JPH0387185A - ヒト免疫グロブリン遺伝子関連ｄｎａ断片及び該ｄｎａ断片を用いる診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、免疫学、遺伝学、全生学、血液学、癌研究等
の分野で、ｆ等動物より哨乳動物などの高等動物までの
免疫グロブリンあるいはＴ細胞レセプターを生産する動
物類における、なかでもヒトにおける免疫グロブリンあ
るいはＴｉＷＩＩ胞レセプターの産生に関与する新たな
りＮＡ断片に関する。

本発明のこれらＤＮＡ断片の、各種細胞からのクローニ
ング及び構造決定による免疫グロブリンあるいはＴ細胞
レセプターの多様な反応性の遺伝子レベルでの解析・実
証を行なうことにより、これらＤＮＡ断片に含まれる遺
伝子の発現過程を利用して、多様な抗原特異性を持つ免
疫グロブリンを各種生産する技術の確立に必要な情報が
提供され得る。

更に、本発明は、前記のこれら特定のＤＮＡ断片を含む
固有のＤＮＡ断片を腫瘍マーカーとして用いるＢ細胞系
あるいはＴ細胞系腫瘍細胞の検出法、ずなわちリンパ系
ＩＩ！Ｔ！瘍、白血病πφの診断方法も提供する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］免疫化
学、細胞免疫学、免疫遺伝学の進展により、動物の生産
する抗体分子（免疫グロブリン）については、以下のよ
うな事実が明らかとされている（参考文献１：後述の参
考文献リストにその詳細を示す）。

免疫グロブリン（Ｉｇ）は、２本の同一な重鎮（Ｈ３ｎ
　）および軽釦（Ｌ釦）からできている。Ｈ釦、Ｌ鎖は
構造および機能上、２つの領域に分かれており、定常（
不変）領域（Ｃ領域）と呼ばれる一定した一次構造を持
つＣ末端側に位置する領域と、可変領域（Ｖ領域）と呼
ばれるＮ末端より約１１０アミノ酸残基の領域とがあり
、■領域が抗原結合領域に相当する。

抗体の抗原結合能力の多様性は、■領域のアミノ酸−次
配列の相違で説明され、即ち対応する遺伝子のＤＮＡ塩
基配列の相違に起因する。

Ｈ鎖及びＬ鎖のＶ領域のアミノ酸の多様性について、Ｎ
末端からの距離とアミノ酸の変異度との相関からみると
、■領域全体として高い変異度があるが、その中でもと
りわけ多様性に富んでいる場所が、それぞれ３個所に集
中している。それは、ｒｇのＶ領域の立体構造に４３い
てβシート構造を形作るポリペプチドＩＩと■の間、■
と■の間及び■と■の間の３個所であり、Ｈ，Ｌ両頭で
計６個所となる。これらの個所が抗原結合部位をポケッ
ト状に形成するので、相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｏｍ
Ｃｎｌ、ａｒｉｌ、ｙ　ｄＣｌ、ｃｒｍｉｎｇｒＣｇｉ
ｏｎ　；ＣＤ　Ｒ）と呼ばれている。

そして、これら３個所はそれぞれＣＤＲＩ、ＣＤＲＩｌ
、、ＣＤＲｍと呼ばれる。

この中でＨｍｌのＣＤＲｍはとりわけ多様性に富んでお
り、このＶ領域部分が、多種類の抗原結合能を有するこ
とと密接に関連している。

２０種類のアミノ酸のうち、比較的βシート構造をつく
りやすいアミノ酸は、システィン、フェニルアラニン、
インロイシン、ロイシン、メチオニン、クルクミン、ス
レオニン、バリン、トリプトファン、チロシンの１０種
類である。

他方１ｇＨ鎖遺伝子の全構成はＨ鎖Ｖ　（ｖａｒｉａｂ
ｌｅ）領域（ＶＯ）遣イ云子、Ｈ釦Ｄ　（ｄｉｖｃｒｓ
ｉｌ、ｙ、分岐）領＠（Ｄ＋＋）遺伝子、Ｈ釦Ｊ　（ｊ
ｏｉｎｉｎｇＭｌ’ｉ合）領域（ＪＨ）遺伝子及びＣ領
域遺伝子のｊ噴で成り立っている。

Ｉｇ遺伝子は、Ｂリンパ球系細棒に特異的に発現する遺
伝子で、その発現はＢｗＩ胞の分化・成熟の過程にとも
なって調節・制御される。

すなわち、これら遺伝子は２種類のＤＮＡ再配列を行な
い、１つはＶＨＤｏｔ　　ＪＨ結合で、これにより完全
な活姓型Ｖ遺イム子が形成される。いまｔつは、Ｈ鎖り
ラススイツヂのためのＤ　Ｎ　Ａ　４１ｆ編成である。

胎児型遺伝子配列の中で分散していたＨ　６１遺伝子は
、幹細胞からＢ細胞へ分化する過程で、まず１つのＤＨ
遺伝子断片と１つのＪ、遺伝子断片が、その間のシグナ
ルへブタマー、シグナルノナマー、スペーサーを含むイ
ントロン部分の欠失をともなって結合し、次にこのＤＪ
ｉ！ｉ合断片が１つのＶ１１断片と結合し、ＶＤＪとい
う遺伝子配列をもつ活性型の■遺伝子が形成される。

このＩｇＨ＆ＪＩ遺伝子り領域に存在するＤＨ遺伝子が
、Ｈ釦ＣＤＲＩ［Ｉをコートする遺伝子てあり、同一の
ファミリーに属する胎児型り、遺伝子は、規則的な間隔
て、マウスでは５キロ塩基対（ｋｂ）（参考文献２）、
ヒトでは９ｋｂ（参考文献３）ととに繰り返しコードさ
れている。

しかしながら、ヒトＤ領域におけるＤｏｉｆｔ伝子の分
布、存在様式については、十分で詳細にわたる検討は未
だ行なわれていなかったのが現状であり、わずか５ｉｃ
ｂｃｎｌｉｓｌらが−に記の報告（参考文ｉ１３　）　
−Ｃ２ツ（７）Ｄ＋＋　Ｊ（云’／）７　ミ’）　　（
Ｄ目ｏｒ、２、ＤＩ、。）を同定していたにすぎない。

そこで、本発明者らの一人は、既にマウスの胎児型Ｉ）
ｕ遺伝子を１２個同定し、３つのファミリーに分類した
（参考文献２）が、引き続き本発明者らはヒトＤ　Ｈｆ
ａ域ゲノムについても詳細に検討し、９ｋｂ単位の中に
、５つの異なるＤＨ遺伝子（ＤＭ＋遺伝子、ＤＬＲ１、
遺伝子、Ｄ　ＸＰＩ遺伝子、ＤＸｌｌ・１遺伝子及びＤ
ＮＩ遺伝子）を同定したく参考文献４）。

Ｄｌ、遺伝子領域は、抗体分子の各種抗原に対する多様
な反応性を、Ｖ　１１遺伝子領域、Ｊ＋＋遺伝子領域と
ともに規定しており、これら３つの遺伝子の結合の組み
合せから、１個の生体は１０６〜１０８種類の抗体分子
をつくり得るとされてる。

他方、Ｔ細胞レセプター、特にβ鎖、δ鎖の遺伝子のＶ
ＤＪ結合の多様な組合せ、そして抗原に対する多様な反
応性も免疫グンロブリンと同様に解明されてきている。

このように多様な抗原に対して、Ｂ細胞系細胞あるいは
Ｔ細胞系細胞が分化し、その分化過程で抗体あるいはＴ
細胞レセプターの各遺伝子間で再編成が起き、多様な抗
体あるいはＴ細胞レセプターを泥土するメカニズムの大
筋は明らかにされたが、その実体については未解決の問
題も多く、そのメカニズムを利用した多様な抗体等の人
為的な生産の研究は未だ行なわれていなかった。

本発明者らは、ＣＲＤｍの抗原結合能の多様性の決定に
特別深く関与しているＤＨ遺伝子領域の全貌を明らかに
し、多種多様な抗体を作製する手段を開発する道を切り
開くことにつなげたいと考えた。

すなわち、更により多くのり。遺伝子をクロー　０ ニングし、そのヌクレオチド配列を明らかにし、特定の
部位のアミノ酸を種々変えたＩｇを人工的に調製するた
めに、それらＤＩ４遺伝子を使用することを企画した。

従来における抗体生産の研究は、特定の抗原に対するポ
リクローナル抗体、モノクローナル抗体を必要にせまら
れ調製している場合がほとんどすべてであったが、本発
明者らの方法は、従来における研究とは逆に、あらかし
め様々な抗体を人二［的に作製しておき、しかる後に、
これまで未検討の抗原あるいは新たに出現してきた抗原
に対応する抗体を、それらの中から探索・スクリーニン
グしていくという方法である。

本発明の目的は、Ｉｇの産生調節機構の解明及び新たに
人工的なＩｇの生産に有用な細胞生物学上、また医学的
に、更に医療産業上の応用に極めて有用な技術を提供す
ることにある。

例えば、各種ＤＨ遺伝子の詳細なヌクレオチド配列と各
種り、□遺伝子のスクリーニングや同定に有用なプロー
ブを提供することにある。

１を 更に、本発明は、前記の各種Ｄｌｌ遺伝子ＤＮＡ断片を
含む固有のＤＮＡ断片を腫瘍マーカーとして用いるＢ細
胞系あるいはＴ細胞系腫瘍細胞の検出法、すなわちリン
パ系腫瘍、白血病等の診断方法も提供する。

