JPH04261153A - 抗ウイルス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は構造

【化３】 を有する化合物（化合物Ｉ）に関する。化合物の構造は
スペクトル特性の詳しい解析によって決定した。

【０００２】質量スペクトルデータ 質量スペクトルはフィニンガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）Ｍ
ＡＴ９０により７０ｅＶにおける電子衝撃（ＥＩ）とし
て記録した。正確な質量測定値は内部標準としてパーフ
ルオロケロセン（ＰＦＫ）を用いて高分解能（ＨＲ−Ｅ
Ｉ）で行なった。トリメチルシリル誘導体はビストリメ
チルシリルトリフルオロアセトアミド及びピリジン（Ｂ
ＳＴＦＡ−ピリジン）の１：１混合液により室温におい
て調製した。化合物Ｉは分子量４７７を有し、分子式Ｃ
３０Ｈ３９ＮＯ４に対応することがわかった（実測値ｍ
／ｚ４７７．２８５４、計算値ｍ／ｚ４７７．２８７７
）。これはジトリメチルシリル誘導体を形成し、そのフ
ラグメンテーションは酢酸、ベンジル及びヒドロキシル
部分の存在を示す。

【０００３】１３Ｃ　ＮＭＲデータ 化合物Ｉの１３Ｃ　　ＮＭＲスペクトルは２２℃におい
てバリアン（Ｖａｒｉａｎ）ＸＬ４００分光計によりＣ
ＤＣｌ３中　１００ＭＨｚで記録した。ケミカルシフト
は内部標準として７７．０ｐｐｍの溶媒ピークを用いて
０（ゼロ）ｐｐｍのテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に相
対するｐｐｍとして示す。 １３Ｃ　ＮＭＲケミカルシフト（ＣＤＣｌ３，２２℃）
：１４．３，２０．９，２２．１，２５．３，３３．０
，３３．３，３４．２，４２．５，４５．７，４７．３
，４８．４，５０．６，５１．８，５３．７，６９．５
，７８．６，１１３．９，１２５．４，１２７．１，１
２７．５，１２８．９５（２ｘ），１２９．００（２ｘ
），１３５．８，１３７．５，１３８．４，１４８．１
，１７０．１及び１７４．２ｐｐｍ．炭素数３０は高分
解能質量スペクトルで得た分子式Ｃ３０Ｈ３９ＮＯ４と
一致する。

【０００４】１Ｈ　ＮＭＲスペクトル 化合物Ｉの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルは図１に示される。 スペクトルは２２℃においてバリアンＸＬ４００ＮＭＲ
分光計によりＣＤＣｌ３中　４００ＭＨｚで記録した。 ケミカルシフトは内部標準として７．２４ｐｐｍの溶媒
ピークを用いて０ｐｐｍのＴＭＳに相対するｐｐｍとし
て示す。

【０００５】結晶構造 化合物Ｉの結晶形のＸ線データは示される通りの相対立
体化学を有する構造（Ｉａ）を支持している。これらの
及び他のデータに基づいて化合物Ｉは前述の構造を有し
、更に好ましい形が次の相対立体化学を有することがか
なり確かであると考えられる。

【化４】 化合物はメタノール、エタノール、イソプロパノール、
酢酸エチル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ベ
ンゼン、ジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド等の
有機溶媒に可溶な白色個体である。

【０００６】本発明の化合物はヒト免疫不全ウィルス（
ＨＩＶ）プロテアーゼの作用を抑制し、従ってヒト後天
性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療又は予防に抗ウィ
ルス剤として使用するのに適応し得る。満足すべき治療
のためにはこの薬剤は良好なＨＩＶプロテアーゼ阻害剤
であるばかりでなく阻害活性が可逆的で競合的であるべ
きであり、更に必要で有益なプロテアーゼ活性を阻害し
ないようにかなり特異的であるべきである。更に抗ウィ
ルス剤は細胞毒性や他の副作用がないことが望ましい。 本発明の化合物は極めて有効なＨＩＶプロテアーゼ阻害
剤であるばかりでなく、実質的に望ましくない細胞毒性
や他の副作用がない。更にその上非常に特異的であり治
療用として投与した場合、その作用部位が避けられるプ
ロテアーゼに対してのみある活性を示すかあるいは全く
阻害作用を有さない。従って本発明はまた化合物ＩのＨ
ＩＶプロテアーゼ酵素阻害量を治療を必要としている患
者に投与することによってＨＩＶプロテアーゼ酵素の活
性を阻害する方法及びヒト後天性免疫不全症候群即ちＨ
ＩＶプロテアーゼ酵素の活性による疾患の治療又は予防
方法に関する。

【０００７】化合物はまた血小板活性化因子のアッセイ
においていくらかの活性を示し、従ってある種炎症症状
の制御における用途に適応することができる。生物活性
から考えると、化合物はときとして限られた意味の抗菌
剤よりもむしろ最も広い意味での抗生物質と呼ぶことが
できる。

【０００８】化合物Ｉは１２３０１パークラウンドライ
ブ、ロックビル、ＭＤ２０８５２のアメリカンタイプカ
ルチュアコレクションの培養蒐集にブタペスト条約に従
い寄託され、受け入れ番号ＡＴＣＣ２０９９４及びＡＴ
ＣＣ２０９９５を指定されているメルク　アンド　カン
パニー、ラーウェイ、ＮＴの培養蒐集のハイポキシロン
フラギホルメ（Ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ　ｆｒａｇｉｆｏｒ
ｍｅ）ＭＦ５５１０又はＭＦ５５１１を培養することに
よって産生されるのが便利である。

