzt werden. Zusätzlich wird eine Vermischung mit
einer Trägerflüssigkeit, mit Untereinheiten einer Trägerflüssigkeit
und/oder eine Vermischung verschiedener freigesetzter Wirkstoffkomponenten
verbessert. Dieses Verfahren kann beispielsweise im Körper
(in vivo) eingesetzt werden, aber auch im Labor (in vitro), beispielsweise
auf sogenannten Analysechips zur DNA-, PCR- oder Blutanalyse. Ein
weiterer Anwendungsbereich liegt in der genauen Positionierung von
Reaktanden bei der Synthese von nano-strukturierten Stoffen.
-
Bevorzugt
werden nach dem Freisetzen oder nach dem Vermischen durch Anlegen
eines Magnetfeldes das zumindest ein magnetischer Partikel oder die
Vielzahl von magnetischen Partikeln aus der Trägerflüssigkeit
entfernt oder in der Trägerflüssigkeit lokal konzentriert.
Insbesondere bei Verwendung dieses Verfahrens bei fluidischen Analyse-Vorrichtungen
kann so die Trägerflüssigkeit ausgetauscht oder entnommen
werden, ohne die magnetischen Partikel zu entfernen. D. h. nach
dem Austausch einer Trägerflüssigkeit stehen dieselben
magnetischen Partikel einem weiteren Experiment oder Test zur Verfügung.
-
Gemäß Anspruch
41 ist eine Anordnung zur Manipulation von Bläschen vorgesehen
mit einer Trägerflüssigkeit und einem in der Trägerflüssigkeit
enthaltenen Bläschen, wobei das Bläschen eine
Hülle und zumindest ein in der Hülle enthaltenes
magnetisches Partikel aufweist. Weiterhin ist zumindest ein Magnetfelderzeuger
vorgesehen, der an das Bläschen ein Magnetfeld anlegt,
insbesondere ein räumlich und zusätzlich oder
alternativ zeitlich veränderbares Magnetfeld. Insbesondere
kann mit einer solchen Anordnung ein wie oben beschriebenes Bläschen
gemäß den oben beschriebenen Verfahren manipuliert
werden.
-
Bevorzugt
ist der zumindest eine Magnetfelderzeuger geeignet, ein fokussiertes
Magnetfeld zu erzeugen, wobei der zumindest eine Magnetfelderzeuger
eine Einrichtung aufweist, um ein erzeugtes Magnetfeld gezielt zu
positionieren.
-
Vorzugsweise
ist bei Verwendung im Labor eine Einrichtung zur Aufnahme der Trägerflüssigkeit mit
den darin enthaltenen Bläschen separat zum Magnetfelderzeuger
angeordnet, so dass die Trägerflüssigkeit für
verschiedene Experimente leicht ausgewechselt werden kann. Alternativ
ist die Aufnahmeeinrichtung als Einwegprodukt konzipiert, so dass nach
einem Experiment oder einem Test keine Reinigung von fluidischen
Komponenten nötig ist.
-
Zusammenfassend
können mittels der beschriebenen Verfahren, Vorrichtung
und Bläschen kleinste Mengen an Flüssigkeiten
und/oder Wirkstoffe – separiert von einem umgebenden Medium – gezielt
transportiert und positioniert werden und die Flüssigkeiten/Wirkstoffe
gezielt an dieser Position freigesetzt werden. Zusätzlich
wird vor dem Freisetzen der Flüssigkeiten/Wirkstoffe oder
nach dem Freisetzen ein Mischen derselben innerhalb des Vesikels oder
mit einer Trägerflüssigkeit verbessert bzw. beschleunigt.
-
Anhand
von Figuren werden Ausführungsbeispiele der Erfindung näher
erläutert. Es zeigen:
-
1 eine
Quellkammer zur Erzeugung von Bläschen,
-
2 ein
erstes Ausführungsbeispiel eines Bläschens,
-
3 ein
weiteres Ausführungsbeispiel eines Bläschens,
in dem ein weiteres Bläschen enthalten ist,
-
4 das
Bläschen von 2 unter Einfluss eines Magnetfeldes,
-
5 das
Bläschen von 3 unter Einfluss eines Magnetfeldes,
-
6 das
Bläschen von 2 unter Einfluss eines Magnetfeldes
zum Transport des Bläschens,
-
7 das
Bläschen von 2 mit geöffneter Hülle,
-
8 das
Bläschen von 7 ohne Einfluss eines Magnetfeldes,
und
-
9 eine
schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Manipulation von
Bläschen.
