JPH0454650B2

JPH0454650B2 -

Info

Publication number: JPH0454650B2
Application number: JP58166503A
Authority: JP
Inventors: Shinichiro Kusunoki; Nobuyuki Tokue
Original assignee: Advance KK
Current assignee: Advance KK
Priority date: 1983-09-12
Filing date: 1983-09-12
Publication date: 1992-08-31
Also published as: JPS6058918A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアミノ基含有医薬品添加剤に関する。Ｎ−ニトロソジメチルアミン（NDMA）を典
型とする各種Ｎ−ニトロソ化合物が微量で強力な
発癌作用を有することは、今日、周知の通りであ
る（H.Druckrey et al.，Z.Krebsforsh，69
103（1967）；J.H.Hotchkiss et al.，J.Assoc.Off.
Anal Chem.，64 1037（1981）及びG.G.Gibson
of Nitrostable Drug and Chemicals”Tayler
and Francis Ltd.，London，1981等々）。更に、今日医薬品として汎用されている二級ア
ミン、三級アミン、アミド等が胃等の体内臓器中
で亜硝酸塩と共存することにより、こうした各種
Ｎ−ニトロソ化合物を反応生成し、発癌因子と成
り得るものであることもまた近時次第に解明され
つつある。（谷村顕雄ら：衛生試験所報告99 １−
16（1981）；谷村ら：厚生省がん研究助成金による
研究報告集1981 No.pt2804−812（1982）；谷村
ら：“医薬品と亜硝酸とからの揮発性ニトロソア
ミンの生成とアスコルビン酸によるその制御”日
本薬学会第103年会6N4−３ 1983年４月６日
等々）特にこれらのＮ−ニトロソ化合物前駆物質
が医薬品として内服される場合、胃内等PHの低い
条件下で一時的に高濃度で存在することも多く、
したがつてこれらの物質のニトロソ化がより進み
易いと考えられる。こうした観点から、アミノ基
を含有する医薬品の体内に於けるＮ−ニトロソ化
の可能性については、大きな関心がもたれてい
る。上記に鑑み本発明者らは前記発癌物質の生体内
生成を効果的に抑制乃至阻害し且つその前駆物質
を無毒化する物質に付き鋭意研究の結果、アミノ
酸の１種であるプロリンが胃内の条件下で脂肪族
アミンと共存した場合に亜硝酸イオンと著しく優
先的に反応して無毒なＮ−ニトロソプリン
（NPRO）を与え、結果的に発癌性Ｎ−ニトロソ
化合物の生体内生成を極めて効果的に阻害して反
応混合物全体をバイオ・アツセイ・レベルでも実
質的に無害化し得るものであることを知見し、本
発明に到達したものである。即ち、本発明はプロリン及び／又は、その塩に
より成るアミノ基含有医薬品添加剤の発明であ
る。以下、本発明剤の有効成分、薬理乃至生物学的
作用、用法、用量、毒性等につき詳細に分説す
る。有効成分本発明剤の有効成分としては、天然産Ｌ−プロ
リンを始めとしてタンパク質加水分解物や合成物
であるDL−プロリン或いはその水和物形態
（C₁₀H₁₆N₂O₄・H₂O）、更にはこれらのナトリウ
ム塩、カリウム塩等の各種塩類が好適に使用され
得る。薬理乃至生物学的作用後記各実験例に示す通り、予備添加プロリンは
二級アミン類及び亜硝酸塩含有溶液の癌原性を実
質的に完全に無毒化する作用を有し、従つてＮ−
ニトロソ化合物由来の発癌予防薬として予防医学
的見地から極めて有用なものと云い得る。ここに
於いて、完全無毒化に要するプロリンの量は亜硝
酸塩に対し約等量モル以上である。尚、生成NPROが癌原性を有さずしかもその
尿中排泄も略完全且つ速やかであることは既に報
告されている通りである（Chu，C.，＆Magee，
P.N.Cancer Res.，41 3653−3657（1981）；
Dailey，R.E.et al，．Toxicol.，３ 23−28
（1975）；Mirvish，S.S.et al.，J.Natl.Inst.64
1435−1442（1980及びOhshima，Ｈ＆Bartsch，
H.Cancer Res.，41 3658−3662（1981）、等）。用法・用量野菜等の食品より摂取された硝酸塩は口腔内等
の微生物により亜硝酸塩に転化される。従つてこ
うして生じた亜硝酸の存在下、アミノ基を含有す
る医薬品が服用されると主として胃等に於いて両
者が反応して癌原性物質が生成するとされてい
る。本邦人にあつては食品からの硝酸塩摂取量は
218〜408mg／日とされており且つ唾液中亜硝酸イ
オン濃度が数ppm〜50ppm程度であること
