JPH0425253B2

JPH0425253B2 -

Info

Publication number: JPH0425253B2
Application number: JP3836183A
Authority: JP
Inventors: Shinichiro Kusunoki; Nobuyuki Tokue
Original assignee: Advance KK
Current assignee: Advance KK
Priority date: 1983-03-10
Filing date: 1983-03-10
Publication date: 1992-04-30
Also published as: JPS59164718A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はＮ−ニトロソ化合物由来の肝臓癌、胃
癌等の発癌の予防剤に関する。

Ｎ−ニトロソジメチルアミン（NDMA）を典
型とする各種Ｎ−ニトロソ化合物が微量で強力な
発癌作用を有することは、今日、周知の通りであ
る（H.Druckrey et al.，Z.Krebsforsh，69
103（1967）；J.H.Hotchkiss et al.，J.Assoc.Off.
Anal.Chem.，64 1037（1981）及びG.G.Gibson
et al.，“Safety Evaluation of Nitrostable
Drug and Chemicals “Tayler and Francis
Ltd.，London，1981等々）。更に、特に強力な発
癌生を有するNDMA等のＮ−ニトロソアミン類
は、野菜等の食品中に豊富に含まれている硝酸塩
が体内で亜硝酸塩に転換されて同じく魚肉等に含
有の脂肪族アミン類と胃等の体内臓器中で反応生
成し、発癌因子と成り得るものであることもま
た、近時次第に解明されつつある（Correa，Ｐ
et al.，Lancet ii、58−60（1975）；
Tannenbaum，S.R et al.，Annals of New
York Academy of Sciences 355 267−277
（1980）；Tannenbaum，S.R.et al.，Cancer
Lett.14 131−136（1981）；D.H.Fine et al.，
Nature265 753（1977）及びP.Schlag et al.，
Lancet，April，５ 727（1980）、等々）。

上記に鑑み本発明者らは前記発癌物質の生体内
生成を効果的に抑制乃至阻害し且つその前駆物質
を無毒化する物質に付き鋭意研究の結果、アミノ
酸の１種であるプロリンが胃内の条件下で脂肪族
アミンと共存した場合に亜硝酸イオンと著るしく
優先的に反応して無毒なＮ−ニトロソプロリン
（NPRO）を与え、結果的に発癌性Ｎ−ニトロソ
化合物の生体内生成を極めて効果的に阻害して反
応混合物全体をバイオアツセイ・レベルでも実質
的に無害化し得るものであることを知見し、本発
明に到達したものである。

以下、本発明剤の有効成分、薬理乃至生物学的
作用、用法・用量、毒性等に付き詳細に分説す
る。

有効成分本発明剤の有効成分としては、天然産Ｌ−プロ
リンを始めとしてタンパク質加水分解物や合成物
であるDL−プロリン或いはその水和物形態
（C₁₀H₁₈N₂O₄・H₂O）、更にはこれらのナトリウ
ム塩、カリウム塩等の各種塩類が好適に使用され
得る。

薬理乃至生物学的作用後記各実験例に示す通り、予備添加プロリンは
二級アミン類及び亜硝酸塩含有溶液の癌原性を実
質的に完全に無毒化する作用を有し、従つてＮ−
ニトロソ化合物由来の発癌予防薬として予防医学
的見地から極めて有用なものと云い得る。ここに
於いて、完全無毒化に要するプロリンの量は亜硝
酸塩に対し約等モル量以上である。

尚、生成NPROが癌原性を有さずしかもその
尿中排泄も略完全且つ速やかであることは既に報
告されている通りである（Chu，C.，＆Magee，
P.N.Cancer Res.，41 3653−3657（1981）；
Dailey，R.E.et al.，Toxicol.，３ 23−28
（1975）；Mirvish，S.S.et al.，J.Natl.Inst.64
1435−1442（1980）及びOhshima，Ｈ＆Bartsch，
H.Cancer Res.，41 3658−3662（1981）、等）。