【０００９】以下で述べられる枯れたばかりのアメリカ
ブナ（ファグス　グランジホリア、Ｆａｇｕｓ　ｇｒａ
ｎｄｉｆｏｌｉａ）の樹皮からの子座採集によって得る
ことができる真菌は次の通り記載することができる。樹
皮から突出している子座は簇生しているものから密集し
ているものまであり、しばしば樹皮面の広範囲にわたっ
て集合しており、半球状から枕状で乳頭状の小穴を有し
乾燥している。若い場合鈍いピンクがかった肉桂色から
赤レンガ色を呈し、次いでフォーンカラー（Ｆａｗｎ　
Ｃｏｌｏｒ）（大文字で始められている色彩名はリッジ
ウェイ，Ｒ．色基準及び命名、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１
９１２年からのものである）、アベラニアス（Ａｖｅｌ
ｌａｎｅｏｕｓ）、バイネイシアス−ルセット（Ｖｉｎ
ａｃｅｏｕｓ−Ｒｕｓｓｅｔ）を呈し、加齢につれて鈍
いやや赤い褐色又は灰色がかった褐色、ウッドブラウン
（Ｗｏｏｄ　Ｂｒｏｗｎ）、アーミイブラウン（Ａｒｍ
ｙ　Ｂｒｏｗｎ）、ソーガムブラウン（Ｓｏｒｇｈｕｍ
　Ｂｒｏｗｎ）、ピカンブラウン（Ｐｅｃａｎ　Ｂｒｏ
ｗｎ）になり最後に放出された子嚢胞子の沈着及び外表
面の分解から黒けを帯びた色になり、しばしばノズロス
ポリウム（Ｎｏｄｕｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）分生子柄の微
細な小房を有する。子座組織は非常に脆く、炭素質で紫
がかった黒色から黒色を呈する。被子器は直径０．１〜
０．３ｍｍで洋梨形から球形に近く、乳頭状の小穴を有
する。子嚢は８胞子で単層、狭い円柱状で有柄であり１
１０〜１７５×６〜９μｍでアミロイド頂端環を有する
。子嚢胞子はかたまって紫がかった黒色、３％ＫＯＨ中
オリーブブラウンからオリーブグレイであり、楕円−不
等辺形であり狭く丸い端を有し、１０〜１４．５×５．
５〜７．５μｍで１〜５個のグッツレ（ｇｕｔｔｕｌａ
ｅ）を有する。

【００１０】培養するとコロニーはジャガイモ−デキス
トロース寒天（ディフコ）上２０℃に１週間で５５〜６
０ｍｍに達する。コロニーは比較的散在する気中菌糸と
多数の深部菌糸を有し、やや透明で綿毛状から薄いビロ
ード毛状で表面は加齢につれて、粉状から顆粒状又は膿
疱状組織になり最初は透明であるが間もなく薄いグレイ
がかったクリーム、グレイがかった淡黄色になり、分生
子が発生する場所は部分的に淡黄色又は肉桂色、淡いオ
ーカーがかった黄色（Ｐａｌｅ　Ｏｃｈｒａｃｅｏｕｓ
　Ｂｕｆｆ）、明るいオーカーがかった黄色（Ｌｉｇｈ
ｔ　Ｏｃｈｒａｃｅｏｕｓ　Ｂｕｆｆ）、明るいピンク
がかった肉桂色（Ｌｉｇｈｔ　Ｐｉｎｋｉｓｈ　Ｃｉｎ
ｎａｍｏｎ）、ピンクがかった肉桂色（Ｐｉｎｋｉｓｈ
　Ｃｉｎｎａｍｏｎ）、肉桂色（Ｃｉｎｎａｍｏｎ）に
なる。裏面は培地の浸出物のために濃く着色され薄黄色
、黄色がかつた緑色、バリウム　イエロー（Ｂａｒｉｕ
ｍＹｅｌｌｏｗ）、ナフタレン　イエロー（Ｎａｐｈｔ
ｈａｌｅｎｅＹｅｌｌｏｗ）、シトロン　イエロー（Ｃ
ｉｔｒｏｎ　Ｙｅｌｌｏｗ）、イエロイシュ　シトロン
（Ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ　Ｃｉｔｒｏｎ）から深緑色、や
や黒い緑色又は黒色、セルペンチングリーン（Ｓｅｒｐ
ｅｎｔｉｎｅ　Ｇｒｅｅｎ）、鈍い黒みの緑（Ｄｕｌｌ
　Ｂｌａｃｋｉｓｈ　Ｇｒｅｅｎ）まで呈する。

【００１１】顕著なノジュロスポリウム分生子段階は自
然では子座の上で形成されるが、培養でも形成される。 分生子柄（コーンミール寒天ディフコ上）は巨大糸状又
はしばしば微小糸状であり、やや直立で硬直しており、
高さ２４０〜５００μｍ直径、３．５〜６μｍで一般に
はっきりした軸がなく仮軸型で１〜８倍に分岐し、しば
しば末端枝に輪生して分岐し、壁は平滑から微細な疣状
で３％ＫＯＨ中では透明から薄いオリーブブラウンであ
る。分生子母細胞は１個又は２〜３の集団で末端枝とし
て又は内部隔壁から出る側枝として存在し、円柱状又は
棍棒状で多芽細胞であり、わずかに微細な小歯突起が分
生子裂開後に残っている。分生子は５〜６×３〜４．５
μｍ、やや洋梨形、倒卵形又は楕円−不等辺形で乾燥し
ており、平滑で分生子母細胞の末端の４〜１０集団は基
底瘢痕のためわずかに截形である。

【００１２】採集地、子座、分生子段階及び培養形態は
２種の別々の単離物において同一であり、発表された記
述と完全に一致している（Ｓ．Ｃ．ジョング（Ｊｏｎｇ
）１９７２年、ワシントン農業実験研究所技術報告（Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ
　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）１７、Ｒ．Ｗ．Ｇ．デニス（Ｄｅ
ｎｎｉｓ）、１９８１年「英国のアスコミセス」）。前
述の性質を有する真菌Ｈ．フラギホルメは種々の広葉樹
の樹皮に見ることができ、特に最近枯れたブナにはよく
見られる。通常広範囲の樹皮は子座と呼ばれる子実体で
覆われている。 子座内に被子器が生じ成熟した場合、勢いよく放出され
る子嚢胞子を形成する。子嚢胞子を標準寒天培地に使用
し、発芽させ、次いで培養して本発明の化合物を得るこ
とができる。

【００１３】子嚢胞子は子座を硫酸ストレプトマイシン
とテトラサイクリンを加えた酵母麦芽エキス寒天を含有
するペトリ皿の上面に固定し、活発に放出している胞子
である子座から子嚢胞子を子座から寒天に２、３時間直
接に放出させ、次いで子嚢胞子を発芽させることによっ
て得ることができる。

【００１４】被子器が子嚢胞子を活発に放出していない
場合、被子器を含有する子座を切り裂き子嚢胞子を注意
して取り出し分離培地に移植することができる。次いで
分離培養菌を使用して所望の生産物を生産する培養培地
に接種することができる。培養すると真菌は白色から薄
い灰色であり、培地の表面を急速に覆い（約１週間）、
次いで深緑色から黒色色素を分泌する詰まった菌糸体を
有する。約２週間後、ノジュロスポリウム分生子段階の
発生の初期に相当する気中菌糸の低い部分が薄肉桂色に
なる。この時点で菌糸体断片又は分生子を麦芽−酵母エ
キス斜面に移植し、保存のために凍結するか又は培地に
接種することによって培養に使用することができる。

