JPH0424035B2

JPH0424035B2 -

Info

Publication number: JPH0424035B2
Application number: JP25265487A
Authority: JP
Inventors: Hideo Fukuda; Ryuhei Ogawa; Takao Fujii
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-10-05
Filing date: 1987-10-05
Publication date: 1992-04-23
Also published as: JPH0195793A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は微生物の培養によるプロピレンの改良
された製造法に関する。〔従来の技術〕従来から、プロピレンは石油分解ガスや天然ガ
スから製造されている。しかし、地球上でのこれ
らの埋蔵量にはおのずから限界がある。微生物によるプロピレンの生成については、マ
ツシユルームがエタン、エチレン、プロパン、プ
ロピレン、ｎ−ブタンを少量生成したとの報告
〔E.M.Turner，M.Wright，T.Ward，andD.J.
Osborne，J.Gen.Microbiol.，91，167−176
（1975）〕、および、牛ふん中の混合菌（菌株の分
離、同定をしていない）での嫌気的メタン発酵、
ならびにペニシリウム・ジギタツム
（Penicillium digitatum ATCCNo.10030の寒天平
板培養で、少量のエタン、エチレン、プロパン、
プロピレンを検出したとの報告〔J.B.Davis and
R.M.Squires，Science，119，381−382（1954）〕
がある。しかし、これらの報告ではいづれもプロ
ピレンの生成量が少く、嫌気倍養か固体表面培養
であり、関与する微生物が不明確か、または、生
成炭化水素の化学構造が不明確である。「炭素数３または／および４の炭化水素の製造
法」、および、「炭化水素混合物の製造法」、に関
する本出願発明者らの出願が公開（特開昭60−
34187号、同61−925297号）されているが、プロ
ピレン生産菌の種類と培地に含まれるべきアミノ
酸の種類が異り、プロピレンの生成量にも大きな
差異がある。〔発明が解決しようとする問題点〕前記の従来の報告では、いずれもプロピレンの
生成量が少く、嫌気や固体表面培養は工業的大量
生産にも必ずしも適していない。また、微生物の
種類が明確でないので、再現性にも乏しい。また、本出願発明者らによる前記出願では、使
用する微生物の種類、培地に含まれるべきアミノ
酸の種類および培養の方法が異り、生成するプロ
ピレン量も必ずしも充分ではない。〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明者らは、充分な再現性のもとで、効率の
よい、微生物によるプロピレンの製造法につい
て、種々研究を重ねた結果、好気的培養条件下に
プロピレンを生成しうる微生物、たとえば、数種
の属に属する糸状菌を好気的に培養して生育させ
たのち、特定のアミノ酸の存在下に好気培養を継
続すると驚くべき量のプロピレンが生成すること
を見出した。本発明はこの知見に基くもので、プロピレンを
生成する能力を有する微生物を好気的に培養して
プロピレンを生産させる方法において、微生物を
予め好気条件下で培養して生育させ、次いでＬ−
バリン、またはＬ−バリンとＬ−イソロイシンの
存在下で好気的に継続培養し、生成するプロピレ
ンを採取することを特徴とする微生物によるプロ
ピレンの製造法である。本発明においては、好気条件下の培養によりプ
ロピレンを生成しうる微生物が用いられる。好ま
しい微生物はペニシリウム（Penicillium）、ペシ
ロマイセス（Paecilomyces）、アスペルギルス
（Aspergillus）またはリゾツプス（Rhizopus）
のような属に属する糸状菌およびその変異株であ
る。それらの微生物のうち、プロピレン生成量の
著るしく多い代表的菌株を挙げれば下記のとおり
である。ペニシリウム・シクロピウム・バル・エキヌラ
トウム（Penicillium Cyclopium var
echinulatum）IFO−7753、ペニシリウム・エク
スパンスム（Penicillum、expansum）IFO−
7100、ペニシリウム・リビドウム（Penicillium
lividum）IFO−6102、ペシロマイセス・フモソ
ロセウス（Paecilomyces fumosoroseus）IFO−
7072、ペシロマイセス・カルネウス
（Paecilomyces carneus）IFO−8292、ペシロマ
