JPH0437720B2 - - Google Patents
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- JPH0437720B2 JPH0437720B2 JP60096553A JP9655385A JPH0437720B2 JP H0437720 B2 JPH0437720 B2 JP H0437720B2 JP 60096553 A JP60096553 A JP 60096553A JP 9655385 A JP9655385 A JP 9655385A JP H0437720 B2 JPH0437720 B2 JP H0437720B2
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Description
産業上の利用分野
本発明は生物試料中の標的ヌクレオチド配列
（DNA、RNAどちらも）の存在を検出する診断
用検定法およびそのポリヌクレオチド試薬複合体
に関する。 従来の技術 生物試料中の特定のポリヌクレオチドの存在を
検出する通常の方法においては典型的には最初の
工程として、表面上に試料の核酸を固定する。一
度試料が固定化されたら通常放射活性リン原子の
ごとき検出可能な標識を付けたプローブポリヌク
レオチドを、固定化試料が標的スクレオチド配列
を持つている場合はプリン／ピリミジン塩基配列
−特異的相補塩基対形成により固定化試料に結合
するように固定化試料とインキユベートする。ハ
イブリダイズしていない標識プローブを洗い流し
た後、保持体上の標識の存在または不在を決定す
る。この決定のための技術には写真フイルムへの
暴露、液体シンチレーシヨン計数および螢光顕微
鏡の使用などが含まれる。 Wardおよび共同研究者（EPA63.879（1982）参
照）はプローブに直接検出可能な標識を付けるよ
り、むしろプローブにある種のヌクレオチド上に
ビオチンのごとき非アイソトープ置換基を付けた
前記技術の変更について記載している。そのよう
な場合においてはハイブリダイズしないプローブ
を洗い流した後保持体を酵素にアビシンを結合し
たような試薬と接触せしめる。アビジン−酵素複
合体は、高いアビジン−ビオチン結合親和性のた
めビオチンに選択的に結合し、標的ヌクレオチド
配列が固定化された基質上に選択的に酵素を固定
する。その後、酵素の基質を添加し、酵素反応の
生成物を検出し、基質上の標的ヌクレオチドの初
期濃度に機能的に依存した増幅された信号を得
る。ENZO BIOCHEM、INCのEPA97.373（1984
年１月４日）もまた参照されたい。 上記の非アイソトープ系の変法はIllinoisの
Standard石油の他のヨーロツパ特許出願にもま
た記載されており、その中の一つの様式（その８
−10ページ参照）においては標的ヌクレオチド配
列に特異的な２つのプローブを使用する。標的ヌ
クレオチド配列の第１の部分にハイブリダイズで
きる第１のプローブを固型保持体に固定すると、
固型保持体と生成物質の試料とのインキユベーシ
ヨンにより試料中の標的ヌクレオチド配列はこの
第１の固定化プローブを通して、選択的に保持体
に結合する。その後、標的ヌクレオチド配列の第
２のしかも異つた部分と選択的にハイブリダイズ
できる第２のプローブを使用し保持体と接触せし
める。再び、もし生物試料中に標的ヌクレオチド
配列が存在していたら、第２のプローブはそのヌ
クレオチド配列に選択的に結合するであろう；お
よび結合構造（またはサンドイツチ）が生成し、
第１のプローブおよび標的ヌクレオチド配列を通
して第２のプローブが保持体に結合する。参考文
献にはこの第２のプローブの、直接または間接的
に光の特定の波長を発生または吸収するものによ
る標識について記載されている（例えば、螢光標
識、リン光標識または化学発光標識）。各々の段
階において非結合の溶液構成物をら保持体を分離
する事により、第３の分離後の保持体の相中の標
識の存在は試料中の標的ヌクレオチド配列の存在
および濃度の関数となる。Orion−Yhtma Oyの
WO83／01459もまた参照されたい。 二重鎖試料核酸を溶液中で制限酵素により消化
し、続いて特定の大きさのフラグメントをろ紙上
で検出する特定の標的ヌクレオチドのための異つ
た診断法がWilsonらにより米国特許4395486号に
記載されている。その記載によると、鎌状赤血球
貧血の原因となる一つの塩基置換が制限酵素切断
の特異部位を消滅させ、その後は通常検出される
２つの特定の大きさの小さなフラグメントの検出
される量が減少するか（鎌状赤血球形成傾向）ま
たは検出されなくなる（鎌状赤血球貧血）。 上記の方法は多くの場合生物試料中のヌクレオ
チド配列の存在を検出するであろうが、各々多工
程または長いインキユベーシヨン期間を必要とす
る工程があるなどの欠点のため、臨床実験室での
簡便な使用が実際上できない。さらに、これらの
多くの方法は妨害ポリヌクレオチド配列またはバ
ツクグラウンド信号に対する確かな標的ヌクレオ
チド配列の低いレベルでの検出に関しての選択性
または感度には限界がある。特に、標識プローブ
の非特異的結合は各々の方法において本質的なバ
ツクグラウンド信号源の代表となる。 標的ヌクレオチド配列のための生物試料の分析
から離れてもハイブリダイゼーシヨン（相補ポリ
ヌクレオチド配列間の二重鎖らせんの形成）の物
理化学の種々の面が研究されてきた。これらの研
究に、インビボおよびインビトロ両系での核酸の
鎖移動および置換の現象の試験がある。しかしな
がらそのような研究を参照すると鎖移動および置
換現象の診断および検出への明瞭な適応性は認め
られなかつた。C.GreenおよびC.Tibbettsは
Nucleic Acids Research ９巻、８号、1905−18
ページ（1981）において6.1kb（6100塩基）単一鎖
DNAポリヌクレオチドがその真中付近（1.7−
3.3kb間）で1.6kb長の末端標識相補DNAポリヌ
クレオチドとハイブリダイズした複合体（ハイブ
リツド）の形成について記載している。溶液中で
この複合体に6.1kb相補鎖を添加すると標識ポリ
ヌクレオチドの急速な置換（この参考文献の1910
ページの図２を参照せよ）が起こり、これは反応
混合物の一部を取り、ゲルクロマトグラフイーに
より分離し、オートラジオグラフイーにより分析
する事によりモニターされる。置換された1.6kb
ポリヌクレオチドは85分以上の期間（濃度に依存
する）放射活性信号の10％未満から90％以上へ一
定に増加し、残りの放射活性の大部分は1.6／
6.1kbハイブリツドにある。総質量当量がDNAの
13.8kbである仮定される部分置換中間体（両方の
長鎖および部分的に置換された短い鎖）は明らか
に検出されていない。著者は分枝種を形成する２
つの6.1kbポリヌクレオチドの最初のハイブリダ
イゼーシヨンが律速段階であり；標識ポリヌクレ
オチドの1.6kb対領域に沿つた置換は非常に速く、
0.8分の分枝（13.8kb質量当量）種の計算平均寿
命と一致すると結論している。彼れは単一分枝ま
たは二重の核の（Ｄ−ループ）中間体種両方の可
能性を示している（参考文献の1912ページに例示
されている）。分枝移動現像のより詳しい研究の
ため、彼らは移動現像を遅らすであろう薬剤を使
用しおよび／または1.6kbハイブリツド塩基対以
上の複合体を使用して置換過程を遅らせようと試
みた（参考文献の1913−1914ページ参照）。1.6／
6.1kb種はGreenらにより挑戦されたが、6.1kb相
補鎖のみであり、どんな非特異鎖も精製されてい
ない事は注意すべき事である。 核酸生化学の別の論文では鎖ハイブリダイゼー
シヨン過程の間核酸と相互作用する重合種が試験
されている。ポリ（エチレングリコール）のごと
きポリエーテルはウイルス粒子単離（K.R.Yama
−motoら、Virology40巻、734−744ページ
（1970））、核酸精製（B.Alberts、Methods in
Enzymology、S.P.ColowickおよびN.O.Kaplans
編集、（Academic Press、N.Y.）、12巻、566−
581ページ（1967））、タンパク質精製（K.G.
Ingram、Arch、Biochem.Biophys、194巻、59
−68ページ（1977））、哺乳類細胞融合（G.Galfre
ら、Natuve266巻、550−552ページ（1977））、お
よび特定の酵素活性の促進（B.H.Pfeifferおよび
S.B.Zimmerman、Nucleic Acids Research、
11巻、7853−7871ページ（1983））のごとき種々
の特異的な生物または生化学過程での使用が観察
される。M.RenzおよびC.KurzはNucleic Acids
Research、12巻、3435−44（1984）（これは本発
明の従来の技術を構成しない）において固定化試
料型のDNAプロープ検定（特にサザンブロツト
と称される型）におけるハイブリダイゼーシヨン
の速度を促進する容積排除剤としてのポリエチレ
ングリコールの使用を記載している。この参考文
献の特に3441ページを参照されたい。この点につ
いては種々の型の他の容積排除ポリマーも適合し
た単一鎖のハイブリダイゼーシヨンの速度を促進
する事が示されている。Wetmurら、
Biopolymers、10巻、601ページ（1971）（硫酸デ
キストラン）、Wahlら、Proc.Nat.Acad.Sci.、76
巻、3683ページ（硫酸デキストラン）を参照され
たい。一般にこの点で有益なポリマーはDNAと
反応しない非イオン性またはアニオン性の水可溶
ポリマー（ポリサツカライドを含む）である。S.
B.Zimmermanら、Proc.Nat.Acad.Sci.、80巻、
5852−56ページ（1983）；B.H.Pfeifferら、上記
文献；水可溶合成ポリマー（P.Molynevx編集；
CRC Press、Inc.、Cleveland、OH−２巻、
1983）を参照されたい。 発明の概要 本発明は試料の標的ヌクレオチド配列
（targetnucleotide sequence）によるプローブヌ
クレオチドからの標識ポリヌクレオチドの急速な
置換（displacement）に基づいており、置換さ
れた標識ポリヌクレオチド中または上に観察され
る標識の直接または間接的な測定を可能にする
（または、ある場合には標識ヌクレオチドは置換
されない）。この方式は試料中の標的ヌクレオチ
ド配列の存在および濃度の機能的に相関した信頼
できる定量的な測定に役に立つ。従つて本発明は
以下の工程を特徴とする生物試料の核酸中の前も
つて決定されている標的ヌクレオチド配列
（DNAおよびRNA両方）の存在を決定する方法
を包含する： (a)() 標的ヌクレオチド配列にプリン／ピリミ
ジン塩基の水素結合を通して塩基対結合がで
きるプローブポリヌクレオチド、および
（）プロ−ブポリヌクレオチドが標的ヌク
レオチド配列に結合できる領域と少くとも部
分的に同じ長さ（coextensive）のプローブ
ポリヌクレオチドの領域でプリン／ピリミジ
ン塩基対の水素結合を通しての塩基対結合に
よりプローブポリヌクレオチドへ結合された
標識ポリヌクレオチドの試薬複合体
（reagent complex）を提供し； (b) 標的ヌクレオチド配列がもし存在するなら、
プローブポリヌクレオチドと結合し、試薬複合
体から標識ポリヌクレオチドを置換する条件下
試薬複合体と試料を接触せしめ； (c) 試薬複合体から置換された標識ポリヌクレオ
チドまたは試薬複合体に残存する標識ポリヌク
レオチドの両方の存在（大まかな量の決定を含
む）を決定する。 本発明はまた以下の試薬複合体を特徴とする生
物試料の核酸中の標的ヌクレオチド配列の存在決
定のための診断用試薬も包含する： () 標的ヌクレオチド配列にプリン／ピリミジ
ン塩基対の水素結合を通して塩基対形成ができ
るプローブポリヌクレオチド、および () プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオ
チド配列に結合できる領域と少くとも同じ長さ
のプローブポリヌクレオチドの領域でプリン／
ピリミジン塩基対の水素結合を通して、プロー
ブポリヌクレオチドへ結合された標識ポリヌク
レオチド； 標的ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレオ
チド間の塩基対形成が標的ヌクレオチド配列に対
し十分な累積結合強度（以下に定義されるよう
な）であり、もし試料中に標的ヌクレオチド配列
が存在すると、それに試薬が接触し、試薬複合体
から標識ポリヌクレオチドを置換できる。 本発明はさらに、置換標識ポリヌクレオチドの
発現の速度を増加するために十分な量の非イオン
性またはアニオン性（ポリエーテルが良好である
が必ずしもポリエーテルでなくてもよい）の容積
排除不活性ポリマーが存在する方法もまたはその
ような試薬複合体を含む診断用キツトも包含す
る。特定の置換されたポリヌクレオチドの発現の
速度を増加するこの効果は本明細書においてしば
しば増加した置換速度の結果として起こる事と解
釈される。その場合、その術語は実際の置換工程
が顕微鏡または分子レベルで促進される事を示す
と読みとつてはならない。実際、申請者は現在、
プローブポリヌクレオチドへの拮抗鎖のハイブリ
ダイゼーシヨンにおける最初のヌクレエーシヨン
段階（第１Ａ図および第１Ｂ図参照）が律速段階
であり、容積排除ポリマーにより促進されると信
じている。もしそれが真実であるなら、全速度の
増加を達成するためには顕微鏡または分子レベル
での置換工程（第１Ｃ図、第１Ｄ図および第１Ｅ
図参照）の促進は必要とされない（第１Ａ図と第
１Ｅ図の比較。） 発明の詳細な説明 本明細書において以下の術語は分子生物学の分
野において一般的に受け入れられている意味に基
づいて使用された： ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖は
互に3′，5′−リン酸ジエステル結合により結合さ
れ、ウラシル（天然にはrUのごとくリボースの
みと結合）、チミン（天然にはdTのごとくデオキ
シリボースのみと結合）、シトシン（dCまたは
rC）、アデニン（dAまたはrA）およびグアニン
（dGまたはrG）のごとき（しかしこれらに限定
されるわけではない）張出たプリンまたはピリミ
ジン塩基と糖の１位の炭素の位置で炭素−窒素結
合により結合されたペントース糖類（一般にリボ
ースまたはデオキシリボース）の直線重合構造を
称する。それ故ポリヌクレオチドはデオキシリボ
核酸（DNA）鎖およびリボ核酸（RNA）鎖を含
む。 そのようなポリヌクレオチド鎖の末端は、ペン
トースの５位の炭素が別のペントースと結合して
いない（しかし水酸基、モノリン酸磯または他の
天然または合成部分と結合）部位は５プライム
（5′）末端、およびペントースの３位の炭素が別
のペントースと結合していない（しかし同様に水
酸基、モノリン酸塩または他の天然または合成部
分と結合）部位は３プライム（3′）末端と呼ばれ
る。 相補塩基体形成またはプリン／ピリミジン塩基
対形成は２つの逆平行ポリヌクレオチド鎖上の張
出し反対部位の塩基間の水素結合を意味し、dG
がdCを反対側であり、dAがdTの反対側であるの
が天然のDNAでは最もエネルギ的に好ましい。
５つの天然に優勢に存在するもの以外の塩基もま
た良好な対形成を行う：例えば、５−メチルシト
シンはグアニンと良好に結合する。説明のため、
この対形成は多くの図に示してあり、逆平行方向
に向いた5′から3′という意味において）相補鎖と
ともに平行な直線で示してある。しかしながら２
種鎖セグメントの実際の形は通常、第１Ｄ図に模
式的に示したごとき種々のピツチのらせん状（よ
く知られている２重らせん）であろう。 本明細書で使用するハイブリダイゼーシヨンと
は２重鎖構造の形成の助けとなる条件下２つのポ
リヌクレオチドを混合し、相補塩基体形成でその
２重鎖構造を形成し、それには相補配列またはほ
とんど相補配列のものが存在する事を意味する。 本発明の方法の基本的な成分はプローブポリヌ
クレオチド（しばしば本明細書ではプローブ
（probe）と称する）、標識ポリヌクレオチド（し
ばしば本明細書では標識（タツグ）ポリヌクレオ
チドまたは放出標識（releasetag）と称される）、
および核酸を含む生物試料（その一部は本明細書
ではしばしば標的ポリヌクレオチドまたは標的ヌ
クレオチド配列と称される）である。試料は標的
ヌクレオチド配列を含むかもしれないし、含まな
いかもしれない。ある場合にはポリエーテル化合
物のごとき容積排除ポリマーもまた提供される。
ある場合には保持体もまた提供され、それにプロ
ーブを通して試薬複合体を固定化するか（そのよ
うな場合プローブはしばしば固定化プローブまた
は固定化プローブポリヌクレオチドと称される）、
または、他の場合、分離工程の一部として、決定
または工程の一部としての置換を起こす。本方法
を実施するには、読み出しのため追加の試薬また
は器具がしばしば必要である；術語“読み出し
（readout）”は、一つまたはそれ以上の相の（通
常分離されている）反応物質中、特に試薬複合体
からの置換およびプローブポリヌクレオチドおよ
び試薬複合体からの置換標識ポリヌクレオチドの
溶液への分離により液相中に存在する標識ポリヌ
クレオチドの直接または間接的検出を意味する。 本発明の実施においては、プローブポリヌクレ
オチドはそのプリン／ピリミジン塩基配列の少く
とも一つの領域が相補塩基対形成により特異的な
試料の標的ヌクレオチド配列へ特異的に結合でき
る直線または環状ポリヌクレオチドである。この
結合はDNAおよびRNA間、DNAおよびDNA間
またはRNAおよびRNA間でもよい。したがつて
プローブはDNAまたはRNAでよい。以下により
充分に議論するごとく、プローブの特異的領域の
みが標的ヌクレオチド配列に選択的に結合するの
が一般的である。プローブの他の領域は種々の天
然のまたは合成配列であり、標的ヌクレオチド配
列とのハイブリダイゼーシヨン反応には関与しな
いが、本発明においては重要な役割を果たす（例
えば保持体への付着のための部位を確保し、もし
望むなら、支持体と標的ヌクレオチド配列が結合
する領域の間にある程度のすき間を提供する）。 本明細書で標的結合領域（図におけるTBR）
と称する標的ヌクレオチドが特異的に結合するプ
ローブの領域に関しては、プローブ配列中の各々
のヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列中にその
正しい相補結合相手（例えばdTに対するdA）を
発生するという意味において結合は完全であるか
（良好なものは完全である）、またはいくつかの不
適合を含んでいるであろう。プローブを標的結合
領域の少くとも一つの部分は、好ましくは試薬複
合体では単一鎖であり、即ち、標識ポリヌクレオ
チド配列と相補的ではなく、また自己相補的でも
ない；この単一鎖領域は、標的ヌクレオチド配列
が標識ポリヌクレオチドを置換する事なくこの領
域の塩基に結合する事ができるので、本明細書で
はしばしば初期結合領域（図におけるIBR）と称
する。プローブのそのような初期結合領域は少く
とも15塩基の長さであり、良好であるのは少くと
も50塩基の長さである。総標的結合領域は初期結
合領域およびほとんどのまたは（良好なのは）す
べての標識ポリヌクレオチド結合領域（図におけ
るLBRおよび以下に議論する）を含んでいる。
総標的結合領域は別個に決定的でないが、良好な
またはより良好なIBRおよびLBR領域の長さの
合計の関数のごとく考えられる。 500以上のプローブの初期結合領域の塩基の長
さは一般的に必要ではないが、多くの場合著しい
短所にはならない。臨床実験室への適用のための
この塩基対形成領域の適した短い方の限界はいく
ぶんプローブポリヌクレオチドの標的結合領域の
塩基配列および以下に記載する塩基組成および他
の物理的因子に依存し特に、意図したハイブリダ
イゼーシヨンの条件、支持体へのプローブの付着
の様式（もしあれば）、ハイブリダイゼーシヨン
の動力学および用いる読み出し系に依存する。 ある種の実施態様においてプローブが固定化さ
れる固体相は特殊な重合物質、セラミツク物質、
試験管または他の容器の壁、紙、ニトロセルロー
スまたはガラスを含むほとんど通常の型のもので
ある。本発明のある様式においては、固体相は、
タンパク室、固定細胞またはウイルス、またはポ
リスチレンのごとき種々のポリマー、ラテツクス
またはガラスのごとき物質で作られた天然の、改
良された天然のまたは合成の粒子またはビーズか
ら成る。 本発明のある種の実施態様において固型支持体
へのプローブの付着の手段は、単なる吸着でもよ
いが、特定の共有結合、イオン結合、疎水性の相
互作用または水素結合などのいくつかの様式が良
好である。共有結合の場合、支持体表面上の化学
部分（例えばアミンまたはカルボキシル部分）と
ポリヌクレオチド、特にポリヌクレオチドの末端
糖環上の水酸基またはリン酸部分の間の反応によ
り結合は直接的である。3′末端に通常存在する遊
離２級水酸基に特異的な結合剤には亜リン酸塩、
無水こはく酸およびフタルアミドが挙げられる。
糖の5′末端上に通常存在するリン酸（少くとも多
くの天然に存在するポリヌクレオチドまたは多く
の切断反応の生成物）に特異的な結合剤には、１
−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカル
ボジイミドのごときカルボジイミドを、イミダゾ
ールまたは１−メチルイミダゾールの存在下また
は非存在下用いる。B.C.F.Chuら、Nucleic
Acids Research11巻、6513−29ページ（1983）
を参照されたい。プローブの末端または他の小さ
な部分に特異的なそのような結合がもし標的結合
領域から離れていれば、吸着または他の同様な付
着の物理的または非特異的な化学手段と比較する
とハイブリダイゼーシヨン反応の間の自由度の程
度はかなり大きい。自由度がそのように非常に大
きいと、標的結合領域の最小長またはハイブリダ
イゼーシヨンが検出可能なレベルに進行するまで
の最小時間を低下させることができる。 非特異的共有結合にはｍ−アミノベンジルオキ
シメチル（ABM）、ｍ−ジアゾベンジルオキシ
メチル（DBM）またはｏ−アミノフエニルチオ
エーテル（APT）のごとき部分を通しての基質
と鎖に沿つた遊離塩基の間の結合が挙げられる。
H.Bunemannら、Nucleic Acids Research、10
巻、7163−7196（1982）（２つの論文）を参照され
たい。他の典型的な非特異的結合の化学はB.