【００１５】化合物ＩはＨ．フラギホルメＡＴＣＣ２０
９９４又は２０９９５を以下に記載する条件下適当な培
地中で生産物の相当量が培地中に形成されるまで培養し
、発酵培地からの有効成分を適当な溶媒で抽出すること
によって回収し、所望の成分を含有する溶液を濃縮し、
次いで濃縮物質をクロマトグラフィー分離にかけて化合
物Ｉを他の代謝物及び不純物から分離することによって
得ることができる。

【００１６】化合物Ｉを生産させるためのＨ．フラギホ
ルメＡＴＣＣ２０９９４又は２０９９５の培養は微生物
によって資化される炭素源及び窒素源を含有し、低レベ
ルの無機塩も含有する栄養培地中で行なうことができる
。培地に微量金属を補足してもよいが、炭素及び窒素の
複合源を使用する場合、微量金属は通常複合源中に存在
している。

【００１７】適当な炭素源としてはグリセリン、糖類、
糖アルコール、デンプン及び他の炭水化物又は炭水化物
誘導体例えばデキストラン、セルロース並びに複合栄養
素例えばオート麦粉、コーンミール、キビ、トウモロコ
シ等がある。培地中に使用される炭素源の正確な量は幾
分培地中の他の成分に依存するが、通常培地の０．５〜
４０重量％の炭水化物の量が十分であると見られる。こ
れらの炭素源は個々に使用することもできるし、数種の
炭素源を同一培地中で混合することもできる。

【００１８】窒素源としてはアミノ酸例えばグリシン、
アルギニン、トレオニン、メチオニン等アンモニウム塩
並びに複合源例えば酵母加水分解物、酵母自己分解物、
酵母細胞、トマトペースト、大豆ミール、カゼイン加水
分解物、酵母エキス、コーン浸漬液、ディスチラーズソ
リュブル、綿実ミール、肉エキス等がある。種々の窒素
源は単独で又は混合して培地の０．２〜１０重量％の量
で使用することができる。

【００１９】栄養無機塩で培地に混入することができる
ものはナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウ
ム、リン酸、硫酸、塩素、炭酸イオン等を生成すること
ができる通常の塩である。またコバルト、マンガン、鉄
、モリブデン、亜鉛、カドミウム等の微量金属も含まれ
る。

【００２０】代表的な有用培地を以下に示す。液体培地
の調製には蒸留水が用いられる。ｐＨは１２１℃で２０
分間滅菌する前に調整することができる。炭酸カルシウ
ムが一成分である場合、ｐＦは特にことわらない限り炭
酸カルシウムを添加する前に調整される。

【００２１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　液体培地　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　培地Ａ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　培地Ｂ（ＰＢＧＧ１）　　　　　
成分　　　　　　　　　　　　　（ｇ／１）　　　　　
　　　　　成分　　　　　　　　　　　（ｇ／１）　　
グルコース　　　　　　　　　　　　　１０．０　　　
　　　　　　グリセリン　　　　　　　　　　　　　７
５．０　　フルクトース　　　　　　　　　　　１５．
０　　　　　　　　　グルコース　　　　　　　　　　
　　　１０．０　　スクロース　　　　　　　　　　　
　　４０．０　　　　　　　　　”アルダミン”　＊ｐ
Ｈ　　　　　　５．０　　”ＮＺアミン”　＊タイプ　
Ｅ　　４．０　　　　　　　　　（ＮＨ４）２　ＳＯ４
　　　　　　　　　　２．０　　尿　　素　　　　　　
　　　　　　　　　　　　４．０　　　　　　　　　大
豆ミール　　　　　　　　　　　　　　２．０　　Ｋ２
ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　０．５　　　　
　　　　　トマトペースト　　　　　　　　　　５．０
　　ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
２５　　　　　　　　クエン酸ナトリウム　　　　　　
２．０　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　０．２
５　　　　　　　　ポリグリコールＰ２０００＊＊　　
２．０ｍｌ／１　　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　
　０．９　　ＣａＣＯ３　　　　　　　　　　　　　　
　８．０　　　　　　　　　　　ｐＨ７．０　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｐＨ
７．０　　　＊　カゼイン加水分解物　　　　　　　　
　　　　　＊　酵母自己分解物　　　　　シェフフィー
ルド　プロダクツ　　　　　　イースト　プロダクツ社
　　　　　クラフト社　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　クリフトン，ＮＪ：“アルダミン”　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　チャンプレイン　インダスト
リーズ社　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　に譲渡された商標
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　＊＊　ダウケミカル社

【００２２
】 　　　　　　培地Ｃ（ＮＰＡ−４）　　　　　　　　　
　　　　　　　　　培地Ｄ（ＮＰＡ−８）　　　　　　
成分　　　　　　　　　　　　（ｇ／１）　　　　　　
　　　　　成分　　　　　　　　　　　　（ｇ／１）　
　アスパラギン　　　　　　　　　　　１．０　　　　
　　　　　　　　アスパラギン　　　　　　　　　　　
１．０　　”エダミン”＊　　　　　　　　　　　　２
．５　　　　　　　　　　　　酵母エキス　　　　　　
　　　　　　　１．０　　”プリマトン”ＨＳ＊＊　　
　　　２．５　　　　　　　　　　　　グルコース　　
　　　　　　　　　　１０．０　　酵母エキス　　　　
　　　　　　　　　５．０　　　　　　　　　　　　Ｃ
ａＣＯ３　　　　　　　　　　　　　　５．０　　麦芽
エキス　　　　　　　　　　　　１０．０　　スクロー
ス　　　　　　　　　　　　　５．０　　ＣａＣＯ３　
　　　　　　　　　　　　　５．０　　　　　　　　　
　　ｐＨ７．２〜７．４　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ｐＨ７．２〜７．４　　　　＊　ラクトアル
ブミン加水分解物　　　　　　シェフィールド　プロダ
クツ　クラフト社　　　＊＊　肉加水分解物 　　　　　　シェフィールド　プロダクツ

