JPH04501069A - 血液成分、角膜、及び鞏膜組織の殺菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 °　ひ　、の１ 背−景 よ−立型Ω分野 本発明は、治療、診断、及び研究で使用される一定の身体組織の処理に関する。

このような組織としては、輸液で使用される血液物質、ならびに移植で使用され る器官及び器官の一部が含まれる。従って、本発明は、一般に血液物質、角膜、 及び１膜に関している。

本発明は、より詳しく言えば、このような組織の殺菌に関係する。すなわち、一 定の血液成分、角膜、及び１膜の殺菌である。本発明が将来その他の移植組織に も応用される可能性もある。

添付した請求の範囲を含む本明細書のため、ここで「血液成分」という言葉が赤 血球又は血小板又は血漿を意味するものと定義しておく。また「細胞性血液成分 」は赤血球又は血小板又は血漿蛋白質（血漿ではなく）を意味するものと定義す る。

さらに「血液産物」は単独で使用される或いはその他の血液成分又はその他の物 質と組み合わせて使用される一つ又は複数の血液成分を意味するものと定義する 。「血液産物」の例としては、例えば全血及び血漿がある。

この処理は一部の有害物質又は汚染物質を不活性化するか活性を大幅に低下させ 、血液成分、器官、又はその他の組織を、治療、診断、又は実験といった人間の 有意義な利用にとって安全なものにするように考案されたものである。このよう な有害物質の中には、一部の血液伝送ウィルス及び以下で述べるその他の微生物 などが含まれる。

旦−従来例技術 人間及び動物の組織、特に人間の血液産物、角膜、及び■組織（これは角膜及び １膜の一部、並びに角膜及び２膜全体を含む）は、非常に一般的に輸液や移植の ために提供されている。しかし輸液又は移植するに当たってこのような組織の安 全性を保証する手段は今までになかった。

人間の血液産物−特に上記の成分−の輸液には、有害物質を伝達するよく知られ たリスクがある。同じことは角膜、業膜、及びその他の器官又は器官成分の移植 でも言える。

添付した請求の範囲を含む本書の目的のために、ここで「有害物質」を疾患又は その他の害を引き起こす可能性があるウィルス又はその他の病原体と定義してお く。

特に興味があるのは、Ｂ型肝炎ウィルス、非Ａ型、非Ｂ型肝炎ウィルスを含む様 々な肝炎を引き起こすと思われるウィルスである。これ以外にはサラトメガロウ ィルス及びエプスタイン−バーウィルスが興味あるウィルスである。

また、後天性免疫不全症候群“ＡＩＤＳ”として知られる、治癒せずしばしば致 命的である屑気と関係したウィルス又はウィルス群も大変興味深い。これは多分 、以前は”ＨＴＬＶ−■”及びソノ他ノＨＴＬＶ型、もっと最近テハ−ＨＩＶ” 、”ＨＩＭ−１”、”ＨＩＶ−Ｉ［”、“ＨＩＶ−１１１−及び１（ｆｆ−４Ｖ ”と命名されているレトロウィルス又はレトロウィルス群によって起こるものと 思われる。ＡＩＤＳの最も一般的な原因は、ｍｖ−ｍ、現在ではＨＩＶと呼ばれ るウィルスであると考えられている。

このような細胞変性レトロウィルスのＡＩＤＳ患者及びＡＴＤＳのリスクが高い 一定のグループのメンバーからの検出及び分離については、しばしば報告されて いる。このような報告書の一つは〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２４．６０ ０〜５０３ページ（１９８４）コに記載されている。

このような所見はピー・ニス・サビン（Ｐ、Ｓ、５ａｖｉｎ）らによる「成人の Ｔ細胞白血病−リンパ腫及び後天性免疫不全症候群におけるヒトＴリンパ栄養レ トロウィルス（Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｒｅｔｒｏｖｉ ｒｕｓｅｓ　ｉｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ−Ｌｙｍｐｈ ｏｍａ　ａｎｄ　`ｃｑｕｉｒｅｄ　１−ｎｅ　Ｄ ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　５ｙｎｄｒｏｚ　）　Ｊ　Ｃジャーナル・オブ・クリニカ ル・イミュノロジー（Ｊ、　Ｃ１１ｎｉｃａ１１＋ｎｎｒｕｎｏ１．）４．４１ ５〜２３ページ（１９８４）］の中で確認されている。また、エフ・ウォンダス タール（Ｆ　、Ｗｏｎｇ−３ｔａａｌ）とアール・シー・ガｏ　（Ｒ，Ｃ，Ｇａ １ｌｏ）による「ヒトＴリンパ栄養レトロウィルス（Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｌｙ＋ｎ ｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）　Ｊ　（ネイチ＋　−（Ｎ ａｔｕｒｅ）３P７． ３９５〜４０２ページ（１９８５））でも確認されている。

肝炎及びＡＩＤＳが血液産物の輸液によって伝染する危険のあることは大きな注 目を集めているが、眼の組織の移植にもそのような伝染の危険があることはあま り知られていない。

それにもかかわらず、エフ・ニス・プライトビル（Ｆ、Ｓ、　Ｂｒｉｇｈｔｂｉ ｌｌ）著の「角膜手術の理論、技術、及び組ｊａ（ＣＯＲＮＥＡＬ　５ＵＲＧＥ ＲＹ　Ｔｈｅｏｒｙ、丁ｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　Ｔｉ５ｓｕｅ）　Ｊ　［５ ３ペーW（Ｍ ｏｓｂｙ　１９８６）］によれば、角膜移植によって少なくともＡＩＤＳウィル スの伝染の可能性があることも認識されている。

さらに、移植前の角膜の保存には、一般に角膜をサポートする栄養培地と殺菌液 が使用されているが、同書の５２ページにはバクテリア及び真菌による角膜汚染 についても記録されている。従って、この外科分野にもバクテリア及び真菌の侵 入をコントロールする効果的な方法が必要である。

生医学の研究、分析、及び治療のためには、様々な肝炎やウィルスを引き起こし たり少なくともそれと関係している様々なウィルス間の差を理解し、それを全て 利用することが非常に重要である。しかし、本書の現在の目的にとって、この様 々な区３１を行うことはめんどうでもあり不必要である。

従って、簡明にするために、本書の以下の部分ではより一般的な用語を使うこと にする。

様々な肝炎ウィルスをより一般的に単に「肝炎ウィルス」と呼び、）ｒｒＬＶ’ ３＜はＨＩＶシリーズ又はその両方を単にｒＡＩ　ＤＳウィルスｊと呼ぶことに する。

しかしこのようにすることによって様々な学名に関連した区】りと不明確さの重 要性を減するつもりは全くない。このように肝炎ウィルスはＡＩＤＳウィルスと 同様に「有害物質」であり、勿論これ以外にもそのような物質がある。

輸液や移植に使用するヒト血液産物、ヒト角膜及び電膜、ならびにその他の組織 を、このような有害物質を一切含まない安全なものにする重要なニーズがある。

現在まで、このようなニーズに対して有効な答えは出ていない。

ここで最近１０年間における、私の発明と関連する２種類の開発について説明す る。しかし、それは今まで輸液及び移植のウィルス汚染の問題とは関連付けられ ていなかった。まず最初はこれらのウィルスを不活性化することが出来る新しい 殺菌剤の開発である。

特に、サビン（Ｓａｖｉｎ）らは、市販されている特定の実験用殺菌剤がＡＩＤ Ｓウィルスの少なくとも一つの形態を完全に不活性化することが出来ることを報 告している。しかし、サビン（Ｓａｖｉｎ）らは、この殺菌剤を血液産物や組織 移植に適用することについては全く触れていない。

この殺菌剤は約０．２３パーセントの亜塩素酸ナトリウムと１．２６パーセント の乳酸から成り、米国コネチカット州ノーウオーク所在のアルシト・コーポレイ ション（Ａｌｃｉｄｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からｒＬＤＪという商品名で 販売されている。メーカーは、ｒＬＤＪを使用前に蒸留水で希釈することを指示 している。サビン（Ｓａｖｉｎ）らはニューイングランド・ジャーナル・オブ・ メディスン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、）　３３．１４１６ページ（１９ ８５）で説明しているように、これを水で１：２００．１：１００　、又はそれ 以下に希釈して使用したと報告している。

この殺菌剤は、米国再発行特許第３１，７７９号明細書のハヮード・アリガー（ Ｈｏｗａｒｄ　Ａｌｌｉｇｅｒ）による特許の成分と一致している。この特許も 同様に、この殺菌剤を血液産物或いは角膜、電膜、又は移植用のその他の身体組 織の上皮又は内皮部分に適用することについては全く示唆していない。

