JPH0445800A - 遺伝子固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 （産業上の利用分野） この発明は担体に遺伝子を固定化する方法に関する。

（従来の技術） 遺伝子（ＤＮＡ）にコードされた遺伝情報はメツセンジ
ャーＲＮＡを介して酵素等のタンパク質として表現され
、これらのタンパク質の働きにより生成した様々な化合
物の集合体として生物が存在する。このような遺伝子の
総数はヒトで５〜１゜万といわれているが、その中に何
らかの異常や変化（例えば、欠損、重複等）が生しるこ
とがある。

その場合には、生成するタンパク質の特性、種類、量な
どが変化し、その結果、生体系のバランスが崩れて疾病
を引き起こす。したがって、逆に、病因となっている遺
伝子を検出することにより、疾病の同定や予防が可能と
なる。近年の遺伝子工学の進歩に伴い、このような遺伝
子そのものに基づく診断（遺伝子診断と呼ばれている）
が可能になってきた。

遺伝子発現の機構を考えると、生化学的レベルでのほと
んどの変化に先行して遺伝子上での変化が生じているこ
とが推定される。したがって、遺伝子診断により、病気
という表現型での変化に先立つ（すなわち、発症前や病
気の潜伏期あるいは極めて初期の）診断や予測が可能と
なる。

また、生体内の細胞の遺伝子は全て同一であるので、遺
伝性の疾患に関しては分析しようとする臓器や組織は特
定されない。特に、胎児に関しては、妊婦から羊水を採
取して羊水中に浮遊している胎児の細胞を調べるだけで
診断することができ、非常に重要な診断方法である。

一般に、遺伝子診断は次のように行なわれる。

まず、試料から遺伝子を抽出し、必要があれば適当な制
限酵素で切断する。次に、この遺伝子を電気泳動にかけ
、その後サザンプロットを行なう。

次いで、目的とする遺伝子に対応する遺伝子プローブ（
通常は、放射性同位元素で標識されている）をハイブリ
ダイズさせた後、低温でオートラジオグラフィーにかけ
てＸ線フィルム上で目的とする遺伝子の有無を確認する
。この方法では遺伝子プローブの標識剤として通常放射
性同位元素が使用されるが、放射性同位元素は診断場所
が限定され、かつ試薬の取扱いにも充分な注意が必要で
あるため、放射性同位元素に替わる安全な標識剤の開発
が進められている。すでに、アビジン−ビオチン結合を
利用するもの、酵素や蛍光物質を使用するもの等が開発
されているが、いずれも感度の点では放射性同位元素に
やや及ばない。

ところで、上記方法では、遺伝子の検ａまでに少なくと
も　２〜３日を要し、測定操作もかなり複雑である。そ
こで、測定操作、特に洗浄過程を簡略化し、測定時間を
短縮するために、いわゆる「サンドイッチ・ハイブリダ
イゼーション」か提示されている（例えば、特開昭６２
−２０５８００号広報および特開昭６２−５０１０７１
号広報）。この方法は、目的とする遺伝子に対して相補
的な塩基配列を有する第一の遺伝子プローブを予め固相
担体に固定化し、次いで試料中の遺伝子とハイブリダイ
ズさせた後、標識剤で標識した検出用の第二の遺伝子プ
ローブと反応させるものである。

（発明が解決しようとする課題） しかしなから、上記サンドイッチ・ハイブリダイゼーシ
ョンにおいても、固相担体への第一の遺伝子プローブの
固定化の効率が悪いという問題点があった。また、ハイ
ブリダイゼーションの際に、目的とする遺伝子以外にも
他の遺伝子が固相担体上に非特異的に吸着されてしまう
という問題もある。この非特異的な吸着を防ぐために、
現在では、予め牛胸腺や鮭の精子などのＤＮＡで長時間
ブロックする方法がとられている。しがし、これは操作
の簡便化、および検出時間短縮の妨げとなっている。

この発明は、上記問題点を解決するためになされたもの
であり、遺伝子、特に遺伝子プローブを、簡便に、かつ
短時間で効率よく担体に固定化することが可能な方法を
提供することを目的とする。