【００２３】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　培地Ｅ（ＫＦ）　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　微量元素　　　　　　　成分　
　　　　　　　（ｇ／１）　　　　　　　　　　　　　
　　成分　　　　　　　　　　　　　（ｇ／１）　　コ
ーン浸漬液　　　　　　５．０　　　　　　　　　　　
　　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　１．０　
　トマトペースト　　　４０．０　　　　　　　　　　
　　　ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　１．０
　　オート麦粉　　　　　　　１０．０　　　　　　　
　　　　　　ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　
０．０２５　　グルコース　　　　　　　１０．０　　
　　　　　　　　　　　ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ　　　　　
　　　　　　０．１　　微量元素　　　　　　　　　１
０．０ｍｌ／ｌ　　　　　　　Ｈ３ＢＯ３　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．０５６　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　（ＮＨ４）６ＭｏＯ２４・４Ｈ２Ｏ　　　０．
０１９　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　
　　　　　　　　０．２　　　　　　　　　　ｐＨ６．
８

【００２４】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　培地Ｆ（３）　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　微量元素　　　　　　　　成分　　
　　　　　　　　　（ｇ／１）　　　　　　　　　　　
　成分　　　　　　　　　　　　（ｇ／１）　　グルコ
ース　　　　　　　　　　　　１０．０　　　　　　　
　　　　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ　　　　　　５．８　グ
リセリン　　　　　　　　　　　　２０．０　　　　　
　　　　　　ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　０．
１　　デキストリン　　　　　　　　　　　５．０　　
　　　　　　　　　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　　　
０．０２　　尿　　素　　　　　　　　　　　　　　　
　　２．０　　　　　　　　　　　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２
Ｏ　　　　　　０．０１５　　ＮａＮＯ３　　　　　　
　　　　　　　　２．０　　　　　　　　　　　ＮａＭ
ｏＯ４・２Ｈ２Ｏ　　　　　０．０１２　　酵母エキス
　　　　　　　　　　　　　１．０　　　　　　　　　
　　ＺｎＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　０．０
２　　Ｎａ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　０．５　
　　　　　　　　　　ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　
　０．００５　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　１
．０　　　　　　　　　　　Ｈ３ＢＯ３　　　　　　　
　　　　　　　　　０．０１　　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ
　　　　　　０．５　　　　　　　　　　　ＫＣｌ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　０．０２　　微量元
素　　　　　　　　　　　　　１．０ｍｌ／ｌ　　　　
　　　ＨＣｌ（濃縮）　　　　　　２．０ｍｌ／ｌ

【００２５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　培地Ｇ（ＮＰＡ−１）　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　無機塩　　　　　　　　　成分
　　　　　　　　　　　　　（ｇ／１）　　　　　　　
　　　　　成分　　　　　　　　　　　（ｇ／１）　　
トウモロコシグルテン　　　　５．０　　　　　　　　
　　　ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
７４　　“エダミン”　　　　　　　　　　　　２．５
　　　　　　　　　　　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　
　０．０２　　“プリマトン”ＨＳ　　　　　　２．５
　　　　　　　　　　　ＮａＨ２ＰＯ４　　　　　　　
　　　　１．４　　酵母エキス　　　　　　　　　　　
　　　１．０　　　　　　　　　　　クエン酸　　　　
　　　　　　　　　　　０．３８　　グルコース　　　
　　　　　　　　　　１０．０　　　　　　　　　　　
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　　　０．２５　　無機塩
　　　　　　　　　　　　　　　　２５０ｍｌ／ｌ　　
　　　　　Ｎａ２ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　０
．３６　　ＣａＣＯ３　　　　　　　　　　　　　　　
５．０　　　　　　　　　　　微量元素　　　　　　　
　　　　　　５０ｍｌ／ｌ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　溶液　　ｐＨ７．２〜７．４にした後　　
　　　　　　　　　　　　ｐＨ７．２〜７．４にする。 　　ＣａＣＯ３を添加。

【００２６】

【００２７】

【００２８】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　培地Ｉ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｋ元素　　　　　　　　成分　　　
　　　　　　（ｇ／１）　　　　　　　　　　　　成分
　　　　　　　　　　　　　（ｇ／１）　　グルコース
　　　　　　　　　　１０．０　　　　　　　　　　　
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　５．８　　グリセ
リン　　　　　　　　　　２０．０　　　　　　　　　
　　ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　０．１　　
デキストリン　　　　　　　　　５．０　　　　　　　
　　　　ＣｏＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　　
０．２　　尿　　素　　　　　　　　　　　　　　　２
．０　　　　　　　　　　　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　　
　　　　　０．０１５　　ＮａＮＯ３　　　　　　　　
　　　　２．０　　　　　　　　　　　Ｎａ２ＭｏＯ４
・２Ｈ２Ｏ　　　　　０．０１２　　酵母エキス　　　
　　　　　　　　１．０　　　　　　　　　　　ＺｎＣ
ｌ２　　　　　　　　　　　　　　　　０．０２　　Ｎ
ａ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　０．５　　　　　　　
　　　　ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　０．００
５　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　１．０　　　　　
　　　　　　Ｈ３ＢＯ３　　　　　　　　　　　　　　
　　　０．０１　　ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　　
　０．５　　　　　　　　　　　ＫＣｌ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．０２　　Ｋ元素　　　　
　　　　　　　　　　　１．０ｍｌ／ｌ　　　　　ＨＣ
ｌ（濃縮）　　　　　　　　　　２．０ｍｌ／ｌ　　ｐ
Ｈ＝７．０に調整

【００２９】固形培地 適当な固形培地は培地Ａのような液相培地でバーミキュ
ライトを被覆することによって調製することができる。 生育に固相を使用する場合、液体培地に接種し、接種し
た培地を滅菌バーミキュライトと密接に接触させてバー
ミキュライトを被覆する。一般に液体培地約４００〜４
５０ｍｌをバーミキュライト約１２００ｃｍ３に使用す
る。あるいは固形培地は複合固形栄養源に基づくことが
できる。このような培地の代表例を以下に示す。固形培
地の調製において基礎液体の調製に蒸留水を使用する。 ｐＨ調整は必要ない。培地を１２１℃で１５分間滅菌す
る。冷めてから蒸留水１５．０ｍｌを各フラスコに加え
更に２０分オートクレーブにかけて生産に使用する固形
培地とする。

【００３０】

【００３１】

【００３２】

【００３３】前述の培地は、Ｈ．フラギホルメＡＴＣＣ
２０９９４又は２０９９５の培養増殖物を選択した培地
に接種し、以下に記載される通り培養して化合物Ｉを産
生することによって行なわれる発酵に使用することがで
きる。一般に培養増殖物即ち菌糸集団は前もって調製し
凍結保存した栄養菌糸体であり、これを解凍し種培地に
接種し、生産培地に接種するための種菌となる菌糸体を
生産するために培養する。種培地は次の組成を有するこ
とができる。

