JPH04179476A - 血管内皮細胞の培養方法 - Google Patents
血管内皮細胞の培養方法Info
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- JPH04179476A JPH04179476A JP2309892A JP30989290A JPH04179476A JP H04179476 A JPH04179476 A JP H04179476A JP 2309892 A JP2309892 A JP 2309892A JP 30989290 A JP30989290 A JP 30989290A JP H04179476 A JPH04179476 A JP H04179476A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
本発明は、血管内皮細胞由来の生理活性物質を効率良く
産生させる血管内皮細胞の培養方法に関する。
産生させる血管内皮細胞の培養方法に関する。
［従来の技術］
血管内皮細胞（Ｅ Ｃ）は、血管内壁の最内層を構成し
ている細胞で、血液−組織間の物質透過を制御したり、
血液凝固阻止や造血、血圧などに関する多くの生理活性
物質（コロニー刺激因子、インターロイキン類、エンド
セリン、プロスタグランジン類など）を産生じ、生体維
持に深くかかわっている。また、損傷血管の修復や組織
での血管新生には、この細胞の増殖か必須要因となって
いる。生体より取り出したヒトＥＣを、ｉｎ ｖＮｒ。
ている細胞で、血液−組織間の物質透過を制御したり、
血液凝固阻止や造血、血圧などに関する多くの生理活性
物質（コロニー刺激因子、インターロイキン類、エンド
セリン、プロスタグランジン類など）を産生じ、生体維
持に深くかかわっている。また、損傷血管の修復や組織
での血管新生には、この細胞の増殖か必須要因となって
いる。生体より取り出したヒトＥＣを、ｉｎ ｖＮｒ。
培養系に移すには、ウシやブタ由来のものと異なり、そ
の増殖のために、増殖刺激因子（ＥＣＧＦ）とゼラチン
（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｊ、、 ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ。
の増殖のために、増殖刺激因子（ＥＣＧＦ）とゼラチン
（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｊ、、 ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ７６、５２１
７−５２２１．１９７９）、フィブロネクチン（Ｍａｃ
ｉａｇ、Ｔ、、 ｅｆ ａｔ、、 Ｊ、 Ｃｅ１ｌ
。
７−５２２１．１９７９）、フィブロネクチン（Ｍａｃ
ｉａｇ、Ｔ、、 ｅｆ ａｔ、、 Ｊ、 Ｃｅ１ｌ
。
Ｂｉｏｌ、、 ９１． ４２０−４２６． １９８１
）、コラーゲン（Ｈｏｓｈｉ。
）、コラーゲン（Ｈｏｓｈｉ。
Ｈ，、ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、。
８１、 ６４１３−６４１７． １９８４）などの細胞
外マトリックス成分を必要とする。すでにいくつかの特
異的あるいは非特異的な増殖因子が報告されているが（
Ｇｏ−ｓｐｏｄａ’ｒｏｗｉｃｘ、Ｄ、、 Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ２４９． １２３−１２７． １９７４）、（
Ｓｈｉｎ、 Ｙ、、 ｅｌ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃ
ｅ、 ２２３． １２！１６−１２９！ｌ。
外マトリックス成分を必要とする。すでにいくつかの特
異的あるいは非特異的な増殖因子が報告されているが（
Ｇｏ−ｓｐｏｄａ’ｒｏｗｉｃｘ、Ｄ、、 Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ２４９． １２３−１２７． １９７４）、（
Ｓｈｉｎ、 Ｙ、、 ｅｌ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃ
ｅ、 ２２３． １２！１６−１２９！ｌ。
１９８４）、（Ｍｉ’ｙａｘｏｎｏ、に、、 ｅｔ
ａｌ、、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ−ｐｈｙｓｉ