Seedによる米国特許4286964号（1981）に記載さ
れている。 直接共有結合に加えて、連結またはスペーサー
分子により共有結合型で間接的にプローブポリヌ
クレオチドを支持体に結合できる。間接共有結合
試薬の例には、カルボジイミドの化学により支持
体上の官能基（例えばエステル）およびポリヌク
レオチドの5′末端糖上に通常存在するリン酸基の
両方に反応できるスペーサー試薬がある。そのよ
うなスペーサー分子としては、一度末端リン酸基
に結合しその後Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルのごとき支持体上の活性基と結合する、上
記引用論文（Chuら）において使用された脂肪族
ジアミンがある。他のスペーサー分子にはヒドロ
キシアルカン酸が挙げられる。なお他のスペーサ
ー分子はヒドラジン部分を持つ支持体と直接反応
し、ヒドラゾンを形成するフエニルケトンのごと
き官能部分を持つことができる。 さらに、プローブのある部分と支持体に吸着ま
たは共有結合的に結合している親和試薬との相互
作用により支持体に非共有結合的にプローブが結
合される。例としては(1)標的ヌクレオチド配列へ
結合できるプローブの領域と重ならないプローブ
ポリヌクレオチドの部分にハイブリダイズできる
短い単一鎖ポリヌクレオチドを支持体に固定化す
る、および(2)１つまたはそれ以上のアビジンまた
はビオチン部分を持つ化学的に改変したプローブ
ポリヌクレオチドを支持体上に吸着または共有的
に結合したビオチンまたはアビジン部分を各々持
つ支持体に結合させる方法がある。後者の方法は
小さな分子ビオチンのタンパク質アビジン（また
はストレプトアビジン）に対する高い親和性
（Kdiss約10-15M）に基づいている。 本発明はプローブの支持体への付着点または複
数の付着点と法的ヌクレオチド配列に特異的に結
合するプローブポリヌクレオチドの領域の間のス
ペーシングに関して限定するわけではないが、プ
ローブの標的結合領域が充分で良好なハイブリダ
イゼーシヨンの間の運動の最大に得られる自由度
を持つように標的ヌクレオチド配列とプローブポ
リヌクレオチドの標的結合領域間のハイブリダイ
ゼーシヨンにはこのスペーシングが充分大きい事
が良好である。 本発明の他の実施態様においてはプローブポリ
ヌクレオチドは支持体に固定化されず、溶液中で
あつたとしてもハイブリダイゼーシヨンが起こる
ように試薬と生物試料を混合するのですべての試
薬複合体は溶液中に存在する。いくつかのこの溶
液ハイブリダイゼーシヨン実施態様においては、
例えば支持マトリツクスにストレプトアビジンが
結合されている多孔性ベツドまたはフイルターに
反応混合物を通過させる事により、ハイブリダイ
ゼーシヨン後にもし望むなら固定化または分離で
きるようにプローブは置換基（親和剤のごとき、
例えばビオチン、または化学部分、例えばニトロ
フエノールのごときハプテン）を含有する。その
ような固定化により続いての決定のため置換され
た標識ポリヌクレオチドのみが液体相に残存する
ようになる。本発明の他の様式の溶液ハイブリダ
イゼーシヨンではサイズ排除クロマトグラフイー
（実施例２を参照）、電気泳動（例えば実施例１を
参照）または他の物理的分離技術のごとき別の分
離法を用いる。本発明のそれ以外の型は、複合体
の分離をせずに置換標識ポリヌクレオチドを決定
する読み出しに関連してより充分に以下に記載す
る。もちろん、分離なしのそのような決定法の多
くは、複合体が固定化プローブポリヌクレオチド
に含まれている過程においても同様に応用され
る。 プローブポリヌクレオチドは種々の方法により
再現性よく製造でき、例えば細菌または他の適し
た微生物から単離された適したプラスミドの一部
またはウイルスベクターとしてまたはその中へク
ローン化し、微生物の遺伝物質の一部としてまた
は他の患者を生物源として得る。一般的にプロー
ブポリヌクレオチド配列（一部が標的結合領域を
形成する）を含む核酸の小さな領域が組換え技術
によりそのようなクローニングベクター中に挿入
される；残り（もしあるなら）のプローブポリヌ
クレオチド配列ではないクローン化挿入物は、標
的ヌクレオチド配列に対するポリヌクレオチド配
列の異種構造のため都合よく選択できる。本発明
のある実施態様において、そのような異種配列は
独特の制限酵素認識部位の存在のごとき特定の性
質で計画的に選択される配列を含んでいる。ある
種の条件下、すべての遺伝子またはすべての遺伝
子を含む配列が環状または直線状の形でベクター
と挿入されたヌクレオチド配列とともに挿入物と
して使用される。製造された時プローブポリヌク
レオチドが２重鎖である場合、変性（熱的、PHの
調製により、または他の常法による塩基対形成の
破壊により）は通常単離に続いて起こる。切断
（特に制限酵素または部位特異的化学切断）は通
常希望の直線形の２重鎖セグメントを形成するた
めに使用し、もし２重鎖環状型が成長していれば
変性に優先するであろう。ある場合には、プロー
ブポリヌクレオチドとして個々に使用するため、
または一つをプローブポリヌクレオチドおよび他
のものを標準ポリヌクレオチドの前駆体とするた
め２重鎖から個々の鎖を精製するのが良好であろ
う。この精製は変性ゲル電気泳動またはアフイニ
テイクロマトグラフイーのごとき常法により実施
する事ができる。いくつかの例においてはM13バ
クテリオフアージのごとき単一鎖ベクターを用い
る複製により単一鎖分子としてプローブポリヌク
レオチドが産生される。いくつかの別の例におい
ては（以下に記載するごとく）、プローブポリヌ
クレオチドおよび標識ヌクレオチドは同じ分子の
一部として製造できる。 本発明の方法および試薬で使用する標識ポリヌ
クレオチドは一般的にプローブポリヌクレオチド
より小さいDNAまたはRNA断片であり２つの点
が重要である：(a)安定であるが、特定の位置でプ
ローブへ可逆的に結合する、および(b)特に置換後
に標識が検出を受け易い。これらの点は、ある種
の型の標識が持つている安定性および置換への影
響を考慮した後で別々に議論する。 標識ポリヌクレオチドおよびプローブポリヌク
レオチド間の対形成は一般的に標的ヌクレオチド
配列およびプローブ間の対形成より小さな数の塩
基上で起こる。多くの場合標識ポリヌクレオチド
が特異的に係合するプローブポリヌクレオチドの
塩基は、後で試料の標的ヌクレオチド配列へ結合
するプローブの塩基の部分集合であり、それ故先
にプローブの結合領域と称した部分を表わす。 本明細書で使用する標識ポリヌクレオチド結合
領域（LBR）という術語は複合体において標識
ポリヌクレオチドが結合するプローブの塩基の配
列を意味する。良好な実施態様においては（すべ
ての図により例示したごとく）標識ポリヌクレオ
チド結合領域はまつたく標的結合領域の一部であ
り（特に第１Ａ図参照）；他の実施態様において
は（第１Ｇ図を参照）；標識ポリヌクレオチド結
合領域の一部（しかし良好なのは大部分）が標的
結合領域の一部である。プローブポリヌクレオチ
ドの標的ヌクレオチド結合領域外の標識ポリヌク
レオチド結合領域が約15塩基以上のものは、一度
この領域の塩基対形成を通しての付着のみになる
とプローブからの標識ポリヌクレオチドの解離が
非常に困難になる為良好ではない。いくつかの良
好な実施態様においては、標識ポリヌクレオチド
が結合するプローブポリヌクレオチドの領域は試
料の標的ヌクレオチド配列が続いて結合するプロ
ーブポリヌクレオチドの大きな領域の一つの末端
の近くの部分集合である。いくつかのそのような
実施態様においては、もし試薬複合体中でプロー
ブが固定化されていると、前記の大きな領域の一
つの末端は直線状プローブポリヌクレオチドの末
端またはその近くである（第１Ａ図に例示し、以
下に議論するごとく；しかしながらTBRの他の
末端もLBRとして使用される事に注目された
い）。 現在、標識ポリヌクレオチドおよびプローブポ
リヌクレオチドの明確な実体は理解されていない
が、それらは単に相補塩基対形成により結合し、
各々のプローブポリヌクレオチドにただ一つの標
識ポリヌクレオチドが結合するのが必要であり、
または標識ポリヌクレオチド当りただ１つの標識
部分（タツグ）がある。標識ポリヌクレオチドの
プローブへの結合に他の型もまた存在するが、一
般的に良好ではない。分離を行わない実施態様に
おいては他の手段では検出法において全く置換さ
れたかのように思われる置換された標識ポリヌク
レオチドがまだ結合しているかいないかに依存し
てそのような他のプローブの標識ポリヌクレオチ
ドの結合の切断が必要とされる場合もあるし、さ
れない場合もある。そのような他の結合の切断は
置換前、中、または後であるがしかし、少くとも
決定工程の前が良好である。単一プローブ鎖上の
多標識ポリヌクレオチド（図６に例示）は１置換
当り多数の置換標識が望まれる場合に特別に応用
した本発明の一つの型である。 プローブの標識ポリヌクレオチド結合領域の大
きさはその自身本発明では決定的ではない、なぜ
なら、この大きさの広い変動は相殺できる、例え
ば、置換工程の温度の変更（前記接触工程(b)）に
より、および試料が結合するプローブの領域の大
きさにより相殺。一般的に良好な標識ポリヌクレ
オチド結合領域（および対応する標識ポリヌクレ
オチドの塩基配列）の大きさは、少くとも約15塩
基であり、好ましくは少くとも20塩基、さらに好
ましいのは少くとも約25塩基である。良好な範囲
は約20から約1000塩基（より良好であるのは約20
から約500塩基、および最も良好なのは約25から
約200塩基）である。通常短い対形成セグメント
の標識ポリヌクレオチド（GC塩基含量のごとき
因子を考えて）は、もし置換工程の温度が非常に
高ければ非特異的模式でプローブから解離する
（融解温度に影響する塩濃度のごとき因子もまた
考慮しなければならない）。D.Freifelderら、
Biopolymers、７巻、81−93ページ（1969）を参
照されたい。異常に長い対形成セグメント（例え
ば1000塩基以上）には本質的に何の利点もない。
そのような長い対形成セグメントはプローブの総
標的結合領域が長くなり、標識ポリヌクレオチド
の都合よい置換のためにより長い標的ヌクレオチ
ド配列を必要とするのでしばしば良好ではない。
標識ポリヌクレオチドの結合部分がもし非常に長
いと、現在利用できるある種の技術または小さい
ポリヌクレオチドに最も適した技術によりもはや
容易には製造できなくなる：例えば、全部の標識
ポリヌクレオチドの有機化学合成、現在約100未
満および特に約60未満の標識ポリヌクレオチド結
合領域に対しては有機化学合成が一般適に容易で
ある；しかしながらそのような合成技術の改良で
より長い配列も容易に作製できる。 標識ポリヌクレオチドの最小の長さ（および、
標識ポリヌクレオチド結合領域もまた）は試薬複
合体安定度に主として相関する。この安定性に影
響する長さ以外の因子はGC含量（その融解温度
に対する効果はよく知られている）および内部塩
基対不適合である。融解温度は、１つまたはそれ
以上の内部塩基対不適合を持つ配列の有効長を確
立する有益な方法である。例としては、１つの内
部塩基対不適合を持つ30塩基の配列（故にただ29
の正しい対）はより短い適合配列のごとく振まう
（少くとも試薬複合対安定性に関して）；29塩基対
配列の振まいからの離脱の程度は不適合塩基対の
位置および行われた塩基交換に依存する。有効長
は不適合対がプリン／プリン、プリン／ピリミジ
ンまたはピリミジン／ピリミジンであるかに依存
して有効長に関して異なる事が期待される。しか
しながら、融解温度実験により有効長は経験的に
決定でき、一連のプローブ／標識ポリヌクレオチ
ド複合体はU.S.S.N.特許出願607.885の実施例８、
およびR.L.OrnsteinおよびJ.R.Frescoによる
Biopolymers、22巻、1979−2000ページ（1983）
に例示されたごとく、種々の温度の支配を受け
る。プローブと塩基体不適合を含む標識ポリヌク
レオチドの複合体の融解温度を決定し、その値を
わずかに短い長さの対形成（しかし、対領域内は
完全な塩基対適合）の複合対の融解温度と同じプ
ローブポリヌクレオチド上で比較すると、塩基対
不適合の標識ポリヌクレオチドの有効対形成長が
見積れ、上記の良好でより良好な範囲に応用され
る。しかしながら、融解温度に基く上記の相関は
第一の容易な見積り手段である事を意味する。与
えられた実際の標識ポリヌクレオチド接合領域の
実際の優先権の程度は標識ポリヌクレオチドが試
薬の貯蔵の間または使用条件下非相同核酸との接
触によりどのくらい複合体中にとどまつている
が、および適当な標的ヌクレオチド配列を持つ核
酸によりどのくらい標識ポリヌクレオチドが置換
されるかに基づいている。塩基体不適合は許され
るが、一般には良好でなく、存在する場合は、一
般的には対形成領域の2/5以下、及び良好には1/1
０以下からなる（例えば、30塩基対長領域の標識
ポリヌクレオチド／プローブポリヌクレオチド対
形成においては良好であるのは最高か３つの不適
当で27は完全に適合している）。 標識ポリヌクレオチドは対形成領域に加え、プ
ローブポリヌクレオチドに特異的に結合しないヌ
クレオチドの領域を含有している。そのような領
域は検出可能は標識に対する対形成領域を結合す
るのに役立ち、それ自身が標識され（例えば放射
性標識またはアビジン、ステプトアビジンまたは
ビオチンのごとき間接マーカーと共有結合によ
り）、または単に何の特別の機能もなく存在する。
標識ポリヌクレオチドはそれ自身線状または環状
で対形成領域以外の領域は２重鎖である（しかし
好ましくはない）。２つの環状核酸分子のハイブ
リダイゼーシヨンに対する可能な位相幾何学的強
制および標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイ
ゼーシヨンの可能な強制のためプローブポリヌク
レオチドが環状の場合は標識ポリヌクレオチドは
環状でないのが良好である。 １つまたはそれ以上の検出可能な標識は一般的
に標識ポリヌクレオチドに沿つて１つまたはそれ
以上のいくつかの点に（特に標識が放射性核また
はビオチンまたはその類似物の場合）、標識ポリ
ヌクレオチドのただ１つの末端または１つの特異
的な内部の場所のみに（例えば、プローブポリヌ
クレオチドへの塩基対形成に含まれていないプリ
ンまたはピリミジン塩基）位置している（常法を
用いて）。試薬複合体中に少くとも１つの標識ポ
リヌクレオチドが対になつていない領域があり、
標識はそのような不対領域上または内に良好に存
在または濃縮されている。使用される直接検出可
能な標識には、放射性核種（特にリン−32、イオ
ウ−35、炭素−14またはヨウ素−125標識ヌクレ
オチド）、螢光化合物（標識ポリヌクレオチドの
遊離末端または標識ポリヌクレオチドの１つまた
はそれ以上の不対塩基に結合したフルオレスカイ
ンまたはローダミン誘導体）、または比色法また
は他の方法により検出可能なニトロフエノール部
分のごとき他の手段（切断を含む）で直接検出可
能な部分が挙げられる。間接的に検出可能な標識
には、前記参考文献EPA63.879、WO83／02277
およびEPA97.373に記載されているごとき免疫化
学または他の親和反応を通して認識可能な抗原性
決定素、アフイニテイーリガンド、抗原または抗
体とし役に立つものを改変したものがあり、標識
ポリヌクレオチドに存在または加えられたビオチ
ン化ヌクレオチドにより例証される（鋳型鎖が存
在しない場合標識ポリヌクレオチドの3′末端に多
数のヌクレオチドを加える酵素末端デオキシヌク
レオチジルトランスフエラーゼによるごとく）。 他の間接的な標識は標識ポリヌクレオチドに結
合した酵素であり（特にプローブと対になる領域
から離れた遊離末端で）、その存在は具体化した
方法の置換および分離工程の後、酵素の基質を加
え、酵素基質または良好には酵素反応生性物を定
量する事により決定する。同様に、標識はアポ酵
素、補酵素、酵素改変剤、酵素コフアクターまた
はその類似の物でもよく、置換後（およびある種
の具体例では分離後）通常添加される他の必要な
試薬と、置換後（およびある種の具体例では分離
後）適当な酵素基質と一緒に用いる。もちろん、
１つの成分（例えば基質）が存在しているのに酵
素反応を起こす事ができないから、これらの他の
試薬が前記の接触（置換）工程(b)の間に溶液中に
存在するであろう。 多検出可能標識は末端デオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼ酵素を用いて標識ポリヌクレ
オチドの製造中に添加する事ができる。例えば１
つが酵素（またはアポ酵素）を含み、１つが補酵
素を含むような多標識ポリヌクレオチドもまた使
用する事ができる。酵素が標識ポリヌクレオチド
に結合する１つの型は親和試薬（例えばビオチン
に対するストレプトアビジン）を通してである。
そのような結合型は種々の実施態様で使用でき、
例えば、ビオチン標識ポリヌクレオチドのプロー
ブへのハイブリダイゼーシヨンにより複合体が調
整される場合、前記接触（置換）工程(b)に先だつ
てビオチンに共役するストレプトアビジン−酵素
を結合する。さらに、複合体中の検出可能標識に
相互作用する部分がプローブ上に存在するように
なる。 検出可能標識の多くの型、特にプローブに対す
る標識ポリヌクレオチドの対形成領域から離れて
いれば、試薬複合体融解温度がほとんどあるいは
全く減少せずおよびより重要な事であるが、標的
ヌクレオチド配列およびプローブポリヌクレオチ
ド間のハイブリダイゼーシヨン反応にほとんど影
響を与えなかつた事により証明される（試験の目
的のため）ごとく、標識ポリヌクレオチドおよび
プローブポリヌクレオチド間の塩基対形成の強度
にはほとんどあるいはまつたく影響を与えない。
塩基対形成領域の標識ポリヌクレオチドのヌクレ
オチド上に共有結合したビオチンのごとき、およ
び対形成領域またはその近くでヌクレオチドに結
合した螢光部分のごときいくつかの型の標識は、
試薬複合対安定性に明白な影響を与える。そのよ
うな効果は一般的に標識ポリヌクレオチド／プロ
ーブポリヌクレオチド結合の不安定化である（従
つてその融解温度を下げる）。その効果は置換の
速度を増すという点でいくぶん有益であるが、標
識ポリヌクレオチドの非特異的解離または“減
少”を増加させる。そのような非特異的“減少”
は置換工程の間温度を下げたり、標識ポリヌクレ
オチド結合領域の長さを増したり、または系の他
のそのような物理化学的性質の改良により通常減
少させる事ができる。 固定化プローブポリヌクレオチドおよび標識ポ
リヌクレオチド間の試薬複合体形成（そのような
複合体は本過程で提供され、本試薬に存在する）
は、標識ポリヌクレオチドのプローブポリヌクレ
オチドへのハイブリダイゼーシヨン前または後で
の支持体（前記のごとき）へのプローブの結合過
程を含む。親和または他の化学試薬をその結合の
媒介または参与に使用する。標識ポリヌクレオチ
ドのプローブポリヌクレオチドへのハイブリダイ
ゼーシヨン後固定化が完了したら、結合部分また
はその一部はプローブへすでに結合できている。
一般的にそのような固定化複合体が形成したら、
続いて、非結合の標識ヌクレオチドを洗い流す
が、その洗浄の条件はプローブへわずかに結合し
ている（例えば、希望の結合部位での多数の相補
塩基を通した結合の変わりに、プローブのどこか
に約15相補塩基以下の塩基を通しているような）
または支持体に吸着されている標識ポリヌクレオ
チドもまた除去するように計画された条件で行
う。プローブポリヌクレオチドおよびプローブポ
リヌクレオチドと標識ポリヌクレオチドの複合体
で支持体へただ端で結合しているものもまたこの
洗浄工程で除去する。洗浄は良好には充分な条件
下、充分な時間をかけて行い、本方法の置換工程
の間特異的な置換とは別に支持体から分離してく
る標識ポリヌクレオチド（プローブポリヌクレオ
チドと伴にまたは単独で）による非特異的なバツ
クグラウンド信号を実質的に除く。支持体上の非
特異的結合部位をブロツクする試薬（例えばタン
パク質）もまた使用できる。 溶液で使用する試薬複合体の製造においてもプ
ローブポリヌクレオチドを結合していない標識ポ
リヌクレオチドを生成物試薬複合体から分離して
おくのがしばしば望ましい（ある例では非結合プ
ローブポリヌクレオチドもまた除去される）。も
し（しばしばある場合であるが）標識ポリヌクレ
オチドがプローブポリヌクレオチドまたは試薬複
合体の両方よりかなり小さければ大きさのみで分
離できる（例えばサイズ排除クロマトグラフイー
により）。そのような分離は試薬複合体の少くと
も一部の２重鎖（プローブの標識ポリヌクレオチ
ド結合領域）の性質にも基づいており、そのよう
な２重鎖領域は、標識ポリヌクレオチドまたはプ
ローブポリヌクレオチドには存在しないようであ
る（両方とも非常に小さい内部結合領域を除いて
単一鎖型であると予想される）。この性質のため、
例えば２重鎖特異的抗−核酸抗体を用いるアフイ
ニテイークロマトグラフイーまたはヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフイーにより非結合標識
ポリヌクレオチドから試薬複合体を分離できる。 いくつかの例においては、標識ポリヌクレオチ
ドおよびプローブポリヌクレオチドが同じポリヌ
クレオチド鎖の一部でありうる。例えば、逆位繰
り返しを持つクローン化DNA挿入片を含むM13
バクテリオフアージから線状単一鎖DNA分子を
構成できる。これらの逆位繰り返し配列は、その
相補性により２重鎖領域を形成でき、標識ポリヌ
クレオチドおよび標識ポリヌクレオチド結合領域
を含むであろう。これらの繰り返しの間または隣
接して位置した配列が初期結合領域を含み、標識
ポリヌクレオチド結合領域に隣接して位置してい
る。独特の制限酵素切断部位（例えば、M13mp7
ポリリンカーまたはその改良）が逆位繰り返し配
列および初期結合領域の外側に位置しており、単
一鎖M13ベクターバツクボーンからクローン化挿
入片を切断して放出する事ができる（G.A.
Ricca、J.M.TaylorおよびJ.E.Kalinyak、Proc.