【００３４】 生産培地Ｅとして上で挙げ、しばしばＫＦ培地と呼ばれ
る培地も種菌培地として使用することができる。

【００３５】種菌培地に接種するために用いられる凍結
栄養菌糸体はＨ．フラギホルメの斜面培養をＹＭＥ種培
地５０ｍｌに入れ、２２℃、７５％相対湿度及び２２０
ｒｐｍで４日間温置して菌体を得、これを小分けしてグ
リセリンを含有する（最終グリセリン濃度１０％まで）
滅菌バイアルに入れ、凍結して−８０℃に維持して準備
したものであることができる。

【００３６】化合物ＩはＨ．フラギホルメの初期の多子
嚢胞子単離物をＹＭＥ寒天斜面上で３週間２５℃で蛍光
光線下で直接温置することにより産生することができる
ことがわかった。こうして産生した菌体を生産培地に接
種し化合物Ｉの生産に使用することができる。また種培
地に接種するために使用して生産培地に接種するのによ
り多量の菌体を産生させることもできる。

【００３７】化合物Ｉの生産ではまずＨ．フラギホルメ
ＡＴＣＣ２０９９４又は２０９９５の培養物の斜面部分
をｐＨ５〜８の栄養種菌培地、好ましくはｐＨ７．０の
ＹＭＥ種菌培地に接種し、フラスコを約１５〜３０℃、
好ましくは約２２〜２８℃の温度で攪拌しながら温置す
る。攪拌は４００ｒｐｍ以下であるが、好ましくは約２
００〜２２０ｒｐｍである。温置は２〜１５日間好まし
くは３〜１０日間かけて行なうことができる。増殖が良
好である場合、通常２〜５日間でその増殖物を使用して
化合物Ｉを生産する生産培地に接種することができる。 適当な場合には新しい種菌培地に培養増殖物の一部を接
種し、次いで同様の条件下で短期間温置して種培地での
第二段階発酵を行なうことによって菌糸集団をより多量
に生産させることができる。次いで得られた増殖物を使
用して生産培地に接種することができる。

【００３８】培養増殖を接種した発酵生産培地は３〜３
０日間、好ましくは７〜２１日間一般には攪拌しながら
温置する。発酵は約２０〜３０℃の温度で好気的に行な
うことができる。約２４〜２８℃の温度が最も好ましい
。本化合物を生産するのに適した栄養培地のｐＨは約５
．０〜８．５で変化させることができ、好ましい範囲は
約６．０〜７．５である。

【００３９】一般に液体培地は特に大規模な生産に好ま
しいが、固形培地はＨ．フラギホルメにより自然の条件
を与え化合物の生産に使用することができる。前で名付
けた固形培地の１種を使用することもできるし、液体培
地に接種し、接種した培地をバーミキュライトに被覆し
、自然固形培地として処理することもできる。

【００４０】生産を栄養培地とプールしたバーミキュラ
イトで行なう場合、種菌の一部を適当な液体培地に接種
するために使用し、接種した培地をバーミキュライトに
被覆する。液体培地的に均一な被覆を十分行なう時間、
密接に接触させ次いで所望の生産を十分行なう時間、温
置することが便利である。一般にこれはローラー機上で
約４〜２４日間、２２〜２５℃、７５％相対湿度で温置
することによって行なう。しばしば温置は最初に高温例
えば２５℃で４〜６日間、その後低温で行なうことがで
きる。

【００４１】固形培地が複合固形栄養源に基づく場合、
種菌培地を使用して固形培地に常法で接種し、得られた
培地を３〜３０日間好ましくは７〜２１日間攪拌しなが
ら一般に約２００〜４００ｒｐｍ、好ましくは約２２０
ｒｐｍで２２〜２５℃において温置する。培養培地のＨ
ＰＬＣを行なうことによって決定することができる培養
期間の完了後、一般に１２〜１８日後、生産物を生産培
地から回収しその後単離する。正確な工程は発酵を液体
培地か固形培地で行なうか、使用する溶媒、使用する吸
着剤あるいは吸着剤の併用によって幾分異なってよい。 発酵を固形培地で行なった場合、第一段階は一般に溶媒
を培地に加え十分に混合して固形物から培養産物を抽出
する。

【００４２】抽出に適当な溶媒は極性溶媒例えばアセト
ン、メチルエチルケトン、メタノール、イソプロパノー
ル等である。次いで混合液を濾過して固形物を除去し、
濾液中に生産物を得る。濾液を減圧下で濃縮して粗生成
物を残留物として得る。残留物を酸素化溶媒に溶解し、
分離工程としてクロマトグラフィーカラムに充填する。 適当なカラムはシリカゲル、シリカベースの逆相及びデ
キストランゲルである。

【００４３】発酵を液体培地で行なった場合、発酵培地
を濾過して菌糸体細胞を回収する。細胞を数回抽出し、
合わせた抽出液を減圧にして生産物を残留物として得る
。抽出に適した溶媒としては酢酸エチル、メチルエチル
ケトン、アセトン及びメタノールがある。生産物の残留
物は、好ましくはシリカゲル、あるいはシリカベースの
逆相及びデキストランゲル等によるクロマトグラフィー
によって精製する。残留物を塩化メチレン及びアセトン
に溶解し、シリカゲルカラムに充填し、ヘキサンで洗浄
し、ヘキサン／アセトンでアセトンの濃度を増加させな
がら溶離することによって行なうことができる。画分を
ＨＰＬＣで監視し、ほとんどの生産物を含有する画分を
合わせ次いで乾固する。残留物を塩化メチレンに溶解し
、クロマトグラフィー精製工程を繰り返す。これは更に
必要であれば繰り返すことができる。生産物を多く含ん
だ画分を合わせ濃縮し、生産物を溶液から結晶化させる
ことにより化合物Ｉを結晶性形態として得ることができ
る。

