JPH04135499A - 遺伝子検出方法 - Google Patents
遺伝子検出方法Info
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- JPH04135499A JPH04135499A JP25901590A JP25901590A JPH04135499A JP H04135499 A JPH04135499 A JP H04135499A JP 25901590 A JP25901590 A JP 25901590A JP 25901590 A JP25901590 A JP 25901590A JP H04135499 A JPH04135499 A JP H04135499A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の目的〕
（産業上の利用分野）
この発明は、試料中に存在する特定の遺伝子を特異的に
検出する遺伝子検出方法に関する。
検出する遺伝子検出方法に関する。
（従来の技術）
遺伝子（ＤＮＡ）にコードされた遺伝情報はメツセンジ
ャーＲＮＡを介して酵素等のタンパク質として表現され
、これらのタンパク質の働きにより生成した様々な化合
物の集合体として生物が存在する。このような遺伝子の
総数はヒトで５〜１０万といわれているか、その中に何
らかの異常や変化（例えば、欠損、重複等）が生じるこ
とかある。
ャーＲＮＡを介して酵素等のタンパク質として表現され
、これらのタンパク質の働きにより生成した様々な化合
物の集合体として生物が存在する。このような遺伝子の
総数はヒトで５〜１０万といわれているか、その中に何
らかの異常や変化（例えば、欠損、重複等）が生じるこ
とかある。
その場合には、生成するタンパク質の特性、種類、量な
どが変化し、その結果、生体系のバランスが崩れて疾病
を引き起こす。したかって、逆に、病因となっている遺
伝子を検出することにより、疾病の同定や予防が可能と
なる。近年の遺伝子工学の進歩に伴い、このような遺伝
子そのものに基づく診断（遺伝子診断と呼ばれている）
が可能になってきた。
どが変化し、その結果、生体系のバランスが崩れて疾病
を引き起こす。したかって、逆に、病因となっている遺
伝子を検出することにより、疾病の同定や予防が可能と
なる。近年の遺伝子工学の進歩に伴い、このような遺伝
子そのものに基づく診断（遺伝子診断と呼ばれている）
が可能になってきた。
遺伝子発現の機構を考えると、生化学的レベルでのほと
んどの変化に先行して遺伝子上での変化が生じているこ
とが推定される。したかって、遺伝子診断により、病気
という表現型での変化に先立つ（すなわち、発症前や病
気の潜伏期あるいは極めて初期の）診断や予測が可能と
なる。
んどの変化に先行して遺伝子上での変化が生じているこ
とが推定される。したかって、遺伝子診断により、病気
という表現型での変化に先立つ（すなわち、発症前や病
気の潜伏期あるいは極めて初期の）診断や予測が可能と
なる。
また、生体内の細胞の遺伝子は全て同一であるので、遺
伝性の疾患に関しては分析の対象となる臓器や組織は特
定されない。特に、胎児に関しては、妊婦から羊水を採
取して羊水中に浮遊している胎児の細胞を調べるだけで
診断することができ、非常に重要な診断方法である。
伝性の疾患に関しては分析の対象となる臓器や組織は特
定されない。特に、胎児に関しては、妊婦から羊水を採
取して羊水中に浮遊している胎児の細胞を調べるだけで
診断することができ、非常に重要な診断方法である。
一般に、遺伝子の検出は次のように行なわれる。
まず、試料から遺伝子を抽出し、必要があれば適当な制
限酵素で切断する。次に、この遺伝子を電気泳動にかけ
、その後サザンプロットを行なう。
限酵素で切断する。次に、この遺伝子を電気泳動にかけ
、その後サザンプロットを行なう。
次いで、目的とする遺伝子に対応する遺伝子プローブ（
通常は、放射性同位元素で標識されている）をハイブリ
ダイズさせた後、低温でオートラジオグラフィーにかけ
てＸ線フィルム上で目的とする遺伝子の有無を確認する
。
通常は、放射性同位元素で標識されている）をハイブリ
ダイズさせた後、低温でオートラジオグラフィーにかけ
てＸ線フィルム上で目的とする遺伝子の有無を確認する
。
このような方法では、通常、プローブの標識は放射性同
位元素を用いて行われている。しかし、放射性同位元素
を用いた場合には検出場所か限定され、試薬の取扱いに
も十分な注意を必要とする。
位元素を用いて行われている。しかし、放射性同位元素
を用いた場合には検出場所か限定され、試薬の取扱いに
も十分な注意を必要とする。
このため、放射性同位元素に代わる安全な標識剤の開発
が試みられており、既に、アビジン−ビオチン結合を利
用するもの、酵素や蛍光物質を利用するものなどが開発
されている。
が試みられており、既に、アビジン−ビオチン結合を利