逆に、アリが−（Ａｌｌｉｇｅｒ）はこの殺菌剤が、その一部の成分のために細 胞壁物質に対して非常に強い親和性を持ち、その結果細胞内部にアクセス出来る ようになることを主張している。この特性によってバクテリア細胞の効果的な侵 入が可能となり、その結果殺菌作用が時には溶血を伴うこともある。

このような殺菌剤を血液産物又は移植組織の外側部分に使用するような示唆が行 われれば、アリガーの発表に基づいて、そのような示唆は多分却下されるだろう 。殺菌剤が血液細胞、血小板、又は移植組織に侵入してそれを損なうことが予想 されるためである。

私の発明は３種類の組織、即ち細胞性血液成分、非細胞性血液成分又は血漿、及 び眼の構成要素と関係している。ここで簡単にこれら３つについて、その他との 対比を明確にするために説明する。

細胞性血液成分に関しては、私の知るかぎり、今までに使用されたり示唆された りした殺菌剤はなかった。このような示唆が行われていれば、２つの理由によっ て無視されていたであろう。

その理由とはまず第一に、ウィルスを不活性化するのに充分強い殺菌剤は細胞成 分をも損なうであろうということ。もう一つの理由は、そのような強い化学物質 を使用すると、輸液する細胞成分に含まれる残留殺菌剤が輸液を受ける者にとっ て危険となる可能性があることである。

角膜及び２膜組織に関しては、上述のように、現在使用されている最も強い予防 物質は抗菌剤であり、これらでも効能に疑問がある。この微妙なコンテキストに おいては、抗菌剤でさえも効果は比較的弱いに違いないと理解されているかもし れない。

血漿処理に関しては、状況はもっと複雑である。細胞性血液産物の場合、今まで に殺菌剤は全く知られておらず、角膜の場合、弱い抗菌剤だけか知られており、 血漿の殺菌の場合、最低一つの良く効く殺菌剤が市販されている。

この物質とはβプロピオラクトンである。この分野ではこれは通常、分別に先立 って血漿を殺菌するのに使用されている。このような処理は、治療用免疫グロブ リン、第８因子、第９因子、及びその他の蛋白質の分離に使用されている。

しかし、βプロピオラクトンは発癌性物質であることが知られており、非常に危 険な可能性がある。実際に輸液される血液産物内にこの物質が多量に残留してい た場合、プロピオラクトンはＡＩＤＳ又は肝炎感染と同じ程度の危険を及ぼす可 能性がある。

本発明に関連したもう一つのもっと最近の開発−しかし血液成分の殺菌とはうま く関係付けられていなかったもの−は自動細胞洗浄器の導入である（例えば、Ｉ ＢＭのモデル２２９２細胞洗浄器）。この種の装置は赤血球、血小板、又は凝固 した血漿蛋白質を洗浄するビンなどのサイクルにかけるようにプログラムするこ とが出来る。機械はこれを大量生産ベースで非常に正確に行う。

しかし同時に、比較的少量ずつ個々に保存された細胞にこのような手続きを応用 することも出来る。特に献血が行われる時の“ユニット”といった単位で保存さ れる血液に応用することが出来、その際献血をプールするのに伴う様々な問題が 回避される。しかし、今までのところ細胞洗浄器は上述のようなウィルス汚染の 問題の軽減に何の役割も果たしていない。

このように血液成分の輸液、又は角膜や電膜といった器官又は器官の一部の移植 における有害物質の伝染を無くする或いは少なくするようなプロセスは今までの ところない。

５咀の車上ね 一定の血液成分のユニット−多分全血といった血液産物のニットも−及び角膜や 電膜といった移植組織のユニットは、現在入手出来る材料で安全かつ経済的に殺 菌することが可能である。私はそれを迅速かつ容易に行う方法を考案した。

血液産物の場合、私の方法は血液産物を収集バックに入れたままでも実施するこ とが出来る。角膜及び１膜（またはその一部）の場合、良く知っている外科的プ ロトコールをほんの少し変更するだけで実施することが出来る。

前述したとおり、本書では「血液成分」を特に赤血球、血小板、又は血漿を意味 するものとして使用している。また「血液産物」は単独の血液成分又は他の血液 成分との組合せで使用する血液成分を意味するものとして使用している。

血液産物は単に分離された成分又は成分の組合せであるかもしれない。或いは血 漿又はその他の媒体、又は興味があるかもしれないし、ないかもしれないその他 の物質が含まれることもあるかもしれない。

本書の目的のためにすでに定義したとおり、「有害物質」とは肝炎ウィルス、Ａ ＩＤＳウィルス、サイトメガロウィルス、又はエプスタイン−バーウィルスであ るかもしれない。しかし、この言葉を血液内にときどき見られる様々な微生物、 例えばＴａｎ０８（３）７１　ｃｒｕｚｉ　−中央及び南アフリカで多く検出さ れる−及び寄生虫をも含むように拡大して使うつもりである。実際、「有害物質 」は多数のウィルスの中の一つ又はその他の微生物である可能性もある。

この最後の文はもちろん大雑把なものであるが、後で分かるように、本発明の方 法は非常に強力な殺菌剤を使用することが出来るため、完全に正当化される。事 実、この方法はＡＩＤＳウィルスといった極めて耐性の高いウィルスやその他の 病原体を不活性化するのに充分強力な殺菌剤と共に使用することが出来る。

従って、本発明の方法をウィルス又は生医学に関連したウィルス様病原体の事実 上すべてを不活性化するのに利用することも可能であると考えられるかもしれな い。有害物質は上述の任意の物質又はその全ての組合せであることもあり得る。

ＷＭ！ｊＪＪ液成分 本発明の最初の具体化は、最低一つの細胞性血液成分から成る血液産物を処理し て、その血液成分の中にある有害物質の活性をなくするか大幅に低下させる方法 である。

本発明のこの最初の具体化自体には最低３つの手段が含まれる。最初の手段は殺 菌剤を細胞性成分含有血液産物に加えることである。

次に行われる２番目の手段は、殺菌剤を一つ又は複数の興味細胞性成分から分離 することである。即ち、赤血球、血小板、又はそれらの組合せから分離すること である。２番目の手段の後に行われる３番目の手段は、一つ又は複数の細胞性血 液成分を有益な使用のために提供することである。

広く考えたこの発明の好適実施例は以下で述べる。しかしこの時点では、興味成 分が細胞性である場合に特に興味のある一つの点を指摘しておこうと思う。

即ち、分離手段を自動又は半自動細胞洗浄器で成分を洗浄することによって行う ことである。この洗浄は、殺菌剤濃度が無視できるほどのレベルに低下するまで 行うべきである。

−°一 本発明の２番目の具体化は、血液産物を有益利用するための準備として、ウィル スの感染性を低下させる方法である。従ってこの具体化は最初の具体化とは異な り、細胞性である血液成分のみには限定されない。

本発明のこの２番目の具体化には最低４つの手段が含まれる。最初の手段は（１ ）有機酸、（２）溶解したときに水溶性カチオンを出す化合物、及び（３）殺菌 剤を血液と等浸透圧にする希釈媒体という３つの成分から成る殺菌剤の選択・調 製である。この用語の一部は後で例を用いて明確にする。

２番目の手段は赤血球、血小板、及び血漿から構成されるグループから選択した 最低一つの血液成分を構成する血液産物を、存在する可能性があるウィルスを不 活性化するのに充分な時間だけ殺菌剤に露出させることである。

最初の２つの手段の後に行われる３番目の手段は、殺菌剤を血液成分から分離す ることである。３番目の後の４番目の手段は、細胞性成分のところで定義したよ うに、血液成分を有益利用のために提供することである。

広く一般的に概念化した本発明の全ての具体化に関係した一定の改良点について は、前述のように以下で述べる。しかし、興味成分に血漿そして血漿内のタンパ ク質が含まれる場合に特に重要であるその一部はここで述べておく。

この場合、分離手段に従来通りの方法での血漿タンパク質の沈澱が含まれる。だ が特に、殺菌剤と存在するその他の物質のすべてを除去するように注意しながら 沈澱する必要がある。この沈澱は一般に８０％以下の濃度の硫酸アンモニウム又 は同様の沈澱剤と接触させて行うのが望ましい。

沈澱の後の手段は比較的少量の生理食塩水へのタンパク質の再懸濁と、それに続 く比較的多量の生理食塩水を用いた徹底的な透析である。この透析によってタン パク質は殺菌剤、沈澱剤（例、硫酸アンモニウム）、血液と等張の希釈剤、及び 存在するかもしれないその他の物質から分離される。