イセス・エレガンス（Paecilomyces elegans）
IFO−7060、アスペルギルス・クラバツス
（Aspergillus clavatus）IFO−8606、リゾツプ
ス・ヤポニクス（Rhizopus japonicus）IFO−
4758など。これらの微生物を培養する培地は、炭素源、窒
素源、無機塩類、その他の栄養素を含有するもの
であればよく、上記に例示した微生物については
通常のカビ用の培地を用いうる。炭素源としては、グルコース、シユクロース、
マルトース、澱粉、キシロース、ソルビトール、
などの炭水化物、グリセリンン、エタノールなど
のアルコール、醋酸、脂肪酸などの有機酸、さら
にはこれらを含有する粗原料が用いられる。とり
わけ、天然界および入為的に副生する再生産可能
なバイオマス、たとえば農産、林産、水産、畜産
などから発生する廃資源、廃棄物、あるいは、各
種製造工程から排出される工場廃水、産業廃棄
物、あるいは、公共下排水、各種工場排水などの
生物的処理から副生する汚泥類、あるいはし尿な
どが、この発明にとつて有用な主原料として用い
られる。これらの主原料は、使用する各種菌株に
よつて異るが、必要に応じて予め溶解または分解
の前処理を行なうこともある。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩などが望ましい。なお、前記
のようなバイオマスを主原料として使用する場合
には、これらの窒素源の添加を必要としないこと
もある。無機塩類としては、リン酸塩、カリ塩、
マグネシウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩な
どの通常のものであり、バイオマスの場合には不
要のこともある。ビタミン、アミノ酸、およびこれらを含有する
酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチー
プリカーなどは、本菌株の生育促進もしくはプロ
ピレンの生成に寄与することがある。特に、本発明の方法では、0.25mM以上の２価
または３価の鉄イオン、0.08〜0.48μMの２価の
銅イオンを含有する培地を使用することが好まし
い。その詳細は後記の実施例で説明する。プロピレン生成微生物の培養において、前記の
段階で微生物が生育（増殖）し、次いで培養を継
続すればプロピレンが生成する。本発明においては、特に継続培養をＬ−バリ
ン、またはＬ−バリンとＬ−イソロイシンの存在
下に行う。これらのアミノ酸を微生物の生育段階
で培地に添加すると菌体の構成に消費されて、そ
の添加効果を示さないことがあるので、微生物が
ある程度生育した時期、すなわち継続培養の段階
をこれらのアミノ酸の添加の下に行うのが好まし
い。Ｌ−バリン、またはＬ−バリンとＬ−イソロ
イシンの好ましい添加量は培地に対してそれぞれ
0.1〜３ｇ／、好ましくは１〜２ｇ／である。
しかしながら、微生物がこれらのアミノ酸をその
菌体構成に必要な量以上に自己供給できる性質を
持つている場合はこれらのアミノ酸を培地に外部
から添加する必要がないことは言うまでもない。培養は好気的条件、たとえば通気撹拌培養、も
しくは、静置培養で行なう。好ましくは、培地の
PHは３〜８、培養温度は20〜35℃に制御しつゝ、
各菌株によつて最良の条件を設定する。生成されたバイオガス中のそれぞれの炭化水素
の量は次のようにして測定されうる。培養途中ま
たは培養終了時の被検液ｘ＝１〜５mlを、予め滅
菌した全容Ｖ＝10〜50mlの試験管に採取し、滅菌
ゴムキヤツプで密栓し、20〜35℃でｔ＝１〜24時
間、往復振とうする。使用菌株によつて呼吸速度
が異るので、振とう中に酸素が欠乏しないような
条件設定つまり、Ｖ、ｘ、ｔの水準を必要に応じ
て、適宜かえることが好ましい。往復振とう終了後、試験管上方の空間部からガ
スシリンジで、ｙ＝0.1〜２mlのガスを抜き取り、
FID法（カラム充填剤の種類によつてカラム温度
を50〜120℃の最適温度にかえる。注入温度も充
填剤の種類に応じて変える。）、キヤリアーガスに
窒素ガスを使う常法のガスクロマトグラフイーに
かける。なお、カラムの充填剤の好ましい例は、
Porapak Ｑ，Ｘ−28，Bond−GC／PIC，
Activated Aluminaなどであり、測定する炭化
水素の種類によつて適宜選択して使用するのがよ
い。別途、あらかじめ各種炭化水素の標準物質を使
つて、上記と同じ条件下で、同じ操作で、ガスク
ロマトグラフイーにかけ、それぞれの炭化水素の
記録紙上での滞留時間を測定しておく。また、各
種炭化水素の標準物質を使つて、それぞれの炭化
水素毎に検量線を求めておく。上記被検ガスのガスクロマトグラフイーについ