用するもの、酵素や蛍光物質を利用するものなどが開発
されている。
（発明が解決しようとする課題）
しかしながら、上記方法では、遺伝子の検出までに少な
くとも ２〜３日を要し、測定操作もかなり複雑である
。
くとも ２〜３日を要し、測定操作もかなり複雑である
。
したがって、この発明は、短時間で結果を得ることがで
きる、簡便かつ高感度の遺伝子検出方法を提供すること
を目的とする。
きる、簡便かつ高感度の遺伝子検出方法を提供すること
を目的とする。
（課題を解決するための手段）
本発明者は、上記事情を考慮の上鋭意研究を続けた結果
、従来必要であるとされた被検試料からの遺伝子の抽出
工程を必要としない遺伝子の検出方法を見出した。すな
わち、この発明の遺伝子検出方法は、 被検試料から特定の塩基配列を有する遺伝子を検出する
方法であって、 被検試料にタンパク分解酵素を作用させて被検試料の除
タンパクを行なう工程と、 除タンパク後の被検試料に制限酵素を作用させて遺伝子
の特異的切断を行なう工程と、切断した遺伝子を変性し
て一本鎖に解離させる工程と、 を具備することを特徴とする。
、従来必要であるとされた被検試料からの遺伝子の抽出
工程を必要としない遺伝子の検出方法を見出した。すな
わち、この発明の遺伝子検出方法は、 被検試料から特定の塩基配列を有する遺伝子を検出する
方法であって、 被検試料にタンパク分解酵素を作用させて被検試料の除
タンパクを行なう工程と、 除タンパク後の被検試料に制限酵素を作用させて遺伝子
の特異的切断を行なう工程と、切断した遺伝子を変性し
て一本鎖に解離させる工程と、 を具備することを特徴とする。
生体においては、通常、遺伝子は種々のタンパク質によ
って覆われている。このため、従来の遺伝子検出方法で
は、被検試料から遺伝子のみを抽出し、得られた遺伝子
を用いて検出を行なっている。これに対して、この発明
においては、被検試料にタンパク分解酵素を作用させて
タンパク質のみを分解することにより除タンパクを行な
う。ここて用いられるタンパク分解酵素としては、特に
限定されるものではなく、公知のどのようなタンパク分
解酵素でも用いることができる。なお、この除タンパク
の際に、リボヌクレアーゼを同時に添加してＲＮＡの分
解を行なうこともできる。これにより、不要のＲＮＡが
除去され、遺伝子の検出の精度かさらに向上する。さら
に、この除タンバクの際には、反応溶液をゆっくりと撹
拌することが好ましい。
って覆われている。このため、従来の遺伝子検出方法で
は、被検試料から遺伝子のみを抽出し、得られた遺伝子
を用いて検出を行なっている。これに対して、この発明
においては、被検試料にタンパク分解酵素を作用させて
タンパク質のみを分解することにより除タンパクを行な
う。ここて用いられるタンパク分解酵素としては、特に
限定されるものではなく、公知のどのようなタンパク分
解酵素でも用いることができる。なお、この除タンパク
の際に、リボヌクレアーゼを同時に添加してＲＮＡの分
解を行なうこともできる。これにより、不要のＲＮＡが
除去され、遺伝子の検出の精度かさらに向上する。さら
に、この除タンバクの際には、反応溶液をゆっくりと撹
拌することが好ましい。
被検試料の除タンパクに続いて、通常の方法で制限酵素
を作用させて遺伝子を特異的に切断する。
を作用させて遺伝子を特異的に切断する。
切断した遺伝子は、その変性温度以上に加熱するなどし
て変性し、−水路に解離させる。遺伝子を変性させるた
めに加熱した場合には、変性後急冷する。
て変性し、−水路に解離させる。遺伝子を変性させるた
めに加熱した場合には、変性後急冷する。
遺伝子の変性後、このように−水路に解離した遺伝子を
用いて、公知の方法によって目的とする遺伝子の検出を
行なうことができる。その際、固定化用担体を添加して
一本鎖に解離した遺伝子の固定化を行なうことが好まし
い。固定化は、公知の固定化用担体を用い、公知の条件
に従って行なうことかできるが、固定化用担体としてマ
グネタイトを用いることにより、以後の分離操作をより
容易に行うことが可能となる。ここで、マグネタイトと
は、磁性粒子をポリスチレン等の担体で覆った粒子を指
す。固定化用担体は、遺伝子の変性の際に共存させるで
もよく、また変性後に添加することもできる。
用いて、公知の方法によって目的とする遺伝子の検出を
行なうことができる。その際、固定化用担体を添加して
一本鎖に解離した遺伝子の固定化を行なうことが好まし
い。固定化は、公知の固定化用担体を用い、公知の条件
に従って行なうことかできるが、固定化用担体としてマ
グネタイトを用いることにより、以後の分離操作をより
容易に行うことが可能となる。ここで、マグネタイトと
は、磁性粒子をポリスチレン等の担体で覆った粒子を指
す。固定化用担体は、遺伝子の変性の際に共存させるで
もよく、また変性後に添加することもできる。
１」的とする遺伝子の検出は、例えば、次のように行な