［課題を解決するための手段］ 本発明のＤＮＡ断片は、ＤＩ＋遺伝子ファミリーＤＡ、
ＤＫ及びＤＩ＋（に属するＤＩ４遺伝子の１以上を少な
くとも含むことを特徴とする。

このＤＮＡ断片は、各種り。遺伝子のスクリーニングや
同定などのプローブとして、あるいは特定の部位のアミ
ノ酸を種々変えたＩｇを人工的に調製するための各種遺
伝子工学的操作に用いる遺伝子配列として有用である。

以下、本発明のＤＮＡ断片について、ＤＸＰ４ＸＰ＋遺
伝子４遺伝子、ＤＫ４遺伝子、ＤＮ４遺伝子、Ｄ　ＩＲ
，遺伝子、Ｄ、遺伝子、ＤＬＲＩ遺伝子、Ｄ　ＸＰ＋遺
伝子、ＤＸＰ１遺伝子、ＤＡ＋遺伝子、ＤＫ＋遺伝子、
ＤＮ１遺伝子、ＤＩＲ２遺伝子及びＤＭ２遺伝子を含む
１５ｋｂからなるＤＮＡ断片を代表例として　２ 詳細に説明する。

なお、１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片中に見い出される遺伝子
ファミリーＤＡ、ＤＫ及びＤＩＲに属するＤ　＋１遺伝
子、すなわち、ＤＡに属するＤＡ４遺伝子、ＤＡ１遺伝
子；Ｄにに属するＤＫ４遺伝子、ＤＫ＋遣イ云子：ＤＩ
Ｈに属するＤ　ＩＲ＋　、　Ｄ　ＩＲ２は、その存在及
び具体的なりＮＡ配列か本発明者らによって初めて特定
されたものである。

先に述べたようにＤｌ、遺伝子領域（多数のＤ１１遺伝
子が配列された領域）には、同一ファミリーに属するり
。遺伝子か９ｋｂ間隔で繰り返されていることが知られ
ており、本発明者らにより同定された上記のＤ　Ｈ遺伝
子と同一ファミリーに屈するＤ　Ｈ遺伝子か該１５ｋｂ
Ｄ　Ｎ　Ａ断片領域以外のり、遺伝子領域にも存在する
（このことは後述の実施例の結果によっても支持されて
いる）。

従って、上記１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片以外のＤｌ、遺伝
子領域中にある遺伝子ファミリーＤＡ　、ＤＫ、ＤＩＲ
に属するＤｌｌ遺伝子もまた本発明に含まれるものであ
る。

話１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片領域のヒト胎児型ＤＮＡでの
存在位置を第１図に模式的に示す。

該１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片領域は、前述の５ｉｅｂｅｎ
ｌ　ｉｓｔらの報告（参考文献３）にあるＤｌに対応す
るり、、Ｒ□の上流及び下流部分に相当し、９ｋｂから
なるＤｌ、８．を含むその上流部分な■とし、下流部分
を■とし、同一ファミリーのＤＨ遺伝子が対応するよう
分割して示した。即ち、■のＤ　Ｎ　Ａ　鎖の３′末端
に、■のＤＮＡ鎖の５′末端が連結している。

■のＤＮＡ鎖と■のＤＮＡ鎖の間に引いた線は、両頭を
比較して挿入あるいは欠失がある部分を示す。

なお、ＲＥ’及びＲＥ２で示された領域は１６ｂｐの繰
り返しを示す。また、ＥはＥｃｏＲＩ切断部位、ＢはＢ
ａｍＨＩ切断部位、Ｈは旧ｎｄｍ切断部位をそれぞれ示
す。Ｅ９は、クローニングのために人工的にマニアチス
らにより導入されたＥｃｏＲＩ切断部位である。

従って、該１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片から所望の部位を含
　４ む小断片を得るには、これらの制限酵素切断部（＋′Ｌ
が好適に利用できる。

上述の本発明の１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片および各Ｄ　１
＋遺伝子は、遺伝子工学を利用した人工的な各種抗体の
調製等、これらＤＮＡ断片の機能な柿々の用途に使用す
る際の原料として、また後に説明する本発明者らによる
新たな知見を確認するための、あるいは免疫グロブリン
生産調節機構の更なる解明のために利用する試薬として
有用である。

これら本発明の１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片および各Ｄ　Ｈ
遺伝子は、例えばヒト免疫グロブリン重鎮遺伝子を適当
な制限酵素で処理して断片化し、これを適当なベクター
に結合して、ＤＮＡライブラリーを作製し、その中から
所望の遺伝子を含むクローンを選択する方法により作製
できる。また、Ｉ）ｕ遺伝子は、１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断
片からの再クローニングや化学的合成法で調製できる。

このＤＮＡライブラリーの作製には、クローニングに広
く用いられている各種のプラスミドやフファージからな
るベクターを用いることができ５ る。

以下、ベクターとして入−ファージ由来のベクターを用
いる場合について述べる。

まず、ヒト免疫グロブリン重鎮遺伝子を有する適当な造
血細胞のＤＮＡを常法により調製し、これを適当な制限
酵素で処理し、得られたＤＮＡ断片をＧｈａｒｏｎ　４
　へベクター等のλ−ファージ由来のベクターに結合さ
せて、ＤＮＡファージライブラリーを作製する。

次に、このＤＮＡファージライブラリーから適当なり　
Ｈ遺伝子スクリーニング用のプローブとハイブリダイズ
する組換え体を、プラークハイビリダイゼーション等の
方法により選別する。

選別された、クローンが所望の遺伝子を含んでいるかど
うかは、その制限酵素地図を作製したり、ヌクレオチド
配列を分析することにより確認できる。

なお、」二連のＤＮＡファージライブラリーとしては、
例えばマニアチス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔ、ｉｓ）のヒトＤ
ＮＡファージライブラリー（参考文献５）が利　６ 用できる。

なお、このスクリーニングには、例えば、１１ｃｎＬｏ
ｎ−Ｄａｖｉｓ法（参老文献６）などが利用できる。

なお、λ−ファージ由来のベクターに所望の遺伝子を組
み込んで作製したクローンは、適当な細菌を宿主として
増殖させて、種々の用途に用いることができる。

マニアチスのヒトＤＮＡファージライブラリーのように
、Ｃｈａｒｏｎ　４　Ａベクターを用いた場合は、宿主
として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
　ＤＰ　５０、Ｅ、ｃｏｌｉ　８０３　［例えば、　Ｋ
、Ｍｕｒｒａｙ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　　Ｅｄ
ｉｎｂｕｒｇｈ）等から人手できるコ、　Ｅ、ｃｏｌｉ
　Ｋ１２　　Ｘ　　１７７８　　　（八Ｔ１’Ｃ３］２
４４）　　、　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ　　８０２　　（
八’Ｉ’　Ｔ　Ｃ３３５２６）、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＬＥ　
３９２　（ＡＴＴに　３３５７２）、Ｅ、ｃｏｌｉＭＭ
　２９ｄ　　（ＡＴＴｏ　３３６２５）　　、　ｆｉ、
ｃｏｌｉ　ＭＭ２１　　（ＡＴＴ（：３３６７８）など
が利用できる。これらの中では、旦、ｃｏｌｉ　８０３
が好ましい。

上記１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を含むクローンは、例えば
、上記マニアチスのヒトＤＮＡファージライブ　７ ラリ−から、Ｒａｖｅｔｃｈらが取り出したＤＩｌ−Ｊ
Ｈプローブ（参考文献１０）を用いて、前述のＢｅｎｔ
ｏｎ−Ｄａｖｉｓ法（参考文献６）によって単離するこ
とができる。

なお、後述の実施例１でマニアチスのヒトＤＮＡファー
ジライブラリーから分離された第１図の１５ｋｂＤ　Ｎ
　Ａ断片を含むりＯ−ン（Ｂａｃｔｅｒｉｏ−ｐｈａｇ
ｅ、　［，１ｏｎｅ　ＨＩＤ−３）は、ＮＧＩＭＢ　（
ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉａ；　　ＰＯＢｏｘ　　３］、　　１３５　　Ａｂｂ
ｅｙｏａｄ、　　Ａｂｅｒｄｅｅｎ八Ｂ９　８Ｄへ。

５ｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫ　）にブタベスト条約に基づい
て寄託されており、その寄託口及び寄託番号は以下のと
おりである。

寄託口：昭和６３年（１９８９）　２月２７日寄託番号
：　ＮＣＩＢ　　４０１２２ また、該１５ｋｂ断片中の各Ｄ　１１遺伝子を個々に、
適当なベクター中に組み込んだクローンは、常法に従っ
て各り。遺伝子の上流及び下流にある適当な制限酵素切
断部位を利用して、これらを切り出　８ してクローン化することによって得ることもできる。

該クローン化に、Ｃｈａｒｏｎ　４　へベクターを用い
た場合は、宿主として−１−記の大腸菌が利用てきる。

また、プラスミドヘクターを用いたクローンとしては、
例えば、後述の実施例２で得られたプラスミドｐＰＤＸ
Ｐ　　（Ｄ　ｘｐ＋遺伝子を含む）、プラスミドｐＤＡ
　　（Ｄ　Ａ４遺伝子を含む）、プラスミドｐＤＫ（Ｄ
ＫＩ遺伝子を含む）、プラスミドｐＤＮ　　（Ｄ　Ｎ４
遺伝子を含む）、プラスミドｐＤＭ（ＤＭ２遺伝子を含
む〉、プラスミドｐＤＬＲ（Ｄ　＋、ｎ＋遺伝子を含む
）等を辛げろことかてきる。

