JPH0442000B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0442000B2 JPH0442000B2 JP15768390A JP15768390A JPH0442000B2 JP H0442000 B2 JPH0442000 B2 JP H0442000B2 JP 15768390 A JP15768390 A JP 15768390A JP 15768390 A JP15768390 A JP 15768390A JP H0442000 B2 JPH0442000 B2 JP H0442000B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chelating agent
- enzyme
- adenine dinucleotide
- nicotinamide adenine
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、基質又は酵素の改良された定量方法
に関する。 〔従来の技術〕 近年、酵素法による生体成分の分析法が広く普
及し、生体中の酵素あるいは非酵素成分の測定系
に、種々の共役反応を利用する場合が非常に多く
なつた。中でも脱水素酵素群は、検出が容易な
NAD又はNADPが関与するため適用範囲が広
く、クレアチンキナーゼ測定系におけるグルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素、トリグリセライド測
定系におけるグリセロール脱水素酵素などがその
よい例である。現在、NADH又はNADPHの検
出は、一般にホルマザン発色系の共役によつて行
われているが、この方法では色素が水に難溶容性
であり、又、反応条件により発色度が異なるので
正確な分子吸光係数を適用しにくい。さらに測定
器具に色素が吸着するなどの欠点がある。 最近、これらの諸問題を解決する新しい発色系
の利用が報告されている。例えば、脱水素酵素−
基質−NADの反応系にFe3+、電子伝達剤及び
Fe2+に特異的に反応するキレート剤を添加した
緩衝液中で次の反応を行わせ、結果として生成し
た着色化合物を比色定量することによる、トリグ
リセライドの測定方法が発表されている（特開昭
54−80192号公報）。 NAD＋気質脱水素酵素 ―――――→NADH＋生成物 NADH＋2Fe3+電子伝達剤 ―――――→ NAD＋2Fe2+ Fe2+（キレート剤）→錯化合物（着色） この方法は、生成する着色物が水溶性であり、
感度もかなり高い。しかしながら、試薬ブランク
値の経時変化が著しいので、比色時には検体ごと
に試薬ブランク値による分光光度計のゼロ調整を
しなければならず、測定する試料件数が限られ、
多検体処理には不適当であつた。 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明者は、この試薬ブランク値の経時変化を
抑制し、比色時の煩雑な操作を除くことにより多
検体処理を可能にするため、種々研究を行つた結
果、試薬ブランク値の上昇は試薬中に含まれる
種々の成分によるFe3+の非特異的還元に帰因し、
とくに酵素蛋白やその夾雑物量に依存して増大す
る傾向があることを見出し、更に、それに効果的
な隠ぺい剤、すなわちFe3+と錯化合物（キレー
ト）を形成するキレート剤を使用することにより
試薬ブランク値の経時変化の抑制が可能であるこ
とを見出した。本発明はかかる知見に基づくもの
である。従つて、本発明方法は、広く一般に脱水
素酵素及びNAD又はNADPを含む測定系に応用
することが可能であり、ホルマザン法にかわる比
色法として、NADH又はNADPHの検出に適用
することができる。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、脱水素酵素と酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（NAD）又は酸化型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（NADP）とを含む酵素反応系により生成する還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NADH）又は還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸（NADPH）の量に対応し
て、電子伝達剤の存在下で第二鉄イオン（Fe3+）
から還元生成する第一鉄イオン（Fe2+）の量を、
Fe2+に特異的に反応するキレート剤の作用によ
り生成する着色化合物として比色定量する方法で
あつて、 前記キレート剤とは別に余剰のFe3+を隠蔽す