うことができる。まず、固定化した一本鎖の遺伝子に、
標識した遺伝子プローブを添加してハイブリダイズさせ
る。次いで、洗浄して未反応のプローブを除去した後、
使用した標識剤に適した方法で標識剤の検出を行なう。
うことができる。まず、固定化した一本鎖の遺伝子に、
標識した遺伝子プローブを添加してハイブリダイズさせ
る。次いで、洗浄して未反応のプローブを除去した後、
使用した標識剤に適した方法で標識剤の検出を行なう。
なお、必要であれば、洗浄に先立って遺伝子と固定化用
担体とを分離することもできる。ここで、遺伝子プロー
ブは、検出しようとする遺伝子と相補的な塩基配列を有
しており、被検試料中に検出しようとする遺伝子が含ま
れる場合にのみハイブリダイゼーションが起こる。した
がって、未反応のプローブを除去した後、プローブに標
識した標識剤を検出することにより、被検試料中の検出
しようとする遺伝子の有無を判定することができる。
担体とを分離することもできる。ここで、遺伝子プロー
ブは、検出しようとする遺伝子と相補的な塩基配列を有
しており、被検試料中に検出しようとする遺伝子が含ま
れる場合にのみハイブリダイゼーションが起こる。した
がって、未反応のプローブを除去した後、プローブに標
識した標識剤を検出することにより、被検試料中の検出
しようとする遺伝子の有無を判定することができる。
（作用）
前述のように、従来の遺伝子検出方法においては、まず
被検試料から遺伝子を抽出し、この遺伝子を以後の操作
に用いている。したがって、すでにこの段階で複数の繁
雑な工程を経なければならない。これに対して、この発
明の遺伝子検出方法では、被検試料にタンパク分解酵素
を直接作用させて除タンパクを行なっている。この場合
、タンパクの分解生成物を除去する必要はなく、次工程
を連続して行なうことが可能である。すなわち、繁雑な
分離・洗浄操作等を省略することが可能となる。
被検試料から遺伝子を抽出し、この遺伝子を以後の操作
に用いている。したがって、すでにこの段階で複数の繁
雑な工程を経なければならない。これに対して、この発
明の遺伝子検出方法では、被検試料にタンパク分解酵素
を直接作用させて除タンパクを行なっている。この場合
、タンパクの分解生成物を除去する必要はなく、次工程
を連続して行なうことが可能である。すなわち、繁雑な
分離・洗浄操作等を省略することが可能となる。
（実施例）
以下、この発明の詳細な説明する。
実施例１ ヒト血清中のＨＢＶ遺伝子の検出肝炎患者７
人および正常人３人からそれぞれ採取した血液試料を用
いて、以下の手順で肝炎ウィルス（ＨＢ Ｖ）の検出を
行なった。
人および正常人３人からそれぞれ採取した血液試料を用
いて、以下の手順で肝炎ウィルス（ＨＢ Ｖ）の検出を
行なった。
まず、被検試料となる血液１−から、４°Ｃにおいて、
３０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより白
血球を分離し、得られた白血球を水冷下でテフロンホモ
ジナイザーを用いて３分間ホモジナイズした。次いで、
ホモジナイズした白血球に、■％ＳＤＳの存在下でｉｎ
＋ｇのプロテイナーゼＫを添加し、３７℃で約１時間ゆ
っくり撹拌することにより除タンパクを行なった。ゆっ
くり撹拌するのは、反応効率を向上させるためである。
３０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより白
血球を分離し、得られた白血球を水冷下でテフロンホモ
ジナイザーを用いて３分間ホモジナイズした。次いで、
ホモジナイズした白血球に、■％ＳＤＳの存在下でｉｎ
＋ｇのプロテイナーゼＫを添加し、３７℃で約１時間ゆ
っくり撹拌することにより除タンパクを行なった。ゆっ
くり撹拌するのは、反応効率を向上させるためである。
この際、不要のＲＮＡを分解するために、反応液中に最
終濃度が１１００Ｉ１／ｌｌｌｌ７となるようにリボヌ
クレアーゼを添加した。
終濃度が１１００Ｉ１／ｌｌｌｌ７となるようにリボヌ
クレアーゼを添加した。
次に、反応液を９０°Ｃで５分間加熱し、被検試料遺伝
子を変性して一本鎖に解離した後、２０℃まで急冷した
。その後、この反応液に予め活性化した遺伝子固定化用
磁性微粒子ＬＯｍｇを添加し、変性した遺伝子を固定化
した。次いで、予め一本鎖に変性したビオチン標識ＨＢ
Ｖ遺伝子プローブ１０ＩＩｇを添加し、５０℃で１時間
穏やかに撹拌して固定化した遺伝子とハイブリダイゼー
ションさせた。ハイブリダイゼーション後の反応液から
、磁石を用いて担体である磁性微粒子を分離し、緩衝液
で十分に洗浄した。この洗浄後の磁性微粒子に、５００
倍希釈のβ−ガラクトシダーゼ標識ヤギ抗ビオチン抗体
を反応させ、再び緩衝液で洗浄した。
子を変性して一本鎖に解離した後、２０℃まで急冷した
。その後、この反応液に予め活性化した遺伝子固定化用