なお、これらプラスミドｐＰＤＸＰを有する大腸菌ＭＶ
］］８４は昭和６３年１２月１５日付で、ブタベスト条
約にｊ、（ついて工業技術院微生物工業技術研究所［茨
城県つくば車乗１　”−Ｊ−［１１番３号（郵便番号３
０５　）　］に寄託され、各寄託番号は次のとおりであ
る。

大腸菌ｐＰＤＸＰ　　（プラスミドｐｐｏｘｐを有すル
）＝　９ ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２１９３ 大腸菌ｐＤＡ　　（プラスミドｐＤＡを有する）：ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−２１８８ 大腸菌ｐＤＫ　　（プラスミドｐＤＫを有する）：ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−２１８９ 大腸菌ｐＤＭ　　（プラスミドｐＤＭを有する）：ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−２１９１ 大腸菌ｐＤＮ　　（プラスミドｐＤＮを有する）：ＦＡ
ＲＭ　ＨＰ−２１９２ 大腸菌ｐＤＬＲ（プラスミドｐＤＬＲを有する）：ＦＥ
ＲＭ　　ＨＰ−２１９０ この１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片の塩基配列は第２図に示す
とおりである。

第２図において、シグナルヘプタマー、シグナルノナマ
一部分に下線が引かれ、オーブンリープ′イングフレー
ム（Ｄ１１コード領域）には太い下線が引かれている。

また、典型的なりＨコード領域の隣接領域のなか以外の
領域にも１５個のＣへＧ　（八／Ｔ）　ＧＴＧ領域が存
在し、そこにも下線が引いである。

０ それらのうちの１つで、ＤＭ遺伝子の上流に位置するヘ
プタマーはシグナルノナマーにより取り囲まれている。

第１図の初めの９ｋｂ領域■には、６個の異なるＤ　Ｈ
遺伝子が同定された。すなわち、　５′Ｄｘｐ４−（］
０６１ｂｐ）−ＤＡ４−（８８９ｂｐ）−Ｄｋ＜−（１
７７３ｂｐ）Ｄ　Ｈ４−（１：１Ｏｂｐ）−Ｄ　Ｍ＋−
（２６１０ｂｐ）−Ｄ　ＬＲ＋−：］’である。

ＤｘｐとＤｌ、１１の間には特徴的な＋６ｂｐの繰り返
し配列が存在し、これらは２１回繰り返され、該繰り返
し部分の共通配列は、（Ｉ：’「ＧＧ（Ｇ／八）　Ｃ（
Ｃ／下）　Ｔ　（Ｃ／八）ＡＣ（Ｃ／下）　ＴＧ　（Ａ
／Ｇ）である（なお、「／」は「または」を意味する）
。また、ＤＸＩ＋４の上流には同し１ｌｉｂｐ配列が１
７回繰り返されている。

軍１図の■領域の次の！］　ｋ　ｂ領域の前゛ｒ部分■
には、Ｉ）ｘｒ’遺伝子を含むＤＮＡ断片が重複化して
おり、Ｄ　ｘｐ＋　とＤｘｐ・１が存在する。

この■領域でのＤ　Ｈ遺伝子の配列順序は、　５′Ｄ　
ｘｐ＋　−（９７ｂＩ’）−Ｄ　ｘｐ・＋−（８０４ｂ
ｐ）−Ｄ　Ａ＋−（８８４ｂｐ）Ｄｋ、−（１４２６ｂ
ｐ）−ＤＮ＋−（４３０ｂｐ）−ＤＭ□−３′であ２す る。

なお、ＤＬＲ２は、まだ本発明者らの配列決定はそこま
で到達していないが、前に挙げた５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ
らの報告（参考文献３）のとおりに存在しているはずで
ある。

また、第１図■部分と■部分での繰り返し配列を対比す
ると、４つの大きな欠失及び押入部分が存在し、それら
は■（２５６ｂｐ）　、■（８５９ｂｐ）　、［相］（
４９９ｂｐ）　、■（１６ｂｐ）で表示された部分（四
角で囲んだり、塗りつぶした３角の印がついている）で
ある（第１図にも対応する部分を示しである）。

更に、０部分と０部分では、点変異や１〜３ヌクレオチ
ドの欠失、挿入のような僅かの相違の存在も認められた
（後述の表１）。

ＤＬＲＩの上流領域のＤＸＰ４遺伝子は、ＤＬＲＩの下
流領域において局所的に重複化されＤ　ＸＰＩ遺伝子及
びＩ）ｘｐ・１遺伝子となっている。

先に挙げた参考文献４の報告で、相同的配列の（１１：
ＡＣＡＧ　（Ｃｈ）　ＣＧＴＣ，ＣＧ　（Ｃ／下）にお
ける不平等交差（乗り換えｃｒｏｓｓ　ｉｎｇ−ｏｖｅ
ｒ）が生じるであろうという仮　２ 説は、上記の事実によって確証された。

以−１＝第１図および第２図で説明したように、本発明
者らがクローン化した１５ｋｂ断片中に新たに３つのＤ
Ｈ遺伝子ファミリーが見い出されたことから、Ｄ１１遺
伝子領域中に存在するＤ１□遺伝子の総数は約３０と見
積ることができる。

すなわち、５ｉｃｂｅｎｌｉｓｔら（参考文献３）は、
４個り５、Ｒ遺伝子ファミリーに属するＤｌ−＋ａ伝子
がヒトのゲノム」−で９ｋｂの間隔で直列にコードされ
ていると報告している。最近、Ｍａｔｓｕｄａら（参考
文献７）は、Ｖ、遺伝子領域の中に更に１つのＤＬＲ遺
伝子（Ｄｌ、ｎｓ）を同定した。Ｂｕｌｕｗｅｌら（参
考文献８）もまた、Ｄ　Ｈ遺伝子の犬及び小クラスター
の構成の特性を記述した。

なお、本発明の１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片は、これら公表
論文のＤＬＲ４の３′側よりＤＬＲ２の５′側までの部
分に相当するものである。

木発明者らは、実施例３においてＤＩ＋遺伝子の総数を
見積るために、第１図に示すような異なるファミリーに
属するＤｌ＋遺伝子を個々にそれぞれ　３ 含む６つのプローブ（第１図中の−で示された部分のＤ
ＮＡ断片をそれぞれ含むクローン）を調製し、これらの
プローブをイ吏用した、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲ■及びＨ
ｉ　ｎ　ｄ　ｍでそれぞれ消化処理したヒト胎盤ＤＮＡ
のササーンハイブリダイゼーションを行なった。

ＤＬＲプローブは、ＢａｍＨＩ消化物では１８．７，２
．６．５．２．２及び１．９ｋｂに相当する位置に５つ
のバンドを同定したが、これは上述の参考文献３での報
告とほぼ同じであった。Ｄ　ｘｐプローブは、ＢａｍＨ
Ｉ消化物では２０．７，２．６．５．４．４及び３．７
ｋｂに相当する位置に５つのハンドを同定した。回様に
、ＤＡ、ＤＫ及びＤＭプローブは上記３種の異なる制限
酵素の１種で５つのバンドを同定した。

このことは、これら５つのＤ　Ｉ４遺伝子ファミリー（
ＤＬＲ，Ｄ、ｐ、ＤＡ　、ＤＫ及びＤＭ）はすべて５つ
のメンバーより構成されていることを示す。

なお、ＤＮプローブでは、上記３種全ての制限酵素にお
ける消化物で３つのバンドしか同定され　４ ていないが、これは９ｋｂの繰り返しのヌクレオチド配
列が繰り返し領域間で良く似ているので、１つのバンド
が２つ以上のり、遺伝子を含んでいたために生じた可能
性がある。また、これに加えて、大きなりＮＡ断片もま
た、２つ以上のＤＩ１ｍ伝子を含んでいる可能性もある
かもしれない。

これらプローブのそれぞれの大きさは、はぼ５００ヌク
レオチド長であるが、プローブでカバーされる領域中に
制限酵素切断部位があるため、あるプローブが１個のＤ
ｕ遺伝子に対し２個のバンドを同定する可能性もある。

すなわち、これらの要因によりサザーンハイプリダイゼ
ーションによるＤＨ遺伝子の数の見積りは妨害を受る可
能セＩ：がある。

しかしながら、それぞれのプローブはＤＮプローブを除
き３種の制限酵素に３〜５のバンドを同定したので、５
つの９ｋｂ間隔を置いた繰り返しがそれぞれ６種のＤ　
Ｈ遺伝子ファミリーを含んでおり、Ｄ　Ｈ遺伝子の総数
がほぼ３０であるということはほぼ間違いない。

５ 一方、第４図に示すように、Ｌ記１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断
片中の各Ｄ□遺伝子は７つのＤＨ遺伝子のファミリーに
分類された。

各Ｄ　Ｈ遺伝子は図示するように１２ヌクレオチドスペ
ーサーで分離されたシグナル　ヘプタマーとノナマー（
下線が引かれている）にその両側が取り囲まれている。

Ｄ　１．ｌｌｌ　−Ｄ　’１．１１．Ｉは１）ｆ１°述
の５ｉｃｂＣｎｌｉｓｌらの報１ｚ（参考文献３）で公
表されたものである。

ところが、本発明者らの分析では、Ｄ　ＬＲ＋のほぼ中
央部は、ＡＡではなくＧＧであった。これは本発明者ら
による新たな知見である。

また、ＤＬＲ５は参考文献９に、Ｄ、イ。５２は参考文
献１０）に報告されたものである。

第４図の比較結果かられかるように、同一り。

遺伝子ファミリーに属するＤ　Ｈ遺伝子間でシグナルヘ
プタマーは良く保存されている。ただし、ＤＭ２の５′
側でＣＡＣ八ＧへＧの代りにＣへＣへＧＣＧが見つかり
、ＤＡ＋の５′側でＴＧＣＴＧＴＧが見つかった。