透析は血液産物処理分野でよく知られているように、半浸透膜における浸透性分 化によって行われる。これは一般に最高４８時間行うべきである。透析手段は殺 菌剤（及び沈澱剤、塩など）の濃度を無視出来るレベルまで効果的に低下させる 。

透析手段の代わりに高速遠心分離を行ってもよい。高速遠心分離の後には上澄み を廃棄し次に洗浄を行うべきである。このプロセスは適宜繰り返してもよい。

次に、次の供給ステップに使用できるようにタンパク質を普通の生理食塩水で再 構成する。

急腺区僕零腺 本発明のこの３番目の実施例は、角膜又は順を処理し、組織内のウィルスの活性 をなくすか大幅に低下させる方法である。この方法には最低４つの手段が含まれ る。

最初の手段は、（１）そのようなウィルスの活性をなくす力吠幅に低下させるこ とが出来る殺菌成分、及び（２）殺菌成分による角膜の溶血を抑止する物質から 成る殺菌剤の選択・調製である。

２番目の手段は角膜又は２膜（又はその一部）の殺菌剤への露出である。前に述 べた実施例の場合と同じく、どれも本発明の範囲内にある様々なバリエーション の任意の一つで、この２番目の手段を最初の手段とオーバーラツプさせて行うこ とも出来る。

最初の２つの後に行う３番目の手段は角膜又は２膜から殺菌剤を分離することで ある。

３番目の手段の後に行う４番目の手段は、組織を角膜又は２膜移植として使用す るために提供することである。

角膜及び２膜に対する発明のこの実施例の場合、３番目の手段に通常の生理食塩 水への組織の浸漬とリンスの手続きが含まれる。浸漬及びリンス（希望すれば撹 拌しながら）は組織内に検出可能な濃度の殺菌剤が含まれなくなるまで行う。

兄■９好週実施例 発明の３つの実施例を説明する際、「有益利用」という言葉を使用した。多分こ れの最も一般的な形は治療向は利用であろう。しかし、本発明は治療向は利用だ けに限られるものではなく、診断及び研究・実験への利用も考えられる。

以下では最も一般的或いは最も広い形での本発明の３つの実施例を説明する。し かし、本発明の利点を最大限に引き出すために、上述しなかった一定の有利な詳 細手段によって方法を実践することが望ましい。

例えば、最初に指摘した実施例の露出手段（細胞性血液成分に関係した）の前か それと関係する殺菌剤の選択又は調製では、殺菌成分と溶血抑止物質から成る殺 菌剤を選択又は調製することが望ましい。露出手段で使用するのはこの殺菌剤で ある。

また、選択又は調製手段では、血液と等浸透圧の殺菌剤を選択又は調製すること が望ましい。即ち、これは、溶血抑止物質として血液と等浸透圧の物質を使用す ることが望ましいことを意味する。

（私はこれらの２つの好みを私の発明の中で最初に述べた実施例の改良点と見な しているが、これはすでに述べた２番目及び３番目の実施例の肝要部分として認 識されるであろう。従って、ここの説明は３つすべての実施例と関係している。

）容易に手に入るそのような血液と等浸透圧の物質には通常の生理食塩水がある 。即ち０９％、ｔ３化ナトリウム液である。他には５％グルコース液が考えられ る。

希釈液としては通常の生理食塩水を、殺菌剤としては亜塩素酸ナトリウム及び乳 酸を使用することが望ましい。

化学的には亜塩素酸ナトリウムは、多分、亜塩素酸と関わる中間段階を介して水 中で二酸化塩素を放出すると理解されている。水の代わりに通常の生理食塩水を 使用しても、二酸化塩素の生成には影響がないと思われる。

実際、生理食塩水からの追加の自由塩素イオンは、多分、殺菌剤が作用する環境 を拡大するであろう。そうであれば、私の殺菌剤と希釈液の組合せは、溶血抑止 力においても殺菌力においても、希釈液として水だけを使用するというメーカー 推薦の組合せよりも優れているであろう。

このような殺菌力の増加が実際に起これば、それは本発明で希釈液として通常の 生理食塩水を使用することによって追加の利点が得られることを意味する。同じ 様なデュアル効果は、上述と同じ原理で作用する殺菌剤及び血液と等浸透圧の希 釈液のその他の組合せによっても得られるかもしれない。

換言すれば、乳酸、亜塩素酸ナトリウム、そして通常の生理食塩水の組合せのよ うなその他の組合せも、イオン群の発生において内部補足的であるかもしれない 。

前述のアリガー（Ａｌｌｉｇｅｒ）の特許、第３１，７７９号には、二酸化塩素 遊離物質としては亜塩素酸ナトリウムが好ましいが、「その他の水溶性カチオン 」を代用することも出来ると示唆している。これとの関連で、カリウムのような その他のアルカリ金属及びアルカリ土類金属も提案されている。

さらに、これもアリガー（Ａｌｌｉｇｅｒ）が指摘したように、乳酸の代わりに その他の有機酸−出来れば類似の構造の−を使用することも出来、乳酸をその他 の酸（有機酸又は無機酸）との組合せで使用することも出来る。列挙された有機 酸としては酢酸、クエン酸、ソルビン酸、フマル酸、及びタンニン酸があり、無 機酸としては硫酸、塩酸、及び燐酸がある。

しかし、通常の生理食塩水と同じ浸透圧効果をもつ化合物のように、これ以外に も多くの同じ様な希釈剤がある。

特に一般的な塩はアルカリ金属とハロゲンの塩である。従ってその他多くのアル カリ金属−ハロゲン塩、及びもつと一般的な金属−ハロゲン塩は専業者ならば容 易に思いつく塩である。このような塩にはカルシウム、カリウムといったその他 のアルカリ金属の塩、及びマグネシウムといったその他の金属一般の塩が含まれ る。またフッ素やヨー素といったその他のハロゲンで出来た塩も含まれる。

フッ化カルシウム、塩化カリウム、臭化マグネシウムなどはどれも候補者として 上げられるように思われる。勿論、殺菌する血液成分との互換性があればである けれども。どの候補も次の分離手段に対する反応性について調べなければならな い。

処理された組織には、稀に、殺菌剤が少量残留していることがある。このような 残留物は望ましいことではなく、本発明の好適実施例においては、本書の様々な 箇所で述べているとおり、これを注意深く回避すべきである。

それにもかかわらず、微量の残留物が存在するリスクはゼロにはならない。この ような事態に対しては、候補者の殺菌剤と希釈液の組合せが輸液後のヒトの血液 と互換性があるかどうかを評価することが有用である。

例えば、微量の乳酸及び亜塩素酸ナトリウムは−特に前述の細胞壁親和性のため に−多くの細胞内に広く拡散し、そこで微量が吸収される可能性がある。このよ うな残留物はこのような特定の細胞にダメージを与えるかもしれない一方、その ダメージはこれらの特定の細胞の損失だけに限られるかもしれない。また同時に 、残留物はプロセスの中で消耗又は事実上代謝される可能性もある。

このようなモデルは、観察される発癌性特性から、物質がシステム内で広く拡散 せず、簡単な相互作用的吸収プロセスを妨害する傾向があることが予想される例 えばプロピオラクトンの動態に比べれば好ましい。従って、以下のパラグラフに ある原理は、候補である殺菌剤と希釈剤の組合せが、大きな害をもたらすことな く移植又は輸液の受け手の身体内に拡散するかどうかを評価すべきであるという ことである。

しかし、本発明の好適実施例は、血液と等浸透圧の物質としての金属−ハロゲン 塩の使用に限られず、化学の専業者ならばよく知っているその能様々な物質を使 用することが出来ることが理解できる。血液と浸透圧が同じで、残留する程度が 微量ならば有害でなく、特に補足的な殺菌成分と組み合わせた時に効果的なその 他の物質に代えるだけでその主張を迂回するつもりはない。

本発明の選択又は調製手段は、様々な化学成分を様々なオーダーの中のいずれか で組み合わせることによって行われるであろうことも強調しなければならない。

例えば、市販するには非常に魅力的であろう一つのアレンジでは、塩が販売用の パッケージングのために殺菌剤と予め混合されるかもしれず、このすでに混合し たものを使用時点で例えば蒸留水（又は滅菌水）によって希釈することになるか もしれない。