るキレート剤としてエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）を含有するPH5.0〜8.6の緩衝液を、基
質の定量の場合には反応が終結した時点で加え、
酵素の定量の場合には酵素反応を停止させる時点
までの規定時間反応させた直後に添加することを
特徴とする、基質又は酵素の定量方法に関する。 即ち、簡単に言えば、本発明方法は、電子伝達
剤の存在下に、脱水素酵素反応により生成した
NADH又はNADPH量に対応してFe3+から還元
生成するFe2+を錯化合物として比色するにあた
り、余剰のFe3+と測定波長に吸収スペクトルを
示さないキレート化合物を生成するキレート剤を
添加して反応を停止させるとともに試薬ブランク
値の経時変化を抑制することを特徴とする基質又
は酵素の改良された定量方法である。 本発明方法におけるキレート剤、即ち、エチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）の効果は、Fe3+と
安定な錯化合物（キレート）を形成し、Fe3+が
還元されるのを抑制する作用で説明することがで
きる。従つて、反応時にキレート剤を共存させる
と、測定反応それ自体であるFe3+の還元を阻害
する可能性がある。そこで、実際に本発明方法を
実施する際には、基質の定量の場合には反応が終
結した時点でキレート剤を加え、酵素の定量の場
合には、酵素反応を停止させる時点までの規定時
間反応させた直後にキレート剤を（必要により酵
素反応停止剤と共に）加える。キレート剤が同時
に酵素反応を停止する作用を有する場合もある。 本発明で使用するキレート剤はエチレンジアミ
ン四酢酸（EDTA）である。 キレート剤は、その濃度とPHにより、効果がか
なり左右されるため、使用する際には条件設定が
重要となる。 次に、本発明のキレート剤であるエチレンジア
ミン四酢酸（EDTA）、及びこれと同様の効果を
有する以下のキレート剤等について、各種の条件
を具体的に示す。 ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸
（EDTA−OH） ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA） ジアミノプロパノール四酢酸（DPTA−OH） ニトリロ三酢酸（NTA） トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸
（CyDTA） ジヒドロキシエチルグリシン（DHEG） リン酸塩 表１及び表２は、後述の参考例１の乳酸脱水素
酵素（LDH）は測定試薬を用いて試験を実施し
た結果を示すものである。表１には、PHが試薬ブ
ランク値の経時変化に及ぼす影響を示した。この
結果から、PHの選択によつては、かえつて逆効果
となつてしまうことがわかる。表２には、キレー
ト剤の濃度が試薬ブランク値の経時変化と呈色に
及ぼす影響を示した。この結果から、キレート剤
が高濃度になるに従つて経時的に試薬ブランク値
は減少するが、反応による呈色をも減少させる傾
向にあることがわかる。従つてLDHを測定する
場合のキレート剤としては、１〜８ｍＭ−
EDTA−OH（PH8.6）や１〜８ｍＭ−DPTA−
OH（PH8.6）、４〜８ｍＭ−CyDTA（PH8.6）が有
効と考えられる。 表３及び表４は、同様に、後述の参考例３のト
リグリセライド測定に用いるキレート剤を検討し
た結果を示すものである。これらの表から、１〜
８ｍＭ（特に１〜４ｍＭ）−EDTA（PH8.6）、１〜
８ｍＭ−DTPA−OH（PH8.6）、４〜８ｍＭ−
CyDTA（PH10.0）及び50ｍＭリン酸緩衝液（PH
6.0）が使用可能なものと判断することができる。
後述の参考例２に記載の方法に従つてクレアチン
キナーゼ（CK）を測定する場合には、ここで生
じる色素が中性以上のPHで不安定であるため、キ
レート剤を弱酸性の条件で用いることが望まし
い。 又、表５に示す様に、使用する緩衝液の種類に
よつて効果の異なるものもある。濃度を変化させ
た場合の実験結果を表６に示した。この結果か
ら、0.5〜２ｍＭのEDTA、EDTA−OH、
DTPA及びCyDTAが有効であることがわかる。 本発明方法に用いられるFe3+は、硫酸第二鉄
アンモニウム、塩化第二鉄などであり、Fe2+に
特異的に反応するキレート剤としては、例えば、
バソフエナンスロリンスルホン酸ナトリウム、２
−ピリジルアルドキシム、３−（２−ピリジル）−
５，６−ビス（４−スルホニル）−１，２，４−
トリアジンスルホン酸ナトリウム、オルトフエナ
ンスロリンが適当である。また、電子伝達剤とし
ては、たとえばフエナジンメトサルフエート
（PMS）、メルドラブルー、メトキシフエナジン
メトサルフエート（Ｍ−PMS）、デイアフオラー
ゼが適している。緩衝液としては、トリエタノー