これに対し、シフナルノナマーは比較的に共通　６ ノナマー（ＧＧＴＴＴＴＴＧＴまたは八（：へへへへへ
［；［：　）から分岐していた。

この現象は、ｒｇおよびＴ細胞レセプター（Ｔｉｌｅ）
遺伝子（＃考文献１１）の別のシグナル領域の中に船釣
に見られる。

なお、マウスの１２個のり、□遺伝子は３つのファミリ
ー（ＤＳ＋’２　、ＤＦＬＩｌｉ及びＤｏｒ、２）に分
類された（参考文献２）。

最大のファミリーのＤｓｐ□はＴへＣＴへＴＧＧＴ配列
を中心領域に含んでいる。また、一番頻繁に使用される
ＤＩ＋遺伝子のＤＦＬＩｆｉ、ＩはＴへＣＴへＣＧＧＴ
配列を含んでいる。ＤｓＰ２ファミリーはＴｙｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｙ　。

Ｔｈｒ−Ｍｅｔ　、　Ｌｅｕ−Ｔｒｐをコードし得るも
のであり、またＤ　ＦＬＩｆｉ、　＋はＴｙｒ−Ｔｙｒ
−Ｇａｙ　、　Ｔｈｒ−Ｔｈｒ　、Ｌｅｕ八ｒへをコー
ドシ得るものである。

ところで、マウス体細胞Ｄ　Ｈ配列の大多数はＴｙｒ−
Ｔｙｒ−Ｇｌｙを含んでいる（参考文献１２）。

このことは、マウスでは３通りのオーブンリーディング
フレームの中の１つが主に使用されていることを示唆し
ている。

７ これに反して、ヒトでは第５図に示すように、３通りの
オーブンリーディングフレームがすべて等しく使われて
いる。

なお、第５図の１５個の体細胞型ＤＨ遺伝子の配列は参
考文献４に公表されたものである。また、第５図に要約
されているヌクレオチド配列の他にも、多数のヒト体細
胞型ＤＨ領域のアミノ酸配列が報告されている（参考文
献１２）。

これらは第６図に示すように２つの組み合せ、すなわち
同一アミノ酸からなるＲＯＭとＬＡＹ、及び同一アミノ
酸配列［ＲＰＰＷＲＦＴ（八ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｒｐ−八ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ　］を含むＭＣＥとＮＺ
Ｕを除いては完全に分岐している。

その他のアミノ酸配列は、３アミノ酸以上の長さの配列
相同性を有していない。

次に、体細胞型ＤＩ４のアミノ酸配列と、第４図のヌク
レオチド配列から決めた胎児型ＤＨのアミノ酸配列とが
以下のように比較された。

３通りのオーブンリーディングフレームはすべて読み出
されことができると仮定して、４つの７８ ミノ酸の内で３つのアミノ酸が一致する例、あるいは４
つのより多いアミノ酸が一致する例が探された。

これらの判断基準を体細胞型Ｄ□の胎児型Ｄ１１への帰
属に採用した理由は、偶然の一致のために３つのアミノ
酸が一致することはほぼ起こり得ないといえるからであ
る。見かけ上のアミノ酸配列はこれらの間で非常に異な
っているが、第６図に示すように１９個の体細胞型Ｄ　
Ｈ配列は胎児型り。

遺伝子のどれか１つに帰属された。

なお第６図において、体細胞型ＤＨ遺伝子配列は参考文
献１２に報告されているものであり、胎児型ＤＨ遺伝子
配列は第２図のヌクレオチド配列から決定されたもので
ある。なお、共通のアミノ酸部分には下線が引かれてい
る。第６図において各アルファベットは以下に示１−ア
ミノ酸を表す。

Ａ　：　八Ｉａ　　　　Ｃ：　　Ｃｙｓ　　　　Ｄ　　
：　Ａｓｐ　　　　Ｅ　　：　　ＧｌｕＦ：Ｐｈｅ　　
Ｇ：ＧＩｙ　　Ｈ：ｔ（ｉｓ　　Ｉ　：ＩＩｅＫ　　：
　　Ｌｙｓ　　　　Ｌ　　：　　Ｌｅｕ　　　　Ｍ　　
：　　Ｍｅｔ、　　　　Ｎ　　：　　八ｓｎＰ　　：　
　Ｐｒｏ　　　　Ｑ　　：　　Ｇｌｎ　　　　Ｒ：　　
八ｒｇ　　　　Ｓ　　：　　Ｓｅｒ９ Ｔ　　：　Ｔｈｒ　　　Ｖ　　：　Ｖａｌ　　　Ｗ　：
　Ｔｒｐ　　　Ｙ　　：　ＴｙｒＭＣＥとＮＺＵで見ら
れた異なる体細胞型り。

配列中の同一配列の存在は、これらがＴｄＴによる無秩
序なヌクレオチド挿入の産物ではなくて、胎児型配列の
中にコードされていることを示している。

ＲＰＰＷＲをコードしていると予測されるヌクレオチド
配列はＧＣに富んでいる。これらはＤＩＲ領域にコード
されているようである。

１５個の公表された体細胞型Ｄ□配列は、すべてＤＮＡ
配列レベルでは胎児型ＤＩＩ遺伝子またはＤＩＲ遺伝子
のどれかに帰属されているので（第５図）、本発明の１
５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片に含まれる７種のＤ　Ｈ遺伝子フ
ァミリーとは異なる多くの他のＤＨ遺伝子が残っている
可能性は少ないと考えられる。

第６図中でこれまでに決めた胎ｙｌＲ型ＤＩｌ逍イ云子
に帰属できない体細胞型ＤＨ遺伝子は、６種のＤＩ＋遺
伝子ファミリーに属する別のＤＩ＋遺伝子に　０ 由来するのかもしれないし、また配列の分岐は体細胞突
然変異により更に拡大しているのかもしれない。

従って、ヒトＩｇＨ釦のＣＤＲｍ領域中の大きな多様性
は、限られた数の胎児型Ｉ）＋＋逍遺伝北よび体細胞突
然変異により作られたということはもっとなことである
。

これらの結果は、ＩｇＨ鎖の体細胞Ｄ　Ｉ＋配列が、マ
ウスとヒトでは木質的に同じ機構で作られており、Ｖ　
ｏ−Ｄ　ｏ−Ｊ□槽構造中体細胞Ｄ□領域の中心部が各
々唯一のＤ　Ｈ遺伝子から山未していることを示してい
る。

（以下余白） 方、Ｄ、遺伝子の進化については以下のような仮説が立
てられている。

５ａｋａｎｏらにより■及びＣドメインをコードするＤ
ＮＡ断片は、おそらく原始的遺伝子の多重化により牛じ
たものであろうとの推論がなされ（参考文献１０、更に
、５ａｋａｎｏ　（参考文献１３）らは先祖のＶコート
ＤＮＡ断片は連続していたが、抑大断片（ＩＳ）様ＤＮ
Ａ要素かこの先祖Ｖ遺伝子の中に挿入されＶとＪ遺伝子
という２つの部分に分けられたと提唱した。

そこで推定−ヒのＩｓ様Ｄ　Ｎ　Ａ　鰻素の両端には、
１２汝び２３ヌクレオチドスペーサーシグナルの存在を
仮定し、また同様のＩｓ様断片がさらにもう一度Ｊ遺伝
子の５′端の近くに挿入され、ＤとＪＪ伝子に分けられ
たのではないかと考えられる。

ＩｇやＴＣＲ遺伝子部位におけるスペーサーの長さの規
則性はこの仮説により説明される。

更にこのＩｓ様ＤＮＡ断片はどちら向きにも挿入された
であろう。

　２ 実際、ツノザメのＩｇＨ鎖遺伝子部位で見られるＤ　Ｈ
遺伝子は５′側に１２ヌクレオチドスペーサーシグナル
を、また３′側に２３ヌクレオチドスベーサーシクナル
を含んでいる（参考文献］５） このＩｓ仮説が正しいならば、Ｊ　Ｈ遺伝子領域の近く
に位置するＤ　Ｉ（。５２が最初に進化したり、遺伝子
であるは１′である。

そこで、他のＤ　Ｈ遺伝子はＤｌｌ　０　ｌｉ　２遺伝
子から由来しているのだろうかという疑問が出てくる。

しかしながら、シフナル領域における突然変異頻度の程
度が介在領域におけるよりもわずかに低いにも拘らず、
これら６つの異なるＤＨ遺伝子が四−の原始ＤＨ遺伝子
より由来しているというのはありそうもないことである
。ＤＨ遺伝子の本質的機能は分岐性を創造することなの
で、通常の蛋白質をコードする遺イ五子のようにＤｕ遺
伝子のヌクレオチド配列を保持するような進化−Ｌの選
択圧力が秤イＦするのは理屈にあわない。機能を持たな
いＩ）ｕ遺伝子の創造は生存能力にはなんの影響も及　
３ さないのかもしれない。

Ａｋｉｒａら（参考文献１１）は、スペーサーの長さと
同じヘプタマーやノナマー配列が組み換えに木質的であ
り、スペーサー領域におけるヌクレオチド配列は重要で
はないということを示した。

しかしなから、Ｉｃｈｉｈａｒａらが指摘しいているよ
うに（参考文献４）、シグナルノナマーやヘプタマー配
列ばかりではなくスペーサー領域もまた一般的に回分式
（パリンドローム的）である。