、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍ、、 １２６． ８３−８
８． １９８５）、増殖支持活性と価格の問題から、大
量培養への適用は、はとんど不可能に近く、物質生産あ
るいは細胞そのものの人工血管などへの利用を目的に、
ヒトＥＣを大量に培養することは、全く実現していない
。
ａｌ、、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ−ｐｈｙｓｉ
、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍ、、 １２６． ８３−８
８． １９８５）、増殖支持活性と価格の問題から、大
量培養への適用は、はとんど不可能に近く、物質生産あ
るいは細胞そのものの人工血管などへの利用を目的に、
ヒトＥＣを大量に培養することは、全く実現していない
。
また、ＥＣは前述のように生体内では多（の機能を持つ
細胞なので、ｉｎ ｖｉ＋ｒｏ培養系で増殖した細胞の
機能性の保持は重要な課題である。すでに報告されてい
る増殖因子と適切なマトリックスをうまく組み合わせて
も、現在では、血管内皮細胞の機能保持培養には限界が
あり、ヒト２倍体線維芽細胞のｉｎ ｖｉ＋＋ｏ培養に
おける機能の維持とは、比較にならないほど困難を極め
ている。
細胞なので、ｉｎ ｖｉ＋ｒｏ培養系で増殖した細胞の
機能性の保持は重要な課題である。すでに報告されてい
る増殖因子と適切なマトリックスをうまく組み合わせて
も、現在では、血管内皮細胞の機能保持培養には限界が
あり、ヒト２倍体線維芽細胞のｉｎ ｖｉ＋＋ｏ培養に
おける機能の維持とは、比較にならないほど困難を極め
ている。
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、有用な生理活性物質を産生ずる血管内皮細胞
を大量に培養することを目的とする。
を大量に培養することを目的とする。
［課題を解決するための手段］
上記の目的は、以下の本発明により達成される。
すなわち本発明は、血管内皮細胞をミクロキャリアー上
にて培養するに際し、培養液の撹拌をズリ応力を１０〜
１３０ ｄｙｎｃ／ｃｍ２の範囲にすることを特徴とす
る培養方法である。
にて培養するに際し、培養液の撹拌をズリ応力を１０〜
１３０ ｄｙｎｃ／ｃｍ２の範囲にすることを特徴とす
る培養方法である。
従来、接着依存性細胞は、その接着依存性の故にガラス
表面上あるいはローラービンを用いる回転培養で培養さ
れていたため、大量培養化か困難であった。しかし、近
年ミクロキャリアー培養法が開発され、接着依存性細胞
も大量培養が可能になってきた。本発明者等は、哺乳動
物細胞のミクロキャリアー培養システムを確立し、すで
にヒト２倍体線維芽細胞の大量培養化に成功している（
Ｓａｎｏ、Ｅ、、 ｅｔ ａ：、、 Ｃａ１ｌ、 ５
ｔｒｕＣ；、 Ｆｕ＋］ｃ：、、 ’、２゜５０９−５
１７． １９８７）。本ミクロキャリアー培養システム
を用い、血管内皮細胞の増殖と大量培養化を試みたとこ
ろ、細胞増殖および有用生理活性物質の産生には、撹拌
回転数に依存した適切な５ｈｅａｒｓｔｒｅｓｓ （ズ
リ応力）か重要なポイントであることを見い出した。す
なわち、血管内皮細胞をミクロキャリアー上に増殖させ
るとき、および増殖した内皮細胞から生理活性物質を産
生させる際に、ミクロキャリアー培養の撹拌によるズリ
応力を１０〜１３０ ｄｙｎｅ／ｃｎｆ、好ましくは２
０〜１１０ｄｙｎｅ／ｄの範囲にすることである。ここ
で述べたズリ応力は次の方法により求められる。
表面上あるいはローラービンを用いる回転培養で培養さ
れていたため、大量培養化か困難であった。しかし、近
年ミクロキャリアー培養法が開発され、接着依存性細胞
も大量培養が可能になってきた。本発明者等は、哺乳動
物細胞のミクロキャリアー培養システムを確立し、すで
にヒト２倍体線維芽細胞の大量培養化に成功している（
Ｓａｎｏ、Ｅ、、 ｅｔ ａ：、、 Ｃａ１ｌ、 ５
ｔｒｕＣ；、 Ｆｕ＋］ｃ：、、 ’、２゜５０９−５
１７． １９８７）。本ミクロキャリアー培養システム
を用い、血管内皮細胞の増殖と大量培養化を試みたとこ
ろ、細胞増殖および有用生理活性物質の産生には、撹拌
回転数に依存した適切な５ｈｅａｒｓｔｒｅｓｓ （ズ
リ応力）か重要なポイントであることを見い出した。す
なわち、血管内皮細胞をミクロキャリアー上に増殖させ
るとき、および増殖した内皮細胞から生理活性物質を産