（Ishiwata，H.et al.，Proceedings of the 3rd
International Conference on Environmental
Mutagens，Tokyo Sept.21−27 1981 page571
−575）、及び胃液中の亜硝酸塩濃度が0.1〜数10μ
ｇ／ml（P.Schlag et al.，Lancet，April ５
727（1980））程度であることを考慮すると、本発
明剤の用量はプロリンとして数100μｇ〜数ｇ／
日・50Kg体重、より好ましくは１mg〜１ｇ／日・
50Kg体重の範囲内であり、予防医学的観点からす
れば実際上は50〜500mg／日・50Kg体重程度で十
分な発癌予防効果を発現し得る。因みに、NDMAの発癌最低量は約1ppmと評価
されており、これはヒト体重50Kg換算で50mgに相
当する（M.Arai et al.，Gann 70 549（1979）、
等）。他方、特にアミン生成量の高い薬剤について
は、少なくとも生成アミン量と等モル以上となる
べくあらかじめプロリン量を設定、配合すること
ができる。例えば、アミノピリンはin vitroで37℃、PH３
で４時間反応後65％のアミン生成量を示すのであ
るから（谷村ら、日本薬学会第103年会6N4−
３）、アミノピリン100mgを服用する場合は33mg以
上のプロリンを配合添加すれば効果的である。尚、天然アミノ酸であるＬ−プロリンは、ゼラ
チン等の天然物に豊富に含まれるので、これらの
加水分解物を本発明剤として使用してもよい。本発明剤の有効成分であるプロリンは散剤、顆
粒剤、カプセル剤、錠剤、水溶液等々種々の剤型
に応じた製剤補助剤あるいは添加剤に適宜混合し
て使用することができ、澱粉、乳糖等の賦形剤の
一部に置き換えてもよい。本発明剤を添加する医薬としてはオキシテトサ
イクリン、テトラサイクリン、ミノサイクリン、
クロルプロマジン、トラザミド、アミノピリン、
スルピリン、デシプラミン、エタンブトール、モ
ルホリン、ピペラジン、クロルジアゼポキシド、
メタピリレン、ルカントン、イミプラミン、プロ
メタジン、トリメプラジン、アミトリプチリン、
Ｎ−メチルアニリン、メチルエフエドリン、ピリ
ジノールカルバメート、ジフエニルジメチルアミ
ノエタン、エリスロマイシン、アセチルスピラマ
イシン、メトフオルミン、チオプロペラジン、エ
タンシレート、プログルミド、クレミゾール、グ
リクロピラミド、トリプロリジン、ジピリダモー
ル、チエチルペラジン、ペルラピン、グアネチジ
ン、等々多数のアミノ基含有薬剤を例示し得る。毒性プロリン乃至その塩は云うまでもなく食品成分
であるので過大な摂取を別とすれば経口的には全
然無毒性である。因に、DL−プロリンをICR系マウス（雄６週
令、平均体重35.0±0.3ｇ、各群10匹）を使用し、
１mg、10mg、100mgの３段階の資料（生理食塩水
0.5ml溶解）を腹腔内に投与し、14日間その生死
を観察し、Behrens−Ka¨rber法に従つて算出し
たD₅₀値は760mg／Kg体重（マウス）以上であつ
た。実施例１ Amesテストによるin vitro実験反応液組成ジメチルアミン（塩酸塩）と亜硝酸ナトリウム
によるジメチルニトロソアミン生成反応が反応PH
3.4において生成率15％［Mirvish.S.S.，J.Nat.
cancer Inst.，44 633（1970）］であることから、
反応液１ml中の生成物が20mgとなる様に以下の如
く反応量を設定した。ジメチルニトロソアミン生成反応液塩酸ジメチルアミン…ジメチルアミン換算量と
して92mg／mlの液を調製し、その0.75mlを用
いた。亜硝酸ナトリウム…142mg／mlの液を調製し、
その0.75mlを用いた。上記二者を、conc HClにてPH3.4とし、さら
に蒸留水適量を加えて、３ml反応液とした。プロリン添加反応液塩酸ジメチルアミン、亜硝酸ナトリウム、い
ずれも上記処方の液を各々１ml用いた。Ｌ−プロリン…238mg／mlの液を調製し、亜硝
酸塩に対して1/2モル等量はその0.95mlを、
１モル等量はその1.9mlを用いた。プロリン添加の際は、ジメチルアミンとプロ
リンを混合後、亜硝酸ナトリウムを加えて
conc HClにてPHを3.4とし蒸留水適量を加えて
４ml反応液とした。反応条件各反応液は、密栓してアルミ箔で覆つて遮光
し、胃中の状態を設定して、なおかつ37℃で３時
間incubateし反応を行なつた。変異原性試験法各反応液のサンプルを、反応液量による変異原
の増加を検討するため、25，50，75，100μと
して反応液の直線性を求めることにした。また、
Ｓ−９量は、150μ／500μmixとし、pre
incubationは25℃で40分、菌株はTA−100を用
いた。［矢作ら．，Mutation Research.，48，121−130
（1977）。］結果を第１乃至２図に示す。第１図中、横軸はジメチルニトロソアミン生成
反応液量（μ）であり、縦軸は復帰（His⁺）