ルアミン緩衝液の他、反応に関わる酵素等の反応
至適条件を満足するような成分とPHを選択するこ
とができる。
に関する。 〔従来の技術〕 近年、酵素法による生体成分の分析法が広く普
及し、生体中の酵素あるいは非酵素成分の測定系
に、種々の共役反応を利用する場合が非常に多く
なつた。中でも脱水素酵素群は、検出が容易な
NAD又はNADPが関与するため適用範囲が広
く、クレアチンキナーゼ測定系におけるグルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素、トリグリセライド測
定系におけるグリセロール脱水素酵素などがその
よい例である。現在、NADH又はNADPHの検
出は、一般にホルマザン発色系の共役によつて行
われているが、この方法では色素が水に難溶容性
であり、又、反応条件により発色度が異なるので
正確な分子吸光係数を適用しにくい。さらに測定
器具に色素が吸着するなどの欠点がある。 最近、これらの諸問題を解決する新しい発色系
の利用が報告されている。例えば、脱水素酵素−
基質−NADの反応系にFe3+、電子伝達剤及び
Fe2+に特異的に反応するキレート剤を添加した
緩衝液中で次の反応を行わせ、結果として生成し
た着色化合物を比色定量することによる、トリグ
リセライドの測定方法が発表されている（特開昭
54−80192号公報）。 NAD＋気質脱水素酵素 ―――――→NADH＋生成物 NADH＋2Fe3+電子伝達剤 ―――――→ NAD＋2Fe2+ Fe2+（キレート剤）→錯化合物（着色） この方法は、生成する着色物が水溶性であり、
感度もかなり高い。しかしながら、試薬ブランク
値の経時変化が著しいので、比色時には検体ごと
に試薬ブランク値による分光光度計のゼロ調整を
しなければならず、測定する試料件数が限られ、
多検体処理には不適当であつた。 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明者は、この試薬ブランク値の経時変化を
抑制し、比色時の煩雑な操作を除くことにより多
検体処理を可能にするため、種々研究を行つた結
果、試薬ブランク値の上昇は試薬中に含まれる
種々の成分によるFe3+の非特異的還元に帰因し、
とくに酵素蛋白やその夾雑物量に依存して増大す
る傾向があることを見出し、更に、それに効果的
な隠ぺい剤、すなわちFe3+と錯化合物（キレー
ト）を形成するキレート剤を使用することにより
試薬ブランク値の経時変化の抑制が可能であるこ
とを見出した。本発明はかかる知見に基づくもの
である。従つて、本発明方法は、広く一般に脱水
素酵素及びNAD又はNADPを含む測定系に応用
することが可能であり、ホルマザン法にかわる比
色法として、NADH又はNADPHの検出に適用
することができる。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、脱水素酵素と酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（NAD）又は酸化型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（NADP）とを含む酵素反応系により生成する還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NADH）又は還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸（NADPH）の量に対応し
て、電子伝達剤の存在下で第二鉄イオン（Fe3+）
から還元生成する第一鉄イオン（Fe2+）の量を、
Fe2+に特異的に反応するキレート剤の作用によ
り生成する着色化合物として比色定量する方法で
あつて、 前記キレート剤とは別に余剰のFe3+を隠蔽す
るキレート剤としてエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）を含有するPH5.0〜8.6の緩衝液を、基
質の定量の場合には反応が終結した時点で加え、
酵素の定量の場合には酵素反応を停止させる時点
までの規定時間反応させた直後に添加することを
特徴とする、基質又は酵素の定量方法に関する。 即ち、簡単に言えば、本発明方法は、電子伝達
剤の存在下に、脱水素酵素反応により生成した
NADH又はNADPH量に対応してFe3+から還元
生成するFe2+を錯化合物として比色するにあた
り、余剰のFe3+と測定波長に吸収スペクトルを
示さないキレート化合物を生成するキレート剤を
添加して反応を停止させるとともに試薬ブランク
値の経時変化を抑制することを特徴とする基質又
は酵素の改良された定量方法である。 本発明方法におけるキレート剤、即ち、エチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）の効果は、Fe3+と