生させる際に、ミクロキャリアー培養の撹拌によるズリ
応力を１０〜１３０ ｄｙｎｅ／ｃｎｆ、好ましくは２
０〜１１０ｄｙｎｅ／ｄの範囲にすることである。ここ
で述べたズリ応力は次の方法により求められる。
ズリ応力（ｄ ｙ ｎ ｅ 、、／ ｃｎｆ ）０平均
剪断速度×粘度（ｃｅｎｔｉ−ｐｏｉｓｅ）本発明で好
ましく用いられるミクロキャリアー培養用スピナー培養
ビンを図１に示す。これをマグネティックスターシー上
に置き、回転数を決めて撹拌培養を行なう。平均剪断速
度は、撹拌子先端からビン内壁までの距離（ａ）とビン
の内径（ｂ）、回転数（ｒｐｍ）とから次の式で求める
ことができる。
剪断速度×粘度（ｃｅｎｔｉ−ｐｏｉｓｅ）本発明で好
ましく用いられるミクロキャリアー培養用スピナー培養
ビンを図１に示す。これをマグネティックスターシー上
に置き、回転数を決めて撹拌培養を行なう。平均剪断速
度は、撹拌子先端からビン内壁までの距離（ａ）とビン
の内径（ｂ）、回転数（ｒｐｍ）とから次の式で求める
ことができる。
このとき、培養液の粘度は約１ ｃｅｎｔｉ−ｐｏｉｓ
ｅであるので、平均剪断速度をＣＧＳ単位で表示するこ
とにより、ズリ応力が計算される。
ｅであるので、平均剪断速度をＣＧＳ単位で表示するこ
とにより、ズリ応力が計算される。
本発明に用いるミクロキャリアーは、ジエチルアミノエ
チル基などの化学残基を結合した架橋デキストランビー
ズ、変性コラーゲンを結合させた架橋デキストランビー
ズ、表面に組織培養処理が施されたポリスチレンビーズ
、コラーゲンビーズ、ゼラチンビーズなどであり、好ま
しくは変性コラーゲンをコートした架橋デキストランビ
ーズ、コラーゲンビーズ、ゼラチンビーズなどである。
チル基などの化学残基を結合した架橋デキストランビー
ズ、変性コラーゲンを結合させた架橋デキストランビー
ズ、表面に組織培養処理が施されたポリスチレンビーズ
、コラーゲンビーズ、ゼラチンビーズなどであり、好ま
しくは変性コラーゲンをコートした架橋デキストランビ
ーズ、コラーゲンビーズ、ゼラチンビーズなどである。
血管内皮細胞は、ヒト、ウシ、ブタなどの大動脈や毛細
血管、あるいはヒトａ帯静脈より分離したもの、あるい
は遺伝子組換え法により形質転換された血管内皮細胞な
どが用いられる。
血管、あるいはヒトａ帯静脈より分離したもの、あるい
は遺伝子組換え法により形質転換された血管内皮細胞な
どが用いられる。
血管内皮細胞の培養に用いる培養液は、ウシなどの動物
の血清を５〜２０％添加した細胞培養用培地を用いるが
、好ましくはＭ１９９培地にウシ胎児血清を１０％添加
したものを用いる。
の血清を５〜２０％添加した細胞培養用培地を用いるが
、好ましくはＭ１９９培地にウシ胎児血清を１０％添加
したものを用いる。
生理活性物質の産生は、誘発剤を用いであるいは誘発剤
による刺激なしで行なう。誘発剤を用いる場合は、産生
させる生理活性物質により適宜選択できるか、通常はｐ
ｏｌｙ Ｉ ： ｐｏｌｙｃなどの合成もしくは天然型
ＲＮＡなどの誘発剤、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮ類など
のサイトカイン、あるいはＰＤＧＦ、ＩＧＦ−βなどの
増殖因子、あるいはＰＭＡ、ＰＨＡＸＬＰＳ、コレラ毒
素などが用いられる。
による刺激なしで行なう。誘発剤を用いる場合は、産生
させる生理活性物質により適宜選択できるか、通常はｐ
ｏｌｙ Ｉ ： ｐｏｌｙｃなどの合成もしくは天然型
ＲＮＡなどの誘発剤、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮ類など
のサイトカイン、あるいはＰＤＧＦ、ＩＧＦ−βなどの
増殖因子、あるいはＰＭＡ、ＰＨＡＸＬＰＳ、コレラ毒
素などが用いられる。
ヒト血管内皮細胞の場合には、この他にｂａｓｉｃ−Ｆ
ＧＦ、 ａｃｉｄｉｃ−ＦＧＦ各種腫瘍細胞、正常細胞
、血小板など由来の血管内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）
を添加することか好ましい。
ＧＦ、 ａｃｉｄｉｃ−ＦＧＦ各種腫瘍細胞、正常細胞
、血小板など由来の血管内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）
を添加することか好ましい。
［実 施 例］
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例１
ヒ１１帯静脈より酵素潅流法にて分離した血管内皮細胞