コロニー数である。図から明らかなように、反応
液量50μ以下が直線性を有するので、これを当
該試験に於ける用量範囲とした。他方、第２図中、両軸は上記と同様であるが、
曲線Ａはプロリン添加反応液、同Ｂはプロリン1/
２モル等量及び同Ｃはプロリン１モル等量添加反
応液のデータである。第２図から明らかなように、プロリン1/2モル
当量添加で充分な変異原性抑制効果が認められ
る。尚、NPROの変異原性がないことも別途確
認されている。実験例２ラツト肝臓中NAD（ニコチンアミド・アデニ
ン・ジ・ヌクレオチド）量変化を指標としたin
vivo実験発癌物質投与によるDANの損傷に対して、臓
器中のNAD量が減少し、臓器特異性のある事が
報告された。［坂本ら．，1981年度日本変異原学
会］そこで、ジメチルニトロソアミンの肝臓特異性
に注目して以下の実験を行なつた。試験動物ウイスター系ラツト（５週令）を１群３匹と
し、各試験において１群を無処置のコントロール
群とした。投与物質および投与方法 Amesテストに用いた各反応液と同様の反応液
を調製し、動物100ｇ当り0.1mlの投与量としてゾ
ンデにより経口投与を行なつた。各反応液投与群は一定時間後に断頭により屠殺
し、充分瀉血後、直ちに開復して肝臓の摘出を行
ない、１匹につき肝臓を約１ｇを正確に秤量して
４検体とし、部分的な測定誤差を出来る限り少な
くする様にした。検体は直ちに凍結させた。 NAD量測定法 Methods of Enzymatic Analysis.，Vol ４，
2045（1974）に準拠したエタノールを基質とした
ADH（アルコール・デヒドロゲナーゼ、1.2mg／
ml）を用いる酸素法により測定を行なつた。すな
わち、秤量後、凍結した検体を凍結した状態でホ
モゲナイズし、これに５mlの0.6N−HCIO₄を加
えて除蛋白する。そのサンプルを3000rpm5分間
遠心分離し上清を得、さらに1M−K₂HPO₄を上
清１mlにつき0.2ml加え、3N−KOHにてPHを7.0
〜7.4の中性に調整する。これをさらに3000rpm5
分間遠心分離して、KCIO₄の沈澱を除いた上清
１mlを得、0.1M−ピロリン酸ナトリウム・塩酸
セミカルバジツドバツフアー（PH8.8）１mlを加
え、エタノール10μを添加して撹拌後、340nｍ
におけるO.D.を測定（E₁）する。さらにADHを
10μ加えて同様にO.D.を測定（E₂）、E₂−E₁の
差（ΔE₃₄₀nｍ）を求め、既知の算出法により肝
臓１ｇ当りのNAD量（μmole）を求めた。実験結果ジメチルニトロソアミン経口投与による変化市販のジメチルニトロソアミンを25mg／Kgお
よび100mg／Kgの用量で肝臓中NAD量の変化を
検討した。測定時間は、坂本らの報告に従い、５，10，
24時間後とした。この結果を第３図に示す。図
中、縦軸は肝臓中NAD量（μmole／ｇ）、横軸
は時間（hr）である（下記第４乃至５図も同
様）。各反応液投与による変化前記例濃度の塩酸ジメチルアミン、亜硝酸ナ
トリウム及びＬ−プロリン液による組成の各々
の反応液を亜硝酸ナトリウムに対して0.25〜２
モル等量に調製し、これをラツトに投与して肝
臓NAD量（μmole／ｇ）を経時測定した。結果を第４図に示す。図中、曲線Ａ，Ｂ，Ｃ
及びＤは各々プロリン無添加、１等量添加、２
等量添加及びコントロール・レベルに夫々対応
する。これと併せて、プロリン２等量相当量単独
（第５図Ａ）およびニトロソプロリン生成相当
量単独投与（第５図Ｂ）についても検討した。次に、プロリン添加量を変えてNDA減少量
が最大である投与後10時間目のNAD量を求め、
用量−反応曲線（第６図Ａ）を求めた。同図
中、縦軸はNAD量々横軸はモル等量であり、
曲線Ｂはコントロール・レベルを示すものであ
る。尚、肝臓中NAD量の減少がDNA損傷のより
直接的な指標である不定期DNA合成の上昇と
極めてよく相関することも、別途確認された。実験例３プロリンによるニトロソモルホリン生成抑制の
in vitro実験反応液組成ニトロソモルホリン生成反応液ホルモリン…8.7μ／ml（0.1mol／）の液を
調製し、その１mlを用いた。亜硝酸ナトリウム…6.9mg／ml（0.1mol／）
の液を調製し、その１mlを用いた。上記二者をconc HCIにてPH3.4とした。プロリン添加反応液モルホリン、亜硝酸ナトリウム、いずれも上
記処方の液を各々１ml用いた。プロリン…23.0mg／ml（0.2mol／）の液を調
製し、その１mlを用いた。モルホリンとプロリンを混合後、亜硝酸ナト
リウムを加えてconc HCIにてPHを3.4とした。反応条件各反応液は密栓して、アルミ箔で覆つて遮光
し、37℃で３時間incubateし反応を行なつた。変異原性試験法各反応液及びニトロソモルホリンのサンプルを
100ml、Ｓ−９量は、150μ／500μmixし、pre
incubationは37℃ 20分、菌株はTA−100を用
いた。結果を第１表に示す。