用法・用量野菜等の食品より摂取された硝酸塩は口腔内等
の微生物により亜硝酸塩に転化され、主として胃
等に於いて摂取食品中成分であるアミン類と反応
して癌原性物質を生成するとされている。本邦人
にあつては食品からの硝酸塩摂取量は218〜408
mg／日とされており且つ唾液中亜硝酸イオン濃度
が数ppm〜50ppm程度であること（Ishiwata，
H.et al.，Proceedings of the 3rd
International Conference on Envi−ronmental
Mutagens，Tokyo Sept.21−27，1981 page571
−575）、及び胃液中の亜硝酸塩濃度が0.1〜数10μ
ｇ／ml（P.Schlag et al.，Lancet，April ５
727（1980）程度であることを考慮すると、本発明
剤の用量はプロリンとして数100μｇ〜数ｇ／
日・50Kg体重、より好ましくは１mg〜１ｇ／日・
50Kg体重のはん囲内であり、予防医学的観点から
すれば実際上は50〜500mg／日・50Kg体重程度で
充分な発癌予防効果を発現し得る。

因みに、NDMAの発癌最低量は約1ppmと評価
されており、これはヒト体重50Kg換算で50mgに相
当する（M.Aral et al.，Gann 70 549（1979）、
等）。

他方、本発明剤は一般に経口投与されるもので
あるが、好適には食品に添加されて共に摂取され
る投与形態をも取り得る。又、その剤型としては
水溶液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、
徐放性マイクロカプセル剤等々、通常の剤型を精
製デンプン末等の適当なキヤリヤ、増量剤、希釈
剤と共に或いはこれらなしに単独に製剤して適宜
選択実施され得る。

本発明剤は又、二級アミン類や硝酸塩含有率の
高い前記食品等を始めとして日常々用のしよう
油、ソース、マヨネーズなどの調味料等の食品に
予め添加、配合されて自然に摂取される形態をも
取り得るので、より一層の予防効果を発揮し得
る。

他方、天然アミノ酸であるＬ−プロリンはゼラ
チン等の天然物に豊富に含まれるのでこれらの加
水分解産物をそのまま本発明剤として使用しても
よい。

毒性プロリン乃至その塩は云うまでもなく食品成分
であるので過大な摂取を別とすれば経口的には全
然無毒性である。

因みに、DL−プロリンをICR系マウス（雄６
週令、平均体重35.0±0.3ｇ、各群10匹）を使用
し、１mg、10mg、100mgの３段階の試料（生理食
塩水0.5ml溶解）を腹腔内に投与し、14日間その
生死を観察し、Behrens−Ka¨rber法に従つて算
出したLD₅₀値は760mg／Kg体重（マウス）以上で
あつた。

実験例１ Amesテストによるin vitro実験反応液組成ジメチルアミン（塩酸塩）と亜硝酸ナトリウム
によるジメチルニトロソアミン生成反応が反応PH
3.4において生成率15％〔Mirvish.S.S.，J.Nat.
cancer Inst.，44 633（1970）〕であることから、
反応液１ml中の生成物が20mgとなる様に以下の如
く反応量を設定した。

ジメチルニトロソアミン生成反応液塩酸ジメチルアミン……ジメチルアミン換算量
として92mg／mlの液を調製し、その0.75mlを用
いた。亜硝酸ナトリウム……142mg／mlの液を
調製し、その0.75mlを用いた。

上記二者を、conc HClにてPH3.4とし、さら
に蒸留水適量を加えて、３ml反応液とした。

プロリン添加反応液塩酸ジメチルアミン、亜硝酸ナトリウム、いず
れも上記処方の液を各々１ml用いた。

Ｌ−プロリン……238mg／mlの液を調製し、亜
硝酸塩に対して1/2モル等量はその0.95mlを、
１モル等量はその1.9mlを用いた。

プロリン添加の際は、ジメチルアミンとプロ
リンを混合後、亜硝酸ナトリウムを加えて
conc HClにてPHを3.4とし蒸留水適量を加えて
４ml反応液とした。

反応条件各反応液は、密栓して、アルミ箔で覆つて遮光
し、胃中の状態を設定して、なおかつ37℃で３時
間incubateし反応を行つた。

変異原性試験法各反応液のサンプルを、反応液量による変異原
の増加を検討するため、25，50，75，100μと
して反応液の直線性を求めることにした。また、
Ｓ−９量は、150μ／500μmixとし、Pre
incubationは25℃で40分、菌株はTA−100を用
いた。

〔矢作ら．，Mutation Research.，48，121−130
（1977）。〕結果を第１乃至２図に示す。

第１図中、横軸はジメチルニトロソアミン生成
反応液量（μ）であり、縦軸は復帰（His⁺）
コロニー数である。図から明らかなように、反応
液量50μ以下が直線性を有するので、これを当
該試験に於ける用量範囲とした。