Nut.Acad.Sci.U.S.A.、79巻、724−728ページ
（1982）参照）。制限酵素切断部位（例えばM13ｍ
p7ポリリンカー）を含む追加の小さな逆位繰り
返し配列は標識ポリヌクレオチド繰り返し配列間
に置く事ができる。そのような部位（例えば第３
Ｄ図のＸ）での切断によると、現在異つたプロー
ブポリヌクレオチドに結合している標識ポリヌク
レオチドを保つ相補プリン／ピリミジン塩基対形
成を残し、もし望むなら固体支持体への結合を媒
介できるプローブポリヌクレオチドの遊離末端を
提供する。１つまたは複数の標識を（もしすでに
存在していない場合）、この時点で標識ポリヌク
レオチドに付ける事ができる。 本発明のいくつかの様子において使用された容
積排除ポリマーがもしポリエーテルであれば、そ
れは式Ｈ（Ｏ−Ｒ）o−Ｈ（式中Ｒは炭素数１〜６の
アルキレンであり、ｎは15〜1000の整数（重量平
均に基づいて）である）のごとき単純なポリ（ア
ルキレンオキシド）である。Ｒはメチレン、１，
１−エチレン、１，２−エチレン、１，２−プロ
ピレン、１，４−ブチレン、１，２−ブチレン、
１，２−ヘキセン（２−ブチレテン）または類似
の２価の飽和炭化水素部分であり、単一の分子内
で混合できる。良好なＲはポリ（エチレングリコ
ール）（PEG、ポリ（エチレンオキシド）または
PEOとも称されている）またはポリ（プロピレ
ングリコール）（PPG、ポリ（プロピレンオキシ
ド）またはPPOと称されている）中のごとき１，
２−エチレンまたは１，２−プロピレンである。
このような例中の整数ｎは重量平均分子量を分子
量のモノマー単位で割つたものを表わし：そのよ
うなモノマー単位分子量はPEGが44でありPPG
が56である。PEGでの重量平均分子量は経験的
に好ましいのは少くとも約1500、良好であるのは
約2500およびより良好であるのは約3000から約
20000の間である。従つてｎ（重量平均に基づい
て）は好ましくは少くとも36、より良好であるの
が少くとも60および最も良好であるのは約70から
約690の間である。同様な良好な範囲の組がPPG
のｎに期待される。 本発明において適したポリエーテル重合剤とし
てはエチレンエキシド、プロピレンオキシドまた
は他のアルキレンオキシドとジオール、トリオー
ル、糖または酸のごとき種々の部分との縮合生成
物である。そのような物質は非イオン性表面活性
剤の分野ではよく知られたもので、本発明におい
て効果的であり、分子量は（および水溶解性）は
プローブポリヌクレオチドから標識ポリヌクレオ
チドの非特異的解離を過度に促進する事なく置換
を促進するのに充分である。 本発明のある種の幅広い型においては、他の化
学的に、不活性で水可溶な非イオン性またはアニ
オン性ポリマーを上記ポリエーテルの変わりにま
たは関連して容積排除ポリマーとして使用でき
る。例としてはポリアクリレート、ポリ（ビニル
アクリレート）、誘導体化したおよび誘導体化し
ない多糖類、ポリリン酸およびカルボキシル、ス
ルホン酸、硫酸、リン酸または他のアニオン性部
分を含む種々の共重合体が挙げられる。限定され
た有益な効果を示す物質はFICOLL、MW400000
遊離水酸基を持つシヨ糖とエピクロロヒドリンの
交叉結合反応生成物；FICOLLはPharmacia社の
登録商標）である。非イオン性容積排除ポリマー
に適した種類は糖とエピクロロヒドリンの反応生
成物である。 ある種の容積排除ポリマーは置換反応に対する
その有益効果が決定工程または決定工程の一部に
おける有害効果を上まわる形で接触（置換）工程
および決定（検出）工程を含む本発明の全部の方
法で良好に使用されている。例えば決定工程が分
離（例えばゲルクロマトグラフイー、サイズ排除
クロマトグラフイー、アフイニテイークロマトグ
ラフイーまたは電気泳動）操作を含んでいるよう
な実施態様においてはある種の容積排除ポリマー
の存在は有害効果を示す。置換を促進するのに有
益と信じられている硫酸デキストランはいくつか
の実験で使われているが電気泳動には有害効果を
持つており（試験した特定の条件下）、有害効果
により、より制限される実験はサイズ排除クロマ
トグラフイー（試験した特定の条件下）である。
しかしながら、ルーチンの実験を通して本方法の
特定の具体例における適したポリマーが発見で
き、ルーチンの実験を通して、ハイブリダイゼー
シヨンおよび置換過程を促進する効果を持つポリ
マーを使用する適した検出または決定条件を見い
出す事ができると思われる。 試料物質（標的ヌクレオチド配列を含む核酸を
潜在的に含む）との実際の接触または置換工程は
通常温度、イオン高度、ポリエーテルポリマー
（または類似の容積排除ポリマー）濃度、および
時間の条件は、前記の洗浄工程よりも厳格ではな
い（従つて標識ポリヌクレオチドの非特異的分離
にもより資さない）。接触工程の間の望まれる温
度範囲は、溶液イオン強度および溶解温度に影響
を及ぼす他の添加物に依存するが約15℃から約90
℃であり；試料核酸のプローブに対して起こるハ
イブリダイゼーシヨンが最大または最大に近い速
度になる点が最も効率のよい温度であろう。ある
場合には、室温近く（15−25℃）から生理学的温
度（37−40℃）までのごときより便利な（一般的
に低い）温度が使用される。多くの文献に記載さ
れているごとく（例えば、J.G.WetmurおよびN.
Davidson J.Mol.Biol.31巻、349−370ページ
（1968）およびC.MinsonおよびG.Darby、ウイル
ス学の実際における新しい発展、１巻、185−229
ページ（Alan Liss、Inc.N.Y.、（1982））、ハイ
ブリダイゼーシヨンの速度はPHおよび試料ヌクレ
オチド濃度の関数でもある。また、本明細書に記
載した良好な検定法において適用したポリエーテ
ルポリマーに加えて、硫酸デキストランのごとき
他の水可溶容積排除ポリマーもポリエーテルポリ
マーに関連して使用する事ができる。置換過程に
影響する酵素および他のタンパク質（大腸菌（E.
Coli）ATP−依存recAタンパク質のごとき）が
さらに示されるであろうがしかしながら、ここに
一緒に出願された我々の出願中の、一般に委託さ
れた出願書（その優先権証明はU.S.S.N.607.885
および684.305である）に記載されているその有
益な効果に基づいている。 試薬複合体および、使用するならばポリエーテ
ルポリマー、の割合、量および濃度は個々に決定
的ではないが、試料および試薬複合体の全ハイブ
リダセイゼーシヨン混合物が実施できる程度の濃
度であることが一般に望ましい。大部分の場合、
標的ヌクレオチド配列への結合部位を有するプロ
ーブポリヌクレオチドは試料中の標的ヌクレオチ
ド配列の予想レベルの10倍以上のモル比（多分
100倍以上のモル比）で存在するように期待され
る。試料事態は（膜およびその類似物から分離し
たもの）アツセイのハイブリダイゼーシヨン工程
のために、完全に又は部分的に溶液状の単一鎖で
存在することが好ましい。（二重鎖試料DNAの変
性による）標的ヌクレオチド配列の非標識補鎖が
存在すると妨害を起こしうる。この妨害な少なく
とも標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を有
する試料鎖に対して過剰モルの試薬を用いる本発
明の好適な型式においては少ないらしい。（置換
の前または後に）選択的なプローブの固定化を含
むハイブリダイゼーシヨンでは、置換した標識ポ
リヌクレオチドは液相中に残留し、次いで試料の
核酸の相補鎖部分と再ハイブリツド化するのか否
か決定される。多くの溶液ハイブリダイゼーシヨ
ンでは、この妨害は動力学的効果によつても最小
にされうる。 一般に、もし使用するならば、ポリエーテルポ
リマーの好適な割合は置換反応中の全水相の重量
比（重量／容積または重量％）で表わすことがで
きる。この比は一般に２％からポリエーテルポリ
マーの溶解限界までであり、約５％と20％（重量
％）の間が好適である。特定の試薬複合体や置換
条件では、好適な割合および適当なポリマー分子
量は実施例13および14に示したルーチン実験法で
更に決定する。 体積排除現象、すなわち（核酸および体積排除
の非イオンまたは陰イオンポリマーが存在する場
合）２つの水溶性ポリマーの不適合、のための基
礎はP.MolyneuxによるWater−soluble
Synthetic Polymer：Properties And
Behavior、２巻、pp167−170（1984）に集約され
ている（そこにある文献も参照せよ）。 一般に、体積排除ポリマーを使用する置換反応
は３時間以上は必要とせず、概して１時間以内で
あり、検出に充分な程度に反応するのに30分以下
であるのが好ましい。これらの時間内に鎖置換反
応を実質上終了させるように条件を調製すること
がしばしば可能である。しかし、より長時間のイ
ンキユベーシヨンも必ずしも不利にはならない。
律速段階はプローブポリヌクレオチドの相補配列
を見出す試料または標的ヌクレオチド配列である
と考えられる（C.GreenおよびC.Tibbetts、
Nucleic Acid Research、９巻、pp.1905〜18
（1981）参照）。一度標的／プローブハイブリダイ
ゼーシヨンが起こり始めると、標識ポリヌクレオ
チドの置換は個々の試薬複合体から１分以内、し
ばしば１秒以内で起こると考えられている。 複合体が最初、固型支持体上にある本発明の様
式のいくつかでは、置換した標識ポリヌクレオチ
ドを含む液相が決定工程の一部として固型支持体
から分離される。複合体が溶液中にあると、本発
明のいくつかの様式は、存在する試薬複合体を固
型支持体に固定するための接触（置換）工程と次
に同様の固体／液体分離という処理を含む（他の
様式のプローブは標的ヌクレオチド配列にハイブ
リツトしたものを含む場合もある）。置換した標
識ポリヌクレオチドを含む液相から複合結合体を
含む固相の分離はクロマトグラフイー、過、遠
心分離、磁力まあはデカンテーシヨンのような物
理的手段で行ないうる。固相は液相から引付けら
れたり、物理的に移動できる磁性または他の分離
可能な粒子を含む。さらに２つの相の完全な分離
は必要ではない。標識測定のための部分分離後の
液相の一部を分取し、残りの液相は混合したまま
固相を配置しておく。もしこの分離が起こるかま
たは利用されると、存在の決定（検出）および存
在する標識ポリヌクレオチドの定量はいずれの相
でも行えるが、液相で行なう方が好ましい。置換
した標識ポリヌクレオチドの存在および定量の測
定という液相中の標識の決定は一般に低いバツク
グラウンドシグナルである点で有利である。多く
のバツググラウンドシグナルは上述したような固
型支持体からの非特異的脱落や、試薬複合体から
の標識ポリヌクレオチド鎖の非特異的分離または
試薬の不完全な調製によつて引起こされて大きく
なりうる。加えて、試料中の標的ヌクレオチド配
列の不存在は液相中の標識ポリヌクレオチドから
のバツクグラウンドレベルに比例したシグナル欠
除を生じる。逆に、もし固相に会合した標識で検
出を行なうと、反対の結果が標識ポリヌクレオチ
ドのレベルが減少しないことで示される。特に試
料ヌクレオチド配列中の予想される標的ヌクレオ
チド配列に対して大過剰モルの試薬複合体を使用
する時には、固相支持体上に残留する標識の測定
は結果として実質的感度を減少させる。 本発明のいくつかの実施態様では、置換後の分
離は起こらず、決定は置換した標識ポリヌクレオ
チドで考えられる。このような決定（検出）工程
は置換によりタツグから検出できるシグナルの変
化を含み、そのシグナルは標識ポリヌクレオチド
上またはプローブポリヌクレオチド上の他の場所
のシグナル影響部分へのタツグの接近により影響
される（下記の第３Ａ−３Ｄ図の記述参照）こと
を含む。 他の様式では、特に固定プローブでは２型式の
タツグ部分の間に相互作用がありうる。検出でき
るタツグの一型式は固型支持体上の一ケ所で固定
プローブポリヌクレオチドとハイブリツドした標
識ポリヌクレオチド上に存在しうる。第似の型式
のタヅグは同一の固型支持体上または物理的に近
接した別々の固型支持体上の離れた位置で固定プ
ローブポリヌクレオチドとハイブリツドした標識
ポリヌクレオチド上に存在しうる。第二の型式の
タツグはプローブは同一の標識ポリヌクレオチド
または固型支持体の離れた位置に他の方法で直接
付着することもできる。２つの型式のタツグを含
む全ての場合において、少なくとも１つの標識ポ
リヌクレオチド（タツグ）が置換した場合にのみ
つの２つの異なつたタツグは相互作用しうる。こ
の相互作用は特にアポグルコースオキシダーゼと
フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）のよ
うなアポ酵素と補酵素に適用できる。 本発明の方法および試薬は種々の濃度で種々の
標的ヌクレオチド配列の検出、決定に利用でき
る。特に標的とされる核酸（ゲノムやその他のも
の）を含む伝染性因子を有する微生物としてはサ
イトメガロウイルスやネイセリアゴノルヘア
（Neisse−ria gonorrhae）のような病原性ウイ
ルス、バクテリアおよびカビが挙げられる。標的
とされる典型的な遺伝子病および症状としてはβ
−地中海貧血、α1−地中海貧血、ネコ鳴き
（criduchat）症候群および網膜芽腫が挙げられ
る。本方法と試薬は標的配列として陰性と判断さ
れるように意図した試料中に存在する最も近接し
た配列から標的ヌクレオチド配列を区別するため
に多塩基ヌクレオチド削除、そう入、置換または
転位が必要とされる時に、まず最初に遺伝子疾患
または変化を検出するのに適用できる。本発明
は、もしあれば、単一塩基変異になる遺伝子疾患
にもある程度応用でき、置換塩基または他の変異
点の相補鎖はプローブポリヌクレオチドの標的結
合領域に望ましくは存在し、その塩基の位置は、
本方法の選択性に影響を与えるであろう領域内に
ある。構造遺伝子、調節遺伝子またはオンコジン
の発現、活性化または転位における変化や差異は
本方法で検出できる。遺伝子発現を調べるには
mRNAを標的とする。構造遺伝子の発現におけ
る他の摂動も同様に検出できる。本方法は組織移
植のための組織適合性検査、微生物での抗生物質
耐性遺伝子の決定および食品、医薬品および水試
料中の特別な伝染性因子や他の微生物の検査にも
適用できる。 特定試験のための法的配列の選択は標的組成や
状態に特有または比較的特有である配列の決定を
含む。この標的配列は（そこに相補的である）標
的結合領域を開発するのに使用され、そして適当
な長さの標識ポリヌクレオチドは標的結合領域の
一部に結合するように開発されている。特定の標
的配列が相対的に独特なもののみである時に、同
一の組織または状態である核酸の異なる部位を標
的とする複式の試薬複合体を、特異性を向上する
ために使用することができる場合もある。 理解する目的で、本発明の１つの実施態様を第
１Ａ〜１Ｅ図を参考にして例証する。ここには長
さが3300ヌクレオチドの固定プローブポリヌクレ
オチドＰが示されている。5′末端からの番号付け
で、ヌクレオチド3000からヌクレオチド3300の領
域が標的ヌクレオチド結合領域（TBR）を表わ
す。簡潔にするため、プローブの第１ヌクレオチ
ドが直接支持体Ｓに付着したと仮定する。第１Ａ
図に図示したように、標識ポリヌクレオチドＬは
150の塩基から成り、タツグＴはその5′末端に付
いている。この150の塩基のうち、51の塩基（塩
基番号100〜150）がプローブの標識ポリヌクレオ
チド結合領域（LBR）、塩基3250〜3300、に特異
的に結合する。それゆえ、支持体Ｓに付着したプ
ローブポリヌクレオチドＰより成る固定プローブ
を通常のハイブリダイゼーシヨン条件下で標識ポ
リヌクレオチドＬ溶液と処理すると、第１Ａ図に
示すようにプローブＰの塩基3250〜3300と標識ポ
リヌクレオチドＬの塩基100〜150の間で塩基対に
なつて、プローブポリヌクレオチドＰの末端に標
識ポリヌクレオチドＬが付着して複合体が形成さ
れる。 通常、例示した複合体をハイブリダイゼーシヨ
ン条件下、生体試料と接触させる。試料は塩基
10000〜10300にこの配列に相当するヌクレオチド
配列を含み、プローブの標的係合領域（TBR）
に選択的に結合する。適当なハイブリダイゼーシ
ヨン条件下、試料ポリヌクレオチドＧは第１Ｂ図
に示すように、まずＧの塩基10051〜10300がプロ
ーブＰの塩基3000〜3249（初期結合領域、IBR）
と結合し、塩基対を形成する。第１Ａ図に示す試
薬複合体中のIBRは完全に単一鎖である。しか
し、熱力学的考察では単一鎖部分に対して第１Ｂ
図に示すような二重鎖部分の方が有利であると認
識されるはずである。しかし、この初期のハイブ
リダイゼーシヨンが律速段階であり、体積排除ポ
リマーの今回の使用が多くの条件下、この段階を
容易にしたり、速度を上げると考えられる。その
後、プローブポリヌクレオチドＰの塩基3250〜
3300（LBR）において標識ポリヌクレオチドＬへ
の結合と試料ポリヌクレオチドＧの塩基10000〜
10050への結合との間に平衡が成立する。この条
件下、第１Ｂ図と第１Ｃ図との間の違いに表わさ
れるような急速なジツパリングとアンジツパリン
グがプローブポリヌクレオチドに沿つた分枝点の
不規則移動に沿つて生じる。このような場合、試
料ポリヌクレオチドＧの付加ポリヌクレオチドが
プローブ塩基3249以後のプローブポリヌクレオチ
ドに結合する時には、標識ポリヌクレオチドＬの
相当する塩基が置換された遊離末端が形成され
る。ここに記載された条件下、このジツパリング
とアンジツパリングはいずれの方向にも起こりう
る。しかし有利なのは最終的に第１Ｃ図に示す右
への付着点位置の移動である。第１図は、塩基番
号3275から、プローブポリヌクレオチドＬがプロ
ーブＰ（第４図）に全て置換される点である塩基
番号3300までの塩基をいくらか引き伸ばしてより
グラフイツクな形式でプローブがほぼ置換された
状態を表わしている。単に両方向への不規則ジツ
パリングとアンジツパリングでは、標識ポリヌク
レオチドＬの離脱が有利と思われ、第１Ｂ図は標
識ポリヌクレオチドＬが試料ポリヌクレオチドＧ
の標的ヌクレオチド配列を置換できるには最も遠
い左側に位置することを表わしている。プローブ
ポリヌクレオチドＰのヌクレオチド配列が選択的
に標的ヌクレオチド配列と結合するが、標識ポリ
ヌクレオチドとは結合しないという領域が初期結
合領域（IBR）の実質的領域に存在する場合は試
料ポリヌクレオチドＧがプローブから完全に置換
するということは珍しい逆の出来事であろう。 本方法および試薬を最適にする重要なパラメー
ターは標識ポリヌクレオチドとプローブポリヌク
レオチドとの間の塩基対の長さと性質である。第
１Ａ図に示した51の塩基対形成を厳密に比較する
と、この長さの増減、いずれかの鎖における不適
当な組合せやループの形成の導入、または自然に
生じる（そして多分特異的な）解離の速度に影響
するようなDNAおよびRNAのいずれかまたは両
方の鎖の選択、のいずれかにより変更態様をつく
ることができる。これに関して、標的ヌクレオチ
ド配列がRNAで標識ヌクレオチドがDNAの場
合、プローブポリヌクレオチドＰがDNAかRNA
かにより、特定の差異が生じる。これは一般に
RNA−RNA結合が塩基対当り最も強く、DNA
−RNA塩基対が中程度の強さで、DNA−DNA
塩基対が最も弱いためである。しかし、もし標的
結合領域（TBR）が標識ポリヌクレオチド結合
領域（LBR）よりも大きいと、標識ポリヌクレ
オチドはRNAであり、なおDNA標的ヌクレオチ
ド配列で置換されうる。例えば、もし標的微生物
がRANウイルスであるか、または標的状態が変
更遺伝子表現の一つであると、RNAを標的とす
ることが必要となりうる。 標識ポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオ
チドに結合する領域での結合強度を減少する１つ
の方法は標識ポリヌクレオチドへの個々の塩基の
不適当な組合せを取入れることである。標的ヌク
レオチド配列と正確にまたはほぼ正確に対を作る
ためプローブヌクレオチド配列を選択すると仮定
すると、この不適合は、正確な（またはほぼ正確
に）結合を有する標的ヌクレオチド配列の類似の
ポリヌクレオチド部分に匹敵する標識ポリヌクレ
オチドの変更や個々の塩基置換として考えられ
る。この変異や置換としては次に挙げるような天
然ヌクレオチドと天然または化学的修飾ヌクレオ
チドとの置換がある。（適切な対dG−rU、dG−
dT、rG−dTまたはrG−rUを生成するための）
ＡへのＧ、ＧへのＡ、Ｃへの５−メチルシトシ
ン、Ｃへの５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｃへ
のゲンチビオシル−５−ヒドロキシメチルシトシ
ン、Ａへの５−ブロモウラシル。多くの好適な実
施態様では、このような変異には自然に起こるヌ
クレオチドの他のヌクレオチドへの置換が挙げら
れる。ある実施態様では、置換としてはピリミジ
ン−ピリミジン対となる不適合対を導くプリンへ
のピリミジンの置換が挙げられる。ピリミジンは
プリンより場所を占めないため、このような個々
のピリミジン−ピリミジン不適合は隣接するヌク
レオチドの対形成への影響は小さい。プリン−ピ
リミジン誤対形成（例えばＡがＣの反対側に位置
したり、ＣやＴがＧの反対側に位置すること）は
いくらか大きな場所を占めるが、ぴつたりと相互
に２つのプリン（Ａ−Ａ、Ａ−ＧまたはＧ−Ｇ）
が位置する場合よりは、まだ一般的に占める場所
は小さい。しかし場所はその占有効果を妨害する
のは反対側へ向うスタツキングエネルギー効果で
ある。一般にプリン／プリン塩基対はより低いス
タツキングの自由エネルギーを示し、プリン／ピ
リミジン塩基対はいくらか大きく、ピリミジン／
ピリミジン塩基対は更にいくらか大きい。R.L.