磁性微粒子ＬＯｍｇを添加し、変性した遺伝子を固定化
した。次いで、予め一本鎖に変性したビオチン標識ＨＢ
Ｖ遺伝子プローブ１０ＩＩｇを添加し、５０℃で１時間
穏やかに撹拌して固定化した遺伝子とハイブリダイゼー
ションさせた。ハイブリダイゼーション後の反応液から
、磁石を用いて担体である磁性微粒子を分離し、緩衝液
で十分に洗浄した。この洗浄後の磁性微粒子に、５００
倍希釈のβ−ガラクトシダーゼ標識ヤギ抗ビオチン抗体
を反応させ、再び緩衝液で洗浄した。
洗浄後、基質溶液を添加し、３７℃で３０分間インキュ
ベートした後、４１５ ｎｍにおける吸光度を測定した
。結果を第１表に示す。
ベートした後、４１５ ｎｍにおける吸光度を測定した
。結果を第１表に示す。
第１表
表中、＃１〜７は肝炎患者、＃８〜１０は正常人由来の
血液試料の結果を示している。この表から明らかなよう
に、正常人由来の血液試料からは４５０ｎｍにおける吸
光はほとんど見られず、肝炎患者由来の血液試料のみか
らＨＶＢ遺伝子が検出された。
血液試料の結果を示している。この表から明らかなよう
に、正常人由来の血液試料からは４５０ｎｍにおける吸
光はほとんど見られず、肝炎患者由来の血液試料のみか
らＨＶＢ遺伝子が検出された。
また、標準のＨＢＶ遺伝子を用いて上記と同様の操作を
行ない、この発明の遺伝子検出方法の検出感度を検定し
たところ、ＤＮＡの量が１ ｐｇ径程度ある場合から検
出が可能であった。これは、放射性同位元素で標識した
プローブを用いる従来の方法とほぼ同程度の感度である
。
行ない、この発明の遺伝子検出方法の検出感度を検定し
たところ、ＤＮＡの量が１ ｐｇ径程度ある場合から検
出が可能であった。これは、放射性同位元素で標識した
プローブを用いる従来の方法とほぼ同程度の感度である
。
以上のように、この発明によれば、従来行なわれている
繁雑な工程を省略して、より簡便に、かつ短時間に結果
を得ることが可能な高感度の遺伝子検出方法が提供され
る。
繁雑な工程を省略して、より簡便に、かつ短時間に結果
を得ることが可能な高感度の遺伝子検出方法が提供され
る。
Claims (1)
- （１）被検試料から特定の塩基配列を有する遺伝子を検
出する方法であって、 被検試料にタンパク分解酵素を作用させて被検試料の除
タンパクを行なう工程と、 除タンパク後の被検試料に制限酵素を作用させて遺伝子
の特異的切断を行なう工程と、 切断した遺伝子を変性して一本鎖に解離させる工程と、 を具備することを特徴とする遺伝子検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25901590A JPH04135499A (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | 遺伝子検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25901590A JPH04135499A (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | 遺伝子検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04135499A true JPH04135499A (ja) | 1992-05-08 |
Family
ID=17328166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25901590A Pending JPH04135499A (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | 遺伝子検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04135499A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004101730A1 (en) * | 2003-05-19 | 2004-11-25 | Tsinghua University | Microparticle based biochip systems and uses thereof |
-
1990
- 1990-09-28 JP JP25901590A patent/JPH04135499A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004101730A1 (en) * | 2003-05-19 | 2004-11-25 | Tsinghua University | Microparticle based biochip systems and uses thereof |
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