JPH044868A

JPH044868A - 細胞培養基材およびそれを用いる細胞培養方法

Info

Publication number: JPH044868A
Application number: JP2105877A
Authority: JP
Inventors: Takehisa Matsuda; 武久松田; Hajime Kurumaya; 元車谷
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1990-04-20
Filing date: 1990-04-20
Publication date: 1992-01-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野コ本発明は、より生体内に近い状態で細胞を培養できる新
規細胞培養基材および細胞培養法を提示する。また、本
発明により得られる細胞は、ハイブリッド型人工臓器、
例えば人工皮膚、人工肝臓、人工血管などを作成する際
に用いることができる。

［従来の技術］生体外で細胞を培養し増殖させる、いわゆる細胞培養技
術は、研究室レベルから各種の生理活性物質の生産など
の工業的なレベルまでその利用か活発になってきた。株
化していない、いわゆる正常細胞は、普通その生育には
基材への接着を必要とする。このため細胞の生育に適当
な各種の高分子材料の開発が行なわれてきた。−例を挙
げると、組織培養フラスコやマイクロビーズなどが挙げ
られる。

しかしながら、従来の培養法は主として株化細胞や線維
芽細胞などに限られ、肝細胞などの高次の機能を有する
細胞を機能の低下をきたすことなく長期間維持したり、
細胞を増やすことは困難であった。また、細胞を基材上
で単層に生育させるものがほとんどであった。−例を挙
げると、ガラス、表面をグロー放電処理したポリスチレ
ン、あるいは適度の正電荷を有する多糖ビーズなどであ
る。これらの基材上では細胞は単層に生育し、基材の表
面全体を被覆した後、コンフレンドとな、って生育を停
止することが知られていた。

一方、培養細胞を三次元的に集合させ高次の組織や器官
を形成させるなど、より生体内に近い状態で培養する手
法はあまり知られておらず、こうした試みの中の１つに
、コラーゲンゲル内培養法があり、不法では細胞は三次
元的に集合することで、より生体内に近い状態で培養が
可能であることが知られている。

しかしながら、コラーゲンゲルは強度が低く、手間がか
かり、また高価であるため、その使用は実験室レベルに
限られていた。

［発明が解決しようとする課８１従来の培養法では、生体内で高次の機能を有する細胞を
長期間維持することが困難であった。また、コラーゲン
ゲル内培養などの特殊な培養法を用いなければ、細胞を
材料表面で単層に培養できるだけで、生体内のように多
数の細胞が三次元的に集合し独自の機能を果たす、いわ
ゆる組織や器官の形成までいたらしめることはできなか
った。

すなわち、本発明の目的は、細胞を三次元的に集合させ
得る、より生体内に近い状態で培養することである。

［課題を解決するだめの手段］本発明の目的は、水との前進接触角が２０度以上５０度
以下の細胞培養基材およびそれを用いる細胞培養方法に
より達成される。

本発明で用いる細胞は、例えば血管内皮細胞、血管平滑
筋細胞、肝実質細胞、牌上皮細胞、線維芽細胞、あるい
はＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞などの株細胞などである。

特に、生体内で三次元的に集合体を形成している細胞群
、例えば肝実質細胞、牌上皮細胞などはこの手法により
細胞を多数集合させると次第に機能分化を示し、単層で
培養するよりも形態的、あるいは機能的に生体内に近い
状態で培養することが可能となるので好ましい。

本発明の水との接触角とは、水の自由表面が固体壁に接
する場所で、液面と固体面とのなす角（液の内部にある
角をとる）をいい、前進接触角とは、ぬれていない新し
い表面での接触角である。

本発明の水との前進接触角が２０度以上５０度以下であ
る必要があり、好ましくは２０度以上４０度以下である
。

材料の接触角を本発明に適応するように制御する方法に
は、次の各手法が挙げられる。

１）接触角の高い基材の接触角を低下させる。

２）接触角の低い基材の接触角を上げる。

３）直接目的の接触角を有する材料を得る。

などの方法があり、そのいずれの手法も用いることが可
能である。

１）の手法において、細胞接着性の高い材料である接触
角の高い基材としては、ポリオレフィン、ポリエステル
、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、
ポリアクリロニトリルなど、フィルムにした際、表面で
の水滴の接触角が６０度以上９０度未満である材料が挙
げられる。

このような基材の接触角を２０度以上５０度以下にする
方法として、Ａ）親水性ポリマーで上述の細胞付着性材料の表面を、
グラフト反応、カップリング反応などによって修飾する
方法Ｂ）低分子化合物による修飾反応によって、親水性の官
能基を導入するなどの方法がある。

