JPH04187237A

JPH04187237A - 分離材及び分離器

Info

Publication number: JPH04187237A
Application number: JP2315524A
Authority: JP
Inventors: Katsumi Kawamura; 克己河村; Tsuneo Hiraide; 恒男平出
Original assignee: Asahi Kogaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Pentax Corp
Priority date: 1990-11-20
Filing date: 1990-11-20
Publication date: 1992-07-03
Anticipated expiration: 2015-03-27
Also published as: JP3026594B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】「利用分野」本発明は、様々な物質の液体クロマトグラフィー分離、
動植物細胞やウィルスの分離などに利用しつる分離材及
び分離器に関する。

［従来技術及びその問題点」従来、液体クロマトグラフィー用充填剤や動植物細胞や
ウィルスの分離剤として、様々な分離吸着剤が提案され
てきたが、分離吸着剤のほとんどは、微細な粒子から成
る。これらの分離吸着剤粒子の多数を、カラム等の容器
に積層して用いている。そのため、振動、その他の力学
的な衝撃により、粒子層が乱れ、分離能が低下するとい
う問題点があった。

また、送液によって、特に、溶媒流入口部分の粒子層が
乱れたり、圧密化して空隙か生じたりするため、分離能
が低下してしまう。

さらに、シリンジ等の容器に平均粒径１００〜２０００
μｍの顆粒を充填して、細胞の分離に用いるカラムも提
案されているが、液体クロマトグラフィー用と同様に振
動などの衝撃により、顆粒の充填状態に乱れか生じるこ
とかあり、その結果、分離性能が低下する。

「発明の目的」本発明は、振動、その他の衝撃や送液によって物質、動
植物細胞及びウィルスに対する分離能が低下しない分離
材及び分離器を提供することを目的とする。

「発明の構成」本発明は、三次元連通孔を有する多孔体を分離吸着材と
して用い、この多孔体の側面を合成樹脂で包囲すること
によって上記目的を達成したものである。

すなわち、本発明による分離材は、三次元連通孔を有す
るリン酸カルシウム系セラミックス、シリカセラミック
ス、チタニアセラミックス又はジルコニアセラミックス
多孔体から成ることを特徴とする。

また、本発明の分離器は、三次元連通孔を有するセラミ
ックス多孔体又は樹脂多孔体の側面が合成樹脂層で包囲
固定されていることを特徴とする。

本発明の分離材は、上記のように、粒子の積層物ではな
（，１個の多孔体から成るものであり、三次元連通孔を
有するリン酸カルシウム系セラミックス、シリカセラミ
ックス、チタニアセラミックス又はジルコニアセラミッ
クス多孔体から成るものである。リン酸カルシウムとし
ては、Ｃａ／Ｐ比が１．４〜１．８のものであれば各種
のものを使用することができるが、焼結性などの点を考
慮すると、１．５〜１．６７であるものか好ましい。さ
らに具体的には、ハイドロキシアパタイト、フッ素アパ
タイト等の各種のアパタイト、リン酸三カルシウム、リ
ン酸四カルシウム及びこれらの混合物を使用することが
できる。

セラミックス多孔体の平均孔径は、通常、０．１〜１０
００μｍであるが、１〜５００μｍであるのが好ましい
。孔径が０．１μｍ未満であると、目詰まりが起こりや
すく、１０００μｍを超えると、分離吸着性能が低下す
る。

さらに、セラミックス多孔体の気孔率は、２０〜７０％
であることが好ましく、３０〜７５％であることがより
好ましい。気孔率が２０％未満では圧力が極めて高（な
ったり、充分に流量を上げることができなかったりする
。また、分離吸着する面積が小さくなり、サンプルの投
入量、回収量が少なくなる。気孔率７５％を超えると、
サンプルを投入した時、吸着することなく流出してしま
う率が高くなり、分離能が低下する。