これらの様々なシーケンスを考える上で重要なことは、希釈のために水を加える ことによって、その結果の混合物が血液と等浸透圧になることである。市販とい うことを考えなければ、どのシーケンスを採用するかは本発明の好適実施例にと って全般的に重要ではない。

換言すれば、予め混合された生理食塩水を殺菌剤に加えてもよいし、塩を殺菌剤 と予め混合しておいてあとで水を加えてもよいし、或いは塩の一部を殺菌剤と一 部を水と予め混合しておいてもよい。以下のような条件が満だされれば、どれを 選択するかは重大ではないと思われる： まず第一に、前述のように、混合物は血液と大体浸透圧が同じでなければならな い（或いは殺菌する組織と大体浸透圧が同じでなければならない）。第二に、下 記で説明するとおり、調製及び浸漬手段はある程度オーバーラツプするかもしれ ないが、一般に浸漬手段の前には最終的に正しい割合を達成しなければならない 。第三に、塩と殺菌剤を予め混合する場合、塩は水が存在しないところで殺菌剤 と互換性がなければならない。

より一般的には、本発明の好適実施例は次のことから構成される。

（１）血液と大体浸透圧が同じ物質で殺菌成分を希釈する；或いは（２）溶血抑 止剤を含む物質を水で希釈する；或いは（３）以上の２つ。

さらに、浸漬手段は選択又は調製手段のあとに行うのが多分最も自然で信頼性が あるけれども、この２つの手段を様々な方法でオーバーラツプさせることも可能 である。どれも本発明の中に含まれている手段である。

例えば、まず組織（血液産物又は移植組織）を希釈剤の中に入れ、次に有機酸と カチオン提供化合物を一緒に組織と希釈剤の中に加えることも出来るであろう。

組織が酸及び化合物の高濃度部分に露出されないようにするために、これは混合 しながら行うことが望ましい。さらにまた、次のことも可能である：は −まず血液産物を希釈剤とカチオン提供化合物の混合物の中に入れ、次に酸を加 える；又は 一生化学処理に熟練した人にとってはもう明らかであろうこれらのシーケンスの 様々な組合せの一つを行う。

簡単に言えば、殺菌剤と溶血抑止剤含有物質の混合物の調製を、身体組織浸漬プ ロセスに統合することが出来る。実際、最初に混合を行っておいて次にその混合 物の中に組織を浸す代わりに、殺菌剤と溶血抑止剤含有物質の混合物を輸液又は 移植する身体組織の周辺で調製することも出来る。

ｒＬＤＪのような殺菌剤の通常の生理食塩水との希釈比率は１：２〜１：２００ ０とすることが出来る。浸漬手段の中に、ＩＢＭ細胞洗浄器のような自動又は半 自動装置に殺菌剤を入れる手段を含めるとなお良い。

更に、浸漬手段と分離手段の間で、殺菌剤を長時間組織と接触させることが望ま しい。

長時間という言葉で私は最低５秒間という時間を表している。しかし、通常の検 査室条件下では、この時間は３０分を越える必要はない。

実際的な問題として、私は接触「維持」時間を約１分〜７分にすることを好む。

この接触時間は、不要な遅延なしに発明の利点を得るのに充分な時間であるよう に思われる。

しかし、この時間は化学のよく知られた原理に従って調整し、冷蔵しながら又は 加熱しながら組織の処理を行ってもよいことは理解できる。温度露出目体から又 は温度と殺菌物質の組合せから組織がダメージを受けないように、低温又は高温 を使用する際には注意しなければならない。

私は維持手段において組織を殺菌剤と一緒に振るか撹拌することを薦める。これ は反応の完了を強化し、反応の完了をいくらか早める。

一般に血液産物の場合、細胞性血液成分との関係で最も重要であるが、私は分離 手段を血液産物を自動又は半自動細胞洗浄器で洗浄することによって実施するこ とを薦める。この洗浄は殺菌剤濃度が有意でないレベルに低下するまで継続すべ きである。

この手続きは実用的で有用で簡単でかつ経済的である。その利点としては特に、 前述の有害物質か輸液や組織移植において伝染するのが無くなる、又は少なくと もそういう可能性が非常に低下するという点が上げられる。

特に、希釈剤として通常の生理食塩水又はそれと同等のものを使用することによ って、溶血を防止するか大幅に抑止することが可能であり、それによってこのプ ロセス発明は組織にとって有害でなくなる。

特に、このプロセスは血液内に存在し正常な又は健康な血液成分活性のインディ ケータとして認識されている一部の物質を実質上無傷にしておくことを確認して いる。これらの確認については、本書の後の方のセクションで説明する。簡単に 言えば、本発明の方法は、血液成分にダメージを与えることなく血液成分を殺菌 することである。

以上の説明において、また本書の他の部分において、輸液するための血液成分、 及び移植するための角膜、２膜、又はその他の組織を言うのに、簡単に「組織」 という言葉を使用している。簡略にするためだけにこうしているにすぎず、本発 明の様々な実施例がその他の実施例と同じか同等である、又はそれをも含むこと を示唆するものと誤解してはならない。

以上で説明した本発明の操作原理及び利点のすべては、以下の詳細説明を読むこ とによってさらに完全に理解されると思われる。

本発明の好適実施例では、次のようにヒト血液の一定成分を殺菌する。まず、そ れが望ましい場合は、細胞性血液成分を血漿及び血漿の一部又は凝固因子やグロ ブリンなどのタンパク質から分離してもよい。

しかし、これを行わなくても、特定の興味成分には全く影響がない。せいぜい分 離されない血漿及びその一部が廃棄されるだけである。さらに、ここで説明した 本発明の改良によって、殺菌プロセスを通してその他の部分（殺菌するしないに かがわら豹は保存するではすでに触れた。溶液は様々な濃度及び様々な方法の一 つで調製することが出来る。

例えば、レビー（Ｌｅｖｙ）の論文又は上述のアリガー（Ａｌｌｉｇｅｒ）の特 許で示唆されている様々なアプローチに従って溶液を調製することも出来るし、 或いは市販されている殺菌剤ＬＤｔｍのラベルにある指示に従って調製すること も出来る。しかしこれらのアプローチや指示は、本発明の内容に合うよう、別の 箇所で指定したとおり、蒸留水希釈液の代わりに血液と浸透圧が同じ希釈液を使 用するよう変更しなければならない。

例えば、殺菌液はまず最初の段階で０２３パーセントの亜塩素酸ナトリウムと１ ．２６バーセントの乳酸から成る液を１＝１０に希釈し、次に第二段階として通 常の生理食塩水（即ち０．９パーセント塩化ナトリウム水溶液）で１　：２００ に希釈し、最終的に１：２００またはそれ以上に希釈することが出来る。

或いは、露出時間を適切に調節することによって、ｌ：１０希釈度の溶液を使用 することも可能である。しかし一部の目的のためには、この強さは過度或いは不 要であるかもしれない。本発明の範囲内では１：２〜１：２０００という広い希 釈範囲を使用することが出来ると思われるが、すでに述べたように私はｌ・２０ ０を薦める。

赤血球の収集と保存の標準手続きでは、まず細胞を遠心分離によって分離し、次 に通常の生理食塩水で洗浄する。このような手続きでは、細胞はすでに生理食塩 水の中にあるため、赤血球に対して本発明を実践する便利な方法は、洗浄を始め るとき、又は洗浄が完了したときに、赤血球と生理食塩水の混合物の中に比較的 高濃度の殺菌液を加えることであるかもしれない。

このような追加は徐々に行うべきであり、赤血球と生理食塩水を混合したところ に追加すべきである。細胞の一部が多量の強い殺菌剤に露出するのを最小限にす るには、このような注意を行うだけで充分なはずである。

赤血球に関してもう一つ考えられる方法は、生理食塩水に代えて殺菌剤と生理食 塩水の混合物を使用すること以外、通常の洗浄手続きを行うという方法である。

どちらにせよ、殺菌は細胞がオリジナルの収集バック、より大きなバック、又は その他の容器の中にあるときに行うことが出来る。

私は大型のバックを使用することを薦める。これによって殺菌剤の量がバックの 量の半分以下になり、殺菌剤と細胞の総量がバックの総量よりもかなり少なくな る。ここでのポイントは、細胞が殺菌剤に過度に露出されないように、又すべで の細胞が適度に露出されるように、充分な量を用いて徹底的かつ効果的な混合を 行うことである。

血小板はこれとは対照的に、通常、血液処理に使用される標準的な手続きでは洗 浄されない。しかし、現在の目的のためには、赤血球に使用する上述の手続きの いずれかを用いて血小板を使用することが有益である。