OrnsteinおよびJ.R.FrescoによるBiopolymers、
22巻、pp.1979〜2016（1983）（２論文）を参照せ
よ。試薬複合体の融点への影響や試薬複合体の安
定性への影響および置換の動力学への影響による
正味の影響はこれらの２つの相反する影響の結合
で主に表わす。このような実験法は、もしあると
するならば、標的ヌクレオチド領域と標識ポリヌ
クレオチドの位置が固定された後で、不適切な組
合せが特定のプローブに対する標識ポリヌクレオ
チドの中にむしろ組み入れられることを決定する
ように要求される。 位置の置換に加えて、不適当な組合せはプロー
ブヌクレオチド配列に相当しない標識ポリヌクレ
オチド中の短い配列のそう入（例えば第１Ａ図に
示した例において標識ポリヌクレオチドＬの塩基
125と126の間への一連のA′のそう入）や一部分
の削除（第１Ａ図での標識ポリヌクレオチドＬの
塩基120〜130の削除）によつて生じうる。標識ポ
リヌクレオチドにおけるそう入は一般に標識ポリ
ヌクレオチドの単一鎖のループまたは十字形を形
成する。そこにおける削除は一般にプローブポリ
ヌクレオチドの単一鎖のループまたは十字形を形
成する。 この置換、削除またはそう入は標識ポリヌクレ
オチドＬとプローブポリヌクレオチドＰとの間の
結合を不安定化させる効果を有し、この不安定化
は標識ポリヌクレオチドの置換をますます促進さ
せる。しかし標的ヌクレオチド配列のない場合に
プローブポリヌクレオチドＰからの標識ポリヌク
レオチドＬの起こりうる非特異的置換を避けるこ
とは重要である。この解離や脱落を最小にするの
に充分な標識ポリヌクレオチドＬとプローブポリ
ヌクレオチドＰとの間の結合の最小の長さは、特
に、ハイブリダイゼーシヨンのPHや温度のような
条件、支持体へのプローブポリヌクレオチドの付
着の方法（例えば、非特異的吸着に対する末端付
着）、不安定化させる置換（や削除または付加）
の程度、水素結合の領域での二重核酸配列、およ
び結合がRNAとRNA、DNAとRNA、DNAと
DNAの間のいずれであるか、という多数の因子
に依存する。特定の場合における最適条件は本発
表の一般教義に基づいたルーチン実験法で経験的
に決定できる。この実験法は安定性を評価する目
的で標的ヌクレオチド配列を欠く試料での融点実
験および最終的な最適化のための置換実験を含ん
でいる。 プローブポリヌクレオチドに結合する標識ポリ
ヌクレオチドの領域（LBR）とプローブポリヌ
クレオチドに結合する標的ヌクレオチド配列の領
域（TBR）との間の幾何学的関係を考慮して、
標識ポリヌクレオチド結合領域が小部分であり、
固型支持体と反応側の標的結合領域の末端で結合
する第１Ａ−１Ｂ図に示すような構成を用いるこ
とができる。TBRおよびLBRの共通の末端（第
１Ａ図におけるプローブポリヌクレオチド3300）
はプローブポリヌクレオチドの一つの末端また
は、それに近いものでもある。しかし、非特異性
の配列においてこの位置を越えたプローブポリヌ
クレオチド領域を有することには大きな利点はな
い。この対形成領域を越えて連続するプローブポ
リヌクレオチドを有し、後で他の手法によつては
ずす（標識ポリヌクレオチドＬでの標識Ｔとは異
なる）標識の付着点まで広がるポリヌクレオチド
が望ましい場合が存在しうる。更に、（標識ポリ
ヌクレオチド上の１つとプローブポリヌクレオチ
ドでの他方という）２つの標識は読み取りの一部
として検出される相互作用により影響されうる。
本発明のいくつかの実施態様では標識結合領域は
支持体に最も近い標的結合領域の末端またはその
付近にあることが好ましい。 本発明に含まれるが、より好ましくない態様と
しては、試料ヌクレオチドの一部（特に、試料ポ
リヌクレオチドＧの塩基9750〜9800のような領
域）に選択的に結合する（塩基3375〜3425のよう
な）領域とLBRを越えたプローブポリヌクレオ
チドＰの延長（すなわち、例えば第いＦ図におけ
る塩基3300を越えた塩基125）が挙げられる。こ
の場合には、試料ポリヌクレオチドＧはプローブ
ポリヌクレオチドＰの塩基3000〜3249およびプロ
ーブポリヌクレオチドＰの塩基3450〜3500と両方
と結合し、標識ポリヌクレオチドＬにかぶさる。
一般的に「三重鎖」範囲またはＤループと表され
るこの構造（C.GreenおよびC.Tibbettsによる
Nuclear Acids Research、９巻、８号、
pp.1905〜18（1981）、特に1912ページを参照）は、
いくつかの幾何学において標識ポリヌクレオチド
Ｌの置換を起こさず、シグナル発生なしに可能な
特異的結合を起こす。プローブの塩基3250〜3300
での置換はまだ可能である（両端から進行しう
る）のに、その塩基9750〜9800での結合による試
料鎖Ｇの自由運動の喪失は、特にらせん構造が実
際に含まれていると考えられる場合に、完全な置
換の確率は減少しうる。 本発明の範囲内のもう１つの状態で、上記のも
のよりより好ましくないものは、標識ポリヌクレ
オチド結合領域（LBR）が標的結合領域
（TBR）を越えたり外側に拡がつたものである。
本発明のこの第２の実施態様を第１Ｇ図（と実施
例13と14）に例証する。図中には試薬複合体を示
しており、標的ヌクレオチド配列はTBRの末端
まで標識ヌクレオチドを置換できる。標識ポリヌ
クレオチドは標識ポリヌクレオチド結合領域
LBRの一部であつて、標的結合領域TBRではな
いプローブ塩基（この塩基の配列は残りの結合領
域、RBRで示される）を経て結合を保つている。
もしRBR（例えば第１Ｇ図でのプローブＰの塩基
3300〜3305）がLBRよりもずつと小さいならば、
理論的には、全体の標識ポリヌクレオチド配列
LBRに結合した他の標識ポリヌクレオチドを解
離することなしに、この複合体中の標識ポリヌク
レオチドをすつかり解離するように（例えばPHや
温度を）この時点で条件を変えることができる
（実施例３では溶液中の置換を示す）。しかし、第
１Ｇ図に示されたハイブリツドは、TBRとLBR
の重複した領域内の塩基に結合した標的ポリヌク
レオチド配列の部分の一部または全部を置換でき
る標識ポリヌクレオチドと標的ヌクレオチド配列
Ｇと完全に結合した後に左に置換することができ
ると思われる。この結果は標識ポリヌクレオチド
の置換能率を低下させると考えられる。 第１Ａから１Ｇ図に示したものと異なつた本発
明の他の実施態様を第２〜６図に例証し、以下に
簡単に検討した。 第２図は第１Ａ図のものと異なつた複合体を用
いる本発明の第３の実施態様を示している。これ
では標識ポリヌクレオチドL1はプローブ鎖P1お
よびP2の標的結合領域Ａの一部分（LBR）と相
補的であるセグメントA1′をそう入したDNAバク
テリオフアージM13の環状陽性（または伝染性）
鎖（M13+）である。この実施態様における標識
は標識ポリヌクレオチドL1のM13+主要部分内に
分布する一連のビオチン部分Ｂと示されている。
これは多分、バクテリア培養中のM13がビオチン
化ヌクレオチドトリホスフアート（例えばビオチ
ン化dATP）中で成長したり、後でM13ヌクレオ
チドにビオチンが化学的に付着する。A1′セグメ
ントもビオチンも結合したヌクレオチドを含んで
いる。この場合（第２図）、試料ポリヌクレオチ
ドＧは各プローブP1とP2のセグメントＡと相補
的である標的ヌクレオチド配列AA′を含んでい
る。この実施態様ではプローブポリヌクレオチド
もM13ゲノムの非必須領域中の一つの位置にそう
入された標的ヌクレオチドＡと相補的であるセグ
メントＡをバクテリアフアージM13を使用して形
成されうる。プローブのM13+セグメントは標識
ポリヌクレオチドのM13+領域へ非相補的（実際
には等しいか相同）である。もし環状フアージが
非特異的に開裂する（例えば制限酵素Haeによ
る部分開裂、R.W.BlakesleyおよびR.D.Wells、
Nature、257巻、pp.421〜422（1975））ならば、
両端に比べて異なる位置にセグメントＡを有する
が一般にセグメントＡの両端にM13+鎖の一部を
もつ直線状鎖が創造される。これは第２図におい
て、鎖P1（図中セグメントＡは支持されたポリヌ
クレオチドの遊離末端に近接している）および鎖
P2（図中セグメントＡは付着末端に近接してい
る）で例証されている。もちろん開裂は（M13+
領域内に２つ以上の開裂による）短縮された鎖を
生成する可能性もあり、（領域Ａ内での開裂によ
る）両末端に分割された領域Ａ分裂片で鎖を生成
することもある。後者の条件は完全で充分効力の
ある標的結合領域の形成失敗になりうる。領域Ａ
がM13+鎖の長さに比べて小さい（7.2キロ塩基、
J.VieraおよびJ.Messing、Gene、19巻、259〜68
（1982））ならば、プローブ鎖が領域Ａ分裂片を有
することが比較的ないと考えられる。セグメント
Ａま位置の均一性は特異的に単一鎖M13DNAを
開裂することにより達成されうる（例えば、逆位
繰返し配列を認識する制限酵素で、またはM13ゲ
ノムへの挿入による）。 置換後、第２図または関連実施態様のビオチン
置換の標識ポリヌクレオチドをストレパビジンお
よびペルオキシダーゼ活性に基づいた比色、蛍光
または化学ルミネツセンス読み取りと連結した西
洋ワサビペルオキシダーゼを用いる前に、例えば
ストレパビジンカラムで液相から濃縮する。 第３Ａ図は試薬複合体がすつかり溶液中にある
本発明の第４の実施態様を示している（支持体は
存在しない）。プローブポリヌクレオチドＰはサ
ブ領域（標識ポリヌクレオチド結合領域
（LBR））を含んだ標的結合領域（TBR）を有
し、LBRにおいて塩基は標識ポリヌクレオチド
(L)の相補塩基と結合する。標識ポリヌクレオチド
(L)はプローブ(P)に付着した消光部分(Q)にきわめて
近接して複合体に保持された蛍光標識(F)を含む。
これらの部分ＦおよびＱは消光部分(Q)によつて吸
収される照射により蛍光標識(F)の刺激によつて生
じるシグナルに対して、第３Ａ図の複合体では充
分に近接している。ＦとＱの典型的な対はローダ
ミンによる蛍光である。M.CobbおよびS.
GotcherによるAm.J.Med.Tech.、48巻、８号、
pp.671〜677（1982）を参照せよ。 第３Ｂ図は標的結合配列全体（TBR）に相補
的である塩基配列を含んだ試料Ｇによる接触の後
の第３Ａ図の試薬複合体を示している。第１Ｂ図
と同様に、結合は最初TBRの不対領域で起こり、
次いでサブ領域LBRから標識ポリヌクレオチド
Ｌの部分が置換する。（第１Ｃ図および第１Ｄ図
で見られたような）部分的な置換の状態を第３Ｂ
図に示す。置換の完了で試料ポリヌクレオチドＧ
の標的配列はプローブＰの全領域TBRに結合し、
標識ポリヌクレオチドＬは全体的に置換される。
この状態では、第３Ｃ図に示すように、標準(F)は
消光されない刺激による検出可能のシグナルを生
じる消光部分(Q)から充分離れている（他のプロー
ブＰが、その標識Ｑが標識Ｆにきわめて接近した
ところに位置するように珍しい場合を除く）。従
つて蛍光標識(F)の刺激と非消光シグナルの測定は
分離工程を実施せずに置換した標識ポリヌクレオ
チド用の定量的検出方法として役立ちうる。 標識ポリヌクレオチドＬとプローブポリヌクレ
オチドＰ（それぞれ標識ＦおよびＱを付けている）
が同一分子の部分を占めているという第３Ａ〜３
Ｃ図の実施態様での変更が第３Ｄ図に示されてい
る。加えて部位Ｘは逆位繰返し配列を含むことを
示しており、その一部は制限酵素認識部位と考え
られる。この酵素はTBRとＬとの間の共有結合
を切断するのに用いられる（しかし、この切断は
読み取りがＦ−Ｑ相互作用に基づく時には必要な
い）。この開裂は支持対へのプローブの付着のた
めの部位の創造における第一工程としても用いら
れ、この付着は置換の前または後に起こる。第３
Ｄ図の全体の幾何学は第１Ａ〜１Ｅ図のものを含
めて種々の実施態様のための単一分子として試薬
複合体を合成するにも用いられる。 第４図はプローブ鎖P3が支持体Ｓに非特異的
に吸着された環状単一鎖ポリヌクレオチドである
複合体を示している。このポリヌクレオチドは適
当なクローニング操作でM13のような単一鎖バク
テリオフアージに標的結合領域（TBR）の挿入
で生成しうる。ここでの標識ポリヌクレオチドＬ
はセグメントTBRの一部分LBRへ唯一相補的で
あるセグメントA1′を含む。 第５図は支持体Ｓへの吸着の代りに、プローブ
鎖P4が支持体Ｓに共有的に付着した結合ポリヌ
クレオチドと結合することを除いて第４図と同様
の複合体を示している。この結合ポリヌクレオチ
ドはTBRセグメントから離れたプローブP4のセ
グメントH′へ相補的である領域Ｈを含む。 第６図はプローブ鎖P5がその遊離末端または
その付近に標的結合領域TBRを含んだ第１Ａ図
の実施態様と同様の複合体を示している。TBR
セグメントの一連の部分（サブセグメントA3、
A4、A5、A6、A7、A8、A9およびA10）は標識ポ
リヌクレオチドの相補領域と対になる各塩基であ
る。標識ポリヌクレオチドL3のセグメントA3′は
サブセグメントA3と対になる。プローブP5は８
個の他のサブセグメント（A3〜A10）（それぞれ、
標識ポリヌクレオチド結合領域を形成する）と同
様に、初期結合領域の形成とともにサブセグメン
トA1およびA2に分割される標的結合領域TBRを
含む。この実施態様では、（第１Ｅ図に示される
ような）試料ポリヌクレオチドＧのセグメント
A′の結合は全ての標識ポリヌクレオチドL3、L4、
L5、L6、L7、L8、L9およびL10を置換し、第１Ａ
図で示された状態で比べて増大したシグナルを生
じる。しかし、それらの標識ポリヌクレオチド
（例えばL8）のいずれかが欠除すると、（標識ポ
リヌクレオチドが補体でない）サブセグメント
A1およびA2と標識ポリヌクレオチドが特定のプ
ローブ鎖上に欠除している（A8のような）他の
プローブセグメントとの結合によつて（第１Ｆ図
のように）標的ヌクレオチドとＤ−ループを形成
すると考えられる。 実施例 以下の実施例のある場合、４種の合成DNAオ
リゴマーを標識のポリヌクレオチドとして使用
し、全てを放射性リン−32原子で標識した。２種
のオリゴマーは1.1kb pBR332DNAフラグメント
の鎖の3′末端に26または27塩基を組合せた27塩基
オリゴマーである。このフラグメントは
pBR332DNAにおけるPstI制限部位からBamHI
制限部位に拡がつている。これらの２種のオリゴ
マー（L1およびL2）と、これらが結合していた
標識ポリヌクレオチド結合領域を表１に示す。オ
リゴマーL2における不適当な組合せのピリミジ
ン塩基には下線を付けてある。
（DNA、RNAどちらも）の存在を検出する診断
用検定法およびそのポリヌクレオチド試薬複合体
に関する。 従来の技術 生物試料中の特定のポリヌクレオチドの存在を
検出する通常の方法においては典型的には最初の
工程として、表面上に試料の核酸を固定する。一
度試料が固定化されたら通常放射活性リン原子の
ごとき検出可能な標識を付けたプローブポリヌク
レオチドを、固定化試料が標的スクレオチド配列
を持つている場合はプリン／ピリミジン塩基配列
−特異的相補塩基対形成により固定化試料に結合
するように固定化試料とインキユベートする。ハ
イブリダイズしていない標識プローブを洗い流し
た後、保持体上の標識の存在または不在を決定す
る。この決定のための技術には写真フイルムへの
暴露、液体シンチレーシヨン計数および螢光顕微
鏡の使用などが含まれる。 Wardおよび共同研究者（EPA63.879（1982）参
照）はプローブに直接検出可能な標識を付けるよ
り、むしろプローブにある種のヌクレオチド上に
ビオチンのごとき非アイソトープ置換基を付けた
前記技術の変更について記載している。そのよう
な場合においてはハイブリダイズしないプローブ
を洗い流した後保持体を酵素にアビシンを結合し
たような試薬と接触せしめる。アビジン−酵素複
合体は、高いアビジン−ビオチン結合親和性のた
めビオチンに選択的に結合し、標的ヌクレオチド
配列が固定化された基質上に選択的に酵素を固定
する。その後、酵素の基質を添加し、酵素反応の
生成物を検出し、基質上の標的ヌクレオチドの初
期濃度に機能的に依存した増幅された信号を得
る。ENZO BIOCHEM、INCのEPA97.373（1984
年１月４日）もまた参照されたい。 上記の非アイソトープ系の変法はIllinoisの
Standard石油の他のヨーロツパ特許出願にもま
た記載されており、その中の一つの様式（その８
−10ページ参照）においては標的ヌクレオチド配
列に特異的な２つのプローブを使用する。標的ヌ
クレオチド配列の第１の部分にハイブリダイズで
きる第１のプローブを固型保持体に固定すると、
固型保持体と生成物質の試料とのインキユベーシ
ヨンにより試料中の標的ヌクレオチド配列はこの
第１の固定化プローブを通して、選択的に保持体
に結合する。その後、標的ヌクレオチド配列の第
２のしかも異つた部分と選択的にハイブリダイズ
できる第２のプローブを使用し保持体と接触せし
める。再び、もし生物試料中に標的ヌクレオチド
配列が存在していたら、第２のプローブはそのヌ
クレオチド配列に選択的に結合するであろう；お
よび結合構造（またはサンドイツチ）が生成し、
第１のプローブおよび標的ヌクレオチド配列を通
して第２のプローブが保持体に結合する。参考文
献にはこの第２のプローブの、直接または間接的
に光の特定の波長を発生または吸収するものによ
る標識について記載されている（例えば、螢光標
識、リン光標識または化学発光標識）。各々の段
階において非結合の溶液構成物をら保持体を分離
する事により、第３の分離後の保持体の相中の標
識の存在は試料中の標的ヌクレオチド配列の存在
および濃度の関数となる。Orion−Yhtma Oyの
WO83／01459もまた参照されたい。 二重鎖試料核酸を溶液中で制限酵素により消化
し、続いて特定の大きさのフラグメントをろ紙上
で検出する特定の標的ヌクレオチドのための異つ
た診断法がWilsonらにより米国特許4395486号に
記載されている。その記載によると、鎌状赤血球
貧血の原因となる一つの塩基置換が制限酵素切断
の特異部位を消滅させ、その後は通常検出される
２つの特定の大きさの小さなフラグメントの検出
される量が減少するか（鎌状赤血球形成傾向）ま
たは検出されなくなる（鎌状赤血球貧血）。 上記の方法は多くの場合生物試料中のヌクレオ
チド配列の存在を検出するであろうが、各々多工
程または長いインキユベーシヨン期間を必要とす
る工程があるなどの欠点のため、臨床実験室での
簡便な使用が実際上できない。さらに、これらの
多くの方法は妨害ポリヌクレオチド配列またはバ
ツクグラウンド信号に対する確かな標的ヌクレオ
チド配列の低いレベルでの検出に関しての選択性
または感度には限界がある。特に、標識プローブ
の非特異的結合は各々の方法において本質的なバ
ツクグラウンド信号源の代表となる。 標的ヌクレオチド配列のための生物試料の分析
から離れてもハイブリダイゼーシヨン（相補ポリ
ヌクレオチド配列間の二重鎖らせんの形成）の物
理化学の種々の面が研究されてきた。これらの研
究に、インビボおよびインビトロ両系での核酸の
鎖移動および置換の現象の試験がある。しかしな
がらそのような研究を参照すると鎖移動および置
換現象の診断および検出への明瞭な適応性は認め
られなかつた。C.GreenおよびC.Tibbettsは
Nucleic Acids Research ９巻、８号、1905−18
ページ（1981）において6.1kb（6100塩基）単一鎖
DNAポリヌクレオチドがその真中付近（1.7−
3.3kb間）で1.6kb長の末端標識相補DNAポリヌ
クレオチドとハイブリダイズした複合体（ハイブ
リツド）の形成について記載している。溶液中で
この複合体に6.1kb相補鎖を添加すると標識ポリ
ヌクレオチドの急速な置換（この参考文献の1910
ページの図２を参照せよ）が起こり、これは反応
混合物の一部を取り、ゲルクロマトグラフイーに
より分離し、オートラジオグラフイーにより分析
する事によりモニターされる。置換された1.6kb
ポリヌクレオチドは85分以上の期間（濃度に依存
する）放射活性信号の10％未満から90％以上へ一
定に増加し、残りの放射活性の大部分は1.6／
6.1kbハイブリツドにある。総質量当量がDNAの
13.8kbである仮定される部分置換中間体（両方の
長鎖および部分的に置換された短い鎖）は明らか
に検出されていない。著者は分枝種を形成する２
つの6.1kbポリヌクレオチドの最初のハイブリダ
イゼーシヨンが律速段階であり；標識ポリヌクレ
オチドの1.6kb対領域に沿つた置換は非常に速く、
0.8分の分枝（13.8kb質量当量）種の計算平均寿
命と一致すると結論している。彼れは単一分枝ま
たは二重の核の（Ｄ−ループ）中間体種両方の可
能性を示している（参考文献の1912ページに例示
されている）。分枝移動現像のより詳しい研究の
ため、彼らは移動現像を遅らすであろう薬剤を使
用しおよび／または1.6kbハイブリツド塩基対以
上の複合体を使用して置換過程を遅らせようと試
みた（参考文献の1913−1914ページ参照）。1.6／
6.1kb種はGreenらにより挑戦されたが、6.1kb相
補鎖のみであり、どんな非特異鎖も精製されてい
ない事は注意すべき事である。 核酸生化学の別の論文では鎖ハイブリダイゼー
シヨン過程の間核酸と相互作用する重合種が試験
されている。ポリ（エチレングリコール）のごと
きポリエーテルはウイルス粒子単離（K.R.Yama
−motoら、Virology40巻、734−744ページ
（1970））、核酸精製（B.Alberts、Methods in
Enzymology、S.P.ColowickおよびN.O.Kaplans
編集、（Academic Press、N.Y.）、12巻、566−
581ページ（1967））、タンパク質精製（K.G.