この特徴は突然変異の結果ではありえず、ＤＩ＋遺伝子
の起源の反映であると考え得る。

以−ヒの推論や仮説に対して、本発明において得られた
新たな知見は、次のような新たな実証への手かがりを提
供する。

第７図は、本発明の１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片中にある新
規なりＩＲ遺遺伝ソファミリ−属する不規則スペーサー
シグナルを含むＤＨ遺伝子の概要である。

第７図（ａ）に示されるように、ＤＭ遺（ｉ子のＬ流に
ＣＡ［；へＧＴＧ配列が在している。このヘプタマーは
シグナルノナマー様配列により両側を取り　４ 囲まれている。］゛と八は、それぞれＧ　Ｇ　ｉ”Ｉ下
１”Ｉ’　Ｇ　’Ｉ’−及びＡＣＡＡＡＡＡ（１ニ一様
配列を示している。上側の配列（Ｄ　＋＋＋、−ＤＭ＋
）は第１図の触初の９ｋｂ鎮域■のＩに、また下側の配
列（Ｄ　ＩＲ２−Ｄ　Ｍ２）は第１図の■に続＜　９ｋ
ｂ領域の前半領域■中に存在する。

これらのＤＩＲ遺伝子間で相違しているヌクレオチドに
は点が付されている。胎児型Ｄ□配列のどれにも帰属で
きなかった２つの体細胞型Ｄ　Ｉ４配列（ＨＩＧＩと３
３３）は、これら領域と配列相同性を有している。この
ＨＩＧＩの体細胞型り、１配列は相補性配列を有してお
り、また３３３の体細胞型ＤＨ配列はＤＩＲ遺伝子領域
と同じ方向で相同性を示している。コロン（＝）は体細
胞型ＤＨ遺伝子と胎児型ＤＩＲ遺伝子の間で一致してい
る、あるいは相補性のあるヌクレオチドを示している。

この体細胞ＤＨ配列データは、ＨＩＧＩについては参考
文献１６カら、３３３については参考文献１７より引用
した。

更に第７図（ｂ）に示すようにＤＩＲ領域は、両　５ 側を１２及び３２メクレオチドスベーサーで隔てられた
シグナルヘプタマー及びノナマーにより挟まれている。

白抜き四角はＧＧＴＴＴＴＴＧＴ−およびへＣＡＡＡＡ
ＡＣＣ−様配列を示す。黒塗り四角はシグナルヘプタマ
ー配列を示す。推定上のＤ　Ｈ遺伝子はシグナルヘプタ
マー（黒塗り三角）及びノナマー（白抜き二角）ではさ
まれた白抜き粋で示した。ヘプタマーとノナマーの間の
数字はスペーサーの長さを示す。

このＤＩｌｔ逍伝了ファミリーか新たに固定されたこと
で、以下のような事項が示唆され得る。

参考文献４には、ＧとＣ残基に富むＨＩＧＩおよび３３
３細胞の体細胞Ｄ□配列に対応するもうつの胎児型ＤＩ
４遺伝子が予言されている。

しかし、をでに同定されていた１７個の胎児型り、遺伝
子は、これと配列相同性を示さず、更にマウスにおいて
さえ、ＧとＣ残基に富む体細胞型り、配列のいくつかは
１２個の胎児型Ｄ　Ｈ断片のどれとも相同性を示さない
（参考文献２）。

ＡｌｔとＢａｌｔｉｍｏｒｅ　　（参考文献１８）は、
Ｎ領域の　６ 分岐に末端転移酵素の関与を提案した際に、Ｎ領域には
ＧＣに富む配列が高頻度で現れることと末端転移酵素が
ｄＧＣ残基選択しやすいことを強調した。

このような胎児型り。遺伝子のどれにも帰属されなかっ
たＧＣに富む体細胞型ＤＩ、配列において、胎児型り、
１遺伝子によりコードされている領域はおそらくエクソ
ヌクレアーゼ活性により除かれているのであろうと考え
られる。

これに対し、本発明者らは第７図（ａ）に示すように、
ＤＭ遺伝子の上流に、配列がＨＩＧＩＤ□配列に相補的
（１８／２］ヌクレオチド）で、かつ３３３細胞のＤＨ
配列と相同的な（１６７２３ヌクレオチド）ＤＮＡ領域
を発見した。このＤＮＡ９Ａ域を取り囲む領域は上述の
ようにいくつかのシグナルヘプタマーとノナマーを含ん
でいる。第７図（ｂ）にはその位置とスペーサー長が図
解的に示されている。

このＤＴｌ＋遺伝子ファミリーにおける５′端のヘプタ
マーとＤＭ遺伝子のヘプタマーとの間の距離７ ばかなり長い（１２７または１５１）にも拘らず、これ
ら領域は両端を１２及び２３ヌクレオチドスベサーシグ
ナルの両者により取り囲まれているこことがわかる。

このＤＩ＋？領域は欠失または逆位によりＤ　ＩＲ−Ｄ
、結合に関与している可能性がある。

興味あることに、相同な配列をならべてみると、ＨＩＧ
Ｉのり、とＤＩＲの極性は逆で３３３とＤＩＲの極性は
同じである。推定上のＤＩＲ−ＤＩ４結合は５′側に１
２及び２３ヌクレオチドスペーサーシグナルを、また３
′側に１２ヌクレオチドスペーサーシグナルを持つはず
なので、Ｖ　ｏ−Ｄ　ＩＲ−Ｄ　ｕ−ＪＨ、ＶＨ−ＤＨ
−ＤＩＲ−ＪＨ及びＶ　＋＜−Ｄ　ｕ−Ｄ　Ｉ　Ｒ−Ｄ
Ｈ−ＪＨの構造のどれかを形成するための基質であるか
もしれない。

次に本発明者らによって得られた知見を基にり、遺伝子
および介在領域での突然変異の頻度を計算するために、
第１図の■と■の部分が比較検討された。

ＤＨ遺伝子が機能を有する断片であるために　８ は、両側の２１ヌクレオチドスペーサーシグナルの存在
が本質的であると思われる。

表１に第１図の■と■の部分における突然変異の頻度を
要約した。

（ユフ＝　−ｊ”　ｚ＝ｌ’　ｊ４ｊ＞なお、この比較
から４つの長い挿入または欠失領域（第１図及び第２図
に示した■〜Ｏで示された部分）はのぞかれている。

表１のグループ■は１６ｂｐ繰り返し領域とＩ）ｘｐ遺
飯ｒ−の間の領域に、グループＩＩはＤＸ１１遺伝子と
ＤＡ遺遺伝の間の領域にそれぞれ対応する。

また、１５７４から１８２９までの挿入領域、１２６８
６から］３１８４まて、　１３２３２から１３２４７ま
で、及び３５３６から４３９４までの部分は表１の比較
から除かれている。

更に、グループ■はＤＡ遺伝子とＤＫ遺伝子の間のｉ域
に、クループ■はＤＫ遺伝子とＤＮ遺イ五子の間の領域
にそれぞれ対応している。

方、グループＶはＤＮ遺伝子とＤＭ遺伝子の間の領域に
、グループ■はＤＭ遺伝子の下流にそれぞれ対応してい
る。。

不−・致の（１）と（２）は（塩Ｘ）転移（ＧφＡおよ
びＴφＣ）と（塩基）転移（プリンφピリミジン）をそ
れぞれ示す。なお、数字は塩基対数を示している。

１ 表１に示すように、転移：塩基転換の頻度比率は、約３
：２であった。

また、短いヌクレオチドの欠失（または挿入）の総数は
Ｉｂｐのものが４５同、２ｂｐのものが８圓、：ｌｂｐ
のものが３回であった。

介在領域での２つの重複単位間の配列の違いの全体は、
約１２木である。

シグナル領域においては、２つの同一遺伝子間でのヌク
レオチドの違いがノナマーでは７ｂｐ（８％）、ヘプタ
マーでは４ｂｐ（６％）、スペーサー領域では］０ｂｐ
（８％）見られた。

シグナル領域及び介在領域における突然変異の大う数は
ＤＮＡ複製の間違いに起因するものと考えられる。

要約すると　１個のヌクレオチドの不一致は２３６回、
連続する２個のヌクレオチドの不一致は５２回、連続す
る３個のヌクレオチドの不一致は７回、連続する４個の
ヌクレオチドの不一致は１目、連続する８個のヌクレオ
チドの不一致は１１す１であった。

　２ １〜３個のヌクレオチドの欠失または挿入の大多数はＧ
ｅｅにからＧＣＣまたはＧＣＣＣＣへのようなりＮＡポ
リメラーゼのすべり（ｓｌｉｐｐａｇｅ）反応（参考文
献２１）により起こっている。

ＤＩ＋コード領域に見られる突然変異のいくつかは上記
と同様である。

Ｄ□コード領域とＤＡ１コード領域の間には差異はなく
、ＤＭＩコード領域とＤＭ２コード領域では２個所に１
個のヌクレオチドの不一致が見られた。

ＤＮＩコード領域とＤＮ４コード領域の間での連続する
３個のヌクレオチドの欠失（または挿入）はＤＮＡポリ
メラーゼのすべり反応に起因するかもしれない。という
のは、へＧＣ配列の３回繰り返しの中の１個の八ＧＧが
欠失していたからである。

例えば、Ｄ　ＸＰＩ　とＤＸＰ１との間、ＤＫ４とＤＫ
＋との間、ＤＬＲファミリー等の、その他のＤＨコード
領域で見られる差異は、異なる特徴を持っている。

突然変異したヌクレオチドは限られた領域に密　３ 集しており、分岐したヌクレオチドは他のＤ　Ｈコード
領域と相同＋＋１°を示している。

参考文献４では、Ｄ１１遺伝子のコード配列が短いオリ
ゴヌクレオチドから組み立てられているように見え、Ｄ
　ＸＰＩ中のＧ　八’Ｉ’　Ａ　’Ｉ”ｒやＤ　ｘｐ・
１の中のＧＧＧＧＡのような分岐した配列がそれぞれＤ
ＬＲＩやＤ　Ｉ＋。５２の中にも范い出されることが指
摘された。