〔発明の構成〕

（課題を解決するための手段） この発明による遺伝子固定化方法は、表面に負電荷およ
び共有結合を形成し得る官能基が存在する担体に、該官
能基との共有結合を介して遺伝子を固定化することを特
徴とする。この発明の方法によって遺伝子が固定化され
た担体は、サンドイッチ・ハイブリダイゼーションを用
いた遺伝子の検出に好適に使用することができる。

この発明の遺伝子固定化方法において用いられる担体は
、前記特性を有するものであれば特に限定されるもので
はない。そのような特性を有する担体としては、例えば
、カルボキシメチル（ＣＭ）セルロース、カルボキシメ
チル（ＣＭ）キチン、カルボキシメチル（ＣＭ）キトサ
ン等のカチオン交換能力を有する多糖類からなるものが
挙げられる。

これらの担体の形状も、膜状てあっても球状であっても
よく特に限定されるものではないが、膜状のものがより
好ましい。また、測定装置等の表面上に、直接、上記負
電荷および共有結合に必要な官能基を形成することも考
えられる。

この発明による遺伝子固定化方法においては、上記担体
の表面に存在する官能基と遺伝子中のアミノ基とが反応
して共有結合を形成することにより、担体に遺伝子が固
定化される。この共有結合を形成する反応は、担体表面
に存在する共有結合に関与する官能基によって異なる。

したがって、担体の表面上に存在する官能基と遺伝子中
のアミノ基とが共有結合を形成する限りにおいて、反応
方法および条件は特に限定されるものではない。

上記共有結合を形成する反応としては、担体に上記のカ
チオン交換能力を有する多糖類を用いた場合には、臭化
シアン等の作用により多糖類を形成する糖単位の水酸基
を活性化する方法を挙げることができる。

上記反応は、通常、固定化しようとする遺伝子を含有す
る溶液に担体を浸漬することにより行なう。この際、遺
伝子含有溶液に超音波を照射することにより、上記反応
の速度を増大させることができる。遺伝子含有溶液に照
射される超音波の強度および周波数は、固定化される遺
伝子の種類および長さ、担体の特性、反応条件等に依存
し、特に限定されるものではない。

担体表面に存在する官能基と遺伝子中のアミノ基との反
応が終了した後も、担体表面にはこの反応に関与せずに
未反応のままの官能基が存在する。

このような未反応の官能基は、この担体が目的とする遺
伝子以外のアミノ基含有化合物（他の遺伝子等）が存在
する状況に置かれた場合に、目的とする遺伝子以外の化
合物を容易に結合する要因となる。これは、上記サンド
イッチ・ハイブリダイゼーションにおいては、担体への
非特異的吸着と同様望ましいものではない。したがって
、上記反応か終了した後、未反応の官能基を不活性化す
ることが好ましい。官能基の不活性化の方法としては、
例えば、適当な保護基と反応させることが挙げられる。

ただし、ここで用いられる保護基は、それ以降の工程に
影響を及はすことがないものでなければならない。上記
サンドイッチ・ハイブリダイゼーションにおいてこの発
明の方法で遺伝子を固定する場合には、例えば、グリシ
ンを用いて未反応の官能基を保】することにより、不活
性化を行なうことができる。

以下、この発明の方法を、０Ｍセルロースからなる担体
を用いた場合を例として、図面を参照して説明する。

第１ａ図ないし第１ｄ図は、この発明の方法を模式的に
示す図である。第１ａ図に示すように、０Ｍセルロース
からなる担体１の表面には、水酸基およびカルボキシメ
チル基が存在する。この担体１に臭化シアンを作用させ
ると、第１ｂ図に示すように、０Ｍセルロースの水酸基
と反応してイミンを形成し、活性化する。さらに、この
担体１をアルカリ条件下におくことにより、カルボキシ
メチル基が負電荷を帯びる。次に、活性化した担体１を
遺伝子２を含有する溶液に浸漬すると、第１Ｃ図に示す
ように、担体１の活性化した水酸基（イミン）と遺伝子
２のアミノ基との間に共有結合が形成され、遺伝子２が
担体１に固定化される。なお、臭化シアンによる膜表面
活性化反応はシアンガスが発生する恐れがあるため、強
制排気装置の中で行なうことが望ましい。