他方、第２図中、両軸は上記と同様であるが、
曲線Ａはプロリン無添加反応液、同Ｂはプロリン
１／２モル等量及び同Ｃはプロリン１モル等量添加
反応液のデータである。

第２図から明らかなように、プロリン1/2モル
等量添加で充分な変異原性抑制効果が認められ
る。尚、NPROの変異原性がないことも別途確
認されている。

実験例２ラツト肝臓中NAD（ニコチンアミド・アデニ
ン・ジ・ヌクレオチド）量変化を指標としたin
vivo実験発癌物質投与によるDNAの損傷に対して、臓
器中のNAD量が減少し、臓器特異性のある事が
報告された。〔坂本ら．，1981年度日本変異原学
会〕そこで、ジメチルニトロソアミンの肝臓特異性
に注目して以下の実験を行つた。

試験動物ウイスター系雄ラツト（５週令）を１群３匹と
し、各試験において１群を無処置のコントロール
群とした。

投与物質および投与方法 Amesテストに用いた各反応液と同様の反応液
を調製し、動物100ｇ当り0.1mlの投与量としてゾ
ンデにより経口投与を行つた。

各反応液投与群は一定時間後に断頭により屠殺
し、充分瀉血後、直ちに開腹して肝臓の摘出を行
ない、１匹につき肝臓を約１ｇを正確に秤量して
４検体とし、部分的な測定誤差を出来る限り少な
くする様にした。検体は直ちに凍結させた。

NAD量測定法 Methods of Enzymatic Analysis.，Vol ４，
2045（1974）に準拠したエタノールを基質とした
ADH（アルコール・デヒドロゲナーゼ、1.2mg／
ml）を用いる酵素法により測定を行つた。すなわ
ち、秤量後、凍結した検体を凍結した状態でホモ
ゲナイズし、これに５mlの0.6N−HClO₄を加え
て除蛋白する。そのサンプルを3000rpm5分間遠
心分離し上清を得、さらに1M−K₂HPO₄を上清
１mlにつき0.2ml加え、3N−KOHにてPHを7.0〜
7.4の中性に調整する。これをさらに3000rpm5分
間遠心分離して、KClO₄の沈殿を除いた上清１ml
を得、0.1M−ピロリン酸ナトリウム・塩酸セミ
カルバジツドバツフアー（PH8.8）１mlを加え、
エタノール10μを添加して撹拌後、340nmにお
けるO.D.を測定（E₁）する。さらにADHを10μ
加えて同様にO.D.を測定（E₂）、E₂−E₁の差
（ΔE_340on）を求め、既知の算出法により肝臓１ｇ
当りのNAD量（μmole）を求めた。

実験結果ジメチルニトロソアミン経口投与による変化
市販のジメチルニトロソアミンを25mg／Kgおよ
び100mg／Kgの用量で肝臓中NAD量の変化を検
討した。

測定時間は、坂本らの報告に従い、５，10，24
時間後とした。この結果を第３図に示す。図
中、縦軸は肝臓中NAD量（μmole／ｇ）、横軸
は時間（hr）である（下記第４乃至５図も同
様）。

各反応液投与による変化前記例濃度の塩酸ジメチルアミン及び亜硝酸
ナトリウム液各0.5mlをとり、同じくＬ−プロ
リン液を亜硝酸ナトリウムに対して0.25〜２モ
ル等量をとり前記と同様にして反応液を調製
し、これをラツトに投与して肝臓NAD量
（μmole／ｇ）を経時測定した。

結果を第４図に示す。図中、曲線Ａ，Ｂ，Ｃ
及びＤは各々プロリン無添加、１等量添加、２
等量添加及びコントロール・レベルに夫々対応
する。

これと併せて、プロリン２等量相当量単独
（第５図Ａ）およびニトロソプロリン生成相当
量単独投与（第５図Ｂ）についても検討した。

次に、プロリン添加量を変えてNAD減少量
が最大である投与後10時間目のNAD量を求め、
用量−反応曲線（第６図Ａ）を求めた。同図
中、縦軸はNAD量、横軸はモル等量であり、
曲線Ｂはコントロール・レベルを示すものであ
る。

尚、肝臓中NAD量の減少が発癌性のより直
接的な指標である不定期DNA合成の上昇と極
めてよく相関することも、別途確認された。

【図面の簡単な説明】

添付第１乃至６図は本発明実験例説明図であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

１有効成分としてプロリン及び／又はその塩を
含有することを特徴とするＮ−ニトロソ化合物由
来の発癌予防剤。