を、コラーゲンコートしたフラスコ中でウシ胎児血清１
０％とＥＣＧＦ活性を含むヒト正常２倍体線維芽細胞の
培養上清２０％を添加したＭ１９９培地で培養し、増殖
させた。０． ３ｗ／ｖ％のゼラチンビーズ（Ｇｅｌｉ
ｂｅａｄ、 Ｆｌａｚｌｅｔｕ）を含む図１に示したス
ピナー培養ビン（５００ｍｌ容量）に上記培養液２００
０１１を入れ、平面培養で増殖させた内皮細胞を１×１
０５／ｍｌになるよう接種した。３７℃で撹拌回転数を
５０〜６００ｒｐｍ （１１〜１２８ ｄｙｎｅ／ｃ
ｒｌ）に設定し、８日間培養してその増殖を調べ、図２
に示した。これより、血管内皮細胞の増殖は、ズリ応力
に依存していることか示された。
を、コラーゲンコートしたフラスコ中でウシ胎児血清１
０％とＥＣＧＦ活性を含むヒト正常２倍体線維芽細胞の
培養上清２０％を添加したＭ１９９培地で培養し、増殖
させた。０． ３ｗ／ｖ％のゼラチンビーズ（Ｇｅｌｉ
ｂｅａｄ、 Ｆｌａｚｌｅｔｕ）を含む図１に示したス
ピナー培養ビン（５００ｍｌ容量）に上記培養液２００
０１１を入れ、平面培養で増殖させた内皮細胞を１×１
０５／ｍｌになるよう接種した。３７℃で撹拌回転数を
５０〜６００ｒｐｍ （１１〜１２８ ｄｙｎｅ／ｃ
ｒｌ）に設定し、８日間培養してその増殖を調べ、図２
に示した。これより、血管内皮細胞の増殖は、ズリ応力
に依存していることか示された。
実施例２
ヒト［帯静脈由来血管内皮細胞を実施例１に準じて平面
培養し、スピナー培養ビンに接種して、３００ ｔｐｍ
（６５ｄｙｎｅ／ｃｆｆｌ）で２日に１度培地交換
を繰り返してコンフルエントまで増殖させた。
培養し、スピナー培養ビンに接種して、３００ ｔｐｍ
（６５ｄｙｎｅ／ｃｆｆｌ）で２日に１度培地交換
を繰り返してコンフルエントまで増殖させた。
増殖飽和に達した細胞を無血清のＭ１９９培地で洗い、
同じ無血清培地を加えて各種回転数（ズリ応力）で２日
間培養し、産生された６ケトプロスタグランデインＦ１
αの量をラジオイムノアッセイ法で測定し、その結果を
図３に示した。これより、血管内皮細胞が特異的に産生
ずる６ケトプロスタグランデインＦ１αの産生は、ズリ
応力に依存して調整されていることかわかる。
同じ無血清培地を加えて各種回転数（ズリ応力）で２日
間培養し、産生された６ケトプロスタグランデインＦ１
αの量をラジオイムノアッセイ法で測定し、その結果を
図３に示した。これより、血管内皮細胞が特異的に産生
ずる６ケトプロスタグランデインＦ１αの産生は、ズリ
応力に依存して調整されていることかわかる。
実施例３
実施例２と同様に実験を行ない、無血清培地中でのイン
ターロイキン−６（ＩＬ−６）の産生量を調べ、図４に
示した。
ターロイキン−６（ＩＬ−６）の産生量を調べ、図４に
示した。
ミクロキャリアー上に増殖した血管内皮細胞をＭ１９９
培地で洗い、Ｏ〜３００ｒｐＩＩＩ （０〜６５ｄ ｙ
ｎ ｅ ／ ｃｒ＆ ）で同無血清培地を用いて培養
し、２〜３日毎にハーベストを繰り返して産生されたＩ
Ｌ−６を酵素免疫測定法を用いて測定した。これより、
Ｉ Ｌ−６の産生も、ズリ応力に依存して産生されるこ
とが明らかとなった。
培地で洗い、Ｏ〜３００ｒｐＩＩＩ （０〜６５ｄ ｙ
ｎ ｅ ／ ｃｒ＆ ）で同無血清培地を用いて培養
し、２〜３日毎にハーベストを繰り返して産生されたＩ
Ｌ−６を酵素免疫測定法を用いて測定した。これより、
Ｉ Ｌ−６の産生も、ズリ応力に依存して産生されるこ
とが明らかとなった。
［発明の効果コ
本発明により、従来困難だった血管内皮細胞の大量培養
を効率良く行なうことができる。したがって、血管内皮
細胞が産生ずる有用な生理活性物質を大量に生産するこ
とができる。
を効率良く行なうことができる。したがって、血管内皮
細胞が産生ずる有用な生理活性物質を大量に生産するこ
とができる。
図１は、本発明で好ましく用いられる培養ビンを示すも
のであり、ａは撹拌子先端からビン内壁までの距離を示
し、ｂは培養ビンの内径を示す。 図２は、実施例１の血管内皮細胞の増殖に及ぼすズリ応
力を示すものである。 図３は、実施例２の血管内皮細胞が産生ずる６ケトプロ
スタグランデインＦ１αの産生量に及ぼすズリ応力の影
響を示すものである。 図４は、実施例３の血管内皮細胞が産生ずるＩＬ−６の
産生量に及ぼすズリ応力の影響を示すものである。 特許出願人 東 し 株 式 会 社図１ ズ寡゛応ブノ （ｔｔｙｎｅ／Ｃｍ２ン 図２ 図３ ズリ応力 （ｄｙｎｅ７ｃｍ２ ） ’−０−３」Ｌ３−５−４ Ｌ ５７二細胞増殖飽