そこで、遺伝子変換（参考文献１９）は、Ｄ　Ｈコード
領域における分岐性を高めている主軒路の１つであるか
もしれないといえる。

更に、ヒ述の本発明における新たな知見を用いてマウス
とヒトのＤＨ配列が比較された。

その結果、第８図（ａ）に示すように。１つのヒトＤ。

遺伝子のＤ）Ｉコードおよびシグナル配列はマウスのＤ
ｓｐ□のものと８］！ｊ；　　（５９／７３）の相同性
を有しており、そのＬにＤＫ４の場合にはＤ１１遺伝子
領域だけでなく５′側及び３′側隣接配列もＤ　ＳＦ３
のものと５７本（１３５／２：１６）の相同性を有して
いることが判明した［第８図（ｂ）］。

　４ このことは、−度り、か進化した後は、Ｄ、□遺伝子部
位には広範囲な突然変異が起こらなかったことを示唆す
る。

６つの異るＤＩ＋遺伝遺伝子離、この隣接配列は大いに
分岐しているようにみえるが、ある組み合せでは５′隣
接配列の１００ヌクレオチド以上にわたり５６〜６１％
の類似性が見つかった。

同程度（５２〜６１％）の相補性が５′と３′隣接配列
の間に見い出された［第９図（ａ）］。

興味深いことには、相補性を示す隣接領域の配列の組み
合せは第９図（ｂ）に示すように異なる遺伝子ファミリ
ーに属している。

以上の事項を要約すると、 ａ２重複化してできてきた２つの単位間での介在配列の
相違は約１八であるが、シグナル領域では６〜８％の相
違があり、 ｂ、５′隣接領域配列の間におけるある組み合せては約
６０亀の類似性が見い出されており、０．５′　と３′
隣接領域配列の間にもまた約６０＊の相補性が見い出さ
れており、 　５ ｄ、更に、Ｄ１１コード領域の大多数には、ＣＡＣ（八
／゛ｒ）ＧＴＧ−様の配列が見い出された（１’：４図
）。

これらの結果に基き、本発明者らはＤＨ遺伝子の起源に
つき以下の仮説を提咄することがてきる。

第１０図に示す構造の原始釣手り遺伝子（ｐｒｉｈ−Ｄ
）のクラスターが存在していた。

ｐｒｉｈ−Ｄ遺伝子とそれを取り巻く領域のヌクレオチ
ド配列は初めから既に分岐していた。

Ｖ−（Ｄ）−Ｊ結合のリコンビナーゼは２つのｐ　ｒ　
ｉ　ｈ　−Ｄ遺伝子を認識した。

これらＤＮＡ断片のｉ　＋１：は同じなので、欠失の代
りに逆位が起こった。

Ｎ断片は２つのシグナルヘプタマーの間に入れられたの
であろう。

この結果得られた断片は、Ｉ）ｏコード領域が二組の１
２ヌクレオチドスペーサーシグナルにより取り囲まれて
いるので、Ｄ　Ｉ４遺伝子としての機能を有している。

この仮定がこの限定された領域で数回生じ　６ た。

このｐｒｉｈ−Ｄ遺伝子の起源として推定される遺伝子
は、シグナルを含み、多遺伝子ファミリーからなってお
り、既に分岐しており、クラスターを形成しているはず
である。

このｐｒｉｈ−Ｄ遺伝子は■遺伝子の３′端であるだろ
う。というのは、Ｄ、遺伝子の隣接領域配列とＶ、遺伝
子の３′隣接領域配列の間に配列類似性が本発明者らに
よって見い出されたからである（第１１図〉。

相同性または相補性の程度（５７〜６３％）は、Ｄ　Ｈ
遺伝子の隣接領域同士の間で見られるのと非常に似てい
る。

ＶＨ遺伝子がｐｒｉｈ−Ｄ遺伝子になるためには、２３
ヌクレオチドスペーサー領域中にＣＡＣ（八／Ｔ）　Ｇ
ＴＧ配列が創造されたはずである。

このことは起こり得たと考えられる。すなわち、現在の
■。遺伝子の３′側にスペーサーの中にもＣＡＣ（八／
Ｔ）　ＧＴＧ様の配列が見つかるからである（参考文献
２０）。

　７ このモデルの有利な点は、逆位で得られたものが機能を
持った分岐Ｄ　Ｉ−１遺伝子であること、及び多種多様
なりＩ（遺伝子を得るためにはこの他に更に突然変異が
起こったことを仮定する必要がないことである。

上記した種々の知見から、ヒト免疫クロプリン重鎖およ
びＴＣＲβ鎖、δ鎖遺伝子におけるＶＤＪ結合の近傍領
域の塩基配列、ずなわちＶ（−Ｎ−Ｄ−Ｎ）Ｊは、事実
」二、無限大の今様性を示すことが明らかとなった。

なお、Ｎは胎児型のＶ、ＤあるいはＪ遺伝子にコードさ
れていないヌクレオチド断片の略号で、Ｖ−Ｄ−Ｊの再
配列の過程で、ＤＮＡ配列内にターミナルトランスフェ
ラーゼの作用により入るヌクレオチド断片である。

例えば、後記の患者骨髄由来のＩ、Ｄ−分泌ミエローマ
細胞のＤＮＡをＢａｍ１ｌＩて氷解し、ＪＨプローブで
検出、分離した２０ｋｂのＤＮＡをファージにパッケー
ジしたＤＮＡクローンλＩＧＤ−１（参考文献２６に記
載〉のＶｌｌ　Ｄｌｌ　Ｊ１１再配列系、！７合部拉を
　８ 第１２図に示す。

Ｄ１１部分にはＤｋ＋およびＤ　ｘｐ・１のみ含まれる
ことが明らかとなった（第１：１図）。

すなわち、他の例を含めて各体細胞型Ｄ　ＩＩには、本
発明でクローン化された１　５ｋｂのＤＮＡ断片等の中
の多数の胎児型Ｄ１１′Ｊ！！、伝子のうちごく一部の
ものが、ＶＨＤｌｌ　ＪＨ再配列の際に無作九に使用さ
れており、体細胞４（ＩＩ　ｌ）　、、の塙ＪＪ：配列
はｊＨＨ＜眼大の多様Ｐ１を示し得る。

この無限大の多様性のあるＤＮＡ断片に対応する抗体の
ペプチド部付かＣＤＲＩＩＩ領域である。。

他方、リンパ球系腫瘍細胞は各個人、それぞれモノクロ
ーナルであることが知られており、腫瘍ごとにＤ　Ｈ及
びＤ　Ｉ４近傍領域（Ｎｌ＋’）で固有のＤＮＡ断片を
有すると考えられる。

このことから、リンパ系腫瘍に羅患した各患者のり、及
びり、近傍領域（Ｎｌ＋）の、その患者に固有のＤＮＡ
断片の塩基配列を腫瘍マーカーとして決定しておけば、
その配列を有するＤＡＮプローブなどを用いて、患者の
全リンパ球（ＤＮＡ　９ 量）における腫瘍細胞（ＤＮＡ量）の割合を算出するこ
とができる。

すなわち、Ｂリンパ球系腫瘍あるいはＴリンパ球系腫瘍
、白血病、骨髄腫等において、種々の抗がん剤やステロ
イド剤による骨髄形成の抑制のための化学療法が行なわ
れている。しかしながら、腫瘍細胞を完全に消滅させる
ことは、副作用などを警戒して、化学療法剤を充分に、
徹底的に投与することができないため、不可能に近い現
状である。

従って、白血病の活動を一時的に抑え込むことができた
、いわゆるリンパ種、白血病の緩解期においても、再生
した正常骨髄細胞中に混入している腫瘍細胞の動態を定
期的に検査・診断し、白血病等の再発を、早期に診断、
予防、治療することが望まれ、行なわれているが、診断
法は、細胞診、骨髄穿刺による骨髄検査などの形態学的
分析にたよらざるをえない状況にある。

骨髄検査においては、白血病性幼若細胞が５〜１５％を
超えた時はじめて、再発の診断が可能で　０ あり、早期の的確な診断は困難であり、またリンパ球に
特異的なモノクロナール抗体を用いた細胞蛍光分析法に
よる診断も近年行なわれているが、検出限界はそう改善
されてはいない。

そこで本発明者らは、前記の知見に基き、リンパ球系細
胞が生産する免疫グロブリン、ＴＣＲに対応する再配列
逍イ云子中のＶｕ　　（Ｎ１１’　　ＤｌｌＮ１４２）
ＪＨのＤＮＡ断片、特にり、□領域及びＤＩ＋ＩＩ近傍
領域（Ｎｏ’、Ｎ　Ｎ２）　（７）　ＣＤ　ＲＩＩＩ　
ニ対応する塩基配列が無限の多様性を示すことを利用し
て、腫瘍細胞に固有のＤＮＡ断片の配列を同定した上で
、正常リンパ球系細胞のＤＮＡ１ｌに対する割合を算出
するというＤＮＡ診断法を完成するに至った。