セラミックス多孔体は、公知の方法により製造すること
ができ、例えば、過酸化水素等の発泡剤を用いる発泡法
、ウレタンフオームにセラミックススラリーを含浸させ
、ウレタンフオームを熱分解するウレタンフオーム法、
樹脂ビーズ、昇華性物質などの熱消失性物質を湿式又は
乾式で混合し、これを加熱消失させる方法などによって
製造することができる。

さらに、セラミックススラリーを脱水・乾燥して得た乾
燥体を比較的低温で焼成し、セラミックスのほぼ球状の
二次粒子同士がその接触部分だけで結合しており、粒子
間隙だけで三次元連通孔を形成している多孔体を製造す
ることもできる。このような粒子間隙だけに基づ（三次
元連通孔を有する多孔体は、極めて微細で、孔径及び分
布が均一な連通孔を有し、高い分離性能を発揮するため
、本発明に使用するのに好適である。このような多孔体
を製造するのに好適な焼成温度は、セラミックスの種類
によって変動し、例えば、−ハイドロキシアパタイトの
場合には、５００〜１２００°Ｃである。この分離材を
液体クロマトグラフィーに用いる場合には、平均粒径１
〜１００μｍの二次１粒子を用いることが好ましい。ま
た、細胞の分離に用いるには、平均孔径２０００μｍ以
下の二次粒子を用いればよい。２０００μｍを超えると
、分離能が低下する。

次に１１本発明の分離器について説明する。

本発明の分離器は、上記のような三次元連通孔を有する
セラミックス多孔体又は樹脂多孔体の側面が、必要に応
じて接着剤層又はプラスチックフィルム層を介して、合
成樹脂層で包囲・固定されているものである。

この分離器に用いる樹脂多孔体としては、例えば、平均
孔径１〜１０００μｍの三次元連通孔を有するポリビニ
′ルアセタール樹脂多孔体などが挙げられる。このよう
な樹脂多孔体は、公知の方法により製造することができ
、例えば、モノマー混合物に発泡剤を添加して重合を行
うことによって製造することができる。ポリビニルアセ
タール樹脂としては、アセタール化率５０〜１００％の
ものが好ましく、例えばポリビニルホルマール、ポリビ
ニルブチラール等が挙げられる（特願平１−４８０００
号明細書参照）。平均孔径は、１μｍ未満では目詰まり
を起こす虞があり、１０００μｍを超えると、吸着表面
積の低下により、分離能が低下する。

本発明の分離器は、上記のような各種の多孔体の側面が
合成樹脂層で包囲・固定されているものである。上記の
ような多孔体をカラム等に充填すると、充填時に多孔体
の側面とカラム壁との摩擦によって多孔体側面の構造が
破壊する虞があり、また、スムースに充填できる寸法に
すると、カラム壁に沿って試料液や溶離溶媒が流れ、分
離能が著しく低下する虞がある。そこで、本発明におい
ては、多孔体の側面を合成樹脂で固め、多孔体側面と合
成樹脂とが結合し、多孔体と分離容器とが結合した形態
とするが、硬化前の合成樹脂組成物は粘度が低いので、
多孔体の気孔内に侵入する虞がある。したがって、粘度
の高い速乾性接着剤をを合成樹脂組成物として使用し、
これを塗り重ねることによって合成樹脂層を形成するの
が好ましい。

また、本発明の一実施態様として、多孔体の側面に粘度
の高い速乾性接着剤を塗布して接着剤層を形成し、その
上に別種の合成樹脂層を設けて多孔体を包囲・固定する
こともできる。

接着剤層の厚さは、その上に塗布される合成樹脂が多孔
体の気孔内に侵入するのを防止できる程度であればよい
。また、合成樹脂層の厚さは、分離器の使用目的などに
よって異なり、高圧液体クロマトグラフィーに用いる場
合には、耐圧性を備えるため、比較的厚（する必要があ
る。

接着剤としては、粘度が高く、速乾性のものであれば、
特に制限はなく、例えば、長潮チバ■製アラルダイト等
のエポキシ樹脂系接着剤などが挙げられる。また、合成
樹脂としては、特に制限はないが、アクリル系樹脂、エ
ポキシ樹脂など、常温硬化型のものを使用すれば、分離
器の製造が容易となり、好ましい。

