CN114181902A - 一种简便、快捷的星形胶质细胞分化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞定向分化技术领域，具体涉及一种星形胶质细胞分化方法。一种简便、快捷的星形胶质细胞分化方法，包括：制备海藻酸盐凝胶基底；在所述海藻酸盐凝胶基底上铺蛋白；将神经干细胞制备成细胞悬液，接种至凝胶基底，培养12小时以上；更换为诱导培养基，每隔24小时换液一次，继续培养三天可获得星形胶质细胞。本发明的方法，缩短干细胞分化周期，提高了星形胶质细胞的分化纯度与效率，更好的为相关研究提供细胞资源。
Description
技术领域
本发明属于干细胞定向分化技术领域，具体涉及一种星形胶质细胞分化方法。
背景技术
星形胶质细胞是中枢神经系统的多功能胶质细胞，参与构成大脑的物理结构，具有支持神经细胞、维持神经元周围离子浓度、免疫调节等重要作用。星形胶质细胞在大脑发育过程中发挥活跃功能，是感觉和认知能力发展的关键。星形胶质细胞可由神经干细胞经诱导分化而来，以神经干细胞的诱导分化作为细胞的来源方式已成为一系列中枢神经系统疾病治疗的一个重要关注点。
目前，由神经干细胞向星形胶质细胞方向的分化方法相对空白且单一，单纯通过添加胎牛血清（FBS）或骨形态发生蛋白4（BMP4）诱导神经干细胞分化获得星形胶质细胞的方法存在分化效率低、产物不纯等问题。由于神经类细胞更适宜生长于柔软基底，现有培养条件的塑料或玻璃培养皿，质地坚硬，对其生长分化可能存在限制。相反，水凝胶材料因其交联网络的存在，具有类似软组织的特性，可为神经类细胞的生长提供较柔软基底。但是基质凝胶（Matrigel）等动物源基底存在价格昂贵、可能引入动物源材料污染以及宗教信仰限制等局限性。因此，需要提出一种基于其他水凝胶材料的、提高星形胶质细胞分化效率的方法。
发明内容
鉴于此，本发明构建了一种基于海藻酸盐凝胶基底的、针对神经干细胞向星形胶质细胞方向的细胞分化平台，具有基底材料价廉易得、生物相容性好，可简便、快捷获得纯度高且分化效果佳的星形胶质等优点。在解决了海藻酸盐凝胶形状不易控制问题的基础上，将其引入到细胞培养体系中，为细胞培养分化提供一个力学可调的基底，其力学调控可来源于刚度、粘弹性等因素，实现神经干细胞向星形胶质细胞的高效分化。
本发明采用的技术方案是：一种简便、快捷的星形胶质细胞分化方法，包括：
制备海藻酸盐凝胶基底；
在所述海藻酸盐凝胶基底上铺蛋白；
将神经干细胞制备成细胞悬液，接种至凝胶基底，培养12小时以上；
更换为诱导培养基，每隔24小时换液一次，继续培养三天可获得星形胶质细胞。
进一步地，海藻酸盐凝胶基底的制备方法包括：
制备浓度为2%（w/v）的海藻酸钠溶液，过滤除菌备用，制备交联液，过滤除菌备用；
于培养皿中加入海藻酸钠溶液，置于-80℃冷冻定型10分钟；于室温加入交联液交联2.5小时，凝胶形成后通过紫外光照射除菌；其中，按培养皿底面积计，海藻酸钠溶液、交联液的体积分别为：45μL/cm2、260μL/cm2。
进一步地，所述的交联液为90 mM的氯化钙和150 mM氯化钠的混合溶液。
进一步地，用含有钙镁离子的PBS溶液配制浓度为10-20μg/ml的层粘连蛋白溶液，加入海藻酸盐凝胶基底表面，于细胞培养箱中过夜；按培养皿底面积计，层粘连蛋白溶液的添加量为：130μL/cm2。
进一步地，接种密度按培养皿底面积计：10000-30000/cm2。
进一步地，所述的诱导培养基为从常规培养液中去除表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，加入5%胎牛血清的培养基。
与现有方法相比，本发明的主要优点包括：
1.缩短干细胞分化周期，提高了星形胶质细胞的分化纯度与效率，更好的为相关研究提供细胞资源。
2.此平台构建方法，成本低廉，操作简便，解决了海藻酸盐凝胶形状不易控制的问题，于孔板中快速获得形貌均一且适于神经类细胞分化的凝胶基底。
3.海洋生物材料的使用与其它动物源生物材料相比，可以避免动物源材料的交叉感染以及宗教信仰的限制，进一步扩展其科学研究或应用范围。
附图说明
图1为本发明实施例的凝胶基底制备及诱导分化流程图；
图2为本发明实施例的海藻酸盐凝胶交联原理示意图；
图3为采用本发明的方法诱导分化的星形胶质细胞谱系标记蛋白S100β、GFAP免疫荧光染色形态图；
图4为采用本发明的方法诱导分化的星形胶质细胞免疫荧光染色统计结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
本实施例提供一种简便、快捷的星形胶质细胞分化方法，该方法流程如图1所示，具体步骤如下：
一、凝胶制备：
1.制备浓度为2%（w/v）的海藻酸钠溶液，过滤除菌备用，制备氯化钙交联液（交联液含有90 mM氯化钙、150 mM氯化钠），过滤除菌备用；
2.以12孔板为例，于孔中加入170μL海藻酸钠溶液，置于-80℃冷冻定型10分钟。如图2所示，采用“界面融化交联”方法，于室温加入1mL交联液交联2.5小时，凝胶形成后通过紫外光照射除菌。