【００４４】クロマトグラフィー精製及び結晶化で使用
することができる他の溶媒系は塩化メチレン／酢酸エチ
ル、塩化メチレン／メタノール等である。化合物Ｉの抗
ウィルス剤としての優れた特性は、化合物のＨＩＶプロ
テアーゼ酵素活性阻害能を試験する検定により例示する
ことができる。ＨＩＶプロテアーゼ阻害活性はβ−ナフ
チルアラニンとプロリン間のペプチド結合を切断するＨ
ＩＶプロテアーゼ活性に影響する化合物の存在を試験す
る検定で見ることができる。適当な基質は３Ｈβ−カゼ
インである。しかしながら　β−ナフチルアラニンとプ
ロリン結合を含む合成ペプチドは更に一致した結果を示
し、特に好ましいのは一端が放射性標識されもう一端が
アルギニン置換されたペプチドであり、この塩基性末端
をカチオン交換樹脂に結合させ切断標識断片を溶出液中
に見い出すことができるものである。

【００４５】代表的な検定として１００ｍＭ酢酸緩衝液
中基質０．５μｌを含有するペプチド基質希釈溶液２５
μｌを、（ａ）１１１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液４５μ
ｌ、（ｂ）０．４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するプロテアーゼ希釈溶液２５μｌ及び（ｃ）０．６
３〜２１０μＭの化合物Ｉ、を含有する溶液５μｌを含
む検定管又は対照として１００ｍＭ酢酸ナトリウムと０
．４％ＢＳＡ、１１１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液４５μ
ｌ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５μｌ（ＤＭ
ＳＯ　９９容量と１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン（ＴＲＩＳ・ＨＣｌ）、ｐＨ７．５　　
１容量）を含むブランク管に添加した。管におけるプロ
テアーゼ溶液の濃度は２．０ｎＭである。次いで検定管
を３７℃で６０分間温置し、次に反応液を５％Ｈ３ＰＯ
４１００μｌで反応停止させる。

【００４６】反応混合液１５０μｌをカチオン交換カラ
ム（ダウエックスＡＧ−５０Ｗ−×８、ダウケミカルカ
ンパニー）に装填し、次いでカラムを水１．８５ｍｌで
洗浄し溶出液をシンチレーションバイアルに集めた。シ
ンチレーション反応混合液７〜１０ｍｌを各バイアルに
加えバイアルを激しく回転させ、次いでシンチレーショ
ンカウンターに入れ、トリチウムチャンネルを用いて計
数した。結果は次の通りであった。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ＤＰＭ　　検定管内容物　　　　　　　　　　　　
壊変／分　　　　　　　　　　　　　　阻害％　　　　
　ブランク　　　　　　　　　　　　　　　　２３６　
　　　　　　　　　　　　　−−　　　全量（対照）　
　　　　　　　　　　　　４４９７　　　　　　　　　
　　　　　−−　　　　化合物Ｉ 　　　　．６３μＭ　　　　　　　　　　　　　５２６
５　　　　　　　　　　　　−１８（０）　　　　２．
１μＭ　　　　　　　　　　　　　３８６２　　　　　
　　　　　　　　　１５　　　　６．３μＭ　　　　　
　　　　　　　　２３０９　　　　　　　　　　　　　
　５１　　　　２１　μＭ　　　　　　　　　　　　　
１１３９　　　　　　　　　　　　　　７９　　　　６
３　μＭ　　　　　　　　　　　　　　　５５０　　　
　　　　　　　　　　　９３　　　２１０μＭ　　　　
　　　　　　　　　　　４０２　　　　　　　　　　　
　　　９６阻害％は次の計算によって得た。

【数１】 化合物Ｉは化合物Ｉの濃度が約６３μｍ以上である場合
、非常に高い阻害度から実質的に完全な阻害までを示す
。

【００４７】従って化合物Ｉは化合物Ｉの治療的に有効
なＨＩＶプロテアーゼ阻害量を治療を必要としている患
者に投与することによって、望ましくないＨＩＶプロテ
アーゼに起因する疾患のＨＩＶプロテアーゼ酵素活性を
阻害するために使用することができる。顕著な特性は化
合物を医薬的に使用し得る担体を含む新規な医薬組成物
に通常の医薬配合手法に従って処方する場合最も効果的
に用いられる。

【００４８】新規な組成物は有効化合物を少なくとも治
療量含有する。一般に組成物は少なくとも１重量％の化
合物Ｉを含有する。使用前の希釈に適した濃縮組成物は
９０重量％以上を含有することができる。組成物として
は直腸、局所、非経口（皮下、筋肉及び静脈内を含む）
、肺（鼻又は口腔内吸入）、他の経鼻投与又はガス吸入
に適した組成物がある。組成物は化合物Ｉを所望の媒体
に適した成分と密接に混合することによって予め充填す
ることができる。

【００４９】経口投与が用いられる場合は液体組成物又
は固形組成物によることができる。液体製剤に対しては
治療薬剤は水、グリコール、油、アルコール等の液体担
体と共にカプセル剤及び錠剤のような固形製剤に対して
はデンプン、砂糖、カオリン、エチルセルロース、炭酸
カルシウム及びナトリウム、リン酸カルシウム、カオリ
ン、タルク、ラクトースを一般にはステアリン酸カルシ
ウムのような滑沢剤と結合剤、崩壊剤等と共に処方され
る。投与の容易さのため錠剤及びカプセル剤が最も有利
な経口投薬形である。特に投与の容易さ及び投薬の均一
性のために組成物を単位投薬形（以下で定義される）で
処方することが有利である。

【００５０】注射による投与である場合は、必要な場合
防腐剤を添加したアンプル又は多回投与用容器の単位投
薬形とすることができる。組成物はまた水中０．８５％
塩化ナトリウム又は５％デキストロースのような油性又
は水性賦形剤中の懸濁液剤、液剤又は乳剤のような形を
取ることができ、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤の
ような処方剤を含有させることができる。緩衝剤並びに
添加剤例えば食塩又はグルコースは等張な液剤を調製す
るために添加することができる。また滴注静脈内投与の
場合、薬剤をアルコール／プロピレングリコール又はポ
リエチレングリコールに可溶化することができる。また
有効成分を投与前に適当な賦形剤で再構成する粉末形と
することができる。

【００５１】投与が吸入による場合、化合物は噴霧器の
加圧充填物からのエアロゾル噴霧の形体で供給するのが
便利である。吸入に好適な供給系は定量投与吸入（ＭＤ
Ｉ）エアロゾルであり、過フッ化炭化水素又は炭化水素
のような適当な推進薬中化合物Ａの懸濁液又は溶液とし
て処方することができる。“単位投薬形”とは物理的に
分離している単位を意味し、各単位は単個で又は複数個
で医薬担体と共に所望の治療効果を生じる有効成分の所
定量を含有する。このような単位投薬形の具体例は錠剤
、カプセル剤、丸剤、粉末包、オブラート包、アンプル
又は多回投与用容器の計量単位である。本発明の単位投
薬量は一般に化合物１００〜２００ｍｇを含有する。 次の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、
限定するものとして解釈すべきではない。