さらに、孔径の大きい多孔体を用いる場合には、粘度の
高い接着剤でも、多孔体の気孔内に入り込む危険がある
ので、このような場合には、液体を透過しない、伸張性
のあるフィルムで多孔体を包囲した後、合成樹脂層を設
けるのが好ましい。ここで用いる合成樹脂の種類には、
特に制限はないが、粘着性を有するものであるのが好ま
しい。

本発明の分離器は、開放型あるいは閉鎖型である。液体
通路としては、注射針やチューブを利用することができ
、多孔体に接着剤で装着してもよいが、カラムジョイト
やカラムエンドにチューブを装着してもよい。

「発明の実施例」次に、図面に基づいて本発明の実施例を示す分離器を詳
述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

第１図は、本発明の一実施例を示す分離器の断面図であ
る。この分離器は、開放型で、一方の端面に液体通路を
有する形式のものであり、多孔体１の側面及び底面に接
着剤層２及び合成樹脂層３が設けられ、多孔体１の底面
には、液体通路としてのチューブ４が接着剤層２及び合
成樹脂層３によって固定されている。ここで、多孔体１
の孔径が大きい場合には、接着剤層２の代わりにプラス
チックフィルム層を設けてもよい。また、合成樹脂層３
を接着剤層２を形成するのに用いた接着剤を用いて形成
し、合成樹脂層と接着剤層とを同一の層として形成する
こともできる。

第１図に示した分離器を用いて、物質、動植物細胞又は
ウィルスを分離する場合には、開放端から試料液及び溶
離溶媒を注入し、チューブ４から流出させる。

第２図は、閉鎖型で、多孔体の両端面に接触して液体通
路が設けられている分離器の断面図である。この分離器
においては、多孔体１の両端面には液体通路としてのチ
ューブ４の外周断面が後述する接着剤により接着される
と共にその補強のためチューブ４に挿通されたカラムエ
ンド５か同じく接着剤により多孔体の両端部及びチュー
ブに接着され、固定されている。さらに、多孔体１の側
面と両端面には、この接着剤による接着剤層２が設けら
れ、この接着剤層２を覆うように合成樹脂層３が形成さ
れている。この形式ではデッドボリュームが全（なく、
高い分離能を達成することができる。

第３図に示した分離器は、閉鎖式であり、多孔体１の両
端面から間隔をおいて液体通路を設けた形式のものであ
る。この分離器においては、市販のフィルタ付きバツク
ドカラムエンドの分離剤か配置される側の端部を切断加
工してカラムエンド７として用いた。このカラムエンド
７のフィルター側端部と多孔体ｌとは密着された状態で
、カラムエンド７及び多孔体１の側面が接着剤により覆
われ、接着剤層２が形成されている。また、この接着剤
層２をさらに覆うように合成樹脂層３が形成されている
。カラムエンド７には、雌ネジ部８が形成され、図示し
ないジヨイントを介してチューブなどと接続され、液体
通路が形成される。第３図に示した吸着分離器において
は、試料液及び溶離溶媒はフィルター６を介して注入・
流出される。

第２図及び第３図に示した分離器においては、−１１＝一方の液体通路から試料液及び溶離溶媒を注入し、他方
の液体通路から流出させることができる。また、これら
の分離器は、閉鎖式であるから、高圧液体クロマトグラ
フィーを行うのに好適である。

次に、本発明の分離器を用いて分離を行った実施例を示
す。

実施例１公知の方法で湿式合成してハイドロキシアパタイトのス
ラリーを得た。このスラリーを噴霧乾燥し、平均粒径１
０μｍの粉末を得た。この粉末をイオン交換水とメチル
セルロース（信越化学工業■製、商品名；メトローズ）
を用いてメチルセルロースの１重量％水溶液１５０ｇを
調製した。これに上記ハイドロキシアパタイト粉末７０
ｇを加え、スラリーとし、その後、乾燥して成形物を作
製し、９５０°Ｃで熱処理し、１０１０Ｘ１０Ｘ２３の
ハイドロキシアパタイトセラミックス多孔体を得た。こ
の多孔体は、気孔率７０％で、５〜１０μｍの気孔径の
連通気孔を有していた。なお、この連通気孔は、粒子間
隙に基づ（ものである。