上記共有結合が形成された後も、第１ｃ図に示すように
、担体１の表面上には活性化した水酸基が反応に関与せ
ずに未反応のまま残存する。この未反応のイミンは、非
特異的吸着の要因となるので、後の工程に影響を与えな
い保：Ｊ基、例えばグリシンと反応させて不活性化する
ことか好ましい（第１ｄ図）。

この発明による遺伝子固定化方法は、サンドイッチ・ハ
イブリダイゼーション法を用いる遺伝子検出方法に好適
に使用することかできる。すなわち、検出しようとする
遺伝子と相補的な塩基配列を有する第１の遺伝子プロー
ブをこの発明の方法によって担体に固定化し、次にこの
担体を試料溶液中に入れてハイブリダイゼーションを行
ない、さらに検出しようとする遺伝子と相補的な塩基配
列を有する第２の遺伝子プローブとのハイブリダイゼー
ションを行なう。試料溶液中に、目的の遺伝子か含まれ
ている場合には、この遺伝子は第１のプローブと第２の
プローブとに挾まれた状態で担体に固定される。したが
って、予め第２のプローブを放射性同位元素等の標識剤
で標識しておき、適当な検出手段で担体上における標識
の有無を測定することにより、試料溶液中における目的
の遺伝子の存在の有無を確認することができる。

第２のプローブを標識するための標識剤は、その存在を
直接検出することが可能なもの、または抗原抗体反応、
酵素反応等を介して間接的に検出可能となるもののいず
れをも用いることができる。

その存在を直接検出することが可能である標識剤として
は、前記放射性同位元素の他に、蛍光・発光物質、酵素
等を用いることができる。しかしながら、これらの標識
剤は、ハイブリダイゼーションの際に分解もしくは変性
してしまうことがあり、正確な測定が困難となることが
ある。したがって、標識剤としては、ハイブリダイゼー
ションの際に分解、変性などが生じない物質が好ましく
、そのような物質として、各種ハブテン、ビオチン、耐
熱性酵素等が好適に用いられる。これらの標識剤は、そ
の存在が間接的に検出可能となるものである。例えば、
ハブテンを標識剤として用いた場合には、ハイブリダイ
ゼーション終了後、標識剤としてのハブテンと他の適当
な標識剤で標識した抗体との抗原抗体反応をさらに行な
う必要がある。

ハイブリダイゼーションの終了後、適当な測定装置を用
いて、前記担体上における標識の有無、すなわち第２の
プローブの存在の有無を確認する。

試料中に目的の遺伝子が存在する場合には、担体上に第
２のプローブの存在が確認される。ここで用いられる測
定装置は、用いられる標識剤の種類によって異なり、特
に限定されるものではない。

例えば、用いられる標識剤が、電位変化もしくは電流変
化に関与するものであれば、測定装置として電極を用い
ることかできる。また、標識剤か蛍光もしくは発光に関
与するものであれば、光ファイバー・ケーブルを使用す
ることもできる。

この発明の遺伝子固定方法に用いられる担体は、測定装
置の表面に膜状に形成されることが好ましい。加えて、
感度等の問題から、測定装置と標識された第２のプロー
ブとの距離は短いほうがよい。

すなわち、担体の膜厚は薄いほうが好ましい。特に好ま
しくは、膜厚は１０ｇｍ以下である。膜厚が厚すぎる場
合には応答速度が遅れ、感度が低下する傾向にある。ま
た、膜厚が薄すぎる場合にはＪ亀裂が入りやすいなど強
度に問題がある。

（作用） 一般に、遺伝子は塩基、核酸およびリン酸からなる高分
子であり、全体としてはリン酸に由来するかなり強い負
電荷を帯びている。このため、表面に負電荷を有する物
質上には吸着しにくい。

方、この発明の方法において用いられる担体の表面には
、負電荷および遺伝子のアミノ基と共有結合を形成し得
る官能基が存在する。したがって、この担体上には遺伝
子が吸着することはほとんどなく、官能基と反応して共
有結合を形成することによってのみ固定化される。