Ingram、Arch、Biochem.Biophys、194巻、59
−68ページ（1977））、哺乳類細胞融合（G.Galfre
ら、Natuve266巻、550−552ページ（1977））、お
よび特定の酵素活性の促進（B.H.Pfeifferおよび
S.B.Zimmerman、Nucleic Acids Research、
11巻、7853−7871ページ（1983））のごとき種々
の特異的な生物または生化学過程での使用が観察
される。M.RenzおよびC.KurzはNucleic Acids
Research、12巻、3435−44（1984）（これは本発
明の従来の技術を構成しない）において固定化試
料型のDNAプロープ検定（特にサザンブロツト
と称される型）におけるハイブリダイゼーシヨン
の速度を促進する容積排除剤としてのポリエチレ
ングリコールの使用を記載している。この参考文
献の特に3441ページを参照されたい。この点につ
いては種々の型の他の容積排除ポリマーも適合し
た単一鎖のハイブリダイゼーシヨンの速度を促進
する事が示されている。Wetmurら、
Biopolymers、10巻、601ページ（1971）（硫酸デ
キストラン）、Wahlら、Proc.Nat.Acad.Sci.、76
巻、3683ページ（硫酸デキストラン）を参照され
たい。一般にこの点で有益なポリマーはDNAと
反応しない非イオン性またはアニオン性の水可溶
ポリマー（ポリサツカライドを含む）である。S.
B.Zimmermanら、Proc.Nat.Acad.Sci.、80巻、
5852−56ページ（1983）；B.H.Pfeifferら、上記
文献；水可溶合成ポリマー（P.Molynevx編集；
CRC Press、Inc.、Cleveland、OH−２巻、
1983）を参照されたい。 発明の概要 本発明は試料の標的ヌクレオチド配列
（targetnucleotide sequence）によるプローブヌ
クレオチドからの標識ポリヌクレオチドの急速な
置換（displacement）に基づいており、置換さ
れた標識ポリヌクレオチド中または上に観察され
る標識の直接または間接的な測定を可能にする
（または、ある場合には標識ヌクレオチドは置換
されない）。この方式は試料中の標的ヌクレオチ
ド配列の存在および濃度の機能的に相関した信頼
できる定量的な測定に役に立つ。従つて本発明は
以下の工程を特徴とする生物試料の核酸中の前も
つて決定されている標的ヌクレオチド配列
（DNAおよびRNA両方）の存在を決定する方法
を包含する： (a)() 標的ヌクレオチド配列にプリン／ピリミ
ジン塩基の水素結合を通して塩基対結合がで
きるプローブポリヌクレオチド、および
（）プロ−ブポリヌクレオチドが標的ヌク
レオチド配列に結合できる領域と少くとも部
分的に同じ長さ（coextensive）のプローブ
ポリヌクレオチドの領域でプリン／ピリミジ
ン塩基対の水素結合を通しての塩基対結合に
よりプローブポリヌクレオチドへ結合された
標識ポリヌクレオチドの試薬複合体
（reagent complex）を提供し； (b) 標的ヌクレオチド配列がもし存在するなら、
プローブポリヌクレオチドと結合し、試薬複合
体から標識ポリヌクレオチドを置換する条件下
試薬複合体と試料を接触せしめ； (c) 試薬複合体から置換された標識ポリヌクレオ
チドまたは試薬複合体に残存する標識ポリヌク
レオチドの両方の存在（大まかな量の決定を含
む）を決定する。 本発明はまた以下の試薬複合体を特徴とする生
物試料の核酸中の標的ヌクレオチド配列の存在決
定のための診断用試薬も包含する： () 標的ヌクレオチド配列にプリン／ピリミジ
ン塩基対の水素結合を通して塩基対形成ができ
るプローブポリヌクレオチド、および () プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオ
チド配列に結合できる領域と少くとも同じ長さ
のプローブポリヌクレオチドの領域でプリン／
ピリミジン塩基対の水素結合を通して、プロー
ブポリヌクレオチドへ結合された標識ポリヌク
レオチド； 標的ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレオ
チド間の塩基対形成が標的ヌクレオチド配列に対
し十分な累積結合強度（以下に定義されるよう
な）であり、もし試料中に標的ヌクレオチド配列
が存在すると、それに試薬が接触し、試薬複合体
から標識ポリヌクレオチドを置換できる。 本発明はさらに、置換標識ポリヌクレオチドの
発現の速度を増加するために十分な量の非イオン
性またはアニオン性（ポリエーテルが良好である
が必ずしもポリエーテルでなくてもよい）の容積
排除不活性ポリマーが存在する方法もまたはその
ような試薬複合体を含む診断用キツトも包含す
る。特定の置換されたポリヌクレオチドの発現の
速度を増加するこの効果は本明細書においてしば
しば増加した置換速度の結果として起こる事と解
釈される。その場合、その術語は実際の置換工程
が顕微鏡または分子レベルで促進される事を示す
と読みとつてはならない。実際、申請者は現在、
プローブポリヌクレオチドへの拮抗鎖のハイブリ
ダイゼーシヨンにおける最初のヌクレエーシヨン
段階（第１Ａ図および第１Ｂ図参照）が律速段階
であり、容積排除ポリマーにより促進されると信
じている。もしそれが真実であるなら、全速度の
増加を達成するためには顕微鏡または分子レベル
での置換工程（第１Ｃ図、第１Ｄ図および第１Ｅ
図参照）の促進は必要とされない（第１Ａ図と第
１Ｅ図の比較。） 発明の詳細な説明 本明細書において以下の術語は分子生物学の分
野において一般的に受け入れられている意味に基
づいて使用された： ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖は
互に3′，5′−リン酸ジエステル結合により結合さ
れ、ウラシル（天然にはrUのごとくリボースの
みと結合）、チミン（天然にはdTのごとくデオキ
シリボースのみと結合）、シトシン（dCまたは
rC）、アデニン（dAまたはrA）およびグアニン
（dGまたはrG）のごとき（しかしこれらに限定
されるわけではない）張出たプリンまたはピリミ
ジン塩基と糖の１位の炭素の位置で炭素−窒素結
合により結合されたペントース糖類（一般にリボ
ースまたはデオキシリボース）の直線重合構造を
称する。それ故ポリヌクレオチドはデオキシリボ
核酸（DNA）鎖およびリボ核酸（RNA）鎖を含
む。 そのようなポリヌクレオチド鎖の末端は、ペン
トースの５位の炭素が別のペントースと結合して
いない（しかし水酸基、モノリン酸磯または他の
天然または合成部分と結合）部位は５プライム
（5′）末端、およびペントースの３位の炭素が別
のペントースと結合していない（しかし同様に水
酸基、モノリン酸塩または他の天然または合成部
分と結合）部位は３プライム（3′）末端と呼ばれ
る。 相補塩基体形成またはプリン／ピリミジン塩基
対形成は２つの逆平行ポリヌクレオチド鎖上の張
出し反対部位の塩基間の水素結合を意味し、dG
がdCを反対側であり、dAがdTの反対側であるの
が天然のDNAでは最もエネルギ的に好ましい。
５つの天然に優勢に存在するもの以外の塩基もま
た良好な対形成を行う：例えば、５−メチルシト
シンはグアニンと良好に結合する。説明のため、
この対形成は多くの図に示してあり、逆平行方向
に向いた5′から3′という意味において）相補鎖と
ともに平行な直線で示してある。しかしながら２
種鎖セグメントの実際の形は通常、第１Ｄ図に模
式的に示したごとき種々のピツチのらせん状（よ
く知られている２重らせん）であろう。 本明細書で使用するハイブリダイゼーシヨンと
は２重鎖構造の形成の助けとなる条件下２つのポ
リヌクレオチドを混合し、相補塩基体形成でその
２重鎖構造を形成し、それには相補配列またはほ
とんど相補配列のものが存在する事を意味する。 本発明の方法の基本的な成分はプローブポリヌ
クレオチド（しばしば本明細書ではプローブ
（probe）と称する）、標識ポリヌクレオチド（し
ばしば本明細書では標識（タツグ）ポリヌクレオ
チドまたは放出標識（releasetag）と称される）、
および核酸を含む生物試料（その一部は本明細書
ではしばしば標的ポリヌクレオチドまたは標的ヌ
クレオチド配列と称される）である。試料は標的
ヌクレオチド配列を含むかもしれないし、含まな
いかもしれない。ある場合にはポリエーテル化合
物のごとき容積排除ポリマーもまた提供される。
ある場合には保持体もまた提供され、それにプロ
ーブを通して試薬複合体を固定化するか（そのよ
うな場合プローブはしばしば固定化プローブまた
は固定化プローブポリヌクレオチドと称される）、
または、他の場合、分離工程の一部として、決定
または工程の一部としての置換を起こす。本方法
を実施するには、読み出しのため追加の試薬また
は器具がしばしば必要である；術語“読み出し
（readout）”は、一つまたはそれ以上の相の（通
常分離されている）反応物質中、特に試薬複合体
からの置換およびプローブポリヌクレオチドおよ
び試薬複合体からの置換標識ポリヌクレオチドの
溶液への分離により液相中に存在する標識ポリヌ
クレオチドの直接または間接的検出を意味する。 本発明の実施においては、プローブポリヌクレ
オチドはそのプリン／ピリミジン塩基配列の少く
とも一つの領域が相補塩基対形成により特異的な
試料の標的ヌクレオチド配列へ特異的に結合でき
る直線または環状ポリヌクレオチドである。この
結合はDNAおよびRNA間、DNAおよびDNA間
またはRNAおよびRNA間でもよい。したがつて
プローブはDNAまたはRNAでよい。以下により
充分に議論するごとく、プローブの特異的領域の
みが標的ヌクレオチド配列に選択的に結合するの
が一般的である。プローブの他の領域は種々の天
然のまたは合成配列であり、標的ヌクレオチド配
列とのハイブリダイゼーシヨン反応には関与しな
いが、本発明においては重要な役割を果たす（例
えば保持体への付着のための部位を確保し、もし
望むなら、支持体と標的ヌクレオチド配列が結合
する領域の間にある程度のすき間を提供する）。 本明細書で標的結合領域（図におけるTBR）
と称する標的ヌクレオチドが特異的に結合するプ
ローブの領域に関しては、プローブ配列中の各々
のヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列中にその
正しい相補結合相手（例えばdTに対するdA）を
発生するという意味において結合は完全であるか
（良好なものは完全である）、またはいくつかの不
適合を含んでいるであろう。プローブを標的結合
領域の少くとも一つの部分は、好ましくは試薬複
合体では単一鎖であり、即ち、標識ポリヌクレオ
チド配列と相補的ではなく、また自己相補的でも
ない；この単一鎖領域は、標的ヌクレオチド配列
が標識ポリヌクレオチドを置換する事なくこの領
域の塩基に結合する事ができるので、本明細書で
はしばしば初期結合領域（図におけるIBR）と称
する。プローブのそのような初期結合領域は少く
とも15塩基の長さであり、良好であるのは少くと
も50塩基の長さである。総標的結合領域は初期結
合領域およびほとんどのまたは（良好なのは）す
べての標識ポリヌクレオチド結合領域（図におけ
るLBRおよび以下に議論する）を含んでいる。
総標的結合領域は別個に決定的でないが、良好な
またはより良好なIBRおよびLBR領域の長さの
合計の関数のごとく考えられる。 500以上のプローブの初期結合領域の塩基の長
さは一般的に必要ではないが、多くの場合著しい
短所にはならない。臨床実験室への適用のための
この塩基対形成領域の適した短い方の限界はいく
ぶんプローブポリヌクレオチドの標的結合領域の
塩基配列および以下に記載する塩基組成および他
の物理的因子に依存し特に、意図したハイブリダ
イゼーシヨンの条件、支持体へのプローブの付着
の様式（もしあれば）、ハイブリダイゼーシヨン
の動力学および用いる読み出し系に依存する。 ある種の実施態様においてプローブが固定化さ
れる固体相は特殊な重合物質、セラミツク物質、
試験管または他の容器の壁、紙、ニトロセルロー
スまたはガラスを含むほとんど通常の型のもので
ある。本発明のある様式においては、固体相は、
タンパク室、固定細胞またはウイルス、またはポ
リスチレンのごとき種々のポリマー、ラテツクス
またはガラスのごとき物質で作られた天然の、改
良された天然のまたは合成の粒子またはビーズか
ら成る。 本発明のある種の実施態様において固型支持体
へのプローブの付着の手段は、単なる吸着でもよ
いが、特定の共有結合、イオン結合、疎水性の相
互作用または水素結合などのいくつかの様式が良
好である。共有結合の場合、支持体表面上の化学
部分（例えばアミンまたはカルボキシル部分）と
ポリヌクレオチド、特にポリヌクレオチドの末端
糖環上の水酸基またはリン酸部分の間の反応によ
り結合は直接的である。3′末端に通常存在する遊
離２級水酸基に特異的な結合剤には亜リン酸塩、
無水こはく酸およびフタルアミドが挙げられる。
糖の5′末端上に通常存在するリン酸（少くとも多
くの天然に存在するポリヌクレオチドまたは多く
の切断反応の生成物）に特異的な結合剤には、１
−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカル
ボジイミドのごときカルボジイミドを、イミダゾ
ールまたは１−メチルイミダゾールの存在下また
は非存在下用いる。B.C.F.Chuら、Nucleic
Acids Research11巻、6513−29ページ（1983）
を参照されたい。プローブの末端または他の小さ
な部分に特異的なそのような結合がもし標的結合
領域から離れていれば、吸着または他の同様な付
着の物理的または非特異的な化学手段と比較する
とハイブリダイゼーシヨン反応の間の自由度の程
度はかなり大きい。自由度がそのように非常に大
きいと、標的結合領域の最小長またはハイブリダ
イゼーシヨンが検出可能なレベルに進行するまで
の最小時間を低下させることができる。 非特異的共有結合にはｍ−アミノベンジルオキ
シメチル（ABM）、ｍ−ジアゾベンジルオキシ
メチル（DBM）またはｏ−アミノフエニルチオ
エーテル（APT）のごとき部分を通しての基質
と鎖に沿つた遊離塩基の間の結合が挙げられる。
H.Bunemannら、Nucleic Acids Research、10
巻、7163−7196（1982）（２つの論文）を参照され
たい。他の典型的な非特異的結合の化学はB.
Seedによる米国特許4286964号（1981）に記載さ
れている。 直接共有結合に加えて、連結またはスペーサー
分子により共有結合型で間接的にプローブポリヌ
クレオチドを支持体に結合できる。間接共有結合
試薬の例には、カルボジイミドの化学により支持
体上の官能基（例えばエステル）およびポリヌク
レオチドの5′末端糖上に通常存在するリン酸基の
両方に反応できるスペーサー試薬がある。そのよ
うなスペーサー分子としては、一度末端リン酸基
に結合しその後Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルのごとき支持体上の活性基と結合する、上
記引用論文（Chuら）において使用された脂肪族
ジアミンがある。他のスペーサー分子にはヒドロ
キシアルカン酸が挙げられる。なお他のスペーサ
ー分子はヒドラジン部分を持つ支持体と直接反応
し、ヒドラゾンを形成するフエニルケトンのごと
き官能部分を持つことができる。 さらに、プローブのある部分と支持体に吸着ま
たは共有結合的に結合している親和試薬との相互
作用により支持体に非共有結合的にプローブが結
合される。例としては(1)標的ヌクレオチド配列へ
結合できるプローブの領域と重ならないプローブ
ポリヌクレオチドの部分にハイブリダイズできる
短い単一鎖ポリヌクレオチドを支持体に固定化す
る、および(2)１つまたはそれ以上のアビジンまた
はビオチン部分を持つ化学的に改変したプローブ
ポリヌクレオチドを支持体上に吸着または共有的
に結合したビオチンまたはアビジン部分を各々持
つ支持体に結合させる方法がある。後者の方法は
小さな分子ビオチンのタンパク質アビジン（また
はストレプトアビジン）に対する高い親和性
（Kdiss約10-15M）に基づいている。 本発明はプローブの支持体への付着点または複
数の付着点と法的ヌクレオチド配列に特異的に結
合するプローブポリヌクレオチドの領域の間のス
ペーシングに関して限定するわけではないが、プ
ローブの標的結合領域が充分で良好なハイブリダ
イゼーシヨンの間の運動の最大に得られる自由度
を持つように標的ヌクレオチド配列とプローブポ
リヌクレオチドの標的結合領域間のハイブリダイ
ゼーシヨンにはこのスペーシングが充分大きい事
が良好である。 本発明の他の実施態様においてはプローブポリ
ヌクレオチドは支持体に固定化されず、溶液中で
あつたとしてもハイブリダイゼーシヨンが起こる
ように試薬と生物試料を混合するのですべての試
薬複合体は溶液中に存在する。いくつかのこの溶
液ハイブリダイゼーシヨン実施態様においては、
例えば支持マトリツクスにストレプトアビジンが
結合されている多孔性ベツドまたはフイルターに
反応混合物を通過させる事により、ハイブリダイ
ゼーシヨン後にもし望むなら固定化または分離で
きるようにプローブは置換基（親和剤のごとき、
例えばビオチン、または化学部分、例えばニトロ
フエノールのごときハプテン）を含有する。その
ような固定化により続いての決定のため置換され
た標識ポリヌクレオチドのみが液体相に残存する
ようになる。本発明の他の様式の溶液ハイブリダ
イゼーシヨンではサイズ排除クロマトグラフイー
（実施例２を参照）、電気泳動（例えば実施例１を
参照）または他の物理的分離技術のごとき別の分
離法を用いる。本発明のそれ以外の型は、複合体
の分離をせずに置換標識ポリヌクレオチドを決定
する読み出しに関連してより充分に以下に記載す
る。もちろん、分離なしのそのような決定法の多
くは、複合体が固定化プローブポリヌクレオチド
に含まれている過程においても同様に応用され
る。 プローブポリヌクレオチドは種々の方法により
再現性よく製造でき、例えば細菌または他の適し
た微生物から単離された適したプラスミドの一部
またはウイルスベクターとしてまたはその中へク
ローン化し、微生物の遺伝物質の一部としてまた
は他の患者を生物源として得る。一般的にプロー
ブポリヌクレオチド配列（一部が標的結合領域を
形成する）を含む核酸の小さな領域が組換え技術
によりそのようなクローニングベクター中に挿入
される；残り（もしあるなら）のプローブポリヌ
クレオチド配列ではないクローン化挿入物は、標
的ヌクレオチド配列に対するポリヌクレオチド配
列の異種構造のため都合よく選択できる。本発明
のある実施態様において、そのような異種配列は
独特の制限酵素認識部位の存在のごとき特定の性
質で計画的に選択される配列を含んでいる。ある
種の条件下、すべての遺伝子またはすべての遺伝
子を含む配列が環状または直線状の形でベクター
と挿入されたヌクレオチド配列とともに挿入物と
して使用される。製造された時プローブポリヌク
レオチドが２重鎖である場合、変性（熱的、PHの
調製により、または他の常法による塩基対形成の
破壊により）は通常単離に続いて起こる。切断
（特に制限酵素または部位特異的化学切断）は通
常希望の直線形の２重鎖セグメントを形成するた
めに使用し、もし２重鎖環状型が成長していれば
変性に優先するであろう。ある場合には、プロー
ブポリヌクレオチドとして個々に使用するため、
または一つをプローブポリヌクレオチドおよび他
のものを標準ポリヌクレオチドの前駆体とするた
め２重鎖から個々の鎖を精製するのが良好であろ
う。この精製は変性ゲル電気泳動またはアフイニ
テイクロマトグラフイーのごとき常法により実施
する事ができる。いくつかの例においてはM13バ
クテリオフアージのごとき単一鎖ベクターを用い
る複製により単一鎖分子としてプローブポリヌク
レオチドが産生される。いくつかの別の例におい
ては（以下に記載するごとく）、プローブポリヌ
クレオチドおよび標識ヌクレオチドは同じ分子の
一部として製造できる。 本発明の方法および試薬で使用する標識ポリヌ
クレオチドは一般的にプローブポリヌクレオチド
より小さいDNAまたはRNA断片であり２つの点
が重要である：(a)安定であるが、特定の位置でプ
ローブへ可逆的に結合する、および(b)特に置換後
に標識が検出を受け易い。これらの点は、ある種
の型の標識が持つている安定性および置換への影
響を考慮した後で別々に議論する。 標識ポリヌクレオチドおよびプローブポリヌク
レオチド間の対形成は一般的に標的ヌクレオチド
配列およびプローブ間の対形成より小さな数の塩
基上で起こる。多くの場合標識ポリヌクレオチド
が特異的に係合するプローブポリヌクレオチドの
塩基は、後で試料の標的ヌクレオチド配列へ結合
するプローブの塩基の部分集合であり、それ故先
にプローブの結合領域と称した部分を表わす。 本明細書で使用する標識ポリヌクレオチド結合
領域（LBR）という術語は複合体において標識
ポリヌクレオチドが結合するプローブの塩基の配
列を意味する。良好な実施態様においては（すべ
ての図により例示したごとく）標識ポリヌクレオ
チド結合領域はまつたく標的結合領域の一部であ
り（特に第１Ａ図参照）；他の実施態様において