得られたセラミックス多孔体の下端にエポキシ樹脂系接
着剤（長瀬チバ■製アラルダイト）を用いてシリコーン
チューブを装着し、多孔体の側面及び底面に同じ接着剤
を用いて厚さ１ｍｍの接着剤層を設け、さらにアクリル
系の包埋用樹脂（丸元工業■製）を用いて厚さ３ＩＩＩ
ｍの合成樹脂層を設けて第１図に示した分離器を作製し
た。上記シリコンチューブの途中にペリスタポンプを接
続し、液体の流速を調整できるようにした。

作製した分離器の開放端から１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐ）（６，８）を入れ、１４７分の流速に調整
し、分離器及びチューブ内を同緩衝液で満たした後、１
０■／ｉの濃度のチトクロームＣを含む水溶液４００μ
ｌを上記開放端から注入し、多孔体に吸着させる。次い
で、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）　
５　ｒｎ（ｌを流し、ポンプ出口より流出した液を分取
した。次に、４００ｒｎＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６，８）　５　Ｊを流し、同様にポンプ出口より流出
した液を分取した。分取した液について蛋白質染色法に
よりチトクロームＣの回収量を測定した。得られた結果
を、下記の第１表に示す。

第１表実施例２実施例１と同様にして直径７．５Ｘ１７＋ｎｎ＋の円柱
状セラミックス多孔体を作製した。この多孔体は気孔径
１０〜２０μｍの連通気孔を有していた。

得られた多孔体及び実施例１に用いたものと同じ接着剤
及び合成樹脂と市販のフィルター付きステンレスカラム
エンドを用いて第３図に示した吸着分離器を作製した。

この分離器の一方の液体通路を入口側とし、蒸留水にウ
シ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略称する）　　１　
’Ｏμｇ／ｍｊ及びリゾチーム１０μｇ／ｍｌを溶解し
た試料溶液を１０μｍ注入し、リン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６，８）を移動相とし、１０ｍＭから４００ｍＭ
の３０分グラジェントクロマトグラフィーを行った。得
られたクロマトグラムを第４図に示す。第４図において
ａはＢＳＡのピーク、ｂはリゾチームのピークである。

実施例３実施例１と同様にして直径７．５　Ｘ　１９．５　ｍｍ
の円柱状セラミックス多孔体を作製した。この多孔体は
気孔径１０〜２０μｍの連通気孔を有していた。

得られた多孔体及び実施例１に用いたものと同じ接着剤
及び合成樹脂とシリコンチューブを用いて第２図に示し
た分離器を作製した。

実施例２に用いたのと同じ試料溶液を、リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６，８）を移動相とし、１０ｍＭから４
００ｍＭの２０分のグラジェントクロマトグラフィーを
行った。得られたクロマトグラムを第５図に示す。第５
図においてａはＢＳＡのピーク、ｂはリゾチームのピー
クである。

実施例４平均粒子径０．８μｍのハイドロキシアパタイト５０重
量％及びバインダーとしてポリビニルアルコール２重量
％を水に混合したスラリーをウレタンフオームに含浸さ
せた。これを室温で乾燥させた後、１２００℃で焼成し
、気孔率７５％、平均気孔径３００μｍの三次元連通孔
を有する多孔体（３Ｘ３Ｘ２０ｍｍ）を作製した。この
多孔体の側面（８Ｘ２０ｍｍの４面）をパラフィルム〔
アメリカンΦカンーカンパニイ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃ
ａｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ）の登録商標）で巻いた後、エポ
キシ樹脂（アラルダイト、ト）で周囲を固着腎だ。また
、端面（８×８ｍｌの面）の一方に２６Ｇ（ゲージ）の
注射針を同じエポキシ樹脂で固是し、細胞分離用分離器
を作製した。