通常、共有結合を介して担体上に目的の遺伝子を固定化
した後も、共有結合に関与せずに未反応のまま残存する
官能基が存在する。これをそのまま残してお（と、それ
以降の工程において別の遺伝子が結合してしまう可能性
がある。目的の遺伝子を固定化した後に未反応の官能基
を不活性化することにより、この不要な結合を防止する
ことができる。

また、官能基が活性化している状態であっても、担体表
面が負電荷を帯びているため、担体の官能基と遺伝子と
の反応速度は遅い。この際、溶液に超音波を照射すると
、遺伝子と担体との会合が強制的に行なわれ、反応が促
進される。

（実施例） 以下、この発明の遺伝子固定化方法の実施例を説明する
。

実施例１−ＣＭ−キチン膜への遺伝子プローブの固定化 まず、ＣＭ−キチン８０（ｆｉ換変度８０％コスモ・バ
イオ■より購入）をイオン交換水に溶解して５％溶液を
調製した。次いで、この粘稠な水溶液の適当量をテフロ
ン膜上に展開し、室温で十分に乾燥させることにより　
ＣＭ−キチンａ（膜厚的１［１０ｎ）を得た。次に、こ
の膜をビーカー中のイオン交換水で再び膨潤させ、さら
に、マグネチック・スターシーで激しく撹拌しながら適
当量の臭化シアン（ＣＮＢｒ）を固体のまま一度に添加
した。添加後直ちに５ＮのＮａＯＨを滴下して反応液の
ｐｏを１０以上に上昇させた。その後、適宜５ＮのＮａ
ＯＨを添加することにより液のＰＨを常に１０以上に保
ちながら、アルカリの消費がほとんどなくなるまで撹拌
を続け、約３０分間反応を行った。反応を行なっている
間、反応温度が２５℃以上にならないように、適当に氷
片を加えた。

反応終了後、膜をイオン交換水でよく洗浄し、予め用意
した肝炎ウィルス（）ＩＢＶ）遺伝子プローブ溶液（０
，ＩＭ　ＮａＨＣＯｓ中に１００．ｃｇ／ｍ）中に速や
かに移した。次いで、室温で一晩ゆっくりと撹拌するこ
とにより、ＨＢＶ遺伝子プローブを共有結合を介して膜
上に固定化した。なお、ここで用いたＨＢＶ遺伝子は独
自に開発したものである。

さらに、未反応の活性基を不活性化するために、膜を１
月グリシン（ｐ）１１０）中に入れて一晩ゆっくりと撹
拌した。

放射性同位元素を用いた実験から、得られた膜の表面に
は約１ｕｇ／ｃｄの遺伝子プローブが固定化されている
ことが確認された。また、この固定化膜を実際の試料と
反応させたところ、従来の担体と異なり、非特異的な遺
伝子の吸着はほとんど見られなかった。

実施例２−ＣＭ−キチン膜への遺伝子プローブの固定化 臭化シアンで表面活性化した膜をＨＢＶ遺伝子プローブ
溶液に移した後、２０　ＫＨｚ、　　１００ｍＷの超音
波を照射しながら室温で１時間ゆっくり撹拌したこと以
外は実施例ユと同様の操作を行ない、遺伝子プローブ固
定化膜を得た。

放射性同位元素を用いた実験から、得られた膜の表面に
は約３ｇ／ｃｊの遺伝子プローブが固定化されているこ
とが確認された。また、この固定化膜を実際の試料と反
応させたところ、従来の担体と異なり、非特異的な遺伝
子の吸着はほとんど見られなかった。

実施例３−ＨＢＶ遺伝子プローブ固定化膜を装着した酸
素電極の作成 実施例１において調製したＨＢＶ遺伝子プローブ固定化
膜を約１０−の大きさに切断した。次いで、切断した膜
を、膜に皺がよらないように十分注意しながら、酸素電
極（東亜電波製）のテフロン膜上に装着した。膜の装着
には０リングを用いた。

実施例４−１（ＢＶ遺伝子プローブ固定化膜を装着した
酸素電極を用いた試料中 のＩ（ＢＹ遺伝子の検出 実施例３において作成したＨＢＶ遺伝子プローブ固定化
膜を装着した酸素電極を用いて、予め制限酵素Ｐｓｔ　
Ｉで処理したヒト血液試料中のＨＢＶ遺伝子の検出を行
なった。