は（第１Ｇ図を参照）；標識ポリヌクレオチド結
合領域の一部（しかし良好なのは大部分）が標的
結合領域の一部である。プローブポリヌクレオチ
ドの標的ヌクレオチド結合領域外の標識ポリヌク
レオチド結合領域が約15塩基以上のものは、一度
この領域の塩基対形成を通しての付着のみになる
とプローブからの標識ポリヌクレオチドの解離が
非常に困難になる為良好ではない。いくつかの良
好な実施態様においては、標識ポリヌクレオチド
が結合するプローブポリヌクレオチドの領域は試
料の標的ヌクレオチド配列が続いて結合するプロ
ーブポリヌクレオチドの大きな領域の一つの末端
の近くの部分集合である。いくつかのそのような
実施態様においては、もし試薬複合体中でプロー
ブが固定化されていると、前記の大きな領域の一
つの末端は直線状プローブポリヌクレオチドの末
端またはその近くである（第１Ａ図に例示し、以
下に議論するごとく；しかしながらTBRの他の
末端もLBRとして使用される事に注目された
い）。 現在、標識ポリヌクレオチドおよびプローブポ
リヌクレオチドの明確な実体は理解されていない
が、それらは単に相補塩基対形成により結合し、
各々のプローブポリヌクレオチドにただ一つの標
識ポリヌクレオチドが結合するのが必要であり、
または標識ポリヌクレオチド当りただ１つの標識
部分（タツグ）がある。標識ポリヌクレオチドの
プローブへの結合に他の型もまた存在するが、一
般的に良好ではない。分離を行わない実施態様に
おいては他の手段では検出法において全く置換さ
れたかのように思われる置換された標識ポリヌク
レオチドがまだ結合しているかいないかに依存し
てそのような他のプローブの標識ポリヌクレオチ
ドの結合の切断が必要とされる場合もあるし、さ
れない場合もある。そのような他の結合の切断は
置換前、中、または後であるがしかし、少くとも
決定工程の前が良好である。単一プローブ鎖上の
多標識ポリヌクレオチド（図６に例示）は１置換
当り多数の置換標識が望まれる場合に特別に応用
した本発明の一つの型である。 プローブの標識ポリヌクレオチド結合領域の大
きさはその自身本発明では決定的ではない、なぜ
なら、この大きさの広い変動は相殺できる、例え
ば、置換工程の温度の変更（前記接触工程(b)）に
より、および試料が結合するプローブの領域の大
きさにより相殺。一般的に良好な標識ポリヌクレ
オチド結合領域（および対応する標識ポリヌクレ
オチドの塩基配列）の大きさは、少くとも約15塩
基であり、好ましくは少くとも20塩基、さらに好
ましいのは少くとも約25塩基である。良好な範囲
は約20から約1000塩基（より良好であるのは約20
から約500塩基、および最も良好なのは約25から
約200塩基）である。通常短い対形成セグメント
の標識ポリヌクレオチド（GC塩基含量のごとき
因子を考えて）は、もし置換工程の温度が非常に
高ければ非特異的模式でプローブから解離する
（融解温度に影響する塩濃度のごとき因子もまた
考慮しなければならない）。D.Freifelderら、
Biopolymers、７巻、81−93ページ（1969）を参
照されたい。異常に長い対形成セグメント（例え
ば1000塩基以上）には本質的に何の利点もない。
そのような長い対形成セグメントはプローブの総
標的結合領域が長くなり、標識ポリヌクレオチド
の都合よい置換のためにより長い標的ヌクレオチ
ド配列を必要とするのでしばしば良好ではない。
標識ポリヌクレオチドの結合部分がもし非常に長
いと、現在利用できるある種の技術または小さい
ポリヌクレオチドに最も適した技術によりもはや
容易には製造できなくなる：例えば、全部の標識
ポリヌクレオチドの有機化学合成、現在約100未
満および特に約60未満の標識ポリヌクレオチド結
合領域に対しては有機化学合成が一般適に容易で
ある；しかしながらそのような合成技術の改良で
より長い配列も容易に作製できる。 標識ポリヌクレオチドの最小の長さ（および、
標識ポリヌクレオチド結合領域もまた）は試薬複
合体安定度に主として相関する。この安定性に影
響する長さ以外の因子はGC含量（その融解温度
に対する効果はよく知られている）および内部塩
基対不適合である。融解温度は、１つまたはそれ
以上の内部塩基対不適合を持つ配列の有効長を確
立する有益な方法である。例としては、１つの内
部塩基対不適合を持つ30塩基の配列（故にただ29
の正しい対）はより短い適合配列のごとく振まう
（少くとも試薬複合対安定性に関して）；29塩基対
配列の振まいからの離脱の程度は不適合塩基対の
位置および行われた塩基交換に依存する。有効長
は不適合対がプリン／プリン、プリン／ピリミジ
ンまたはピリミジン／ピリミジンであるかに依存
して有効長に関して異なる事が期待される。しか
しながら、融解温度実験により有効長は経験的に
決定でき、一連のプローブ／標識ポリヌクレオチ
ド複合体はU.S.S.N.特許出願607.885の実施例８、
およびR.L.OrnsteinおよびJ.R.Frescoによる
Biopolymers、22巻、1979−2000ページ（1983）
に例示されたごとく、種々の温度の支配を受け
る。プローブと塩基体不適合を含む標識ポリヌク
レオチドの複合体の融解温度を決定し、その値を
わずかに短い長さの対形成（しかし、対領域内は
完全な塩基対適合）の複合対の融解温度と同じプ
ローブポリヌクレオチド上で比較すると、塩基対
不適合の標識ポリヌクレオチドの有効対形成長が
見積れ、上記の良好でより良好な範囲に応用され
る。しかしながら、融解温度に基く上記の相関は
第一の容易な見積り手段である事を意味する。与
えられた実際の標識ポリヌクレオチド接合領域の
実際の優先権の程度は標識ポリヌクレオチドが試
薬の貯蔵の間または使用条件下非相同核酸との接
触によりどのくらい複合体中にとどまつている
が、および適当な標的ヌクレオチド配列を持つ核
酸によりどのくらい標識ポリヌクレオチドが置換
されるかに基づいている。塩基体不適合は許され
るが、一般には良好でなく、存在する場合は、一
般的には対形成領域の2/5以下、及び良好には1/1
０以下からなる（例えば、30塩基対長領域の標識
ポリヌクレオチド／プローブポリヌクレオチド対
形成においては良好であるのは最高か３つの不適
当で27は完全に適合している）。 標識ポリヌクレオチドは対形成領域に加え、プ
ローブポリヌクレオチドに特異的に結合しないヌ
クレオチドの領域を含有している。そのような領
域は検出可能は標識に対する対形成領域を結合す
るのに役立ち、それ自身が標識され（例えば放射
性標識またはアビジン、ステプトアビジンまたは
ビオチンのごとき間接マーカーと共有結合によ
り）、または単に何の特別の機能もなく存在する。
標識ポリヌクレオチドはそれ自身線状または環状
で対形成領域以外の領域は２重鎖である（しかし
好ましくはない）。２つの環状核酸分子のハイブ
リダイゼーシヨンに対する可能な位相幾何学的強
制および標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイ
ゼーシヨンの可能な強制のためプローブポリヌク
レオチドが環状の場合は標識ポリヌクレオチドは
環状でないのが良好である。 １つまたはそれ以上の検出可能な標識は一般的
に標識ポリヌクレオチドに沿つて１つまたはそれ
以上のいくつかの点に（特に標識が放射性核また
はビオチンまたはその類似物の場合）、標識ポリ
ヌクレオチドのただ１つの末端または１つの特異
的な内部の場所のみに（例えば、プローブポリヌ
クレオチドへの塩基対形成に含まれていないプリ
ンまたはピリミジン塩基）位置している（常法を
用いて）。試薬複合体中に少くとも１つの標識ポ
リヌクレオチドが対になつていない領域があり、
標識はそのような不対領域上または内に良好に存
在または濃縮されている。使用される直接検出可
能な標識には、放射性核種（特にリン−32、イオ
ウ−35、炭素−14またはヨウ素−125標識ヌクレ
オチド）、螢光化合物（標識ポリヌクレオチドの
遊離末端または標識ポリヌクレオチドの１つまた
はそれ以上の不対塩基に結合したフルオレスカイ
ンまたはローダミン誘導体）、または比色法また
は他の方法により検出可能なニトロフエノール部
分のごとき他の手段（切断を含む）で直接検出可
能な部分が挙げられる。間接的に検出可能な標識
には、前記参考文献EPA63.879、WO83／02277
およびEPA97.373に記載されているごとき免疫化
学または他の親和反応を通して認識可能な抗原性
決定素、アフイニテイーリガンド、抗原または抗
体とし役に立つものを改変したものがあり、標識
ポリヌクレオチドに存在または加えられたビオチ
ン化ヌクレオチドにより例証される（鋳型鎖が存
在しない場合標識ポリヌクレオチドの3′末端に多
数のヌクレオチドを加える酵素末端デオキシヌク
レオチジルトランスフエラーゼによるごとく）。 他の間接的な標識は標識ポリヌクレオチドに結
合した酵素であり（特にプローブと対になる領域
から離れた遊離末端で）、その存在は具体化した
方法の置換および分離工程の後、酵素の基質を加
え、酵素基質または良好には酵素反応生性物を定
量する事により決定する。同様に、標識はアポ酵
素、補酵素、酵素改変剤、酵素コフアクターまた
はその類似の物でもよく、置換後（およびある種
の具体例では分離後）通常添加される他の必要な
試薬と、置換後（およびある種の具体例では分離
後）適当な酵素基質と一緒に用いる。もちろん、
１つの成分（例えば基質）が存在しているのに酵
素反応を起こす事ができないから、これらの他の
試薬が前記の接触（置換）工程(b)の間に溶液中に
存在するであろう。 多検出可能標識は末端デオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼ酵素を用いて標識ポリヌクレ
オチドの製造中に添加する事ができる。例えば１
つが酵素（またはアポ酵素）を含み、１つが補酵
素を含むような多標識ポリヌクレオチドもまた使
用する事ができる。酵素が標識ポリヌクレオチド
に結合する１つの型は親和試薬（例えばビオチン
に対するストレプトアビジン）を通してである。
そのような結合型は種々の実施態様で使用でき、
例えば、ビオチン標識ポリヌクレオチドのプロー
ブへのハイブリダイゼーシヨンにより複合体が調
整される場合、前記接触（置換）工程(b)に先だつ
てビオチンに共役するストレプトアビジン−酵素
を結合する。さらに、複合体中の検出可能標識に
相互作用する部分がプローブ上に存在するように
なる。 検出可能標識の多くの型、特にプローブに対す
る標識ポリヌクレオチドの対形成領域から離れて
いれば、試薬複合体融解温度がほとんどあるいは
全く減少せずおよびより重要な事であるが、標的
ヌクレオチド配列およびプローブポリヌクレオチ
ド間のハイブリダイゼーシヨン反応にほとんど影
響を与えなかつた事により証明される（試験の目
的のため）ごとく、標識ポリヌクレオチドおよび
プローブポリヌクレオチド間の塩基対形成の強度
にはほとんどあるいはまつたく影響を与えない。
塩基対形成領域の標識ポリヌクレオチドのヌクレ
オチド上に共有結合したビオチンのごとき、およ
び対形成領域またはその近くでヌクレオチドに結
合した螢光部分のごときいくつかの型の標識は、
試薬複合対安定性に明白な影響を与える。そのよ
うな効果は一般的に標識ポリヌクレオチド／プロ
ーブポリヌクレオチド結合の不安定化である（従
つてその融解温度を下げる）。その効果は置換の
速度を増すという点でいくぶん有益であるが、標
識ポリヌクレオチドの非特異的解離または“減
少”を増加させる。そのような非特異的“減少”
は置換工程の間温度を下げたり、標識ポリヌクレ
オチド結合領域の長さを増したり、または系の他
のそのような物理化学的性質の改良により通常減
少させる事ができる。 固定化プローブポリヌクレオチドおよび標識ポ
リヌクレオチド間の試薬複合体形成（そのような
複合体は本過程で提供され、本試薬に存在する）
は、標識ポリヌクレオチドのプローブポリヌクレ
オチドへのハイブリダイゼーシヨン前または後で
の支持体（前記のごとき）へのプローブの結合過
程を含む。親和または他の化学試薬をその結合の
媒介または参与に使用する。標識ポリヌクレオチ
ドのプローブポリヌクレオチドへのハイブリダイ
ゼーシヨン後固定化が完了したら、結合部分また
はその一部はプローブへすでに結合できている。
一般的にそのような固定化複合体が形成したら、
続いて、非結合の標識ヌクレオチドを洗い流す
が、その洗浄の条件はプローブへわずかに結合し
ている（例えば、希望の結合部位での多数の相補
塩基を通した結合の変わりに、プローブのどこか
に約15相補塩基以下の塩基を通しているような）
または支持体に吸着されている標識ポリヌクレオ
チドもまた除去するように計画された条件で行
う。プローブポリヌクレオチドおよびプローブポ
リヌクレオチドと標識ポリヌクレオチドの複合体
で支持体へただ端で結合しているものもまたこの
洗浄工程で除去する。洗浄は良好には充分な条件
下、充分な時間をかけて行い、本方法の置換工程
の間特異的な置換とは別に支持体から分離してく
る標識ポリヌクレオチド（プローブポリヌクレオ
チドと伴にまたは単独で）による非特異的なバツ
クグラウンド信号を実質的に除く。支持体上の非
特異的結合部位をブロツクする試薬（例えばタン
パク質）もまた使用できる。 溶液で使用する試薬複合体の製造においてもプ
ローブポリヌクレオチドを結合していない標識ポ
リヌクレオチドを生成物試薬複合体から分離して
おくのがしばしば望ましい（ある例では非結合プ
ローブポリヌクレオチドもまた除去される）。も
し（しばしばある場合であるが）標識ポリヌクレ
オチドがプローブポリヌクレオチドまたは試薬複
合体の両方よりかなり小さければ大きさのみで分
離できる（例えばサイズ排除クロマトグラフイー
により）。そのような分離は試薬複合体の少くと
も一部の２重鎖（プローブの標識ポリヌクレオチ
ド結合領域）の性質にも基づいており、そのよう
な２重鎖領域は、標識ポリヌクレオチドまたはプ
ローブポリヌクレオチドには存在しないようであ
る（両方とも非常に小さい内部結合領域を除いて
単一鎖型であると予想される）。この性質のため、
例えば２重鎖特異的抗−核酸抗体を用いるアフイ
ニテイークロマトグラフイーまたはヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフイーにより非結合標識
ポリヌクレオチドから試薬複合体を分離できる。 いくつかの例においては、標識ポリヌクレオチ
ドおよびプローブポリヌクレオチドが同じポリヌ
クレオチド鎖の一部でありうる。例えば、逆位繰
り返しを持つクローン化DNA挿入片を含むM13
バクテリオフアージから線状単一鎖DNA分子を
構成できる。これらの逆位繰り返し配列は、その
相補性により２重鎖領域を形成でき、標識ポリヌ
クレオチドおよび標識ポリヌクレオチド結合領域
を含むであろう。これらの繰り返しの間または隣
接して位置した配列が初期結合領域を含み、標識
ポリヌクレオチド結合領域に隣接して位置してい
る。独特の制限酵素切断部位（例えば、M13mp7
ポリリンカーまたはその改良）が逆位繰り返し配
列および初期結合領域の外側に位置しており、単
一鎖M13ベクターバツクボーンからクローン化挿
入片を切断して放出する事ができる（G.A.
Ricca、J.M.TaylorおよびJ.E.Kalinyak、Proc.
Nut.Acad.Sci.U.S.A.、79巻、724−728ページ
（1982）参照）。制限酵素切断部位（例えばM13ｍ
p7ポリリンカー）を含む追加の小さな逆位繰り
返し配列は標識ポリヌクレオチド繰り返し配列間
に置く事ができる。そのような部位（例えば第３
Ｄ図のＸ）での切断によると、現在異つたプロー
ブポリヌクレオチドに結合している標識ポリヌク
レオチドを保つ相補プリン／ピリミジン塩基対形
成を残し、もし望むなら固体支持体への結合を媒
介できるプローブポリヌクレオチドの遊離末端を
提供する。１つまたは複数の標識を（もしすでに
存在していない場合）、この時点で標識ポリヌク
レオチドに付ける事ができる。 本発明のいくつかの様子において使用された容
積排除ポリマーがもしポリエーテルであれば、そ
れは式Ｈ（Ｏ−Ｒ）o−Ｈ（式中Ｒは炭素数１〜６の
アルキレンであり、ｎは15〜1000の整数（重量平
均に基づいて）である）のごとき単純なポリ（ア
ルキレンオキシド）である。Ｒはメチレン、１，
１−エチレン、１，２−エチレン、１，２−プロ
ピレン、１，４−ブチレン、１，２−ブチレン、
１，２−ヘキセン（２−ブチレテン）または類似
の２価の飽和炭化水素部分であり、単一の分子内
で混合できる。良好なＲはポリ（エチレングリコ
ール）（PEG、ポリ（エチレンオキシド）または
PEOとも称されている）またはポリ（プロピレ
ングリコール）（PPG、ポリ（プロピレンオキシ
ド）またはPPOと称されている）中のごとき１，
２−エチレンまたは１，２−プロピレンである。
このような例中の整数ｎは重量平均分子量を分子
量のモノマー単位で割つたものを表わし：そのよ
うなモノマー単位分子量はPEGが44でありPPG
が56である。PEGでの重量平均分子量は経験的
に好ましいのは少くとも約1500、良好であるのは
約2500およびより良好であるのは約3000から約
20000の間である。従つてｎ（重量平均に基づい
て）は好ましくは少くとも36、より良好であるの
が少くとも60および最も良好であるのは約70から
約690の間である。同様な良好な範囲の組がPPG
のｎに期待される。 本発明において適したポリエーテル重合剤とし
てはエチレンエキシド、プロピレンオキシドまた
は他のアルキレンオキシドとジオール、トリオー
ル、糖または酸のごとき種々の部分との縮合生成
物である。そのような物質は非イオン性表面活性
剤の分野ではよく知られたもので、本発明におい
て効果的であり、分子量は（および水溶解性）は
プローブポリヌクレオチドから標識ポリヌクレオ
チドの非特異的解離を過度に促進する事なく置換
を促進するのに充分である。 本発明のある種の幅広い型においては、他の化
学的に、不活性で水可溶な非イオン性またはアニ
オン性ポリマーを上記ポリエーテルの変わりにま
たは関連して容積排除ポリマーとして使用でき
る。例としてはポリアクリレート、ポリ（ビニル
アクリレート）、誘導体化したおよび誘導体化し
ない多糖類、ポリリン酸およびカルボキシル、ス
ルホン酸、硫酸、リン酸または他のアニオン性部
分を含む種々の共重合体が挙げられる。限定され
た有益な効果を示す物質はFICOLL、MW400000
遊離水酸基を持つシヨ糖とエピクロロヒドリンの
交叉結合反応生成物；FICOLLはPharmacia社の
登録商標）である。非イオン性容積排除ポリマー
に適した種類は糖とエピクロロヒドリンの反応生
成物である。 ある種の容積排除ポリマーは置換反応に対する
その有益効果が決定工程または決定工程の一部に
おける有害効果を上まわる形で接触（置換）工程
および決定（検出）工程を含む本発明の全部の方
法で良好に使用されている。例えば決定工程が分
離（例えばゲルクロマトグラフイー、サイズ排除
クロマトグラフイー、アフイニテイークロマトグ
ラフイーまたは電気泳動）操作を含んでいるよう
な実施態様においてはある種の容積排除ポリマー
の存在は有害効果を示す。置換を促進するのに有
益と信じられている硫酸デキストランはいくつか
の実験で使われているが電気泳動には有害効果を
持つており（試験した特定の条件下）、有害効果
により、より制限される実験はサイズ排除クロマ
トグラフイー（試験した特定の条件下）である。
しかしながら、ルーチンの実験を通して本方法の
特定の具体例における適したポリマーが発見で
き、ルーチンの実験を通して、ハイブリダイゼー
シヨンおよび置換過程を促進する効果を持つポリ
マーを使用する適した検出または決定条件を見い
出す事ができると思われる。 試料物質（標的ヌクレオチド配列を含む核酸を
潜在的に含む）との実際の接触または置換工程は
通常温度、イオン高度、ポリエーテルポリマー
（または類似の容積排除ポリマー）濃度、および
時間の条件は、前記の洗浄工程よりも厳格ではな
い（従つて標識ポリヌクレオチドの非特異的分離
にもより資さない）。接触工程の間の望まれる温
度範囲は、溶液イオン強度および溶解温度に影響
を及ぼす他の添加物に依存するが約15℃から約90
℃であり；試料核酸のプローブに対して起こるハ
イブリダイゼーシヨンが最大または最大に近い速
度になる点が最も効率のよい温度であろう。ある
場合には、室温近く（15−25℃）から生理学的温
度（37−40℃）までのごときより便利な（一般的
に低い）温度が使用される。多くの文献に記載さ
れているごとく（例えば、J.G.WetmurおよびN.
Davidson J.Mol.Biol.31巻、349−370ページ
（1968）およびC.MinsonおよびG.Darby、ウイル
ス学の実際における新しい発展、１巻、185−229
ページ（Alan Liss、Inc.N.Y.、（1982））、ハイ
ブリダイゼーシヨンの速度はPHおよび試料ヌクレ
オチド濃度の関数でもある。また、本明細書に記
載した良好な検定法において適用したポリエーテ
ルポリマーに加えて、硫酸デキストランのごとき
他の水可溶容積排除ポリマーもポリエーテルポリ
マーに関連して使用する事ができる。置換過程に
影響する酵素および他のタンパク質（大腸菌（E.