こうして作製した分離器にヒト抹消血リンパ細胞５Ｘ１
０’個を浮遊させたハンクス培地０．２　ｍｌを流し、
この浮遊液が多孔体に充分浸透した後、３ｒＡｌのハン
クス培地を流して非吸着細胞を流出させて回収した。こ
の回収した細胞に蛍光標識抗体、抗Ｌｅｕ　４と抗Ｌｅ
ｕ１２をラベルした後、ＦＡＣ８（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｃｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｔｅｒ
）を用いてＴ細胞及びＢ細胞の陽性率を調べた。結果を
下記の第２表に示す。

実施例５平均孔径１００μｍでホルマール化率が８０〜８６％の
ポリビニルホルマール樹脂シート（スポンヂベルイータ
：鐘紡■製）を８　Ｘ　８　Ｘ　２０　ｍｍに切断した
。この樹脂シートの側面（８Ｘ２０ｍｍの面）をバラフ
ィルムで巻いた後、エポキシ樹脂（アラルダイト）で周
囲を固着した。また、端面（８Ｘ８ｍｍの面）の一方に
２６Ｇの注射針を同じエポキシ樹脂で固定し、細胞分離
用分離器を作製した。

実施例４と同様の操作を行って下記の第２表に示すリン
パ球の分離結果を得た。

第２表第２表に示した結果から明らかなとおり、Ｂ細胞が分離
材に吸着されたため、相対的にＴ細胞の濃度が高くなっ
ている。

「発明の効果」本発明の分離材は、粒子の積層物ではなく、−体形状の
多孔体から成るのて、分離器内で層の乱れや圧密化を起
こさない。また、本発明の分離材は、様々な物質の分離
ばかりでなく、細胞やウィルスの分離にも使用すること
ができ、高い分離能を示す。

さらに、本発明の分離器は、流入口付近にデッドボリュ
ームを作ることなく製造でき、また、送液によってもデ
ッドボリュームができす、分離材の圧密化が起こらず、
衝撃に強く、分離材層の乱れが起こらず、高い分離能を
示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例を示す分離器の断面図、第２
図は別の実施例を示す分離器の断面図、第３図はさらに
別の実施例を示す分離器の断面図、第４図は実施例２で
得られたクロマトグラム、第５図は実施例３で得られた
クロマトグラムである。符号の説明 ■・・・多孔体、２・・・接着剤層、３・・・合成樹脂
層、４・・・チューブ、５及び７・・・カラムエンド、
ａ・・・ＢＳＡのピーク、ｂ・・・リゾチームのピーク特許出願人　　旭光学工業株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）三次元連通孔を有するリン酸カルシウム系セラミ
ックス、シリカセラミックス、チタニアセラミックス又
はジルコニアセラミックス多孔体から成ることを特徴と
する分離材。
（２）骨格部分が、粒子の接触部分で相互に結合されて
いるものであり、連通孔が粒子間隙に基づくものである
請求項１記載の分離材。
（３）骨格部分を構成する粒子の平均粒径が１〜２００
０μｍである請求項２記載の分離材。
（４）三次元連通孔を有するセラミックス多孔体又は樹
脂多孔体の側面が合成樹脂層で包囲・固定されているこ
とを特徴とする分離器。
（５）多孔体の少なくとも一方の端面に接触して又は間
隔を置いて液体通路が設けられている請求項４記載の分
離器。
（６）液体通路が多孔体の一方の端面に接触して設けら
れ、接着剤層及び樹脂層によって固定された注射針又は
チューブである請求項５記載の分離器。
（７）液体通路が多孔体の両方の端面に接触して設けら
れ、接着剤層及び合成樹脂層で固定されたカラムジョイ
ントを介して装着された送液チューブである請求項５記
載の分離器。
（８）液体通路が、多孔体の両端面に配置されたフィル
ターを介して設けられ、合成樹脂層によって固定された
カラムエンドである請求項５記載の分離器。