血漿蛋白質の処理と分離の手続きはすでに説明した。角膜及び１膜組織を処理す る一般的な手続きについても概略は説明しであるが、殺菌アレンジを収穫、栄養 、及び外科環境の特殊なニーズと状況に適応させなければならないことはご承知 のとおりである。

血液産物を殺菌剤に露出させたあとは、成分から殺菌剤を除去する。除去は自動 装置を用いた又は用いない洗浄によってうまく行える。

赤血球又は血小板の洗浄には自動細胞洗浄器（例、ＩＢＭ　２２９２細胞洗浄器 ）を使用すると便利であろう。洗浄器には標準的に使用される希釈率の２００倍 までの希釈率をプログラムすることが出来る。

洗浄器はまた、殺菌剤と成分との混合を数秒、出来れば数分行うようにプログラ ムすることも出来る。また、そのあと自動的に成分を洗浄するようにもプログラ ムすることが出来る。

自動化によって私の発明の有用性は増す。自動化により、赤血球、血小板、及び 血漿蛋白質の洗浄を迅速に行うことが出来、発明を生産規模で実践することが出 来るからである。

殺菌剤の成分及び殺菌時間は、本発明の範囲及び精神から外れない範囲内で変更 してもよい。

もっと具体的に言えば、亜塩素酸ナトリウム及び乳酸の殺菌液は、Ａｌｃｉｄｅ 　ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからＬＤｔｍという商標で販売されている。この物質 は“ベース”と“アクティベーター”という２つの部分に分けて販売されている 。これらの物質は亜塩素酸ナトリウムと乳酸を含んでいると理解されている。

この２つの部分をメーカーの指示に従って希釈液と混合するが、その際一つの重 要な例外がある。それはメーカーが指定している蒸留水の代わりに通常の生理食 塩水を使用することである。これによってＬＤベースと通常の生理食塩水が１： １０の割合で混合される。次にアクティベーターをＬＤベースと同じ量だけ追加 して、通常の生理食塩水で更に希釈し、最終的な希釈度を１２００とする。

最終的な殺菌液では、亜塩素酸ナトリウムと乳酸の濃度はどちらも１パーセント 以下になる。溶液のｐＨは４〜６にするのが望ましい。

２、組織の生存 この溶液で処理した血液成分は処理後も無傷で活性を維持していると判断した。

この判断は本書の「背景」の部分ですでに指摘した２つの理由により、決して自 明ではない。まず一つは、私の知るかぎり、今まで上述の殺菌剤が輸液又は移植 する身体組織に応用されたことは聞いたことがない。

第二に、特許がある殺菌剤“ＬＤ″には細胞侵入力があるが、これによって熟練 者は血液産物又は移植組繊細胞が侵害されると考えるだろうことである。実際、 問題の殺菌剤をメーカーの指示に従って調製した場合、この問題は実践において 確認されている（或いはサビン（Ｓａｖｉｎ）らによって説明されている）。

もっとはっきり言えば、殺菌剤をメーカーの指示どおりに調製してヒト赤血球に 使用した場合、溶血が起こる。血小板に使用した場合、血小板の崩壊が起こる。

これらの結果はどちらも実験によって直接確認されている。

“ＬＤ”殺菌剤を同様に調製して、角膜、宋膜、及び同様のデリケートな組織に 使用した場合、少なくとも上皮又は内皮の損傷が起こるであろう。光の透過と反 射が重要な機能である角膜組織の場合、表面が損傷しただけでも角膜組織全体が 役に立たなくなる。

同様に、私の知る限り、上述のＬＤｔｍ！菌剤を血漿に応用することについては 今までに言われたことがない。しかしこの殺菌剤をメーカーの指示に従って調製 し、血漿に応用すれば、血漿蛋白質の変成が起こるであろう。

ここで述べている３つの中で最も貴重であり最ももろい成分は赤血球だと思われ る。従って、処理後も赤血球の有用性が持続することを示すことが最も重要であ り、私の最初の実験は赤血球を用いて行った。

３、赤血球の生存 Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓから提供された赤血球ユニットからの赤 血球アリコート２つを通常の生理食塩水で３回洗浄した。これらのアリコートの 一つは“ＥＸＰ”　（実験）とラベルした容器に入れた。

約３分の１まで満ちていたこの容器に容器が一杯になるまで上述の殺菌剤を加え た。容器の中身を混合し、混合物を約１０〜５０秒放置した。

次に細胞を通常の生理食塩水で４回洗浄し、通常の生理食塩水の中に再懸濁させ た。殺菌した細胞を肉眼で注意深く観察したところ、溶血の形跡は見られなかっ た。

赤血球の対照アリコートを同じように、即ち、通常の生理食塩水で洗浄した。但 し殺菌剤は加えなかった。対照にも溶血はな力じた。

殺菌剤で処理した赤血球にまだ生存能力があり、従って輸液に適しているかどう かをさらに詳しく調べるために、下記のような分析を行った。そこで詳しく述べ ているように、殺菌−５赤血球の２つの代表的な成分の酸素輸送能力と酵素活性 はどちらも事実上損なわれていないことが分かった。

これらのいくつかのテストに基づき、本プロセスの完全性は確立されたと考える 。通常の生理食塩水で洗浄したあとは、赤血球は前述の様々な有害物質及びその 他の有害物質を伝達しない、輸液に適したものになる。

殺菌し洗浄した細胞を約４℃で数日間生理食塩水に入れて保存し、グルコース、 無機燐、カリウム、及びマグネシウムの溶液の中に入れて３７℃で培養した。

次に細胞を２，３ＤＰＧ及びＡＴＰについて分析した。これらの分析で使用した 方法については、エイ・ニス・キース（Ａ、Ｓ、Ｋｅｉｔｈ）による［２，３ジ ホスホグリセリン酸の還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド結合分析：分 光光度法及び蛍光測定法（Ｒｅｄｕｃｅｄ　ｎｉｃｏｔｉｎ−ａｍｉｄｅ　ａｄ ｅｎｉｎｅ　ｄｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−１ｉｎｋｅｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏ ｆ　２．３　ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃ■窒奄メ@ａｃｉｄ：ｓｐｅｃｔｒｏ − ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　ａｎｄ　ｆｌｕｏｒｏｖｔｒｉｃ　ｐｒｏｃｅｄｕｒ ｅｓ）Ｊ　Ｃジェネラル・ラボラトリ−°クリニカル・メディスン（Ｇｅｎｅｒ ａｌ　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、）７７．４７０ページ（＋９７１）：ｌ 　、ウオレ・ンク、グリユーバー、及びバーブマイヤ−（Ｗｏｒｅｋ　、　Ｇｒ ｕｂｅｒ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ）による「アデノシン５′三燐酸、３− ホスホグリセリン酸塩キナーゼを用いた測定（Ａｄｅｎｏｓｉｎ、　５’、　ｔ ｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ。

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔ ｅ　ｋｉｎａｓｅ）　Ｊ　［エイチー１−ｅバーブマイヤー（Ｈ，ｔｌ、Ｂｅｒ ｇｍｅｙｅｒ）の酵素分析法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎ ａｌｙｓｉｓ）　４．２０９７ページ、m、Ｙ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９７４）］を参照されたい。

筋肉やその他のソースからのモノホスホグリセリン酸塩ムターゼの組織標本に２ ．３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＣ）ホスファターゼ活性があることは、何人 もの研究者が指摘している。ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）とその同僚は、脳組織の酸 抽出物内の非常に低レベルの２．３−ＤＰＧを測定するためにこの存在を活用し た。

彼らは蛍光測定法を用いてホスファターゼ活性の産物である３−ホスホグリセリ ン酸（３−ＰＧＡ）を測定した。ローリ−のグループは還元ニコチンアミドアデ ニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）結合反応を利用した。

その反応では３−ＰＧＡはホスホグリセリン酸塩キナーゼ（ＰＧＫ）とグリセル アルデヒド３−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）によって化学式どおりにグリ セルアルデヒド３−燐酸に変換された。私はこの蛍光測定法を赤血球内のもつと 高濃度の２．３−ＤＰＧを測定するように改良した。

ローズ（Ｒｏｓｅ）は、赤血球では２．３−ＤＰＧホスファターゼがピロ燐酸塩 と２−ホスホグリコール酸の両方によって刺激されることを報告している。これ は筋肉ＰＧＭのホスファターゼ活性にも見られる特性である。彼女は２−ホスホ グリコール酸塩とＰＧＭを使用して、形成された３−ＰＧＡを乳酸に変換して２ ．３−ＤＰＧを分析する分光光度分析法を考案した。