Coli）ATP−依存recAタンパク質のごとき）が
さらに示されるであろうがしかしながら、ここに
一緒に出願された我々の出願中の、一般に委託さ
れた出願書（その優先権証明はU.S.S.N.607.885
および684.305である）に記載されているその有
益な効果に基づいている。 試薬複合体および、使用するならばポリエーテ
ルポリマー、の割合、量および濃度は個々に決定
的ではないが、試料および試薬複合体の全ハイブ
リダセイゼーシヨン混合物が実施できる程度の濃
度であることが一般に望ましい。大部分の場合、
標的ヌクレオチド配列への結合部位を有するプロ
ーブポリヌクレオチドは試料中の標的ヌクレオチ
ド配列の予想レベルの10倍以上のモル比（多分
100倍以上のモル比）で存在するように期待され
る。試料事態は（膜およびその類似物から分離し
たもの）アツセイのハイブリダイゼーシヨン工程
のために、完全に又は部分的に溶液状の単一鎖で
存在することが好ましい。（二重鎖試料DNAの変
性による）標的ヌクレオチド配列の非標識補鎖が
存在すると妨害を起こしうる。この妨害な少なく
とも標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を有
する試料鎖に対して過剰モルの試薬を用いる本発
明の好適な型式においては少ないらしい。（置換
の前または後に）選択的なプローブの固定化を含
むハイブリダイゼーシヨンでは、置換した標識ポ
リヌクレオチドは液相中に残留し、次いで試料の
核酸の相補鎖部分と再ハイブリツド化するのか否
か決定される。多くの溶液ハイブリダイゼーシヨ
ンでは、この妨害は動力学的効果によつても最小
にされうる。 一般に、もし使用するならば、ポリエーテルポ
リマーの好適な割合は置換反応中の全水相の重量
比（重量／容積または重量％）で表わすことがで
きる。この比は一般に２％からポリエーテルポリ
マーの溶解限界までであり、約５％と20％（重量
％）の間が好適である。特定の試薬複合体や置換
条件では、好適な割合および適当なポリマー分子
量は実施例13および14に示したルーチン実験法で
更に決定する。 体積排除現象、すなわち（核酸および体積排除
の非イオンまたは陰イオンポリマーが存在する場
合）２つの水溶性ポリマーの不適合、のための基
礎はP.MolyneuxによるWater−soluble
Synthetic Polymer：Properties And
Behavior、２巻、pp167−170（1984）に集約され
ている（そこにある文献も参照せよ）。 一般に、体積排除ポリマーを使用する置換反応
は３時間以上は必要とせず、概して１時間以内で
あり、検出に充分な程度に反応するのに30分以下
であるのが好ましい。これらの時間内に鎖置換反
応を実質上終了させるように条件を調製すること
がしばしば可能である。しかし、より長時間のイ
ンキユベーシヨンも必ずしも不利にはならない。
律速段階はプローブポリヌクレオチドの相補配列
を見出す試料または標的ヌクレオチド配列である
と考えられる（C.GreenおよびC.Tibbetts、
Nucleic Acid Research、９巻、pp.1905〜18
（1981）参照）。一度標的／プローブハイブリダイ
ゼーシヨンが起こり始めると、標識ポリヌクレオ
チドの置換は個々の試薬複合体から１分以内、し
ばしば１秒以内で起こると考えられている。 複合体が最初、固型支持体上にある本発明の様
式のいくつかでは、置換した標識ポリヌクレオチ
ドを含む液相が決定工程の一部として固型支持体
から分離される。複合体が溶液中にあると、本発
明のいくつかの様式は、存在する試薬複合体を固
型支持体に固定するための接触（置換）工程と次
に同様の固体／液体分離という処理を含む（他の
様式のプローブは標的ヌクレオチド配列にハイブ
リツトしたものを含む場合もある）。置換した標
識ポリヌクレオチドを含む液相から複合結合体を
含む固相の分離はクロマトグラフイー、過、遠
心分離、磁力まあはデカンテーシヨンのような物
理的手段で行ないうる。固相は液相から引付けら
れたり、物理的に移動できる磁性または他の分離
可能な粒子を含む。さらに２つの相の完全な分離
は必要ではない。標識測定のための部分分離後の
液相の一部を分取し、残りの液相は混合したまま
固相を配置しておく。もしこの分離が起こるかま
たは利用されると、存在の決定（検出）および存
在する標識ポリヌクレオチドの定量はいずれの相
でも行えるが、液相で行なう方が好ましい。置換
した標識ポリヌクレオチドの存在および定量の測
定という液相中の標識の決定は一般に低いバツク
グラウンドシグナルである点で有利である。多く
のバツググラウンドシグナルは上述したような固
型支持体からの非特異的脱落や、試薬複合体から
の標識ポリヌクレオチド鎖の非特異的分離または
試薬の不完全な調製によつて引起こされて大きく
なりうる。加えて、試料中の標的ヌクレオチド配
列の不存在は液相中の標識ポリヌクレオチドから
のバツクグラウンドレベルに比例したシグナル欠
除を生じる。逆に、もし固相に会合した標識で検
出を行なうと、反対の結果が標識ポリヌクレオチ
ドのレベルが減少しないことで示される。特に試
料ヌクレオチド配列中の予想される標的ヌクレオ
チド配列に対して大過剰モルの試薬複合体を使用
する時には、固相支持体上に残留する標識の測定
は結果として実質的感度を減少させる。 本発明のいくつかの実施態様では、置換後の分
離は起こらず、決定は置換した標識ポリヌクレオ
チドで考えられる。このような決定（検出）工程
は置換によりタツグから検出できるシグナルの変
化を含み、そのシグナルは標識ポリヌクレオチド
上またはプローブポリヌクレオチド上の他の場所
のシグナル影響部分へのタツグの接近により影響
される（下記の第３Ａ−３Ｄ図の記述参照）こと
を含む。 他の様式では、特に固定プローブでは２型式の
タツグ部分の間に相互作用がありうる。検出でき
るタツグの一型式は固型支持体上の一ケ所で固定
プローブポリヌクレオチドとハイブリツドした標
識ポリヌクレオチド上に存在しうる。第似の型式
のタヅグは同一の固型支持体上または物理的に近
接した別々の固型支持体上の離れた位置で固定プ
ローブポリヌクレオチドとハイブリツドした標識
ポリヌクレオチド上に存在しうる。第二の型式の
タツグはプローブは同一の標識ポリヌクレオチド
または固型支持体の離れた位置に他の方法で直接
付着することもできる。２つの型式のタツグを含
む全ての場合において、少なくとも１つの標識ポ
リヌクレオチド（タツグ）が置換した場合にのみ
つの２つの異なつたタツグは相互作用しうる。こ
の相互作用は特にアポグルコースオキシダーゼと
フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）のよ
うなアポ酵素と補酵素に適用できる。 本発明の方法および試薬は種々の濃度で種々の
標的ヌクレオチド配列の検出、決定に利用でき
る。特に標的とされる核酸（ゲノムやその他のも
の）を含む伝染性因子を有する微生物としてはサ
イトメガロウイルスやネイセリアゴノルヘア
（Neisse−ria gonorrhae）のような病原性ウイ
ルス、バクテリアおよびカビが挙げられる。標的
とされる典型的な遺伝子病および症状としてはβ
−地中海貧血、α1−地中海貧血、ネコ鳴き
（criduchat）症候群および網膜芽腫が挙げられ
る。本方法と試薬は標的配列として陰性と判断さ
れるように意図した試料中に存在する最も近接し
た配列から標的ヌクレオチド配列を区別するため
に多塩基ヌクレオチド削除、そう入、置換または
転位が必要とされる時に、まず最初に遺伝子疾患
または変化を検出するのに適用できる。本発明
は、もしあれば、単一塩基変異になる遺伝子疾患
にもある程度応用でき、置換塩基または他の変異
点の相補鎖はプローブポリヌクレオチドの標的結
合領域に望ましくは存在し、その塩基の位置は、
本方法の選択性に影響を与えるであろう領域内に
ある。構造遺伝子、調節遺伝子またはオンコジン
の発現、活性化または転位における変化や差異は
本方法で検出できる。遺伝子発現を調べるには
mRNAを標的とする。構造遺伝子の発現におけ
る他の摂動も同様に検出できる。本方法は組織移
植のための組織適合性検査、微生物での抗生物質
耐性遺伝子の決定および食品、医薬品および水試
料中の特別な伝染性因子や他の微生物の検査にも
適用できる。 特定試験のための法的配列の選択は標的組成や
状態に特有または比較的特有である配列の決定を
含む。この標的配列は（そこに相補的である）標
的結合領域を開発するのに使用され、そして適当
な長さの標識ポリヌクレオチドは標的結合領域の
一部に結合するように開発されている。特定の標
的配列が相対的に独特なもののみである時に、同
一の組織または状態である核酸の異なる部位を標
的とする複式の試薬複合体を、特異性を向上する
ために使用することができる場合もある。 理解する目的で、本発明の１つの実施態様を第
１Ａ〜１Ｅ図を参考にして例証する。ここには長
さが3300ヌクレオチドの固定プローブポリヌクレ
オチドＰが示されている。5′末端からの番号付け
で、ヌクレオチド3000からヌクレオチド3300の領
域が標的ヌクレオチド結合領域（TBR）を表わ
す。簡潔にするため、プローブの第１ヌクレオチ
ドが直接支持体Ｓに付着したと仮定する。第１Ａ
図に図示したように、標識ポリヌクレオチドＬは
150の塩基から成り、タツグＴはその5′末端に付
いている。この150の塩基のうち、51の塩基（塩
基番号100〜150）がプローブの標識ポリヌクレオ
チド結合領域（LBR）、塩基3250〜3300、に特異
的に結合する。それゆえ、支持体Ｓに付着したプ
ローブポリヌクレオチドＰより成る固定プローブ
を通常のハイブリダイゼーシヨン条件下で標識ポ
リヌクレオチドＬ溶液と処理すると、第１Ａ図に
示すようにプローブＰの塩基3250〜3300と標識ポ
リヌクレオチドＬの塩基100〜150の間で塩基対に
なつて、プローブポリヌクレオチドＰの末端に標
識ポリヌクレオチドＬが付着して複合体が形成さ
れる。 通常、例示した複合体をハイブリダイゼーシヨ
ン条件下、生体試料と接触させる。試料は塩基
10000〜10300にこの配列に相当するヌクレオチド
配列を含み、プローブの標的係合領域（TBR）
に選択的に結合する。適当なハイブリダイゼーシ
ヨン条件下、試料ポリヌクレオチドＧは第１Ｂ図
に示すように、まずＧの塩基10051〜10300がプロ
ーブＰの塩基3000〜3249（初期結合領域、IBR）
と結合し、塩基対を形成する。第１Ａ図に示す試
薬複合体中のIBRは完全に単一鎖である。しか
し、熱力学的考察では単一鎖部分に対して第１Ｂ
図に示すような二重鎖部分の方が有利であると認
識されるはずである。しかし、この初期のハイブ
リダイゼーシヨンが律速段階であり、体積排除ポ
リマーの今回の使用が多くの条件下、この段階を
容易にしたり、速度を上げると考えられる。その
後、プローブポリヌクレオチドＰの塩基3250〜
3300（LBR）において標識ポリヌクレオチドＬへ
の結合と試料ポリヌクレオチドＧの塩基10000〜
10050への結合との間に平衡が成立する。この条
件下、第１Ｂ図と第１Ｃ図との間の違いに表わさ
れるような急速なジツパリングとアンジツパリン
グがプローブポリヌクレオチドに沿つた分枝点の
不規則移動に沿つて生じる。このような場合、試
料ポリヌクレオチドＧの付加ポリヌクレオチドが
プローブ塩基3249以後のプローブポリヌクレオチ
ドに結合する時には、標識ポリヌクレオチドＬの
相当する塩基が置換された遊離末端が形成され
る。ここに記載された条件下、このジツパリング
とアンジツパリングはいずれの方向にも起こりう
る。しかし有利なのは最終的に第１Ｃ図に示す右
への付着点位置の移動である。第１図は、塩基番
号3275から、プローブポリヌクレオチドＬがプロ
ーブＰ（第４図）に全て置換される点である塩基
番号3300までの塩基をいくらか引き伸ばしてより
グラフイツクな形式でプローブがほぼ置換された
状態を表わしている。単に両方向への不規則ジツ
パリングとアンジツパリングでは、標識ポリヌク
レオチドＬの離脱が有利と思われ、第１Ｂ図は標
識ポリヌクレオチドＬが試料ポリヌクレオチドＧ
の標的ヌクレオチド配列を置換できるには最も遠
い左側に位置することを表わしている。プローブ
ポリヌクレオチドＰのヌクレオチド配列が選択的
に標的ヌクレオチド配列と結合するが、標識ポリ
ヌクレオチドとは結合しないという領域が初期結
合領域（IBR）の実質的領域に存在する場合は試
料ポリヌクレオチドＧがプローブから完全に置換
するということは珍しい逆の出来事であろう。 本方法および試薬を最適にする重要なパラメー
ターは標識ポリヌクレオチドとプローブポリヌク
レオチドとの間の塩基対の長さと性質である。第
１Ａ図に示した51の塩基対形成を厳密に比較する
と、この長さの増減、いずれかの鎖における不適
当な組合せやループの形成の導入、または自然に
生じる（そして多分特異的な）解離の速度に影響
するようなDNAおよびRNAのいずれかまたは両
方の鎖の選択、のいずれかにより変更態様をつく
ることができる。これに関して、標的ヌクレオチ
ド配列がRNAで標識ヌクレオチドがDNAの場
合、プローブポリヌクレオチドＰがDNAかRNA
かにより、特定の差異が生じる。これは一般に
RNA−RNA結合が塩基対当り最も強く、DNA
−RNA塩基対が中程度の強さで、DNA−DNA
塩基対が最も弱いためである。しかし、もし標的
結合領域（TBR）が標識ポリヌクレオチド結合
領域（LBR）よりも大きいと、標識ポリヌクレ
オチドはRNAであり、なおDNA標的ヌクレオチ
ド配列で置換されうる。例えば、もし標的微生物
がRANウイルスであるか、または標的状態が変
更遺伝子表現の一つであると、RNAを標的とす
ることが必要となりうる。 標識ポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオ
チドに結合する領域での結合強度を減少する１つ
の方法は標識ポリヌクレオチドへの個々の塩基の
不適当な組合せを取入れることである。標的ヌク
レオチド配列と正確にまたはほぼ正確に対を作る
ためプローブヌクレオチド配列を選択すると仮定
すると、この不適合は、正確な（またはほぼ正確
に）結合を有する標的ヌクレオチド配列の類似の
ポリヌクレオチド部分に匹敵する標識ポリヌクレ
オチドの変更や個々の塩基置換として考えられ
る。この変異や置換としては次に挙げるような天
然ヌクレオチドと天然または化学的修飾ヌクレオ
チドとの置換がある。（適切な対dG−rU、dG−
dT、rG−dTまたはrG−rUを生成するための）
ＡへのＧ、ＧへのＡ、Ｃへの５−メチルシトシ
ン、Ｃへの５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｃへ
のゲンチビオシル−５−ヒドロキシメチルシトシ
ン、Ａへの５−ブロモウラシル。多くの好適な実
施態様では、このような変異には自然に起こるヌ
クレオチドの他のヌクレオチドへの置換が挙げら
れる。ある実施態様では、置換としてはピリミジ
ン−ピリミジン対となる不適合対を導くプリンへ
のピリミジンの置換が挙げられる。ピリミジンは
プリンより場所を占めないため、このような個々
のピリミジン−ピリミジン不適合は隣接するヌク
レオチドの対形成への影響は小さい。プリン−ピ
リミジン誤対形成（例えばＡがＣの反対側に位置
したり、ＣやＴがＧの反対側に位置すること）は
いくらか大きな場所を占めるが、ぴつたりと相互
に２つのプリン（Ａ−Ａ、Ａ−ＧまたはＧ−Ｇ）
が位置する場合よりは、まだ一般的に占める場所
は小さい。しかし場所はその占有効果を妨害する
のは反対側へ向うスタツキングエネルギー効果で
ある。一般にプリン／プリン塩基対はより低いス
タツキングの自由エネルギーを示し、プリン／ピ
リミジン塩基対はいくらか大きく、ピリミジン／
ピリミジン塩基対は更にいくらか大きい。R.L.
OrnsteinおよびJ.R.FrescoによるBiopolymers、
22巻、pp.1979〜2016（1983）（２論文）を参照せ
よ。試薬複合体の融点への影響や試薬複合体の安
定性への影響および置換の動力学への影響による
正味の影響はこれらの２つの相反する影響の結合
で主に表わす。このような実験法は、もしあると
するならば、標的ヌクレオチド領域と標識ポリヌ
クレオチドの位置が固定された後で、不適切な組
合せが特定のプローブに対する標識ポリヌクレオ
チドの中にむしろ組み入れられることを決定する
ように要求される。 位置の置換に加えて、不適当な組合せはプロー
ブヌクレオチド配列に相当しない標識ポリヌクレ
オチド中の短い配列のそう入（例えば第１Ａ図に
示した例において標識ポリヌクレオチドＬの塩基
125と126の間への一連のA′のそう入）や一部分
の削除（第１Ａ図での標識ポリヌクレオチドＬの
塩基120〜130の削除）によつて生じうる。標識ポ
リヌクレオチドにおけるそう入は一般に標識ポリ
ヌクレオチドの単一鎖のループまたは十字形を形
成する。そこにおける削除は一般にプローブポリ
ヌクレオチドの単一鎖のループまたは十字形を形
成する。 この置換、削除またはそう入は標識ポリヌクレ
オチドＬとプローブポリヌクレオチドＰとの間の
結合を不安定化させる効果を有し、この不安定化
は標識ポリヌクレオチドの置換をますます促進さ
せる。しかし標的ヌクレオチド配列のない場合に
プローブポリヌクレオチドＰからの標識ポリヌク
レオチドＬの起こりうる非特異的置換を避けるこ
とは重要である。この解離や脱落を最小にするの
に充分な標識ポリヌクレオチドＬとプローブポリ
ヌクレオチドＰとの間の結合の最小の長さは、特
に、ハイブリダイゼーシヨンのPHや温度のような
条件、支持体へのプローブポリヌクレオチドの付
着の方法（例えば、非特異的吸着に対する末端付
着）、不安定化させる置換（や削除または付加）
の程度、水素結合の領域での二重核酸配列、およ
び結合がRNAとRNA、DNAとRNA、DNAと
DNAの間のいずれであるか、という多数の因子
に依存する。特定の場合における最適条件は本発
表の一般教義に基づいたルーチン実験法で経験的
に決定できる。この実験法は安定性を評価する目
的で標的ヌクレオチド配列を欠く試料での融点実
験および最終的な最適化のための置換実験を含ん
でいる。 プローブポリヌクレオチドに結合する標識ポリ
ヌクレオチドの領域（LBR）とプローブポリヌ
クレオチドに結合する標的ヌクレオチド配列の領
域（TBR）との間の幾何学的関係を考慮して、
標識ポリヌクレオチド結合領域が小部分であり、
固型支持体と反応側の標的結合領域の末端で結合
する第１Ａ−１Ｂ図に示すような構成を用いるこ
とができる。TBRおよびLBRの共通の末端（第
１Ａ図におけるプローブポリヌクレオチド3300）
はプローブポリヌクレオチドの一つの末端また
は、それに近いものでもある。しかし、非特異性
の配列においてこの位置を越えたプローブポリヌ
クレオチド領域を有することには大きな利点はな
い。この対形成領域を越えて連続するプローブポ
リヌクレオチドを有し、後で他の手法によつては
ずす（標識ポリヌクレオチドＬでの標識Ｔとは異
なる）標識の付着点まで広がるポリヌクレオチド
が望ましい場合が存在しうる。更に、（標識ポリ
ヌクレオチド上の１つとプローブポリヌクレオチ
ドでの他方という）２つの標識は読み取りの一部
として検出される相互作用により影響されうる。
本発明のいくつかの実施態様では標識結合領域は
支持体に最も近い標的結合領域の末端またはその
付近にあることが好ましい。 本発明に含まれるが、より好ましくない態様と
しては、試料ヌクレオチドの一部（特に、試料ポ
リヌクレオチドＧの塩基9750〜9800のような領
域）に選択的に結合する（塩基3375〜3425のよう
な）領域とLBRを越えたプローブポリヌクレオ
チドＰの延長（すなわち、例えば第いＦ図におけ
る塩基3300を越えた塩基125）が挙げられる。こ
の場合には、試料ポリヌクレオチドＧはプローブ
ポリヌクレオチドＰの塩基3000〜3249およびプロ
ーブポリヌクレオチドＰの塩基3450〜3500と両方
と結合し、標識ポリヌクレオチドＬにかぶさる。
一般的に「三重鎖」範囲またはＤループと表され
るこの構造（C.GreenおよびC.Tibbettsによる
Nuclear Acids Research、９巻、８号、
pp.1905〜18（1981）、特に1912ページを参照）は、
いくつかの幾何学において標識ポリヌクレオチド
Ｌの置換を起こさず、シグナル発生なしに可能な
特異的結合を起こす。プローブの塩基3250〜3300
での置換はまだ可能である（両端から進行しう
る）のに、その塩基9750〜9800での結合による試
料鎖Ｇの自由運動の喪失は、特にらせん構造が実
際に含まれていると考えられる場合に、完全な置
換の確率は減少しうる。 本発明の範囲内のもう１つの状態で、上記のも
のよりより好ましくないものは、標識ポリヌクレ
オチド結合領域（LBR）が標的結合領域
（TBR）を越えたり外側に拡がつたものである。
本発明のこの第２の実施態様を第１Ｇ図（と実施
例13と14）に例証する。図中には試薬複合体を示
しており、標的ヌクレオチド配列はTBRの末端
まで標識ヌクレオチドを置換できる。標識ポリヌ
クレオチドは標識ポリヌクレオチド結合領域
LBRの一部であつて、標的結合領域TBRではな
いプローブ塩基（この塩基の配列は残りの結合領
域、RBRで示される）を経て結合を保つている。
もしRBR（例えば第１Ｇ図でのプローブＰの塩基
3300〜3305）がLBRよりもずつと小さいならば、
理論的には、全体の標識ポリヌクレオチド配列
LBRに結合した他の標識ポリヌクレオチドを解
離することなしに、この複合体中の標識ポリヌク
レオチドをすつかり解離するように（例えばPHや
温度を）この時点で条件を変えることができる
（実施例３では溶液中の置換を示す）。しかし、第
１Ｇ図に示されたハイブリツドは、TBRとLBR
の重複した領域内の塩基に結合した標的ポリヌク
レオチド配列の部分の一部または全部を置換でき
る標識ポリヌクレオチドと標的ヌクレオチド配列
Ｇと完全に結合した後に左に置換することができ
ると思われる。この結果は標識ポリヌクレオチド
の置換能率を低下させると考えられる。 第１Ａから１Ｇ図に示したものと異なつた本発
明の他の実施態様を第２〜６図に例証し、以下に
簡単に検討した。 第２図は第１Ａ図のものと異なつた複合体を用
いる本発明の第３の実施態様を示している。これ
では標識ポリヌクレオチドL1はプローブ鎖P1お
よびP2の標的結合領域Ａの一部分（LBR）と相
補的であるセグメントA1′をそう入したDNAバク
テリオフアージM13の環状陽性（または伝染性）
鎖（M13+）である。この実施態様における標識
は標識ポリヌクレオチドL1のM13+主要部分内に
分布する一連のビオチン部分Ｂと示されている。
これは多分、バクテリア培養中のM13がビオチン
化ヌクレオチドトリホスフアート（例えばビオチ
ン化dATP）中で成長したり、後でM13ヌクレオ
チドにビオチンが化学的に付着する。A1′セグメ
ントもビオチンも結合したヌクレオチドを含んで
いる。この場合（第２図）、試料ポリヌクレオチ
ドＧは各プローブP1とP2のセグメントＡと相補
的である標的ヌクレオチド配列AA′を含んでい
る。この実施態様ではプローブポリヌクレオチド
もM13ゲノムの非必須領域中の一つの位置にそう
入された標的ヌクレオチドＡと相補的であるセグ
メントＡをバクテリアフアージM13を使用して形
成されうる。プローブのM13+セグメントは標識
ポリヌクレオチドのM13+領域へ非相補的（実際
には等しいか相同）である。もし環状フアージが
非特異的に開裂する（例えば制限酵素Haeによ
る部分開裂、R.W.BlakesleyおよびR.D.Wells、
Nature、257巻、pp.421〜422（1975））ならば、
両端に比べて異なる位置にセグメントＡを有する
が一般にセグメントＡの両端にM13+鎖の一部を
もつ直線状鎖が創造される。これは第２図におい
て、鎖P1（図中セグメントＡは支持されたポリヌ
クレオチドの遊離末端に近接している）および鎖
P2（図中セグメントＡは付着末端に近接してい
る）で例証されている。もちろん開裂は（M13+
領域内に２つ以上の開裂による）短縮された鎖を
生成する可能性もあり、（領域Ａ内での開裂によ
る）両末端に分割された領域Ａ分裂片で鎖を生成
することもある。後者の条件は完全で充分効力の
ある標的結合領域の形成失敗になりうる。領域Ａ
がM13+鎖の長さに比べて小さい（7.2キロ塩基、
J.VieraおよびJ.Messing、Gene、19巻、259〜68
（1982））ならば、プローブ鎖が領域Ａ分裂片を有
することが比較的ないと考えられる。セグメント
Ａま位置の均一性は特異的に単一鎖M13DNAを
開裂することにより達成されうる（例えば、逆位
繰返し配列を認識する制限酵素で、またはM13ゲ
ノムへの挿入による）。 置換後、第２図または関連実施態様のビオチン
置換の標識ポリヌクレオチドをストレパビジンお
よびペルオキシダーゼ活性に基づいた比色、蛍光
または化学ルミネツセンス読み取りと連結した西
洋ワサビペルオキシダーゼを用いる前に、例えば
ストレパビジンカラムで液相から濃縮する。 第３Ａ図は試薬複合体がすつかり溶液中にある
本発明の第４の実施態様を示している（支持体は
存在しない）。プローブポリヌクレオチドＰはサ
ブ領域（標識ポリヌクレオチド結合領域
（LBR））を含んだ標的結合領域（TBR）を有
し、LBRにおいて塩基は標識ポリヌクレオチド
(L)の相補塩基と結合する。標識ポリヌクレオチド
(L)はプローブ(P)に付着した消光部分(Q)にきわめて
近接して複合体に保持された蛍光標識(F)を含む。
これらの部分ＦおよびＱは消光部分(Q)によつて吸
収される照射により蛍光標識(F)の刺激によつて生
じるシグナルに対して、第３Ａ図の複合体では充
分に近接している。ＦとＱの典型的な対はローダ
ミンによる蛍光である。M.CobbおよびS.