Ａ）の手法をとる際に用いることのできる親水性ポリマ
ーとしては、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリア
クリルアミド、ポリヒドロキシメチルメタクリレート、
セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース、ヒド
ロキシエチルセルロース、メチルセルロース）　アミロ
ース、アルギン酸など、あるいはこれらの共重合体およ
び誘導体がある。また、アルブミンなどの親水性の生体
内物質を固定化してもよい。

（Ａ）の手法の中でも、基材としてポリ塩化ビニルを用
い、親水性ポリマーとしてポリエチレンオキシドを用い
るのが好ましい。

また、Ｂ）の手法をとる際に用いる官能基は、水酸基、
アルデヒド基がある。本手法をとる際は、使用する材料
によって反応を選ぶ必要があり、例えばポリエステルな
どでは水酸化ナトリウムにより表面を加水分解によって
導入する方法がある。

２）の例を挙げると、本発明において見い出された接触
角よりも、低い接触角を有する材料としては、表面での
水の接触角が低い材料、例えばセルロースおよびその誘
導体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチ
レンオキシド、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール
、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリヒ
ドロキシメチルメタクリレートなどと、その共重合体お
よびその誘導体などがある。

これらの細胞付着性の低い材料に、本発明に適した細胞
付着性を賦与する手法として、表面に疎水性の低分子化
合物やポリマーを表面カップリング反応あるいはグラフ
ト反応によって導入したり、化学架橋剤によって表面を
修飾するなどの方法かある。

ここで用いる疎水性の低分子化合物としては、アルキル
イソシアネート、アルキルグリシジルエーテル、フェニ
ルイソシアネート、アニリン、安息香酸が好ましく用い
られる。架橋剤としては、ポリエチレングリコールグリ
シジルエーテル、ヘキサメチレンジイソシアネート、グ
リセロールポリグリシジルエーテル、グルタルアルデヒ
ド、両端に活性エステル基を持つポリエチレングリコー
ルなどかある。このような反応は表面の一部か被覆され
る程度が好ましく、この割合はＥＳＣＡ（Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｎ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）などで分析できる。

また、３）の例を挙げると、オレフィン、スチレン、塩
化ビニル、アクリロニトリルなどの疎水性モノマーと親
水性モノマー、例えばポリエチレンオキシドを含むビニ
ル系モノマー、アクリル酸、ビニルアルコール、ビニル
ピロリドン、アクリルアミド、ヒドロキシメチルメタク
リレート、アルギン酸の共重合体などが挙げられる。本
共重合体作成の際、モノマー中に２つ以上二重結合を持
つモノマーを１〜５％加えておくこともできる。

この共重合の割合としては、例えば親水性モノマーの割
合が１０〜５０％が好ましく、例えばアクリロニトリル
と分子ｆｉ１０００程度のメトキシポリエチレングリコ
ールモノメタクリレートとの共重合体では９：１〜７：
３が好ましい。

本発明は、ヒドロゲルからなる細胞培養基材を用いるの
が好ましい。ここでいうヒドロゲルとは、コロイド溶液
がシェリー状に固化したものであるゲルのうち、多量の
水を含むものであり、含水率３０〜９８％のものが好ま
しく用いられる。このヒドロゲルとしては、例えばセル
ロースおよびその誘導体、ポリアクリルアミド、ポリエ
チレングリコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、
ポリビニルピロリドンを３０〜９８％含むポリ塩化ビニ
ル、ポリアクリロニトリルまたはポリスチレンなどの重
合体、あるいはデンプン、アガロース、メチルセルロー
ス、ヒドロキシエチルセルロースの架橋体などが挙げら
れる。

また、基材上に細胞接着因子として知られるコラーゲン
フィブロネクチン、ビトロネクチン、あるいはラミニン
をイオン結合あるいは共有結合にて固定化したもの、あ
るいは３級または４級アミノ基などの強い正電荷を持つ
基材は、基材への細胞接着性が向上するため、細胞が基
材表面の全面を単層に被覆し、三次元集合体を形成しな
いため、好ましものではない。

本発明の細胞培養基材の形状はどんなものでもよいが、
例えばフィルム状、球状かあり、好ましくはフィルム状
である。

本基材では、従来の細胞の付着が強固な材料に比べて、
細胞の増殖が悪い傾向が認められる。このため基材上に
播種する細胞数は多い方がよく、基材１ｃＪあたり１〜
１０４から１〜１０６程度が好ましい。

本発明の培養方法は、通常の方法により行なわるが、例
えば、日本組織培養学会編、組織培養の技術（朝食書店
）に記載された方法を細胞の種類に応じて行なえばよい
。

本発−明により細胞培養を三次元で行なえるようになり
、毛細血管、肝、牌といった独自の機能を果たす組織、
器官の形成ができる。

［実　施　例□コ以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１市販のセルロース透析膜（ユニオンカーバイト社製）を
１０％プロピルイソシアネートＤＭＳＯ溶液に浸漬し、
撹拌しつつ３０℃で反応させた。