ここで説明する２、３−ＤＰＧの蛍光測定法及び分光光度分析法は、非常に多様 性及び信頼性が高いと証明された方法である。これはローリ−（Ｌｏｗｙ）と同 僚、ローズとリーボウイツツ（Ｒｏｓｅ　ａｎｄ　ＬｉｅｂｏｗｉｔＺ）　、及 びチｉｉ−／りとエカート（Ｃｚｏｋ　ａｎｄ　Ｅｃｋｅｒｔ）の方法を合成し たものである。

材料損よび方法 イミダゾール（３級）、還元形グルタチオン（ＧＳＨ）、硫酸上ドラジン液（Ｎ ｏ、　７５０−３）、および２−ホスホグリコレートを入手した。蒸留水は、水 の螢光を大幅に低減した混合床脱イオナイザに通した。

試料の調製：慣習に従って、全血１容量を水冷した６％（Ｗ／Ｖ）過塩素酸（Ｐ ＣＡ）　２容量に加え、十分に混合した後、少なくとも１５分間氷の上に放置す る。摂氏２度にて２０分間、２７．０００　Ｇで遠心分離にかけて茶色の変性タ ンパク質を分離する。その後、２Ｍ）０（ｃｏ２約１７６容量で澄明な上澄み液 を中和する。

吸光光度分析：すべでの試薬を原液として調製し、冷凍保存する。ただし、イミ ダゾールとヒドラジンは室温にて保存する。３４０ミリマイクロで１センチメー トルのバス長をもつ水晶の超微細キュベツトに入れ、自動記録スペクトロフォト メータにおいて２４℃〜２８℃（温度調整せず）にて反応が起こす。

通常の全血については、中性のＰＣＡ抽出液（１／１０　ミリリットル）を反応 混合液１ミリリツトルアリコートに添加する。抽出液の量は反応混合液に影響を 与えずに３７１０ミリリツトルまで増加することができる。

Ｇ３ＰＤとＰＧＫ　（４マイクロリツトル中）の混合液を、３−ＰＧＡおよび１ ．３−ＤＰＧのすべてが反応した後に（通常検出不可能）添加し、ＰＧＭ　（５ マイクロリツトル）で３４０ミリマイクロの吸収を測定する。反応は通常１５分 から２０分で終了するが、ＰＧＭのロットが異なるとホスファターゼの活性が少 し異なるため、別の新しい試薬についてもこれを測定すべきである。

ブランク・キュベツトにはＰＣＡ抽出液ではなく蒸留水を入れる。ＰＣＡ抽出液 を含有するが酵素は含有しないブランクは通常どれも同じであるが、定期的に確 認すべきである。２−メルカベタノールをＧＳＨに置換すると、全血の中和ＰＣ Ａ抽出液の存在により酵素を追加しなくとも散発的に高いブランク（１０分当た り０．０３〜０．０４０．Ｄ、単位）力絹己茅された。

螢光分析：試料のヘモトクリットに従ってＰＣＡ抽出液の試料サイズを決定する （２〜３マイクロリツトル）。同様に選択した微量ピペットを使って、試料およ び標準液を添加する。反応は５分で終了する。

計算：吸光係数をＮＡＤＨＩミリモル当たり６，２２０．Ｄ、単位とし、ＰＧＭ 添加前後の３４０ミリマイクロ吸収における相違を測定することによって、２． ３−ＤＰＧの濃度を割り出す。値を試薬ブランクに照らして修正する（通常０． ０１００．Ｄ、単位以下）。螢光分析では、ＮＡＤＨの螢光変化を、吸光光度分 析により標準化した２、３Ｄｅｆ液のそれと比較する。

２．３−ＤＰＧの初期濃度が当該のＮＡＤＨのそれに近づくと、ヒドラジンが存 在しないため直線性に有意なバラツキが生じる。２　、３−ＤＰＧから無機リン 酸を義務的に遊離させると、１．３−ＤＰＧとＧ−３−Ｐの最終比率に悪影響を 及ぼす。Ｇ−３−ＰはＮＡＤＨを過度に用いない限り、ヒドラジンでトラップし なければならない。

ヒドラジン液の力価は定期的に確認する必要がある。これは標準曲線に照らして 直線性を調べることによって確認することができる。

螢光分析のハーフタイムは通常１分以下である。この分析方法は非常に感度が高 いため、血液の保管中またはｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験など、非常に低濃度の２．３ −ＤＰＧを測定するのに使用される。分析の精度は、微量ピペットの品質、取扱 う技術者の技能に大きく左右される。

特異性：ＰＧＭをシステムに添加すると、２．３−ＤＰＧと２−ＤＰＡは共に３ −ＰＧＡに変換する。通常の血液では、２−ＰＧＡの濃度は２　、３−ＤＰＧの ３００分の１であるため無視できる。しがし、多くの組織に見られるように、こ れらの化合物がほぼ同程度の濃度で存在する場合には、区別する必要がある。

３−ＰＧＡが反応した後にホスホグリコレートなしにＰＧＭ（１ミリリツトル当 たり５ミリグラム）を添加して、２−ＰＧＡ含量の概算を算出するために分析方 法を修正することができる。

この場合、２．３−ＤＰＧは非常にゆっくり反応し、２−ＰＧＡは急速に３−Ｐ ＧＡに変換する。

ホスホグリコレートとのホスファターゼの選択的活性が２．３−ＤＰＧを測定す る。この修正には、通常組織に存在する低レベルの２−ＰＧＡで十分な感度でも ってＮＡＤＨを螢光測定することが要求される。

方法の利点 本方法の利点はいくつもある。もっとも重要な利点としては、率による分析では なく、「終点」による分析である。２．３−ＤＰＧ濃度を、ＰＧＭ反応に与える 接触効果と関連付ける分析方法には率の測定が含まれるが、これは分析条件が少 しでも異なると結果に大きな影響を及ぼす。

このような方法における「率」は、まず始め初期値を読んで、その後間隔を１回 置いてもう１度値を読んで直線性をめることが多いが、異なる試料間の直線性か らのバラツキは検出することができない。さらに、既知の純度の標準品について の検量線に従って計算が行われる。

一方、「終点」を利用した分析方法は、ブランクキュベツトを同間隔で読む限り 、終了後いつでも都合のよい時に値を読むことができる。計算は、吸光光度分析 によって測定するときはモルの吸光係数に基づいて行われ、検量線に従った計算 は行わない。

高感度が要求される場合は、螢光分析法を使用することができる。総リン酸およ びタロモトロブ酸方法と同様に、抽出材料の分画は不要である。

２−ＰＧＡの相互作用があるため絶対的とは言えないが、特異性は多くの赤血球 適用に十分応える。その場合、２−ＰＧＡの濃度は無視することができる。２− ＰＧＡ反応後、ホスホグリコレートによる２、３−ＰＧＡの選択的活性は、分析 の特異性を向上させることができる。

Ｇ−３−Ｐへの「後方」反応は、ラクターゼへの「前方」反応に比べ多用性があ る。３−ＰＧＡと２−ＰＧＡの濃度は、２　、３−ＤＰＧの濃度に比べて通常無 視することができる。

一方、ピルビン酸塩は、一定の試験条件下で有意に蓄積し、初期乳酸デヒドロゲ ナーゼ反応は多くのＮＡＤＨを消耗する。さらに、２．３−ＤＰＧが非常に低濃 度の場合、２−ＰＧＡ濃度の相互反応は、無処理赤血球の５〜１０倍の係数で２ −ＰＧＡの濃度を超える。

拮−里 温度後、殺菌赤血球（試験）のＡＴＰと２．３−ＤＰＧを無処理の赤血球のそれ と比較した。これら２つの酵素は、赤血球の移植の可能性および適応性の重要な 予言者と考えられている。

ＡＴＰと２．３−ＤＰＧを再生する能力には大きな違いはないように思われた。

結果を表１とＨに示す。２つの表は共に、リストした時間において殺菌、洗浄、 遅延冷却、および温度した後の濃度を表している。

洗浄は生理食塩水で行い、冷凍は上述したように摂氏４度にて行った。温度は、 グルコース、無機リン酸、カリウム、およびマグネシウムを補助として、摂氏３ ７度にて行った。

表ＩとＨに示した試験の大きな違いは、殺菌剤に浸漬した時間の長さにある。表 ■は前述したように殺菌期間が１分未満のものである。

表Ｈに示したデータは、４分の殺菌時間（殺菌手段を生き抜く赤血球の能力を調 べる過酷な試験）後に得たデータである。４分間の殺菌後、溶血の証拠およびＡ ＴＰの損失は一切認められなかった。