-
1 zeigt
eine Quellkammer 12, die zur Herstellung von Vesikeln 2 verwendet
wird. Im Folgenden wird beispielhaft ein Verfahren zur Herstellung
von Vesikeln 2 unter Verwendung eines elektrischen Feldes
beschrieben. Dabei wird ein dünner Lipidfilm in wässriger
Lösung gequollen und der Film durch ein elektrisches Wechselfeld
abgelöst und zu Vesikeln 2 umgeformt.
-
Bei
den beschriebenen Beispielen werden zwei verschiedene Lipide als
Hauptbestandteil der Quelllösungen verwendet: DOPC (1,2-Dioleyol-sn-Glycero-3-Phoshocholine)
ist ein Lipid, das im gesamten experimentell zugänglichen
Temperaturbereich in der fluiden Phase ist. DMPC (1,2-Dimyristol-sn-Glycero-3-Phosphocholine
Chloroform) kann bei niedrigen Temperaturen in die Gelphase überführt
werden. Die erste Quelllösung ist eine Mischung aus 150 μl
DOPC Chloroformlösung mit einer Konzentration c = 2,5 mg/ml
sowie 10 μl Texas-RedTM DHPE Chloroformlösung
mit einer Konzentration c = 0,5 mmol/l. Die Zusammensetzung der
zweiten Quelllösung ist gleich, allerdings wird die DOPC-Lösung
durch eine DMPC-Lösung mit gleicher Konzentration ersetzt.
Als Trägersubstrat 14, 14' werden Glasplatten
verwendet, die vorzugsweise mit Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichtet
sind. Da die Platten transparent sind, kann die Bildung der Vesikel 2 in der
Quellkammer 12 unter dem Mikroskop beobachtet werden. Die
leitfähige ITO-Beschichtung dient als Elektrode.
-
Als
magnetische Partikel werden Magnetbeads 8 verwendet. Um
Vesikel 2 mit eingeschlossenem Magnetbeads 8 quellen
zu können, wird vor dem Auftragen einer Lipidlösung
bzw. Quelllösung auf das Trägersubstrat 14, 14' zunächst
10 μl einer Magnetbead-Lösung auf das Trägersubstrat 14, 14' verteilt und
im Vakuum getrocknet.
-
Danach
wird 10 μl der DOPC- oder DMPC-Quelllösung auf
das Trägersubstrat 14, 14' aufgetragen.
Das Trägersubstrat 14, 14' wird dann für
3 Stunden ins Vakuum gelegt, um das Chloroform abdampfen zu lassen.
Dann werden jeweils zwei Trägersubstrate 14, 14' mit
einem Abstandshalter 16, insbesondere einem Teflonspacer,
zu der Quellkammer 12 zusammengeklebt. Die Grundfläche
der Quellkammer 12 beträgt ca. 20 × 50
mm2, der Abstand der Trägersubstrate
beträgt ca. 2 mm. Nachfolgend wird die Quellkammer 12 mit
einer Flüssigkeit 6, insbesondere einer Zuckerlösung,
gefüllt.
-
Zum
Quellen wird an die Trägersubstrate 14, 14' bzw.
an die Elektroden mittels einer Wechselspannungsquelle 18 eine
10 Hz Wechselspannung angelegt, die langsam von 0 auf 2,6 Volt erhöht
wird. Der eigentliche Quellvorgang dauert ca. 18 Stunden.
-
Wie
in 1 dargestellt, kann unter dem Mikroskop beobachtet
werden, dass sich zunächst auf den Platten blasenartige
Membranformen bilden, die sich langsam mit Flüssigkeit 6 Pillen
und sich schließlich ablösen, um jeweils eine
Hülle 4 eines Vesikels 2 bilden. Einige
der gebildeten Vesikel 2 enthalten einzelne Magnetbeads 8,
beispielsweise bis zu dreißig Magnetbeads 8. Zum
größten Teil sind die Vesikel unilamellar, d.
h. sie weisen zwei einlagige Lipidschichten (d. h. eine Lipiddoppelschicht)
auf. Die Größe der Vesikel 2 liegt zwischen
10 und 60 μm, wobei einige Vesikel 2 auch bis
zu 130 μm groß werden können. Nach dem
Quellen können die Vesikel 2 abpipettiert und
im Kühlschrank gelagert werden.
-
Bei
der Herstellung von DMPC-Vesikeln 2 muss beachtet werden,
dass die Phasenübergangstemperatur dieses Lipids bei 23°C
liegt. Im Vergleich dazu liegt die Phasenübergangstemperatur
von DOPC bei 20°C. Da Lipide während des Quellens
in der fluiden Phase (Lα-Phase)
sein müssen, um ausreichend verformbar zu sein, wird die
Quellkammer 12 bei der Erzeugung von DMPC-Vesikeln 2 im
Wärmebad inkubiert. Des weiteren verringert sich beim Übergang
von der fluiden Phase in die sogenannte Gelphase die Fläche
einer Lipiddoppelschicht um ca. 30%. Um ein Platzen der Vesikel 2 durch
die Membrankontraktion beim Abkühlen zu vermeiden, muss das
Volumen der Vesikel 2 vorher osmotisch verringert werden.