安定な錯化合物（キレート）を形成し、Fe3+が
還元されるのを抑制する作用で説明することがで
きる。従つて、反応時にキレート剤を共存させる
と、測定反応それ自体であるFe3+の還元を阻害
する可能性がある。そこで、実際に本発明方法を
実施する際には、基質の定量の場合には反応が終
結した時点でキレート剤を加え、酵素の定量の場
合には、酵素反応を停止させる時点までの規定時
間反応させた直後にキレート剤を（必要により酵
素反応停止剤と共に）加える。キレート剤が同時
に酵素反応を停止する作用を有する場合もある。 本発明で使用するキレート剤はエチレンジアミ
ン四酢酸（EDTA）である。 キレート剤は、その濃度とPHにより、効果がか
なり左右されるため、使用する際には条件設定が
重要となる。 次に、本発明のキレート剤であるエチレンジア
ミン四酢酸（EDTA）、及びこれと同様の効果を
有する以下のキレート剤等について、各種の条件
を具体的に示す。 ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸
（EDTA−OH） ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA） ジアミノプロパノール四酢酸（DPTA−OH） ニトリロ三酢酸（NTA） トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸
（CyDTA） ジヒドロキシエチルグリシン（DHEG） リン酸塩 表１及び表２は、後述の参考例１の乳酸脱水素
酵素（LDH）は測定試薬を用いて試験を実施し
た結果を示すものである。表１には、PHが試薬ブ
ランク値の経時変化に及ぼす影響を示した。この
結果から、PHの選択によつては、かえつて逆効果
となつてしまうことがわかる。表２には、キレー
ト剤の濃度が試薬ブランク値の経時変化と呈色に
及ぼす影響を示した。この結果から、キレート剤
が高濃度になるに従つて経時的に試薬ブランク値
は減少するが、反応による呈色をも減少させる傾
向にあることがわかる。従つてLDHを測定する
場合のキレート剤としては、１〜８ｍＭ−
EDTA−OH（PH8.6）や１〜８ｍＭ−DPTA−
OH（PH8.6）、４〜８ｍＭ−CyDTA（PH8.6）が有
効と考えられる。 表３及び表４は、同様に、後述の参考例３のト
リグリセライド測定に用いるキレート剤を検討し
た結果を示すものである。これらの表から、１〜
８ｍＭ（特に１〜４ｍＭ）−EDTA（PH8.6）、１〜
８ｍＭ−DTPA−OH（PH8.6）、４〜８ｍＭ−
CyDTA（PH10.0）及び50ｍＭリン酸緩衝液（PH
6.0）が使用可能なものと判断することができる。
後述の参考例２に記載の方法に従つてクレアチン
キナーゼ（CK）を測定する場合には、ここで生
じる色素が中性以上のPHで不安定であるため、キ
レート剤を弱酸性の条件で用いることが望まし
い。 又、表５に示す様に、使用する緩衝液の種類に
よつて効果の異なるものもある。濃度を変化させ
た場合の実験結果を表６に示した。この結果か
ら、0.5〜２ｍＭのEDTA、EDTA−OH、
DTPA及びCyDTAが有効であることがわかる。 本発明方法に用いられるFe3+は、硫酸第二鉄
アンモニウム、塩化第二鉄などであり、Fe2+に
特異的に反応するキレート剤としては、例えば、
バソフエナンスロリンスルホン酸ナトリウム、２
−ピリジルアルドキシム、３−（２−ピリジル）−
５，６−ビス（４−スルホニル）−１，２，４−
トリアジンスルホン酸ナトリウム、オルトフエナ
ンスロリンが適当である。また、電子伝達剤とし
ては、たとえばフエナジンメトサルフエート
（PMS）、メルドラブルー、メトキシフエナジン
メトサルフエート（Ｍ−PMS）、デイアフオラー
ゼが適している。緩衝液としては、トリエタノー
ルアミン緩衝液の他、反応に関わる酵素等の反応
至適条件を満足するような成分とPHを選択するこ
とができる。
【表】
【表】
【表】
(1) キレート剤添加直後に測定した吸光度に
対する、60分後に測定した吸光度の百分率
で示した。
対する、60分後に測定した吸光度の百分率
で示した。
【表】
【表】
【表】
以上述べたことから、本発明方法は広く一般に
脱水素酵素及びNAD又はNADPを含む測定系へ
の応用が充分可能であり、比色時の煩雑な操作を
必要とせず、信頼度の高い測定を多検体にわたり
可能とする。又、本発明方法は高い感度を期待で
きるため、反応時間の短縮や試料の微量化も可能
であることが明らかである。
脱水素酵素及びNAD又はNADPを含む測定系へ
の応用が充分可能であり、比色時の煩雑な操作を
必要とせず、信頼度の高い測定を多検体にわたり
可能とする。又、本発明方法は高い感度を期待で
きるため、反応時間の短縮や試料の微量化も可能