このＤＮＡ診断法は以下の過程を含む。

まず、個々の患者のリンパ球系細胞固有のＤＮＡ配列を
決定し、リンパ系腫瘍細胞の量を定量するに当って、は
とんど全ての細胞の■。およびＪ　Ｈ遺伝子に保存され
、共通にみられるＤＮＡ断片、すなわちＶＨ中のオリゴ
ヌクレオチドを第１ １のプライマーとし、またＪｌｌ中のオリゴヌクレオチ
ドと相補的なオリゴヌクレオチドを第２のプライマーと
して合成し、これらを患者リンパ系腫瘍細胞から分取し
たＤＮＡと混合し、ＰＣＲ，法［５ａｉｋｉ等のｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ法：参
考文献２４コ等によってＤＮＡポリメラーゼの存在ドで
う量のＤＮＡを増ｌ１１１．♂生産させ、個々の思名の
リンパ球系細胞固有のＤ　Ｉ＋領域近傍の遺伝子（Ｎ□
１、Ｎ□２）の塩１Ｊみ配列を決定し、Ｉ−記Ｖ　Ｉｆ
　ｉ’から選択したＤＮＡＮＡ断片１１　”ゝと、決定
したＮ中から選択したＤＮＡ断片Ｎ１□Ｉ　ｆａｌ　か
らなるＶ　Ｈ′ａ’　　Ｎ　ｏ’　Ｌａ’　Ｄ　Ｎ　Ａ
断片を、また場合ニヨッてはＤＨにまで入り込んだＤＮ
Ａ断片を、患者固有の第３のプライマーとして合成する
。また、」−記Ｊ　ｌ（中から選択したＤＮＡ断片と相
補的なりＮＡＡ断片、（゛）と、決定したＮｌ＋”から
選択したＤＮＡ断片と相補的なりＮＡＡ断片、１２ｆａ
ｌ　とからなるＮ、（２ｆａ）Ｊ　ｕ　（”’ＤＮＡ断
片を、また場合によってはＪＨ領領域他の部位のＤＮＡ
断片と相補的なりＮＡ断片を、患者固有の第４のプライ
マー　２ として合成する。

次に、更に患者の治療過程において経時的に患名リンパ
球ＤＮＡと第３のプライマーと第２のプライマー（また
は第４のプライマー）の組と、あるいは第１のプライマ
ーと第４のプライマーの組と混合してＰＣＲ法等によっ
てＤＮＡポリメラーゼの存在下で多量のＤＮＡを増幅生
産させ、その生産されたＤＮＡ量からリンパ系腫瘍細胞
の割合を測定する。

この方法を用いることにより、白血病等の患者の制癌剤
等による治療効果、奏功度の診断、および再発の診断を
早期に、迅速に行なうことができる。

この診断法は、Ｂリンパ種、Ｔリンパ種、急性白血病、
骨髄腫等の診断に特に好適に利用できる。

ＩｇＤ−分泌ミエローマ患者における本発明の診断法の
一例を以ドに説明する。

まず、患者固有のＶ　（Ｎ’　−Ｄ−Ｎ２　）Ｊの再配
列結合部位のＤＮＡ断片の塩基配列を決定す　３ る。

ＩｇＤ−分泌ミエローマ患者の骨髄細胞あるいは末梢血
リンパ細胞より１；９法（参考文献２２）に従いＤＮＡ
を分取し、モしてＶ。中に高い頻度で保存されたＤＮＡ
断片オリゴヌクレオチドを第１のプライマーとし、また
Ｊ　１４中に高い頻度で保存されたＤＮＡ断片オリゴヌ
クレオチドに相補的な配列を有するＤＮＡ断片オリゴヌ
クレオチドを第２のプライマーとして選択し、選択した
配列を、例えば固相トリエステル法（参考文献２：１）
によって、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍ
ｏｄｅｌ　３８０八ＤＮＡ合成器を用いて合成する。

次に、合成されたオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣで精製
した。

第１及び第２のプライマーとしては、以下のものが用い
得る。

第１のプライマー ５　−ＣへＣＧＧＣＣＧ’ｒＧＴＡ’ｒＴへＣＴＧＴＧ
−：１５　−Ｃ八（：ＧＧＣＣ八ＴＣへ八’ｒへＴＴＴ
ＧＴＧ−３４ 第２のプライマー ５−へＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧへＧ−３次に、
検査診断対象としてのＩｇＤ−分泌ミエローマ患者より
常法（参考文献２２）により分取したリンパ球系細胞Ｄ
ＮＡと、第１および第２のプライマーを用い、ＰＣＲ法
を利用して、これらプライマー間に形成されるＤＮＡ配
列［Ｖ　（Ｎ’　−ＤＮ２）Ｊをコートする配列：　Ｖ
Ｈ（ＮＨ’　　ＤＨ−Ｎ　ｏ’）　Ｊ　ｕ　ｌを多量に
増幅生産させる。

増幅されたＤＮＡ配列は、そのメクレオチド配列をサン
ガーらのジデオキシ法（参考文献２５）によって決定し
てから、その患者固有の腫瘍マーカーとして登録してお
く。

次に、この患者のリンパ球系細胞固有のり。領　５ 域近傍の遺伝子（Ｎ’ｕ、Ｎ２ｏ）の塩基配列を選択し
、上記Ｖ。中の任意のＤＮＡ断片■Ｈ″′〉と、決定し
たＮ。１の中の任意のＤＮＡ断片Ｎ□Ｉ　ｆ″ｌ　から
なるＶｕ′ａ’　　Ｎｌ１１（”　Ｄ　ＮＡ断片を、マ
タ場合ニよってはＤ□にまで入り込んだＤＮＡ断片を、
患者固有の第３のプライマーとして合成する。

また、−に記ＪＨ中の任意のＤＮＡ断片と相補的なりＮ
Ａ断片、ＩＨ１ａ＋と、決定したＮ□′の中の任意のＤ
ＮＡ断片と相補的なりＮＡ断片Ｎ、、２（“）とからな
るＮ、２１ａｌ　−ＪＨｆ″ｌＤＮ　Ａ断片を、マタ場
合によってはＪ　Ｈ領域の他の部位のＤＮＡ断片と相補
的なりＮＡ断片を、患者固有の第４のプライマーとして
合成する。

この第３及び第４のプライマーとしては例えば以下のも
のが利用できる。

第３のプライマー ５　−ＴＧＴＧにへＡＧへＧＧＧＣＣＴＴＴＧへＡ−３
第４のプライマー ５　−ＣへＧＧＣＣＣＡＡＧへＧＴＧＧＧＣへＴＴ−３
次に、第３及び第４のプライマーと、検査診断　６ 対象としてのＩｇＤ＝分泌ミエローマ患者より、たとえ
ば治療経過を追って経時的に常法（参考文献２２）によ
り分取したリンパ球系細胞ＤＮＡとをＰＣＲ法によって
処理し、これらプライマーの作用によって増幅したＤＮ
Ａ配列があるかどうか、また増幅したＤＮＡの量から腫
瘍細胞の割合を測定する。

なお、この増幅操作には、第１のプライマーと笛４のプ
ライマーとを組合せて、第３のプライマーと第２のプラ
イマーとを組合せて用いることもできる。

また、増幅したＤＮＡ配列の検出は、電気泳動法によっ
て反応混合物を展開し、発色反応等によって可視化した
バンドと、先に患者固有の腫瘍マーカーとして登録した
ＤＮＡ配列の同様の操作の結果とを比較して、１ＩＪ−
の位置にバンドが表れるかどうかによって行なうことが
できる。

また、プライマーとして用いたＤＮＡ断片をプローブ類
として用いサザーンハイプリダイゼーションを行ない、
バンドを分析することもでき７ る。

なお、第３及び第４のプライマーは、ＤＮＡ配列を患者
固有の腫瘍マーカーとして登録したＤＮＡ配列から任意
に選択し、選択された配列ごとに上述と同様の操作を繰
り返して、その有効性を確認することで決定でき、上記
の配列に限定されない。

［実施例］ 実施例Ｉ Ｉｃｈｉｈａｒａ、　Ｙ、、　Ｋｕｒｏｓａｗａ、　Ｙ
、　ｅｔ　ａｌ　；　ｌ１ｕｒ、　ＪＩｍｍｕｎｏｌ、
、　１８．６４９−６５２（１９８８）に記載の方法に
従って、Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　　（バーバード大学
）から供給されたヒトＤＮＡファージライブラリー（参
考文献５）からヒト胎児型ＤＮＡのクローンＩＩＵＤ−
３を単離した。

すなわち、上記マニアチスのヒトＤＮＡファージライブ
ラリーから、Ｒａｖｅｔｃｈらか取り出したＤ　Ｈ”’
　Ｊ　Ｈプローブ（参考文献１０）を用イー（、Ｂｅｎ
ｔｏｎ−Ｄａｖｉｓ法（参考文献６）によって、該Ｄ「
Ｊ、プローブにハイブリダイズする１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ
断　８ 片を含むクローン）ＩＵＤ−３を単離した。

次に得られたクローンＨＩＤ−３中の１５ｋｂ断片の常
法に従って制限酵素地図を作製し、またそのヌクレオチ
ド配列を、Ｍｅｓｓｉｎｇら［Ｍｅｓｓｉｎｇ　、　Ｊ
、　ｅｔａｌ；　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　八ｃｉｄｓ　　
Ｒｅｓ、、　　９．　３０９−３２１（１９８１）］の
方法に従ったＭ１３ｍｐｌＯまたはＭＩ：ｌｍｐＨをク
ローニングベクターとして用いたジデオキシ法［Ｓａｎ
ｇｅｒ、　　Ｆ、ｃｔ、　　ａｔ；　　Ｐｒｏｃ、　　
Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、。