GotcherによるAm.J.Med.Tech.、48巻、８号、
pp.671〜677（1982）を参照せよ。 第３Ｂ図は標的結合配列全体（TBR）に相補
的である塩基配列を含んだ試料Ｇによる接触の後
の第３Ａ図の試薬複合体を示している。第１Ｂ図
と同様に、結合は最初TBRの不対領域で起こり、
次いでサブ領域LBRから標識ポリヌクレオチド
Ｌの部分が置換する。（第１Ｃ図および第１Ｄ図
で見られたような）部分的な置換の状態を第３Ｂ
図に示す。置換の完了で試料ポリヌクレオチドＧ
の標的配列はプローブＰの全領域TBRに結合し、
標識ポリヌクレオチドＬは全体的に置換される。
この状態では、第３Ｃ図に示すように、標準(F)は
消光されない刺激による検出可能のシグナルを生
じる消光部分(Q)から充分離れている（他のプロー
ブＰが、その標識Ｑが標識Ｆにきわめて接近した
ところに位置するように珍しい場合を除く）。従
つて蛍光標識(F)の刺激と非消光シグナルの測定は
分離工程を実施せずに置換した標識ポリヌクレオ
チド用の定量的検出方法として役立ちうる。 標識ポリヌクレオチドＬとプローブポリヌクレ
オチドＰ（それぞれ標識ＦおよびＱを付けている）
が同一分子の部分を占めているという第３Ａ〜３
Ｃ図の実施態様での変更が第３Ｄ図に示されてい
る。加えて部位Ｘは逆位繰返し配列を含むことを
示しており、その一部は制限酵素認識部位と考え
られる。この酵素はTBRとＬとの間の共有結合
を切断するのに用いられる（しかし、この切断は
読み取りがＦ−Ｑ相互作用に基づく時には必要な
い）。この開裂は支持対へのプローブの付着のた
めの部位の創造における第一工程としても用いら
れ、この付着は置換の前または後に起こる。第３
Ｄ図の全体の幾何学は第１Ａ〜１Ｅ図のものを含
めて種々の実施態様のための単一分子として試薬
複合体を合成するにも用いられる。 第４図はプローブ鎖P3が支持体Ｓに非特異的
に吸着された環状単一鎖ポリヌクレオチドである
複合体を示している。このポリヌクレオチドは適
当なクローニング操作でM13のような単一鎖バク
テリオフアージに標的結合領域（TBR）の挿入
で生成しうる。ここでの標識ポリヌクレオチドＬ
はセグメントTBRの一部分LBRへ唯一相補的で
あるセグメントA1′を含む。 第５図は支持体Ｓへの吸着の代りに、プローブ
鎖P4が支持体Ｓに共有的に付着した結合ポリヌ
クレオチドと結合することを除いて第４図と同様
の複合体を示している。この結合ポリヌクレオチ
ドはTBRセグメントから離れたプローブP4のセ
グメントH′へ相補的である領域Ｈを含む。 第６図はプローブ鎖P5がその遊離末端または
その付近に標的結合領域TBRを含んだ第１Ａ図
の実施態様と同様の複合体を示している。TBR
セグメントの一連の部分（サブセグメントA3、
A4、A5、A6、A7、A8、A9およびA10）は標識ポ
リヌクレオチドの相補領域と対になる各塩基であ
る。標識ポリヌクレオチドL3のセグメントA3′は
サブセグメントA3と対になる。プローブP5は８
個の他のサブセグメント（A3〜A10）（それぞれ、
標識ポリヌクレオチド結合領域を形成する）と同
様に、初期結合領域の形成とともにサブセグメン
トA1およびA2に分割される標的結合領域TBRを
含む。この実施態様では、（第１Ｅ図に示される
ような）試料ポリヌクレオチドＧのセグメント
A′の結合は全ての標識ポリヌクレオチドL3、L4、
L5、L6、L7、L8、L9およびL10を置換し、第１Ａ
図で示された状態で比べて増大したシグナルを生
じる。しかし、それらの標識ポリヌクレオチド
（例えばL8）のいずれかが欠除すると、（標識ポ
リヌクレオチドが補体でない）サブセグメント
A1およびA2と標識ポリヌクレオチドが特定のプ
ローブ鎖上に欠除している（A8のような）他の
プローブセグメントとの結合によつて（第１Ｆ図
のように）標的ヌクレオチドとＤ−ループを形成
すると考えられる。 実施例 以下の実施例のある場合、４種の合成DNAオ
リゴマーを標識のポリヌクレオチドとして使用
し、全てを放射性リン−32原子で標識した。２種
のオリゴマーは1.1kb pBR332DNAフラグメント
の鎖の3′末端に26または27塩基を組合せた27塩基
オリゴマーである。このフラグメントは
pBR332DNAにおけるPstI制限部位からBamHI
制限部位に拡がつている。これらの２種のオリゴ
マー（L1およびL2）と、これらが結合していた
標識ポリヌクレオチド結合領域を表１に示す。オ
リゴマーL2における不適当な組合せのピリミジ
ン塩基には下線を付けてある。
【表】
他の実施例で使用した２つのオリゴマーは
1.1kbヒトアルブミン遺伝子配列の中央付近の領
域に適合する32塩基オリゴマーである。他の２つ
のオリゴマー（L3およびL4）の配列は以下の実
施例７に記載されている。 実施例 １ 27塩基の１つの不適合を含有するオリゴマー
（表１のL2）を32P−ｒ−ATPでリン酸化しM13
ｍp9クローン−16DNAの十鎖にハイブリダイ
ズする。M13ｍP9クローン−16DNAはプラス
鎖がBamHI部位をその3′末端に含有するように
向けているpBR322の1.1kbのPstI−BamHI断片
をその中にクローンしたバクテリオフアージM13
ｍp9DNAより構成される。結合オリゴーマはセ
フアロース 4Bカラムにて試薬複合体より非結
合オリゴマーを除去することにより精製する。プ
ローブ分子の約40％が標識オリゴマーとハイブリ
ダイズすることが明らかとなつた。約250ngの試
薬複合体を５倍モル過剰の単鎖競合M13ｍp8ク
ローン20DNAが非相同M13ｍp8DNAに41℃にて
2XSSC存在下20分または２時間、暴露する。
M13ｍp8クローン20DNAのプラス鎖はM13ｍp9
クローン−16に存在するpBR322DNAに相補
的な1.1kbDNA鎖をその中にクローン化したバク
テリオフアージM13ｍp8DNAより構成される。
それぞれのサンプルの一部をゲル電気泳動とオー
トラジオグラフイーのために取る（データは示さ
ないが、次の分析を確信させるものである）。残
りのサンプル（5500−8000cpm全活性）５mlのセ
フアロース 4Bカラムを用いた。３滴画分をTE
（10ｍＭトリス、PH8.0、１ｍＭ Na2EDTA）中
に溶出しシンチラントと計数した。結果は表２に
まとめた。
1.1kbヒトアルブミン遺伝子配列の中央付近の領
域に適合する32塩基オリゴマーである。他の２つ
のオリゴマー（L3およびL4）の配列は以下の実
施例７に記載されている。 実施例 １ 27塩基の１つの不適合を含有するオリゴマー
（表１のL2）を32P−ｒ−ATPでリン酸化しM13
ｍp9クローン−16DNAの十鎖にハイブリダイ
ズする。M13ｍP9クローン−16DNAはプラス
鎖がBamHI部位をその3′末端に含有するように
向けているpBR322の1.1kbのPstI−BamHI断片
をその中にクローンしたバクテリオフアージM13
ｍp9DNAより構成される。結合オリゴーマはセ
フアロース 4Bカラムにて試薬複合体より非結
合オリゴマーを除去することにより精製する。プ
ローブ分子の約40％が標識オリゴマーとハイブリ
ダイズすることが明らかとなつた。約250ngの試
薬複合体を５倍モル過剰の単鎖競合M13ｍp8ク
ローン20DNAが非相同M13ｍp8DNAに41℃にて
2XSSC存在下20分または２時間、暴露する。
M13ｍp8クローン20DNAのプラス鎖はM13ｍp9
クローン−16に存在するpBR322DNAに相補
的な1.1kbDNA鎖をその中にクローン化したバク
テリオフアージM13ｍp8DNAより構成される。
それぞれのサンプルの一部をゲル電気泳動とオー
トラジオグラフイーのために取る（データは示さ
ないが、次の分析を確信させるものである）。残
りのサンプル（5500−8000cpm全活性）５mlのセ
フアロース 4Bカラムを用いた。３滴画分をTE
（10ｍＭトリス、PH8.0、１ｍＭ Na2EDTA）中
に溶出しシンチラントと計数した。結果は表２に
まとめた。
【表】
【表】
モル過剰の非相同
M13mp8DNA〓2時間、
41℃
実施例 ２ 単鎖M13ｍp9クローン−16DNAより構成さ
れる精製試薬（実施例１参照）と１つの不適合を
含有するリン酸化された27−mer（上記表１中標
識ポリヌクレオチドL2）は実施例１の様に調製
する。競合ハイブリダイゼーシヨンは2XSSC存
在下50℃にて１時間まで実施する；サンプルは氷
上に置いて後1.5mm厚の５％（上）と20％（底）
の重層ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動す
る。電気泳動は約600V−ｈで行ない重層ゲル系
をオートラジオグラフする。それぞれのサンプル
は50ngの遊離標識−プローブ混合物を含有す
る；M13ｍp8クローン20DNAはサンプル競合
DNAとして働き、M13ｍp8DNAと剪断牛胸腺
DNAは非相同物である。表３は個々のポリアク
リルアミド穴に置かれたサンプルの同定と遊離ま
たは非結合標識オリゴマーのパーセントをまとめ
たものである。オリゴマー値パーセントはそれぞ
れのゲル線のオートラジオグラムをデンシトメー
ターで走査して得たものである。
M13mp8DNA〓2時間、
41℃
実施例 ２ 単鎖M13ｍp9クローン−16DNAより構成さ
れる精製試薬（実施例１参照）と１つの不適合を
含有するリン酸化された27−mer（上記表１中標
識ポリヌクレオチドL2）は実施例１の様に調製
する。競合ハイブリダイゼーシヨンは2XSSC存
在下50℃にて１時間まで実施する；サンプルは氷
上に置いて後1.5mm厚の５％（上）と20％（底）
の重層ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動す
る。電気泳動は約600V−ｈで行ない重層ゲル系
をオートラジオグラフする。それぞれのサンプル
は50ngの遊離標識−プローブ混合物を含有す
る；M13ｍp8クローン20DNAはサンプル競合
DNAとして働き、M13ｍp8DNAと剪断牛胸腺
DNAは非相同物である。表３は個々のポリアク
リルアミド穴に置かれたサンプルの同定と遊離ま
たは非結合標識オリゴマーのパーセントをまとめ
たものである。オリゴマー値パーセントはそれぞ
れのゲル線のオートラジオグラムをデンシトメー
ターで走査して得たものである。
【表】
【表】
線 サンプル核酸 間 ト
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (a)() 標的ヌクレオチド配列に対し、プリ
ン／ピリミジン塩基の水素結合を通して塩基
対結合ができるプローブポリヌクレオチド、
および () プロ−ブポリヌクレオチドが標的ヌクレ
オチド配列に結合できる領域に全部またはほ
とんど全部共通するプローブポリヌクレオチ
ドの領域でプローブポリヌクレオチドに対
し、プリン／ピリミジン塩基の水素結合を通
して塩基対結合により結合された標準ポリヌ
クレオチドとの試薬複合体を提供し； (b) 該試薬複合体を試料とインキユベートして存
在する標的ヌクレオチド配列がプローブポリヌ
クレオチドと結合して標識ポリヌクレオチドを
複合体から除去し；そして (c) 試薬複合体から除去された標識ポリヌクレオ
チドの存在を測定する； 各工程から成る生物試料の核酸中の予め決定され
ている標的ヌクレオチド配列の存在を測定する方
法。 ２ 標識ポリヌクレオチド結合領域が約20から
500ヌクレオチドの長さである特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ３ 標識ポリヌクレオチド領域の一部ではない標
的結合領域の部分が少なくとも約100ヌクレオチ
ドの長さであり、および少なくとも標準ポリヌク
レオチド結合領域の大きさである特許請求の範囲
第１項または第２項のいずれかに記載の方法。 ４ プローブポリヌクレオチドが試料標的ヌクレ
オチド配列への塩基対結合できる標的結合領域、
および少なくとも約15ヌクレチオドの標識ポリヌ
クレオチドに対してプリン／ピリミジン塩基対形
成により結合する標識ポリヌクレオチド結合領域
を含み；標識ポリヌクレオチドの結合領域の少な
くともいくつかのヌクレオチドが標的ポリヌクレ
オチド結合領域に含まれており；および標識ポリ
ヌクレオチド結合領域の約15を越えないヌクレオ
チドが標的結合領域外に存在する特許請求の範囲
第１項ないし３項のいずれかに記載の方法。 ５ プローブポリヌクレオチドが複合体中の固体
支持体に固定化されている特許請求の範囲第１項
ないし第４項のいずれかに記載の方法。 ６ 測定工程(c)が (c1) 固定化プローブポリヌクレオチドを含む第
１の相を除去された標識ポリヌクレオチドを含
む第２の相から分離し；そして (c2) 第２の相における標識ポリヌクレオチドの
存在を測定する； 各工程から成る特許請求の範囲第５項記載の方
法。 ７ 試薬複合体が接触工程(b)間、溶液中に遊離し
ている特許請求の範囲第１項から第４項のいずれ
かに記載の方法。 ８ 測定工程(c)が、 (c1) 接触工程(b)の後、反応溶液の一部から残存
している試薬複合体を分離し、 (c2) 分離後溶液相中のいかなる除去された標識
ポリヌクレチオドの存在をも測定する、 各工程から成る特許請求の範囲第７項記載の方
法。 ９ 標識ポリヌクレオチドおよびプローブポリヌ
クレオチドの間の塩基対形成が少なくとも１つの
不適合対により中断される特許請求の範囲第１項
ないし第８項のいずれかに記載の方法。 １０ 標識ポリヌクレオチドが酵素に結合してい
るポリヌクレオチドである特許請求の範囲第１項
から第９項のいずれかに記載の方法。 １１ 標的ポリヌクレオチド配列がDNAである
特許請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに
記載の方法。 １２ プローブポリヌクレオチドがDNAである
特許請求の範囲第１項から第１１項までのいずれ
かに記載の方法。 １３ (a)() 標的ヌクレオチド配列に対し、プ
リン／ピリミジン塩基の水素結合を通して塩
基対結合ができるプローブポリヌクレオチド
と、（）プロ−ブポリヌクレオチドが標的
ヌクレオチド配列に結合できる領域に全部ま
たはほとんど全部共通するプローブポリヌク
レオチドの領域でプローブポリヌクレオチド
に対し、プリン／ピリミジン塩基の水素結合
を通して塩基対結合により結合された標識ポ
リヌクレオチドとの試薬複合体を提供し； (b) 該試薬複合体を試料とインキユベートして存
在する標的ヌクレオチド配列がプローブポリヌ
クレオチドと結合して標識ポリヌクレオチドを
複合体から除去し；そして (c) 試薬複合体中に残存する標識ポリヌクレオチ
ドの存在を測定する； 各工程から成る生物試料の核酸中の予め決定され
ている標的ヌクレオチド配列の存在を測定する方
法。 １４ 実施工程(b)をポリエーテルポリマーの存在
下で、存在する標的ポリヌクレオチド配列がプロ
ーブポリヌクレオチドに結合しそして複合体から
標識ポリヌクレオチドを除去する条件下で実施
し、前記ポリエーテルポリマーが除去標識ポリヌ
クレオチドの出現の速度を増加せしめるのに十分
な分子量および濃度である特許請求の範囲第１項
から第１３項までのいずれかに記載の方法。 １５ ポリエーテルポリマーが式Ｈ（Ｏ−Ｒ）ｎ
（式中Ｒは炭素数１〜６のアルキレン部分であり、
ｎが重量平均分子量に基づいた約35から約690ま
での整数である）を有するポリ（アルキレンオキ
シド）である特許請求の範囲第１４項記載の方
法。 １６ ポリエーテルポリマーがポリ（エチレンオ
キシド）である特許請求の範囲第１５項記載の方
法。 １７ ポリ（エチレンオキシド）が少なくとも約
1500の重量平均分子量である特許請求の範囲第１
７項記載の方法。 １８ 接触工程(b)を除去標識ポリヌクレオチドの
出現の速度の増加のために、試薬複合体に関し十
分な分子量および量の非イオン性またはアニオン
性である不活性な体積排除ポリマーの存在下で実
施する特許請求の範囲第１項から第１３項までの
いずれかに記載の方法。 １９ () プリン／ピリミジン塩基対の水素結
合を介して標的ヌクレオチド配列に塩基結合で
きるプローブポリヌクレオチド；および () プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレオ
チド配列に対して塩基結合できる領域と全部ま
たはほとんど全部共通するプローブポリヌクレ
オチドの領域に、プリン／ピリミジン塩基対の
水素結合を介してプローブポリヌクレオチドに
塩基対結合した標識ポリヌクレオチド；から成
り 標的ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレオ
チドとの間の強い（potential）塩基対結合が試
薬複合体から標識ポリヌクレオチドの除去を可能
にするものである、 生物試料の核酸中の予め測定されている標的ヌ
クレオチド配列の存在を測定するための診断用試
薬。 ２０ 標識ポリヌクレオチド結合領域が約20から
500ヌクレオチドの長さである特許請求の範囲第
１９項に記載の診断用試薬。 ２１ プローブポリヌクレオチドが試薬複合体中
の固体支持体に固定化されている特許請求の範囲
第１９または２０項記載の診断用試薬。 ２２ 溶液中に完全に遊離している特許請求の範
囲第１９または２０項記載の診断用試薬。 ２３ プローブポリヌクレオチドが除去標識ポリ
ヌクレオチドから試薬複合体のアフイニテイ分離
のための付着部分を含んでいる特許請求の範囲第
２２項記載の診断用試薬。 ２４ (a) 生物試料の核酸中の予め決定された標
的ヌクレオチド配列の存在を測定する試薬複合
体であつて： () プリン／ピリミジン塩基対の水素結合を
介して標的ヌクレオチド配列に塩基結合でき
るプローブポリヌクレオチド；および () プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレ
オチド配列に対して塩基結合できる領域と全
部またはほとんど全部共通するプローブポリ
ヌクレオチドの領域に、プリン／ピリミジン
塩基対の水素結合を介してプローブポリヌク
レオチドに塩基対結合した標識ポリヌクレオ
チド； から成り 標的ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレ
オチドとの間の強い（potential）塩基対結合
が試薬複合体から標識ポリヌクレオチドの除去
を可能にするものである； からなる試薬合体と、 (b) 除去標識ポリヌクレオチドの出現の速度の増
加のために試薬複合体に関して十分な分子量お
よび量のポリエーテルポリマー とを含む生物試料の核酸中の予め決定されている
標的ヌクレオチド配列の存在を測定する診断用キ
ツト。 ２５ (a) 生物試料の核酸中の予め決定された標
的ヌクレオチド配列の存在を測定する試薬複合
体であつて： () プリン／ピリミジン塩基対の水素結合を
介して標的ヌクレオチド配列に塩基結合でき
るプローブポリヌクレオチド；および () プローブポリヌクレオチドが標的ヌクレ
オチド配列に対して塩基結合できる領域と全
部またはほとんど全部共通するプローブポリ
ヌクレオチドの領域に、プリン／ピリミジン
塩基対の水素結合を介してプローブポリヌク
レオチドに塩基対結合した標識ポリヌクレオ
チド； から成り 標的ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレ
オチドとの間の強い（potential）塩基対結合
が試薬複合体から標識ポリヌクレオチドの除去
を可能にするものである； からなる試薬合体と、 (b) 除去標識ポリヌクレオチドの出現の速度の増
加のために試薬複合体に関して十分な分子量お
よび量の非イオン性またはアニオン性の不活性
な体積排除ポリマーとを含む生物試料の核酸中
の予め決定されている標的ヌクレオチド配列の
存在を測定する診断用キツト。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US607885 | 1984-05-07 | ||
| US06/607,885 US4766062A (en) | 1984-05-07 | 1984-05-07 | Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor |
| US684308 | 1991-04-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6131100A JPS6131100A (ja) | 1986-02-13 |
| JPH0437720B2 true JPH0437720B2 (ja) | 1992-06-22 |
Family
ID=24434111
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9655385A Granted JPS6131100A (ja) | 1984-05-07 | 1985-05-07 | 置換ポリヌクレオチド検定法およびそのポリヌクレオチド複合体試薬 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4766062A (ja) |
| JP (1) | JPS6131100A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US6955915B2 (en) | 1989-06-07 | 2005-10-18 | Affymetrix, Inc. | Apparatus comprising polymers |
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