て、記録紙上の各ピーク部分の滞留時間を測定し
て前記標準ガスのそれと対比して、該当する炭化
水素の種類を判定する。ついで、それぞれの炭化
水素の該当部分の面積を測定し、前記標準ガスに
ついての検量線を使つて、それぞれの炭化水素の
量Ei^nlを求める。なお、次式を使つて、被検ガス中のそれぞれの
炭化水素の生成速度Pi^nl／ml・hrを算出すること
ができる。こゝに添字ｉは、被検ガス中に混在す
る各種炭化水素の種類によつて変ることを示して
いる。 Pi＝Ei・（Ｖ−ｘ／ｙ）・１／ｘ・１／ｔ生成バイオガスから、目的とするプロピレンを
分離、採取するには、生成バイオガスをそのまゝ
ゼオライトあるいは活性炭などの適当な吸着剤に
吸着して不純ガスと分離した後に脱着したり、も
しくは、予め苛性ソーダ液に接触させて副生する
炭酸ガスを除去した後に、上記吸着剤に吸着、脱
着することもできる。ゼオライトとしては、モレ
キユラーシーブス３Ａ，４Ａ，５Ａ，および１０
Ｘ〔ユニオン昭和(株)製〕、ゼオラムＡ−３，Ａ−
４，Ａ−５，およびＦ−９〔東洋ソーダ工業(株)
製〕などが使用される。また、活性炭としてはモ
レキユラーシービングカーボン〔武田薬品工業(株)
製〕などが使用される。〔発明の効果〕本発明の特長としては、使用する主原料とし
て、容易に入手可能で、しかも再生産可能なバイ
オマス、とりわけ、農産、林産、水産、畜産など
から発生する廃資源、廃棄物、あるいは、各種製
造工場から排出される工場廃水、産業廃棄物、あ
るいは、公共下排水、各種工場排水などの生物的
処理から副生する汚泥類、あるいはし尿などが、
有利に使用できること、ならびに、本発明の方法
を実施することによつて、上記主原料として使用
するバイオマス類の一種の微生物学的な廃液処
理、廃棄物処理を行なうことに相当すること、な
どをあげることができる。さらに、原油や天然ガ
スからの現行製造法に較べると、主原料が再生産
可能なバイオマスであるから枯渇する恐れのない
こと、微生物の作用を利用する反応であるから比
較的低温、低圧の緩和な条件のもとで製造できる
こと、本発明の方法によつて副生する不純ガスと
しては炭酸ガスがその大部分であり、したがつて
目的とするプロピレンの精製が容易であり、製品
の純度も高いこと、などの特長があげられる。以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明する。実施例１ 300ml三角フラスコに第１表に示す合成培地
（たゞしカルボキシ・メチル・セルロース
（CMC）を、30ｇ／培養液、ずつ添加）を100
mlずつ仕込み、120℃、15分間、加圧蒸気滅菌し、
冷却後、斜面培養した各種菌株の２白金耳ずつを
接種し、常法通り25℃で３日間、回転振とう培養
機（回転半径７cm、180rpm）で前培養した。 300ml三角フラスコに、第１表に示す合成培地
（CMC無添加）を100mlずつ仕込み、同上のよう
に滅菌、冷却後、上記前培養液５mlずつを移殖
し、常法通り25℃で52時間、上記回転振とう培養
機で本培養した。このようにして得られた培養液１mlを30ml容
（18mmφ）の滅菌済試験管にそれぞれ採取し、滅
菌水１ml、または、Ｌ−バリン（Ｌ−Val）含有
液１ml（元の培養液に換算して１ｇ／になる濃
度のＬ−Val液）、または、Ｌ−ValとＬ−イソロ
イシン（Ｌ−Ile）含有液１ml（元の培養液に換
算して、それぞれ１ｇ／になる濃度の液）を、
それぞれ分注し、直ちに密栓して、25℃で15時間
往復振とう機（130回／分、振幅3.5cm）にかけて
シール状態での培養を続け、バイオガスを発生さ
せた。なお、本文に前記したように使用菌株によ
つて呼吸速度が異るので、シール培養期間中に酸
素が欠乏しないような条件設定が重要である。シール培養の終了後、試験管上方の気相部から
ガスシリンジで、それぞれ１mlずつの生成バイオ
ガスを抜きとり、本文記載の方法でガスクロマト
グラフイーにかけて、目的とするプロピレンの生
成速度を算出した。結果が第２表に示されている。Ｌ−Val、また
は／およびＬ−ValとＬ−Ileの無添加時には、い
ずれの菌株もプロピレンを生成しないのに、これ
らのアミノ酸を添加すると、プロピレンを生成
し、特にＬ−ValとＬ−Ileを同時に添加すると、
著量のプロピレンを生成した。P.
cyclopiumIFO7753について、Ｌ−Ile単独添加時
の実験を追加し、整理した結果が第３表に示され
ている。Ｌ−ValとＬ−Ile両者を同時添加する
と、明らかに相乗的な効果を示している。現時点では詳細は不明であるが、プロピレンの
生成に対して、Ｌ−Valが前駆物質的に、Ｌ−Ile
が促進物質的な作用をもつているようにも考えら
れる。