この実施例において用いられるヒト血液試料の制限酵素
処理は常法に従って行なった（例えば、臨床検査、ＶＯ
ｌ、３２、Ｎｏ、４．４０１　　（１９Ｈ）参照）。

また、ＨＢＶ遺伝子プローブは市販のもの（ジーン・メ
ッド社製）を用い、市販のビオチン標識試薬（エンゾチ
ン社製）を用いて標識した。さらに、ウサギ抗−ビオチ
ン抗体は市販のもの（エンゾチン社製）を用い、常法に
従ってグルコース・オキシダーゼ（ＧＯＤ　；シグマ社
製）を用いて標識した（例えば、生物化学実験法　１５
「免疫学実験入門」、松橋　直　他著、学会出版センタ
ー、１５１（１９８１）参照）。

まず、試料遺伝子およびビオチン標識１１ＢＶ遺伝子プ
ローブを含む反応液中に、実施例３において作成したＨ
ＢＶ遺伝子プローブ固定化膜を装着した酸素電極を浸漬
し、６０℃で３０分間ハイブリダイズさせた。反応後、
酸素電極の表面をイオン交換水で十分洗浄した。次いで
、この酸素電極を、ＧＯＤＩＩ　！抗−ビオチン抗体を
含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に浸漬し、３７℃で
３０分間インキュベートした。再びイオン交換水で酸素
電極を十分に洗浄した後、１％グルコースを含有するＰ
ＢＳ中に移し、３７℃で５分間ＣＯＤ活性を測定した。

この酵素活性は、電極を溶液中に浸漬したときに測定さ
れる溶在酸素濃度の減少量（電極表面近傍の局部的な減
少）を電流値に変換して評価した。下記第１表に１０検
体の測定結果を示す。表に示した１０検体のうち、＃１
〜７は肝炎患者、＃　８〜１０は正常人からの血液試料
である。

第 表 ｌｌｉｌｌ表から明らかなように、肝炎患者からの血液
試料（＃１〜７）の電流値の減少量が大きく、これらの
試料にＨＢＶ遺伝子が存在することが確認された。

また、標準の）ＩＢＶ遺伝子を用いて検出感度を検定し
たところ、約１　ｐｇのＤＮＡ量から検出可能であった
。。これは、放射性同位元素で標識した遺伝子プローブ
を用いる従来法とほぼ同等の感度である。

〔発明の効果〕

以上のように、この発明の方法は、担体の表面上に存在
する官能基と遺伝子との間の共有結合を介して遺伝子を
固定化する。したがって、簡便で、かつ効率よく固定化
することが可能である。また、担体表面の官能基と遺伝
子との反応の際に超音波を照射した場合には、反応が促
進されて固定化に要する時間が短くなり、この発明の方
法を含む全体の工程の時間が短縮される。さらに、この
発明の方法によって遺伝子が固定化された担体は、非特
異的な遺伝子の吸着がほとんど見られない。したがって
、この発明の方法を用いた遺伝子の検出は、高感度かつ
高精度である。

【図面の簡単な説明】 Ｊｉｌａ図ないし第１ｄ図は、この発明の方法の一具体
例を模式的に示す図である。 ｌ・・・担体、２・・・遺伝子。 出願人代理人　弁理士　鈴江武彦 第１ａ図 ワ 第１ｃ 図 第１ｂ図 ４ノ 第１ｄ図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）表面に負電荷および共有結合を形成し得る官能基
   が存在する担体に、該官能基との共有結合を介して遺伝
   子を固定化することを特徴とする遺伝子固定化方法。
2. （２）表面に負電荷および共有結合を形成し得る官能基
   が存在する担体に、該官能基との共有結合を介して遺伝
   子を固定化する工程と、 該共有結合に関与しない担体表面上の官能基を不活性化
   する工程とを具備することを特徴とする遺伝子固定化方
   法。
3. （３）表面に負電荷および共有結合を形成し得る官能基
   が存在する担体を、遺伝子を含有する溶液中に浸漬する
   工程と、 該溶液に超音波を照射しながら、官能基との共有結合を
   介して担体に遺伝子を固定化する工程とを具備すること
   を特徴とする遺伝子固定化方法。