和後の培養日数 図４
のであり、ａは撹拌子先端からビン内壁までの距離を示
し、ｂは培養ビンの内径を示す。 図２は、実施例１の血管内皮細胞の増殖に及ぼすズリ応
力を示すものである。 図３は、実施例２の血管内皮細胞が産生ずる６ケトプロ
スタグランデインＦ１αの産生量に及ぼすズリ応力の影
響を示すものである。 図４は、実施例３の血管内皮細胞が産生ずるＩＬ−６の
産生量に及ぼすズリ応力の影響を示すものである。 特許出願人 東 し 株 式 会 社図１ ズ寡゛応ブノ （ｔｔｙｎｅ／Ｃｍ２ン 図２ 図３ ズリ応力 （ｄｙｎｅ７ｃｍ２ ） ’−０−３」Ｌ３−５−４ Ｌ ５７二細胞増殖飽
和後の培養日数 図４
Claims (1)
- （１）、血管内皮細胞をミクロキャリアー上にて培養す
るに際し、培養液の撹拌によるズリ応力を１０〜１３０
ダイン／ｃｍ＾２の範囲にすることを特徴とする血管内
皮細胞の培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2309892A JP2990789B2 (ja) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | 血管内皮細胞の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2309892A JP2990789B2 (ja) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | 血管内皮細胞の培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04179476A true JPH04179476A (ja) | 1992-06-26 |
| JP2990789B2 JP2990789B2 (ja) | 1999-12-13 |
Family
ID=17998575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2309892A Expired - Fee Related JP2990789B2 (ja) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | 血管内皮細胞の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2990789B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1019489A1 (en) * | 1996-11-20 | 2000-07-19 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Application of shear flow stress to chondrocytes |
| JP2006509502A (ja) * | 2002-12-11 | 2006-03-23 | フェローサン アクティーゼルスカブ | スワブとしてのゼラチンベースの材料 |
-
1990
- 1990-11-14 JP JP2309892A patent/JP2990789B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1019489A1 (en) * | 1996-11-20 | 2000-07-19 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Application of shear flow stress to chondrocytes |
| EP1019489A4 (en) * | 1996-11-20 | 2002-08-28 | Advanced Tissue Sciences Inc | APPLICATION OF SHEAR FLOW STRESS ON CHONDROCYTES |
| JP2006509502A (ja) * | 2002-12-11 | 2006-03-23 | フェローサン アクティーゼルスカブ | スワブとしてのゼラチンベースの材料 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2990789B2 (ja) | 1999-12-13 |
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