表Ｉ−１分未満の殺菌時間を含む前記処理後の赤血球成分濃度（ヘモグロビン１ グラム当たりのマイクロモル） ２　１．７９　０．９６　１，３４　２．８９４　１．１９　０　１．３４　０ 表ｎ−４分間の殺菌時間を含む前記処理後の赤血球成分濃度（ヘモグロビン１グ ラム当たりのマイクロモル） 従って、赤血球および他の２つの低感受性血液成分は、ここで説明した処理を行 った後においてもヒトの輸血に対して安全で適したものであると結論付けること ができる。これらの成分は、先に列挙した有害物質などを伝達するリスクがほと んどないか、もしくはまこの確認試験は次のように実施した。

新鮮な末梢血液を健康なドナーから採血した。血液はすぐに遠心分離器にかけて 赤血球と血漿を分離した。血漿は少量の赤血球（約０．５ミリリツトル）と−緒 に全部取り除いて、残留物質が新鮮な赤血球だけからできているようにした。

このようにして、赤血球の２つのアリコートを調製した。各アリコートをそれぞ れ同量の殺菌液に入れた。

この目的のために、２つの異なった殺菌液を調製した。１つは、これとは別の目 的のために殺菌剤を調製する従来の方法に従って調製し、もう１つは、本発明に 従って調製した。

従来の方法に従った殺菌剤は、まず１５．１％乳酸１容量を１０容量の滅菌水に 加え、これに乳酸と同量の２．７３％塩化ナトリウム液を加えて調製した。この 溶液は２５分間室温にて温度し、その後滅菌水にて１＝２０に希釈した。

同時に、もう１つの本発明による殺菌液は、滅菌水に代わって生理食塩水（０， ９％）を使った点を除いて同様の方法で調製した。

赤血球の２つのアリコートを各殺菌液に入れて室温にて１分間温置した。

従来方法による殺菌液を含有する混液においては、すぐに赤血球のリーシス（溶 解）が認められた。次にこの混液を遠心分離して目視検査した。遠心管の底に生 きた赤血球を認めることはできなかった。

本発明による殺菌液を含有する混液においては、リーシスは認められなかった。

この混液も次に遠心分離して目視検査した。上部の水相は遊離ヘモグロビンがな いことを示すものであり、赤血球自体は無処理の赤血球でよく見られるように遠 心管の底に移動した。加えて、この混液を吸光光度分析により測定した結果、遊 離ヘモグロビンが存在しないことがわかった。

４、血小板の生存 血小板を浸漬するための２つの溶液を調製した。１つは殺菌液であり、もう１つ は食塩水である。

殺菌液は、ＬＤ”ベース２ミリリツトルに冷却した生理食塩水２０ミリリツトル を混合して調製し、この混液を少なくとも１時間放置した。その後、ＬＤ”″活 性化因子２ミリリットルを加えて、４８０ミリリツトルの生理食塩水とした。

２本の管のそれぞれに単回共通単位の血小板を半分溝たした。１本の管の残り半 分には上述した殺菌液を満たし、もう１本の管の残り半分には食塩水を満たした 。

２本の管を振って、３分管放置した後、長時間高速で遠心分離にかけた。両方の 管から上澄み液を取り除いて、管内の内容物を生理食塩水で洗浄した。

このように処理した２つの試料と、同単位の血小板からなる無処理の試料をスラ イドに乗せて、血小板の形態について検査した。これら３つの試料間には血小板 の形態学的相違は認められなかった。

５、血漿タンパク質の生存 新鮮な末梢血液を健康なドナーから採血し、すぐに遠心分離にかけて赤血球と血 漿を分離した。血漿に赤血球が付かないような方法により血漿を取り除いた。

この血漿７５ミリリツトルを処理する試験試料とした。同様の２ミリリツトルの 対照アリコートを別に設定して無処理の対照とし、後に試験試料との分析に当て た。

殺菌液は次のようにして調製した。まず、１５．１％乳酸１容量を１０容量の生 理食塩水に加え、これに乳酸と同じ容量の２．７３％塩化ナトリウム溶液を加え た。次にこの混液を７５分間室温にて温置し、その後、生理食塩水に１＝２０の 割合で希釈した。

この溶液７５ミリリツトルを同量の血漿試験試料と混合し、この混液を５分間室 温にて温置した。

ｐＨ７，４の飽和硫酸アンモニウムを３７５ミリリットル加えて、血漿タンパク 質を沈澱させた。添加時、この溶液全体を氷の上に置いて摂氏４度の温度を維持 した。

このすべての材料を遠心分離した。遠心分離は、１０分間１３，０００　Ｇにて 実施した。

沈澱したタンパク質を７．５ミリリツトルの生理食塩水に入れて再懸濁させ、半 透透析バッグに移して、１２時間６リツトルの生理食塩水に対して涼しい部屋で 透析した。６す・ントルの生理食塩水は１２時間の間３度変えて、硫酸アンモニ ウムの痕跡を取り除いた。

処理した血漿試験試料と無処理の血漿対照アリコートの標準血清タンパク質電気 泳動を認可された臨床免疫試験所にて実施した。

電気泳動α−１、β、γのピークは、殺菌処理によりタンパク質が損失しないこ とを実証した。しかし、アルブミンはほぼ５０パーセント損失した。

アルブミンの損失は、殺菌液による損傷というよりも、沈澱時および遠心分離時 における不完全な回収が大きな原因であるようであった。その他の大型のタンパ ク質について実証されているように、遠心分離時間を長くとり、硫酸アンモニウ ムを多く添加すれば完全に回収できたかもしれない。

６、隔膜！Ｉｌ織の生存 予備試験において、血小板について上述した調製方法によって調製した殺菌液に 、特に１：２００に希釈した殺菌液にヒトの隔膜を１５秒間浸漬し、その後その 隔膜を生理食塩水で洗浄した。

隔膜の内皮を顕微鏡検査したところ、有意な変化は認められなかった。

以上の開示は単に典型的な例として捉えられるべきであって、本発明の適用範囲 を限定するものではなく、請求の範囲を参照して決定されるべきものである。

手続補正書防式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０３４４１ 平成１年特許願第５０９８１０号 ２、発明の名称 血液成分、角膜、及び掌膜組織の殺菌 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏　名　ルピンスタイン、アラン　アイ５、補正命令の日付　平成３年１０月２ １日（発送日　平成３年１１月５日） ６、補正の対象 ７、補正の内容 （１）別紙の通り 国際調査報告

Claims (63)