【００５２】

【実施例１】Ｈ．フラギホルメの最初の増殖子嚢胞子単
離物からの菌糸体を、綿栓をした５０ｍｌのポリプロピ
レン管中で傾面にしたディフコ酵母−麦芽エキス、寒天
１５ｍｌ（１リットル当りエキス４１ｇを含む）に接種
した。培養物を連続蛍光光線中２５℃で３週間生育させ
て培地中に二次代謝物を得た。次いで管の内容物をメチ
ルエチルケトン８ｍｌで抽出した。次いで溶媒を抽出液
から除去し、代謝物を含む残留物を９９％のＤＭＳＯと
１％のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲ
ＩＳ）緩衝液の混合液０．１ｍｌに溶解した。次いで試
料を前述の通りＨＩＶプロテアーゼ阻害活性に対して試
験した。代謝物は、１ｍｌ当り２５μｌ全ブイヨン等価
物（ＷＢＥ）の濃度において８３％の活性をもつことが
わかった。力価測定によりＩＣ５０　６μｌ　ＷＢＥ／
ｍｌを有することがわかった。

【００５３】

【実施例２】Ｈ．フラギホルメの斜面培養物を２５０ｍ
ｌの三角フラスコ中のＹＭＥ種培地５０ｍｌに入れた。 得られた培地を２２℃、７５％相対湿度及び２インチス
ロウ（ｔｈｒｏｗ）回転振盪機の２２０ｒｐｍにおいて
４日間温置して菌体を得た。菌体を小分けしてグリセリ
ンを含む滅菌バイアル（最終グリセリン濃度１０％）に
入れ、凍結し−８０℃に維持した。１本の凍結バイアル
を室温に解凍し、ＹＭＥ種培地５０ｍｌに接種するため
に使用し、得られた接種培地を２２℃、２２０ｒｐｍで
４日間温置した。得られた菌体を１２ｍｍの磁器ボール
で無菌的に浸軟させ、スラリー２４ｍｌを生産培地Ａ　
４２５ｍｌと生産培地Ｉ　４２５ｍｌにそれぞれ入れた
。 各生産培地を振盪して菌体量を分散させ、大きな粒子の
バーミキュライト１２５０ｃｍ３　を含む１１０×５３
５ｍｌローラー培養容器に加えた。ローラー培養容器を
振盪して内容物を分散させ、ローラー機上で２２℃、７
５％相対湿度で１９日間温置して発酵培地中の二次代謝
物を得た。温置期間の後、固体発酵物質をローラージャ
ー壁から機械的に除去し、メチルエチルケトン７００ｍ
ｌを加え、ローラージャーに蓋をした。ジャーをローラ
ージャー装置に水平に約１　１／２　時間置くことによ
って発酵混合液を抽出した。二次代謝物を含むメチルエ
チルケトン抽出液を濾過し、濾液を減圧にかけて溶媒を
除去し、二次代謝物を残留物として回収した。残留物を
５０％メチルエチルケトンとメタノールに溶解した。溶
液の一部を前述と同様のＨＩＶプロテアーゼ阻害検定で
試験することにより陽性の阻害活性を示した。

【００５４】

【実施例３】実施例２で記載した通り調製したＨ．フラ
ギホルメの凍結栄養菌糸体（ＦＶＭ）を次の培養で使用
した。ＹＭＥ種菌培地（５０ｍｌ）にＨ．フラギホルメ
のＦＶＭ１．０ｍｌを接種し、回転振盪機（２２０ｒｐ
ｍ、５．１ｃｍスロウ）により４日間２５℃で生育した
。培養物は菌糸集団として発育するので、次の培養の前
に１０個の滅菌セラミック小ボールと５個の滅菌小シリ
ンダーを加え、回転振盪機により３０分間温置すること
により菌糸塊を破壊した。種菌の２４ｍｌ部分を用いて
培地Ａを含む各４リットルローラージャー生産容器に接
種し、接種容器をローラー機により２５℃で４日間、そ
の後２２℃で１５日間温置した。

【００５５】固形基質発酵物を含む４個の４リットルロ
ーラージャーの各々の内容物をメチルエチルケトン５０
０ｍｌで２時間１００ｒｐｍにおいて抽出し、次いで濾
過してメチルエチルケトン抽出液を得た。抽出液を減圧
下で濃縮乾固し、残留物を１：１のアセトン：塩化メチ
レン２０ｍｌに溶解した。溶液の１６ｍｌを４：１のヘ
キサン：アセトン中シリカゲル（Ｅ．メルク）５００ｍ
ｌカラムによりクロマトグラフィー処理し、ヘキサン：
アセトン４：１の２カラム容量（ＣＶ）次に３：１と１
：１のヘキサン：アセトンの各々１　ＣＶで連続して溶
離した。約４０画分を用いＨＩＶプロテアーゼ阻害検定
で生物検定した。活性は画分１８〜２１に見られ、あわ
せて約３５０ｍｌになり、２．２〜２．８ＣＶに相当し
た。前述の画分を減圧下で乾固して白色粉末６００ｍｇ
を得た。

【００５６】この粉末をメタノールに溶解し結晶化させ
た。結晶３００ｍｇを回収し、純度を１ｍｇ試料でワッ
トマン−ＯＤＳ−３（４．６ｍｍ×２５ｃｍ、５μｍ）
カラムにより流速１ｍｌ／分で４０℃において６０：４
０のアセトニトリル：水溶媒系を用いるＨＰＬＣ（Ｓｐ
ｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　８７００型）で決定し２
１３と２４３ｎｍのＵＶで監視して保持時間１２．１分
である精製化合物Ｉを得た。結晶の一部を５×２０ｃｍ
シリカゲル（Ｅ．メルク）プレートに３：１のヘキサン
：アセトン溶離溶媒を用いて薄層クロマトグラフィーに
かけた。化合物はＲｆ０．２５を有した（５０％硫酸を
噴霧し加熱した場合橙色に着色した）。この標品の結晶
は前に示した質量スペクトルとＮＭＲデータを有した。 試料を前述と同様のペプチド切断検定にかけ、ＨＩＶプ
ロテアーゼ検定でＩＣ５０約３μｇ／ｍｌを有すること
がわかった。