【表】製剤例１処方スルピリン 300ｇプロリン 90ｇ乳糖 300ｇデンプン 300ｇゼラチン 10ｇ全量 1000ｇスルピリンを等量のデンプンと均一に混合し、
これに乳糖とプを加えて更に混合した。別にゼラ
チン10ｇに精製水130mlを加え、ゼラチン液とし、
これを結合剤として練合し、常法により造粒、熱
風乾燥を行ない、１包スルピリン0.3ｇ、プロリ
ン0.09ｇを含有する顆粒剤を得た。製剤例２処方アミノピリン 300ｇプロリン 120ｇ乳糖 270ｇデンプン 300ｇゼラチン 10ｇ全量 1000ｇ以上から前例と同様の方法により、１包につき
アミノピリン0.1ｇ、プロリン0.04ｇを含有する
顆粒剤を得た。製剤例３処方塩酸クロルプロマジン 100ｇプロリン 100ｇ６％HPC乳糖 450ｇステアリン酸タルク 40ｇデンプン 310ｇ全量 1000ｇ以上を十分に混合し、打錠して１個につき塩酸
クロルプロマジン0.05ｇ、プロリン0.05ｇを含有
する錠剤を得た。製剤例４処方クロルジアゼポキシド 100ｇプロリン 150ｇデンプン 740ｇステアリン酸マグネシウム 10ｇ全量 1000ｇ以上を十分に混合し、カプセルに充填し、１個
につきクロルジアゼポキシド0.02ｇ、プロリン
0.03ｇを含有するカプセル剤を得た。

【図面の簡単な説明】

添付第１乃至６図は本発明実験例説明図であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

１アミノ基を含有する医薬品に添加する医薬品
添加剤であつて、少なくとも、前記アミノ基含有
医薬品が生成するアミン量と等モル以上のプロリ
ン及び／又はその塩より成ることを特徴とする医
薬品添加剤。