【特許請求の範囲】
1. １．不活性化のため、あるいは活性を大きく低減させるために、血液成分量にお いて有害物質である少なくとも１種類の細胞性血液成分を含む血液生成物を処理 する方法であって、血液生成物を殺菌剤にさらす段階と、その後で殺菌剤を細胞 性血液成分から分離する段階と、細胞性血液成分を有効利用する段階とを有する ことを特徴とする血液生成物の処理方法。
2. ２．浸漬前または浸漬時に、殺菌物質と溶血を抑止する物質から成る殺菌剤を浸 漬時の使用のために選択・調製する段階を含む請求項１記載の方法。
3. ３．血液との等張性が非常に高い殺菌剤を選択・調製する手段を含む請求項２記 載の方法。
4. ４．溶血を抑止する物質が血液と十分に等張する請求項２記載の方法。
5. ５．溶血を抑止する物質が、ハロゲンイオンからなる請求項２記載の方法。
6. ６．ハロゲンイオンが、塩素イオンからなる請求項５記載の方法。
7. ７．溶血を抑止する物質が、アルカリ金属イオンからなる請求項２記載の方法。
8. ８．アルカリ金属イオンが、ナトリウムイオンからなる請求項７記載の方法。
9. ９．溶血を抑止する物質が、アルカリ金属イオンとハロゲンイオンからなる請求 項２記載の方法。
10. １０．溶血を抑止する物質が、食塩、すなわち塩化ナトリウム液からなる請求項 ９記載の方法。
11. １１．溶血を抑止する物質が、ハロゲンイオンからなる請求項４記載の方法。
12. １２．溶血を抑止する物質が、アルカリ金属イオンからなる請求項４記載の方法 。
13. １３．溶血を抑止する物質が、アルカリ金属イオンとハロゲンイオンからなる請 求項４記載の方法。
14. １４．溶血を抑止する物質が、食塩、すなわち塩化ナトリウム液からなる請求項 １３記載の方法。
15. １５．血液と十分に等張する物質中に殺菌物質を希釈して殺菌剤を選択・調製す る手段を含む請求項２記載の方法。
16. １６．血液と十分に等張する物質が、アルカリ金属−ハロゲン食塩水である請求 項１５記載の方 法。
17. １７．アルカリ金属一ハロゲン食塩水が、食塩、すなわち塩化ナトリウムである 請求項１６記載の方法。
18. １８．溶血抑止物質を含有する殺菌物質を水に希釈して殺菌剤を選択・調製する 手段を含む請求項２記載の方法。
19. １９．殺菌物質に含有されている溶血抑止物質が、アルカリ金属−ハロゲン食塩 である請求項１８記載の方法。
20. ２０．前記食塩が、食塩、すなわち塩化ナトリウムである請求項１９記載の方法 。
21. ２１．殺菌物質が、酸、および溶解すると水溶性カチオンを呈する化合物からな る請求項２記載の方法。
22. ２２．酸が、有機酸である請求項２１記載の方法。
23. ２３．有機酸が、いくつかのカルボキシル基をもつ液体有機酸からなる請求項２ ２記載の方法。
24. ２４．水溶性カチオンを呈する化合物が、塩素化合物である請求項２１記載の方 法。
25. ２５．塩素化合物が、過酸化塩素塩である請求項２４記載の方法。
26. ２６．酸が、いくつかのカルボキシル基をもつ液体有機酸であり、溶解すると水 溶性カチオンを呈する化合物が、塩化ナトリウムである請求項２１記載の方法。
27. ２７．溶血を抑止する物質が、血液と十分に等張する請求項２６記載の方法。
28. ２８．溶血を抑止する物質が、生理食塩水とほぼ同等の濃度の食塩である請項２ ６記載の方法。
29. ２９．殺菌物質が、酸、および溶解すると水溶性カチオンを呈する化合物からな り、溶血を抑止する物質が血液と十分に等張する請求項２６記載の方法。
30. ３０．殺菌物質が、酸、および溶解すると水溶性カチオンを呈する化合物からな り、溶血を抑止する物質が、アルカリ金属−ハロゲン食塩水からなる請求項２記 載の方法。
31. ３１．浸漬前または浸漬時に、乳酸と塩化ナトリウムを生理食塩水に希釈して殺 菌剤を調製する段階を含む請求項１記載の方法。
32. ３２．浸漬前または浸漬時に、塩化ナトリウム約０．２３％と乳酸約１．２６％ の溶液として殺菌剤を調製する段階を含む請求項１記載の方法。
33. ３３．血液と十分に等張する媒体をさらに希釈する調製段階を含む請求項３２記 載の方法。
34. ３４．媒体を生理食塩水として、１：２から１：２０００の倍率で希釈する請求 項３３記載の方法。
35. ３５．細胞洗浄器のような自動または半自動装置に殺菌剤を入れて維持した後、 細胞洗浄器内で細胞性血液成分を洗浄する浸漬段階を含む請求項１記載の方法。
36. ３６．浸漬開始から取り除くまでの段階の間、約５秒から３０分間殺菌剤を産物 と接触させて維持する段階を含む請求項１記載の方法。
37. ３７．浸漬開始から取り除くまでの間、約１２秒から５分間殺菌剤を生成物と接 触させて維持する段階を含む請求項１記載の方法。
38. ３８．赤血球と血小板からなるグルーブから選択した少なくとも１種類の血液成 分からなる血液生成物内の微生物を不活性化する方法であって、血液生成物を自 動あるいは半自動の細胞洗浄器に入れて殺菌剤にさらし、装置内で殺菌剤を血液 産物と混合させ、その後、装置内で血液成分を洗浄して殺菌剤を取り除くことを 特徴とする血液生成物中の微生物の不活性化方法。
39. ３９．溶血を抑止する物質を含有する殺菌剤を加える浸漬段階を含む請求項５７ 記載の方法。
40. ４０．分離段階の前に、血液生成物の別の部分から少なくとも１種類の血液成分 を取り除く段階を含む請求項１記載の方法。
41. ４１．浸漬段階の前に、取除を行う請求項４０記載の方法。
42. ４２．血液と十分に等張する媒体内で赤血球を洗浄して分離する段階を含む請求 項１記載の方法。
43. ４３．ウイルスの感染能を低減し、有効利用できる血液生成物を調製する方法で あって、有機酸、溶解すると水溶性カチオンを呈する化合物、および殺菌剤を血 液と十分に等張させる希釈媒体からなる殺菌剤を選択・調製し、赤血球、血小板 、および血漿からなるグループから選択した少なくとも１種類の成分からなる血 液生成物を、存在するいかなるウイルスも不活性化するのに十分な時間殺菌剤に 浸漬し、その後、血液成分から殺菌剤を分離して血液成分を有効利用することを 特徴とするウイルスの感染能を低減する方法。
44. ４４．殺菌剤の濃度が認められなくなるまで、血液と十分に等張する媒体で血液 成分を洗浄して分離する段階を含む請求項４３記載の方法。
45. ４５．血漿を含む血液産物と共に使用して、血漿タンパク質を沈澱させて分離す る段階を含む請求項４３記載の方法。
46. ４６．硫酸アンモニウムで血漿タンパク質を沈澱させて分離する段階を含む請求 項４３記載の方法。
47. ４７．８０％以下の硫酸アンモニウムで血漿タンパク質を沈澱させて分離する段 階を含む請求項４３記載の方法。
48. ４８．血漿タンパク質をさらに再懸濁して分離する請求項４５記載の方法。
49. ４９．血液と十分に等張する少量の媒体に血漿タンパク質をさらに再懸濁し、そ の後、血液と十分に等張する多量の媒体に対し半透膜を使って徹底的に透析して 分離する請求項４５記載の方法。
50. ５０．ウイルスの感染能を低減し、有効利用できる血液生成物を調製する方法で あって、生理食塩水にそれぞれ２％以下の割合の乳酸と塩化ナトリウムの溶液か ら殺菌剤を調製し、赤血球、血小板、および血漿からなるグループから選択した 少なくとも１種類の成分からなる血液産物を、存在するいかなるウイルスも不活 性化するのに十分な時間だけ殺菌剤に浸漬し、その後、殺菌剤の濃度が認められ なくなるまで生理食塩水で血液成分を洗浄して血液成分を有効利用することを特 徴とするウイルスの感染能を低減させる方法。
51. ５１．角膜または撃膜組織においてウイルスの活性を大きく低減、すなわち不活 性化させる処理方法であって、ウイルスの活性を大きく低減させる、または不活 性化させることのできる殺菌物質と、殺菌物質によって隔膜または撃膜組織の溶 血を抑止する物質からなる殺菌剤を選択・調製し、隔膜または撃膜組織を殺菌剤 に浸漬した後、隔膜または撃膜組織から殺菌剤を分離して、隔膜または撃膜組織 を移植組織として使用できるようにすることを特徴とする角膜または撃膜の処理 方法。
52. ５２．血液と十分に等張する殺菌剤を選択・調製する請求項５１記載の方法。
53. ５３．溶血を抑止する物質が血液と十分に等張する請求項５１記載の方法。
54. ５４．血液と十分に等張する物質内で殺菌物質を希釈して調製する選択・調製段 階を含む請求項５１記載の方法。
55. ５５．溶血抑止剤を含有する殺菌物質を水に希釈して殺菌剤を調製する選択・調 製段階を含む請求項５１記載の方法。
56. ５６．殺菌物質に含まれる溶血抑止剤が前記水に希釈した後、血液と十分に等張 しうる媒体とする請求項５５記載の方法。
57. ５７．殺菌物質が、酸、および溶解すると水溶性カチオンを呈する化合物からな る請求項５１記載の方法。
58. ５８．酸が、液体有機酸で、溶解すると水溶性カチオンを呈する化合物が塩化ナ トリウムである請求項５７記載の方法。
59. ５９．浸漬前に、血液と十分に等張する媒体に乳酸と塩化ナトリウムを希釈して 殺菌剤を調製する請求項５１記載の方法。
60. ６０．浸漬前に、塩化ナトリウム約０．２３％と乳酸約１．２６％の溶液として 殺菌剤を調製する請求項５１記載の方法。
61. ６１．血液と十分に等張する媒体を、さらに希釈して調製する請求項６０記載の 方法。
62. ６２．媒体を生理食塩水として、１：２から１：２０００の倍率で希釈する請求 項６１記載の方法。
63. ６３．約５分未満の時間、隔膜または撃膜組織を殺菌剤に接触させたままに維持 して浸漬する請求項５１記載の方法。