【表】

【表】実施例２ 30ml三角フラスコに、第１表に示す合成培地
100mlを仕込み、実施例１と同様に前培養、本培
養、シール培養を行なつた。たゞし、P.
cyclopium IFO7753を使用した。また、第１表
記載の合成培地成分中のFe₂（SO₄）₃、0.01ｇ／
の代りに、第４表に記載した鉄塩を使用し、さら
に、CuSO₄・5H₂Oの量を２mg／から３mg／
（培地中のC²⁺濃度として0.12μM）に変更した。結果が第４表に示されている。この結果から、
培地に含まれる鉄イオンの濃度は0.25mM以上が
好ましい。

【表】

【表】実施例３ 300ml三角フラスコに、第１表に示す合成培地
100mlを仕込み、実施例１と同様に前培養、本培
養、シール培養を行なつた。たゞし、P.
cyclopiumIFO7753を使用した。また、第１表記
載の合成培地成分中のCuSO₄・5H₂O2mg／無
機塩類溶液（0.02mg／培養液、Cu²⁺として
0.08μM）の代りに、第５表に記載した銅濃度に
変更し、さらに、Fe₂（SO₄）₃の量を0.01ｇ／か
ら0.25ｇ／（培地中のFe³⁺濃度として1.25mM）
に変更した。結果が第５表に示されている。培地に含まれる
銅イオンの濃度としては、0.08〜0.48μMが好ま
しい。

【表】

【表】実施例４温州みかんを圧搾してジユースを搾汁した後の
残渣（水分：77％、固形分：23％、全糖：19.4
％）400ｇに水約500ml添加して、ミキサーでホモ
ジネートし、硝酸ソーダを１ｇ添加し、液量を１
にして、2.6のミニジヤーフアーメンターに
仕込み、120℃、20分間オートクレーブに入れて
滅菌し、冷却後、予め同じ培地で振とう培養した
P.cyclopiumIFO7753の前培養液50mlを移植し、
0.1VVMの無菌空気を通気し、撹拌回転数
400rpm、培養温度25℃で10日間培養した。なお、
培地中のＬ−Val含量は約0.3ｇ／、Ｌ−Ile含
量は約0.15ｇ／であつた。この全培養期間を通じて、排気を10％苛性ソー
ダ液槽、水洗槽、水分分離槽に順次導いて不純ガ
スを除去し、ついでゼオラムＡ−３〔東洋ソーダ
工業(株)製〕の層を通過させて、さらに不純ガスを
吸着除去し、通過ガスをゼオラムＡ−４〔東洋ソ
ーダ工業(株)製〕の充填管に導びき、吸着したプロ
ピレンを真空吸引して脱着回収した。得られたプロピレンは約1.7mgであつた。

Claims

【特許請求の範囲】１プロピレンを生成する能力を有する微生物を
好気的に培養してプロピレンを生産させる方法に
おいて、微生物を予め好気条件下で培養して生育
させ、次いでＬ−バリン、またはＬ−バリンとＬ
−イソロイシンの存在下で好気的に継続培養し、
生成するプロピレンを採取することを特徴とする
微生物によるプロピレンの製造法。２微生物がペニシリウム属、ペシロマイセス
属、アスペルギルス属またはリゾツプス属に属す
る特許請求の範囲第１項記載の製造法。３微生物を微量の、好ましくは0.25mM以上の
２価または３価の鉄イオンを含有する培地に培養
する特許請求の範囲第１項記載の製造法。４微生物を微量の、好ましくは0.08−0.48μM
の２価の銅イオンを含有する培地に培養する特許
請求の範囲第１項記載の製造法。