JPH04135497A - 疎水性核酸プローブを用いた遺伝子検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子を特異的に検
出するための遺伝子検出方法に関する。

（従来の技術） 遺伝子（ＤＮＡ）に刻み込まれた遺伝情報は、メツセン
ジャーＲＮＡを介して蛋白質あるいは酵素として表現さ
れる。この蛋白質や酵素の働きにより、生命の維持に必
要な様々な化合物の生合成および代謝が行われる。この
ように、遺伝子に支配された多様な物質の動的平衡系と
して、生物が存在しているわけである。

ヒトの遺伝子の総数は５〜１０万といわれている。これ
ら遺伝子の中に、例えば欠損や重複のような何等かの異
常や変化が生じると、生成される蛋白質の特性、種類お
よび量などが変化し、結果として生体系のバランスが崩
れて疾病を引き起こすことになる。従って、逆に病因と
なる既知の遺伝子を検出することによって、疾患の同定
や予防が可能である。このような遺伝子そのものに基づ
く診断は、近年の遺伝子工学の進歩によって可能となっ
たもので、遺伝子診断と呼ばれている。

従来の診断法と比較して、遺伝子診断には次のような幾
つかの特色がある。

遺伝子発現の機構を考えると、殆どの生化学レベルでの
変化に先行して、遺伝子上での変化が生じていることが
推定される。従って、遺伝子変化の検出による遺伝子診
断では、病気という表現型での変化に先だって、即ち、
発症前や病気の潜伏期あるいは極めて初期の段階で、診
断や予測ができる。これが第一の特色である。第二の特
色は、生体内の細胞では遺伝子は全て同一であるので、
遺伝性の疾患に関する遺伝子診断法は、分析する臓器や
組織に依存しないことである。このことは、特に胎児で
の診断では重要である。即ち、この特色によって、妊婦
から羊水を採取し、羊水中に浮遊している胎児の細胞を
調べるだけで診断を行うことが可能となる。

一般的な遺伝子診断法において、従来用いられている遺
伝子検出法の手順を略記すれば次の通りである。

まず、試料から遺伝子を抽出し、必要があれば適当な制
限酵素で切断した後、電気泳動およびサザンプロットを
行なう。次に、目的とする遺伝子に対して相補的な塩基
配列を有する核酸プローブ（通常は、放射性同位元素で
ラベルされている）を、プロットされた遺伝子とハイブ
リダイスさせる。続いて、低温でＸ線フィルムに感光さ
せることによりハイブリダイズされた核酸プローブを検
出し、目的とする遺伝子の存在を確認する。

この従来の検出法では、核酸プローブをハイブリダイズ
させた後、未反応の核酸プローブを除去する操作が必ず
必要とされ、これが操作を繁雑なものにしている。この
点を改善するために、プローブを固相に固定化する方法
や、均一系での反応システムが考案されているが、何れ
の場合も感度が低い等、未解決の問題が多く残されてい
るのが現状である。

（発明の解決しようとする課題） 本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、その課題は
、安全性および簡便性に優れると共に、短時間かつ高感
度で目的とする遺伝子の有無を検出することができる遺
伝子検出方法を提供することである。

［発明の構成コ （課題を解決するための手段） 本発明は、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基
配列を有する一本鎖の核酸プローブを一本鎖に変性した
遺伝子サンプルに添加した後、遺伝子とハイブリダイズ
された前記核酸プローブを検出することによって前記目
的遺伝子の存在を確認する遺伝子検出法において、前記
核酸プローブとして、該プローブの構成部分である核酸
の糖、燐酸および／または塩基に疎水性物質を挿入或い
は結合させることにより調製した疎水性核酸プローブを
用いることを特徴とするものである。

核酸は本来親水性であるが、あえて疎水基を導入した疎
水性核酸プローブを利用すれば、反応を均一系で行なう
ことができ、且つ未反応のプローブの除去が容易になる
。即ち、疎水性溶媒で処理するのみて未反応のプローブ
を除去することが可能となる。本発明者はこの点に着目
し、本発明に到達したものである。