反応の進行は、反応時間の経過に伴ない、材料表面の窒
素原子が増加することをＥＳＣＡによって観察するとと
もに、接触角が増加することによって確認した。

反応時間１時間で水による前進接触角３５″のセルロー
ス膜を得た。この膜を第１図に示すようなチャンバーに
セットした。

中太動脈から単離し、組織培養用フラスコで増殖させた
血管内皮細胞を、フィルム１　ｃＴ！あたり５×１０４
個まき炭酸ガスインキュベーター内で培養した。

反応時間１時間（接触角３５度）の基材上で培養した細
胞の培養１日目の形態は、比較的丸い形であった。３日
目では細胞同士が集合して、基材から離れた細胞を含め
て細胞集合体を形成した。

７日目には凝集した細胞は部分的に集合し、細長い高次
集合体を形成した。集合体の断面の走査型および透過型
電子顕微鏡で観察したところ、細胞同士の境界が曖昧で
細胞同士が非常に強固に結合していること、断面に管腔
構造が観察されたことより、本構造体が毛細血管である
ことが確認された。このような毛細血管か形成された例
は８例中４例であった。

比較例１〜３実施例１で用いたセルロース透析膜を化学修飾しないも
の（比較例１）、実施例１の反応時間を２４時間と変更
する以外は実施例１と同じセルロース膜（比較例２）、
市販の培養皿を切断したもの（比較例３）を用いて、実
施例１と同様に細胞培養を行なった。

比較例１の無処理のセルロースフィルムは水との前進接
触角が１９度であり、細胞培養を行なっても細胞は基材
にほとんど付着せず、従って毛細血管は形成されなかっ
た。また、比較例２のセルロースフィルム（接触角６８
度）および比較例３の組織培養皿（接触角６０度）では
、培養１日目では細胞は実施例１で得られる細胞と比較
し、より伸展した形状を示し、３日目では増殖するもの
の基材に強固に付着しており、実施例のように細胞が基
材から離れる例は観察されなかった。７日目には細胞は
、いわゆるコンフレンドの状態になって増殖は停止し、
実施例のような毛細血管の形成は認められなかった。

実施例２市販のポリエステルフィルム（東し株式会社製）を、０
．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、４０度で３時
間反応させた。このフィルムを所定濃度のゼラチン水溶
液に浸漬し、４０度で２４時間反応させた。このフィル
ム表面に、分子量が６００のジアミノポリエチレングリ
コールをジシクロへキシルカルボジイミドを用いて固定
化した。

フィルムに残存するアミノ基は、無水酢酸−酢酸によっ
てブロックし、細胞培養基材を得た。この基材の水との
前進接触角は４８度であった。

ラットからコラゲナーゼ還流法により肝細胞を単離した
。実施例１と同じように、第１図に示す細胞培養チャン
バーは、このフィルムを装着し、１ｃ−あたり７×１０
５個の細胞をまいた。培養１日目では細胞は軽度に伸展
した後集合し、培養４日目で多数の細胞が集合した直径
約１００ミクロンの球状の多細胞凝集体を形成した。本
球状物を透過電顕にて観察すると、生体の肝臓に近いよ
く発達したミトコンドリア、ｒＥＲ，ゴルジ装置が認め
られた。肝細胞特異機能の指標としてアルブミン分泌量
を測定し、同時にＤＮＡ１を測定して単位ＤＮＡあたり
のアルブミン分泌量を求めたところ、３．２±０．３μ
ｇ／μｇＤＮＡであった。

比較例２実施例２で用いた市販のポリエステルフィルムを用い、
実施例１と同様に検討した。本フィルム上で水の前進接
触角は７０度であった。

本フィルムに肝細胞を付着させたところ、細胞はフィル
ム−面にコンフレンド状態で生着し、多細胞の集合体を
形成することはなかった。透過電顕ての観察から、細胞
内部のミトコンドリア、ｒＥＲ、ゴルジ装置は実施例２
に比較して未発達であった。また、単位ＤＮＡあたりの
アルブミン分泌量は０．５±０．１μｇ／μｇＤＮＡで
あった。

［発明の効果］本発明により、より生体内に近い状態で細胞培養が行な
えるため、細胞を三次元的に集合させることができ、組
織、器官の形成が可能となる。従って、本発明により毛
細血管、肝、牌などを得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本実施例で用いる細胞培養チャンバーである
。１・・・・・・細胞培養基材２・・・・・・スライドガラス３・・・・・・押　さ　え４・・・・・・シリコーン・ゴム

Claims

【特許請求の範囲】

（１）水との前進接触角が２０度以上５０度以下である
細胞培養基材。
（２）請求項１記載の細胞培養基材がヒドロゲルからな
る細胞培養基材。
（３）請求項１または２記載の細胞培養基材を用いるこ
とを特徴とする細胞培養方法。