界面融化交联：即将海藻酸钠溶液冷冻定型后，于上层加入交联液使两者发生交联的方式。因海藻酸钠与交联液交联反应迅速，当室温的交联液与冷冻的海藻酸钠接触时，使得冷冻层表面融化且立即与交联液反应，形成凝胶层。同时交联液中钙离子可以透过表层凝胶进入下层，随着海藻酸钠溶液的解冻完成后续交联反应，从而形成均一且表面平整的凝胶。此种方式解决了海藻酸盐凝胶形状不易控制的问题，可使海藻酸盐直接于孔板中发生交联，获得形貌均一且适于细胞生长的凝胶基底。
二、细胞分化诱导：
1.铺蛋白：用含有钙镁离子的PBS溶液配制浓度为20μg/ml的层粘连蛋白溶液，以12孔板为例，加入0.5毫升蛋白溶液，于细胞培养箱中过夜。
2.细胞传代：将神经干细胞经细胞消化液处理，离心后弃上清，使用神经干细胞常规培养液（含表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等）悬浮细胞，按照26000个/cm²的接种密度传代至海藻酸钠凝胶基底。
3.分化诱导：神经干细胞传代12小时后，从常规培养液中去除表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，加入5%胎牛血清，每隔24小时换液一次，继续培养三天可获得星形胶质细胞。
采用本发明的方法诱导分化的星形胶质细胞的形态：
将采用本发明的方法诱导分化的星形胶质细胞对谱系标记蛋白S100β、GFAP进行免疫荧光染色，其结果如图3所示。图为不同视野范围下（比例尺30μm、50μm）S100β与GFAP的标记蛋白染色，可通过其荧光的表达鉴定星形胶质细胞以及显示出细胞的分化形态。染色发现，细胞表现出典型的星形胶质细胞形态，且具有很强的荧光亮度。
采用本发明的方法诱导分化的星形胶质细胞的分化率：
实验组：采用本发明的方法，将神经干细胞传代至铺蛋白的海藻酸盐凝胶基底，在含有生长因子的培养液中贴壁，之后撤去生长因子加入5%的胎牛血清诱导分化三天。
对照组：采用常规方法，将神经干细胞传代至铺蛋白的塑料孔板，在含有生长因子的培养液中贴壁，之后撤去生长因子加入5%的胎牛血清诱导分化三天。
分化三天后进行细胞固定染色，使用Image J进行荧光强度分析。通过总荧光强度/细胞数目计算得到单个细胞的荧光表达量，实验组与对照组相比有显著区别，如图4所示，表明本发明提供的方法，能够显著提高星形胶质细胞分化率。
Claims (6)
1.一种简便、快捷的星形胶质细胞分化方法，其特征在于，包括：
制备海藻酸盐凝胶基底；
在所述海藻酸盐凝胶基底上铺蛋白；
将神经干细胞制备成细胞悬液，接种至凝胶基底，培养12小时以上；
更换为诱导培养基，每隔24小时换液一次，继续培养三天可获得星形胶质细胞。
2.根据权利要求1所述的简便、快捷的星形胶质细胞分化方法，其特征在于，海藻酸盐凝胶基底的制备方法包括：
制备浓度为2%（w/v）的海藻酸钠溶液，过滤除菌备用，制备交联液，过滤除菌备用；
于培养皿中加入海藻酸钠溶液，置于-80℃冷冻定型10分钟；
于室温加入交联液交联2.5小时，凝胶形成后通过紫外光照射除菌；其中，按培养皿底面积计，海藻酸钠溶液、交联液的体积分别为：45μL/cm2、260μL/cm2。
3.根据权利要求2所述的简便、快捷的星形胶质细胞分化方法，其特征在于，所述的交联液为90 mM氯化钙和150 mM氯化钠的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的简便、快捷的星形胶质细胞分化方法，其特征在于，用含有钙镁离子的PBS溶液配制浓度为10-20μg/ml的层粘连蛋白溶液，加入海藻酸盐凝胶基底表面，于细胞培养箱中过夜；按培养皿底面积计，层粘连蛋白溶液的添加量为：130μL/cm2。
5.根据权利要求1所述的简便、快捷的星形胶质细胞分化方法，其特征在于，接种密度按培养皿底面积计：10000-30000/cm2。
6.根据权利要求1所述的简便、快捷的星形胶质细胞分化方法，其特征在于，所述的诱导培养基为从常规培养液中去除表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，加入5%胎牛血清的培养基。
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| CN108865997A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-11-23 | 华南师范大学 | 一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法 |
| KR102255066B1 (ko) * | 2020-02-18 | 2021-05-24 | 중앙대학교 산학협력단 | 3’-메톡시플라본을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 성상세포로의 분화 유도용 조성물 |
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2021
- 2021-11-05 CN CN202111304987.2A patent/CN114181902B/zh active Active
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