本発明において用いる疎水性物質または疎水性官能基は
とくに限定されるものではないが、その−例としては、
例えばＣ１゜〜Ｃ３０の長鎖アルキル基が挙げられる。

疎水性基の導入部位、ハイブリダイズの際に塩基対間の
水素結合形成を不能にしない限り、該プローブの構成部
分である核酸の糖、燐酸および／または塩基の何れの位
置であっても良い。また、プローブを十分に疎水化でき
る範囲であれば、疎水性基の導入個数は特に限定されな
いが、プローブの１塩基当たり１個の疎水性基を導入す
るのが好ましい。

本発明において、核酸プローブの標識にはビオチン、ハ
プテン、蛍光物質、放射性同位元素等を用いることがで
きる。しかし、これらに限定されるものではなく、化学
的または物理的手段によって検出可能な標識物質であれ
ばどの様なものでも使用できる。

本発明の適用対象であるで核酸試料は、従来法に従って
抽出する。この核酸試料液を９８°Ｃで熱変性し、７０
℃に冷却した後、疎水性核酸プローブとハイブリダイズ
させる。このとき疎水性核酸プロ−ブをリポソーム等の
有機溶媒に溶解する同相に固定化しておくとハイブリダ
イゼーション反応を効率よく進行させることができる。

形成された遺伝子／プローブのハイブリッドは、一般に
ＤＮＡ断片はプローブよりも長いため、全体として親水
性となる。従って、反応後に、試料液を疎水性溶媒で処
理すると、未反応の疎水性プローブは疎水性溶媒中に抽
出されることになり、水溶液中から除去される。一方、
目的遺伝子とハイブリダイズされたプロニブは水溶液中
に止まるから、核酸試料中の目的遺伝子を検出すること
ができる。

（作用） 上記のように、本発明による遺伝子検出方法では、疎水
性溶媒処理のみで未反応プローブの除去が行なうことが
できる。従って、従来の方法に比較して未反応プローブ
の除去操作が簡略化され、そのための時間も大幅に短縮
されるから、簡便かつ短時間で遺伝子の検出が可能にな
る。

（実施例） 以下に、本発明による遺伝子検出法の実施例を説明する
。

実施例１：疎水性プローブを用いた 遺伝子検出法 核酸プローブとしてｖ−ｍｙｃ　（１，５Ｋｂ）を選択
し、その燐酸の部分にＦＩＴＣて標識した長鎖アルキル
基（ＣＩ８Ｈ３７）を結合させてプローブを疎水性にし
た。こうして得られた疎水性プローブを、リポソーム（
ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン；コレ
ステロール＝１　：　１）と混合することにより、リポ
ソーム上に固定化した。

核酸の抽出は従来法に従って行なった。得られたサンプ
ル溶液を９８℃で熱変性させた後、７０℃に冷却した。

このサンプル溶液に、先に調製した核酸プローブ固定化
リポソームを加え、１５分間ノ１イブリダイゼーション
反応を行なった。反応後、溶液をクロロホルムで処理し
てリポソームを溶解することにより、未反応のプローブ
をクロロホルム中に除去した。目的遺伝子とハイブリダ
イズしたプローブは水溶液中に残り、従って水溶液中の
蛍光強度を測定することにより目的遺伝子の定量を行な
うことができた。

この実施例では、疎水性核酸プローブを用いた結果、遺
伝子検出までの時間を従来の方法に比べて３０分程度短
縮することができた。

〔発明の効果〕

以上詳述したように、本発明によれば核酸プロブを用い
た遺伝子検出を簡便かつ短時間で行うことができる。従
って、本発明は遺伝子診断法や遺伝子工学の分野等、特
定の遺伝子を検出する際の方法として極めて有用である
。

出願人代理人　弁理士　鈴江武彦

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列
   を有する一本鎖の核酸プローブを一本鎖に変性された遺
   伝子サンプルに添加した後、遺伝子とハイブリダイズさ
   れた前記核酸プローブを検出することによって前記目的
   遺伝子の存在を確認する遺伝子検出法において、前記核
   酸プローブとして、該プローブの構成部分である核酸の
   糖、燐酸および／または塩基に疎水性物質を挿入或いは
   結合させることにより調製した疎水性核酸プローブを用
   いることを特徴とする遺伝子検出方法。