【００５７】

【実施例４】Ｈ．フラギホルメＡＴＣＣ２０９９４の凍
結培養物１ｍｌをＹＭＥ種培地５０ｍｌを含む２５０ｍ
ｌの三角フラスコに移植し、接種した培地を２５℃、２
２０ｒｐｍで９６時間培養した。この時間の終りに培養
物１０ｍｌをＹＭＥ培地５００ｍｌを含む２リットル容
プレーンフラスコに移植し、得られた培地を２５℃、１
８０ｒｐｍで培養した。次に培養物１５０ｍｌをＹＭＥ
培地１５リットルを含む２３リットル発酵槽容器に移植
した。発酵槽を２５℃、３００ｒｐｍ、気流４．５リッ
トル／分及び背圧０．３５バールで約４８時間操作した
。この時間の終りにブイヨン２．５リットルを次の組成
のＰＢＧＧ−１（改良）５０リットルを含む７０リット
ルの容器に無菌的に移植した。

【００５８】

【００５９】接種した培地を７２時間培養し、この時点
でｐＨを希ＮａＯＨで４．４〜６．０に調製した。培養
を続け、１００時間後にブイヨンのｐＨを７．５に上げ
た。残りの培養期間（２２０時間）中培養物のｐＨを希
Ｈ２ＳＯ４で手で調整して７．５以下のレベルを維持し
た。溶存酸素レベル３０％を維持し、良好な混合をする
ためにｒｐｍを開始値３００から必要に応じて調整した
。

【００６０】前述の発酵で得たブイヨンをジカイタイト
（Ｄｉｃａｉｔｉｔｅ）（ジアトマイト、グレフコミネ
ラルスの製品）により濾過し、細胞を酢酸エチルで２回
抽出した。酢酸エチル溶液を減圧下４０℃で濃縮して油
状物を得、次に塩化メチレンとアセトン８００ｍｌに溶
解し、シリカゲル（ディビッドソン）１．５ｋｇを含む
漏斗に充填した。漏斗をヘキサン１リットルで洗浄し、
次に４：１のヘキサン／アセトン４リットル、３：１の
ヘキサン／アセトン４リットル及びアセトン４リットル
で連続して溶離し、溶出液を実施例３で使用したのと同
じカラムと溶媒系を用いてＨＰＬＣ分析にかけた。大部
分の化合物が画分１（１リットル）に見られ、残りは画
分６〜９に見られた。

【００６１】画分１を減圧下４０℃で乾固し残留物を塩
化メチレン２００ｍｌに溶解しシリカゲル１．２ｋｇを
含むシリカゲル漏斗に充填し、同一溶媒系で溶離した。 所望の化合物はこの溶離物の画分４〜７に見られた。化
合物Ｉ　３．６ｇを画分４から結晶化した。残りの画分
を合わせ、少量に減少し、濾過した。濾液から化合物Ｉ
１２ｇ以上を含有する白色固形物３２ｇを得た。これを
塩化メチレン１５０ｍｌに溶解し、４：１のヘキサン／
アセトン中シリカゲル２．５リットルを含む２．５リッ
トルのシリカゲル（ディビッドソン）カラムに充填した
。生成物を４：１のヘキサン／アセトン３リットル、６
：１の６リットル及び１：１の３リットルを連続して用
いてカラムから溶離した。５．２５リットルに及ぶ画分
６〜２２は化合物Ｉを含有した。画分をプールし濃縮し
て少量にし、濾過して白色結晶性生成物１２．７５ｇを
得た。生成物の同一性は、溶離溶媒として３：１のヘキ
サン／アセトンを用いて２０ｃｍシリカゲル（Ｅ．メル
ク）プレートによるＴＬＣでＲｆ０．２５（硫酸で橙色
）を得、更に流速１ｍｌ／分のワットマン−ＯＤＳ−３
（４．６ｍｍ×２５ｃｍ、５μｍ）カラムによるＨＰＬ
Ｃで、ＵＶにより２１３と２４３ｎｍにおいて監視して
保持時間１２．１分を得ることによって確認した。

【００６２】

【実施例５】各々化合物Ｉ　　５００ｍｇを含有する１
０００個の圧縮錠剤を次の処方から調製する。 　　微細な粉末にした成分を十分に混合し、１０％デン
プンペーストで顆粒にした。顆粒を乾燥し、錠剤に圧縮
した。

【００６３】

【実施例６】各々化合物Ｉ　　５００ｍｇを含有する１
０００個の硬ゼラチンカプセルを次の処方から調製する
。 混和によって成分の均一混合物を調製し、２ピース硬ゼ
ラチンカプセルに充填するために使用した。

【００６４】

【実施例７】次の処方を有する注射用溶液２５０ｍｌを
常法によって調製する。 デキストロース　　　　　　　　　　　　　１２．５　
ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２５０ｍＬ化合物Ｉ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　４００ｍｇ成分を混和した後滅菌して使用す
る。

【実施例８】次の処方を有するエアロゾル組成物を調製
することができる。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１缶当り　
　　　　　化合物Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２４　ｍｇ　　　　
レシチンＮＦ液体 　　　　　　　　濃縮　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２ｍｇ　　　
　トリクロロフルオロメタン、ＮＦ　　　　　　　　　
　４．０２６ｇ　　　　ジクロロジフルオロメタン、Ｎ
Ｆ　　　　　　　　１２．１５ｇ

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は化合物１のスペクトルを表わす図である
。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　式 【化１】 を有する化合物。
2. 【請求項２】　　次の立体化学配置 【化２】 を有する請求項１記載の化合物。
3. 【請求項３】　　請求項１記載の化合物のＨＩＶプロテ
   アーゼ阻害量を医薬的に使用し得る担体との混合物とし
   て包含しているＨＩＶプロテアーゼの阻害に有用な医薬
   組成物。
4. 【請求項４】　　単位投薬量として請求項１記載の化合
   物１００〜２００ｍｇを含有する請求項３記載の組成物
   。
5. 【請求項５】　　請求項１記載の化合物のＨＩＶプロテ
   アーゼ酵素阻害量を投与することを特徴とするＨＩＶプ
   ロテアーゼ酵素の活性を阻害する方法。
6. 【請求項６】　　請求項１記載の化合物の治療的に有効
   なＨＩＶプロテアーゼ阻害量を治療を必要としている患
   者に投与することを特徴とするＨＩＶプロテアーゼ酵素
   の活性による疾患の治療方法。