Dazu wird zusätzlich Sucrose zu der DMPC-Vesikel-Lösung
gegeben, um die Gesamtkonzentration auf 300 mM zu erhöhen.
-
Damit
erhöht sich das verfügbare Volumen in den Vesikeln 2 und
ein Platzen der Vesikel 2 wird verhindert.
-
2 zeigt
ein Ausführungsbeispiel eines beispielsweise mit dem oben
beschriebenen Verfahren hergestellten Vesikels 2 mit einer
Hülle 4, die die Flüssigkeit 6 und
Magnetbeads 8 einschließt. Die Hülle 4 kann
eine Vielzahl von Schichten aufweisen. Vorzugsweise ist sie unilamellar,
d. h. besteht aus einer Lipiddoppelschicht. Die Flüssigkeit 6 kann
eine Mischung aus mehreren Flüssigkeiten sein oder zusätzlich
weitere funktionalisierte Partikel (nicht dargestellt) enthalten,
wie z. B. Wirkstoffe, Reagenzien oder Marker. Das Vesikel 2 bildet
ein von der äußeren Umgebung abgeschirmtes Kompartiment
oder einen Behälter für die Flüssigkeit 6 und/oder
die funktionalisierten Partikel.
-
3 zeigt
eine weiteres Ausführungsbeispiel eines Vesikels 2' in
dessen Hülle 4' ein weiteres Vesikel 2'',
die Beads 8 und eine Flüssigkeit 6' eingeschlossen
ist. Dieses weitere Vesikel 2'' enthält eine weitere
Flüssigkeit 6''. Die weitere Flüssigkeit 6'' kann
eine Substanz enthalten oder sein, die zur Reaktion mit der Flüssigkeit 6' geeignet
ist. Insbesondere sind die Flüssigkeiten 6', 6'' wässrige
Lösungen, insbesondere biokompatible Lösungen.
Vorzugsweise enthalten die Flüssigkeiten 6', 6'' Wirkstoffe
zur medizinischen oder therapeutischen Behandlung. Beispielsweise
enthalten die Flüssigkeiten 6', 6'' Impfstoffe
oder Krebsmarker. In Ausgestaltung können in dem weiteren
Vesikel 2'' weitere Magnetbeads 8' eingeschlossen
sein. Das oder die weiteren Magnetbeads 8' können
auch anstelle der Magnetbeads 8 vorgesehen sein.
-
4 zeigt
das Vesikel von 1 in einer Trägerflüssigkeit 10 unter
Einfluß eines magnetischen Feldes M. Durch das Anlegen
eines Magnetfeldes M richten sich die Magnetbeads 8 nach
dem Magnetfeld M aus und bilden insbesondere Aggregate, wobei die
Beads insbesondere stäbchenförmig angeordnet sind.
Bei Anlegen eines räumlich und/oder zeitlich veränderlichen
Magnetfeldes können diese Aggregate bewegt werden. Insbesondere können
diese Aggregate als eine Art "Mikro-Rührstäbehen"
verwendet werden, wenn sie durch Drehung des äußeren
Magnetfeldes M zur Rotation gebracht werden. Somit kann die Flüssigkeit 6 im
Inneren der Hülle 4 mittels der Aggregate bzw.
der Magnetbeads 8 durchmischt werden.
-
Dies
ist insbesondere von Vorteil, wenn wie in 2 dargestellt
in der Hülle 6' des Vesikels 2' ein weiteres
Vesikel 2'' vorliegt. Wie in 5 dargestellt kann
durch die Bewegung der Magnetbeads 8 mittels des äußeren
Magnetfelds M die Hülle 4'' des weiteren Vesikels 2'' zumindest
teilweise zerstört werden oder geöffnet werden,
so dass die im Inneren des zweiten Vesikels 2'' enthaltene
Flüssigkeit 6'' freigesetzt wird. Nachfolgend
kann durch Bewegung (z. B. Rotation) der Magnetbead-Aggregate ein
Durchmischen der weiteren Flüssigkeit 6'' mit
der Flüssigkeit 6' des Vesikels 2' verbessert
bzw. beschleunigt werden. So kann zu einem bestimmten Zeitpunkt
ein Wirkstoff aus dem weiteren Vesikel 2'' freigesetzt werden
und gezielt im Vesikel 2' aktiviert werden, ohne das die
so aktivierte Flüssigkeit oder der Wirkstoff in die umgebende
Trägerflüssigkeit 10 freigesetzt wird.