であることが明らかである。
第１図は血清中のLDH活性の測定におけるウ
ロブレウスキー単位と吸光度との関係を示すグラ
フであり、第２図はクレアチンキナーゼ（CK）
活性測定における測定可能領域を示すグラフであ
り、そして第３図はトリグリセライドの測定にお
ける測定可能領域を示すグラフである。
ロブレウスキー単位と吸光度との関係を示すグラ
フであり、第２図はクレアチンキナーゼ（CK）
活性測定における測定可能領域を示すグラフであ
り、そして第３図はトリグリセライドの測定にお
ける測定可能領域を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 脱水素酵素と酸化型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（NAD）又は酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）
とを含む酵素反応系により生成する還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）又
は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸（NADPH）の量に対応して、電子伝達
剤の存在下で第二鉄イオン（Fe3+）から還元生
成する第一鉄イオン（Fe2+）の量を、Fe2+に特
異的に反応するキレート剤の作用により生成する
着色化合物として比色定量する方法であつて、 前記キレート剤とは別に余剰のFe3+を隠蔽す
るキレート剤としてエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）を含有するPH5.0〜8.6の緩衝液を、基
質の定量の場合には反応が終結した時点で加え、
酵素の定量の場合には酵素反応を停止させる時点
までの規定時間反応させた直後に添加することを
特徴とする、基質又は酵素の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15768390A JPH0343096A (ja) | 1990-06-18 | 1990-06-18 | 基質又は酵素の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15768390A JPH0343096A (ja) | 1990-06-18 | 1990-06-18 | 基質又は酵素の定量方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15396181A Division JPS5856698A (ja) | 1981-09-30 | 1981-09-30 | 基質又は酵素の改良された定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0343096A JPH0343096A (ja) | 1991-02-25 |
| JPH0442000B2 true JPH0442000B2 (ja) | 1992-07-10 |
Family
ID=15655108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15768390A Granted JPH0343096A (ja) | 1990-06-18 | 1990-06-18 | 基質又は酵素の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0343096A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2185647T3 (es) * | 1993-01-28 | 2003-05-01 | Roche Diagnostics Corp | Composiciones utiles en la determinacion anaerobia de analitos. |
| EP1466987B1 (en) * | 2001-12-28 | 2008-11-19 | Arkray, Inc. | Method of colorimetry |
| KR100693899B1 (ko) | 2001-12-28 | 2007-03-12 | 아크레이 인코퍼레이티드 | 비색 분석 방법에 이용하는 시약 |
-
1990
- 1990-06-18 JP JP15768390A patent/JPH0343096A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0343096A (ja) | 1991-02-25 |
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