-
6 zeigt
wie durch das Anlegen eines Magnetfeldes beispielsweise das Vesikel 2 von 1 in einer
Trägerflüssigkeit 10 bewegt werden kann.
Indem die Aggregate oder auch einzelne Magnetbeads 8 im
Magnetfeld M eine Kraft erfahren – in diese Darstellung
ist die Kraftwirkung nach rechts gerichtet – bewegen sie
sich im Inneren des Vesikel 2 bzw. relativ zur Trägerflüssigkeit 10 fort.
Insbesondere wird ein Magnetbead 8 oder die Magnetbeads 8 in
einen Fokus des Magnetfeldes M gezogen bzw. folgen dem Fokus des
Magnetfeldes M. Somit kann durch die auf die Beads 8 ausgeübte
Kraft das Vesikel 2 gezielt transportiert und positioniert
werden.
-
7 zeigt
das Freisetzen der Flüssigkeit 6 des Vesikels 2 von 1.
Beispielsweise werden mittels eines magnetischen Impulses die Magnetbeads 8 ruckartig
beschleunigt und treten dabei durch die Hülle 4 des
Vesikels 2. Eine weitere Möglichkeit zum Öffnen
der Hülle 4 ergibt sich aus einer Bewegung der
Beads 8 mit einer Geschwindigkeit dem das Vesikel 2,
z. B. aufgrund der viskosen Gegenkräfte der Trägerflüssigkeit 10 nicht
folgen kann. Dabei wird ein Teil der Hülle 4 durch
die Beads verformt bzw. in die Länge gezogen bis die Hülle 4 aufgrund
der Verformung reißt. Durch das Öffnen bzw. das
zumindest teilweise Zerstören der Hülle 4 werden
die Flüssigkeit 6, ebenso wie die Beads 8 in
die Trägerflüssigkeit 10 freigesetzt.
Auf die gleiche Weise wird ein wie oben beschriebener aktivierter
Wirkstoff freigesetzt.
-
Nach
dem Freisetzen kann wie oben beschrieben mittels Bewegung der – nun
in der Trägerflüssigkeit 10 vorliegenden – Magnetbeads 8 ein
Mischen bzw. Durchmischen der Flüssigkeit 6 mit
der Trägerflüssigkeit 10 beschleunigt
werden.
-
8 zeigt
das geöffnete Vesikel 2 von 7 ohne
angelegtes Magnetfeld M. Die Aggregate trennen sich und es liegen
wieder einzelne Magnetbeads 8 vor. Die Magnetbeads können
aus der Trägerflüssigkeit 10 wiederum
mittels eines Magnetfelds M getrennt werden bzw. von ihr separiert
werden. Bei Verwendung der Vesikel im Körper (beispielsweise von
Vesikeln 2, 2' im Blut als Trägerflüssigkeit 10) werden
biokompatible Magnetbeads 8 verwendet, so dass die Beads 8 keinen
schädlichen Einfluß auf den Körper haben
und beispielsweise problemlos vom Körper ausgeschieden
werden können. Insbesondere weisen die Magnetbeads 8 eine
biokompatible Beschichtung auf, wie eine Latexhülle.
-
9 zeigt
eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 20 zur
Manipulation von Vesikeln 2, 2'. Mittels an einem
Rotor 24 befestigten Permanentmagneten 22, 22' wird
unterhalb eines auf einem Träger 21 angeordneten
Trägerflüssigkeit 10 ein rotierendes
Magnetfeld erzeugt. Dadurch werden in der Trägerflüssigkeit 10 enthaltenen
Vesikel 2, 2' mit Magnetbeads 8 auf die
oben beschriebene Weise manipuliert. Insbesondere wird eine in den
Vesikeln 2, 2' enthaltene Flüssigkeit 6, 6' und/oder
ein Wirkstoff freigesetzt und mit der Trägerflüssigkeit 10 durchmischt.
-
- 2,
2'
- Vesikel
- 4,
4', 4''
- Hülle
- 6,
6', 6''
- Flüssigkeit
- 8
- Magnetbeads
- 10
- Trägerflüssigkeit
- 12
- Quellkammer
- 14,
14'
- Trägersubstrat
- 16
- Abstandhalter
- 18
- Wechselspannungsquelle
- 20
- Vorrichtung
- 21
- Träger
- 22,
22'
- Permanentmagnet
- 24
- Rotor
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Wixforth A.,
Acoustically driven planar microfluidics, Superlattices Microstruct
2003; 33: 389–396 [0002]
- - Szostak J. W., Bartel D. P., Luisi P. L., Synthesizing life,
Nature 2001; 409: 387–390 [0002]