Ｕ、Ｓ、八、、　７４．５４６３−５４６７　（１９７
７）］により決定し、第１図に示す制限酵素地図及び第
２図に示すヌクレオチド配列か得られた。

第１図及び第２図に示した結果から、該クローンＨＩＤ
−３の１５ｋｂ断片は、参考文献３中におけるり、に対
応するＤＬＲＩを断片が含むことが確認され、該１５ｋ
ｂ断片は胎児型ＤＨ遺伝子領域を含むものであることが
判明した。

実施例２ 実施例１で得たクローンＨＩＤ−３中の１５ｋｂ断片か
ら以下に示す制限酵素切断部位を利用して各ＤＮＡ断片
を調製し、それらをそれぞれ個々に、　９ ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ　ＫＳ　ｐｌｕｓ　　ベクター（
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＳａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＧＡ、　
ＵＳＡ）中に常法に従って、クローン化し、第１図のＨ
で示される部位を有する組み換えＤＮＡ、すなわち、プ
ラスミドｐＰＤＸＰ（Ｄ　ｘｐ＋遺伝子を含む）、プラ
スミドルＤへ（Ｄ□遺伝子を含む）、プラスミドｐＤＫ
　　（ＤＫｕ！伝子を含む）、プラスミド９Ｉ１１Ｎ（
Ｄ　ＮＡ遺伝子を含む）、プラスミドｐＤＭ（ＤＭ□遺
伝子を含む）、プラスミドｐＤＬＲ（Ｄ　ｂｎ＋遺伝子
を含む）を得た。

Ｄ　ＸＰ＋遺伝子を含む断片（Ｄｘｐ・１遺伝子を含む
）；ＢａｍＨＩ　−Ｂａｌ　Ｉ　”（１０２３２）−Ｐ
ｓｔＩ　（１０７４９）ＤＡ４遺伝子を含む断片； ＢａｍＨＩ　　−ＥｃｏＲＶ　’（１５ｆｉ＋）−八ｃ
ｃ　　Ｉ　　（２２８７）−ＸｈｏＩＤに１遺伝子を含
む断片： Ｓａｃ　Ｉ　（＋２２４１）−Ｓｍａ　Ｉ　（１２８７
５）ＤＮ４遺伝子を含む断片； ＢａｍＨＩ　（４２６０）−ＮｃｏＩ　”（４９０１）
−５ａ１．　ＩＤＭ２遺伝子を含む断片（ＤＩ＋＋、、
を含む）：Ｘｂａ　Ｉ　−５ＬｕＩ　”（１４３３９）
−ＥｃｏＩ　（１４９２３）Ｄ　ＬＲ＋ＲＩ子を含む断
片； 　０ Ｘｂａ　　Ｉ　−ＮｃｏＩ　（７５７７）−１１ｉｎｄ
　ｍ　（８］７４）なお、上記の「７」は構築過程で破
壊された部位を示し、また括弧内の数字は第２図におけ
る塩基番号に相当する。

なお、各り９．遺伝子を含むプラスミドの単離には、ベ
クターの存するポリリンカ一部位か利用された。

得られた各組み換えＤＮＡはそれぞれ個々に大腸菌ＭＶ
１１８４に常法によって導入された。

実施例３ 実施例２で得た１５ｋｂから得られた各断片をそれぞれ
個々にプローブとして用いて、ヒト胎盤ＤＮＡのサザン
ハイプリダイゼーションを行なった。

Ｇｒｏｓｓ−ロｅｌ　１ａｒｄらの方法［Ｇｒｏｓｓ−
Ｂｅｌｊａｒｄ、　Ｍ。

ｅｔ　ａｌ、；　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、
　３６．３２−３８　（１９７３）］に従ってヒト胎盤
ＤＮＡを抽出した。

抽出しなヒト胎盤ＤＮＡは、制限酵素ＢａｍＨＩ。

ＥｃｏＲＩ及びｌ１ｉｎｄＩＩＩてそれぞれ個々に消化
処理された。

１ 得られた３種のＤＮＡ混合物（各々５μ）は、それぞれ
０．綿アガロースゲルを用いた電気泳動処理された。

各ゲルは、まず０．２５Ｍ　　ＨＣＩで１５分間、次に
０．５Ｍ　Ｎａ０１１　、］、５５ＭＮａＣｌで３０分
間、更に１．０Ｍ１’ｒｊｓ−１１ｃＩ　（ｐＨ７，５
）緩衝液（１，５Ｍ　Ｎａ１ｌを含む）で３０分間処理
された。

この処理によって得られたＤＮＡは、Ｏｌｓｚｃｗｓｋ
ａら［ＯＩｓｚｅｗｓｋａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、；Ｔ
ｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔ、ｉｃｓ。

４、９２−９４　（１９８８）］によるサザーンの方法
［５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、；　、１．　Ｍｏ１
．　Ｂｉｏｌ、、９８，５０３−５１７（１９７５）　
］の変法に従って、ＬＫＢ　２０１６　ＶａｃｕＧｃｎ
ｃｖａｃｃｕｍ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　（
ファルマシア社製）を用いて、２０Ｘ　ＳＳ（：を利用
してナイロン膜（ＨｙｂｏｎｄＮ、アマ−ジャム）に移
された。

膜に移されたＤＮＡは５分間の紫外線照射処理及び８０
℃、２時間の処理で固定された。

上記の操作で調製された冬服は、煮沸洗浄溶液（０，１
×ＳＳ（：　、０．１！ｔｉ　５ＤＳ）中に１５分間浸
消された後、プレハイブリダイゼーション（５ｘ　５Ｓ
Ｐｌｉ　２ （２０ｘ　５ＳＰＥ：　０．２Ｍ　Ｎａ１１２Ｐ０４緩
衝液（ｐＨ７，４、３，６ＭＮａＣ］　、２０ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡを含む）　、　Ｏ，Ｉｍｇ／ｍｌ　　熱変性サケ
粒子ＤＮＡ、５０！ｊｉホルムアミド［メルク社（ダル
ムシュタット、西独）製］、５％Ｉｒｉｓｈｃｒｅａｍ
　１ｊｑｕｅｕｒ　　［Ｂａｌｌｅｙｓ社（ダブリン、
アイルラント）製］および０．１４ｋ　ＳＤＳに４２℃
で一晩処理）を行なった。

この、プレハイブリダイゼーション処理が終了した後、
実施例２で得た各ＤＮＡ断片をランダムオリゴヌクレオ
チド′ラベリング法［Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、八。

Ｐ、　　ｅｔ　　ａｌ、：　　　八ｎａ１．　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｒｎ、、　　１３２．　６−１３（１９８３）］
によって３２ｐで標識する過程を含む方法により、熱変
性３２ｐ標識化ＤＮＡとし、それらを個々にプローブと
して加えることを除いては、上記プレハイブリダイゼー
ションと同様の処理条件のハイブリダイゼーションを行
なった。

４ｘＳＳＣで４２℃、３０分の洗浄および２回の０．５
ｘ　ｓｓｃの洗浄処理を行ない、−８０℃の条件でのオ
ートラジオグラフを行なった。

結果を第３図に示す。

　３ 実施例４ ［第１及び第２のプライマー川の配列の選択］実施例１
及び２で得られた各ＤＮＡ断片及びこれらＤＮＡ断片の
クローニングに用いた各種プローブを用い、ＴｇＤ−分
泌ミエローマ患者から常法（参考文献２２）に従い骨髄
細胞あるいは末梢血リンパ細胞より分取したＤＮＡを、
実施例３と同様の手法を用いたサザーンハイブリダイゼ
ーシジンにかけ、その結果からＶＨ（ＮＩＰ’　　ＤＩ
４　　ＮＨ２）ＪＨの再配列結合を有するＤＮＡ断片を
特定してそれを実施例１で用いたｌ１ｅｎ１．ｏｎ−Ｄ
ａｖｉｓ法によりクローニングし、それらのヌクレオヂ
ド配列をＳａｎｇｅｒらのジデオキシ法（参考文献２５
）によって分析した。

次に、上述のようにして得られたＶ　（Ｎ’　−Ｄｕ２
）Ｊの再配列結合部の配列をコートする領域［Ｖｕ　　
（Ｎｏ”Ｄｕ　　Ｎ、２）Ｊｕ　］におけるＶ□遺伝子
領域及びＪ　１１遺伝子領域のそれぞれにおいて高い頻
度て保存されたＤＮＡ配列を特定した。

　４ その結果、■、１遺伝子領域中に高い頻度で保存された
ＤＮＡ配列として以下の配列（なお括弧内はどれを選択
しても良く、括弧内部分の異なるものを混合して用いて
も良い）を見い出し、第１のプライマー用配列とした。

■５　’−ＧＡＣＧＧ［；［；ＧＴＧＴ八’ＩへＩ’八
［；　ＴＧ　ＴＧ−３■５°−ＣへＣＧＧＣＣへＴＣＴ
ＡＴＴＴＴＴＧＴＧ−３また、Ｊ、遺伝子領域に高い頻
度で保存されたＤＮＡ配列と相補的な配列として、以下
の配列を見い出し、第２のプライマー用配列とした。

５−へＣＣＴＧＡＧＧへＧＡＣ：ＧＧＴＧＡＣ−３５−
ＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＡＣ−３なお、参考
に、第２のプライマー用配列の選択に利用した上記の分
析の結果得られたＪＨ遺伝子　５ 領域における配列の−・部を第１４図に示す。

実施例５ 実施例４で選択した第１のプライマー用配列のうちの１
つを選択し、その配列を有するオリゴヌクレオチドを同
相トリエステル法（参考文献２３）によって、八ｐｐｌ
ｉｃｄ　Ｂｉｏｓｙｓｌ、ｅｍＳＭｏｄｃｌ　１１１Ｏ
Ａ　ＤＮＡ合成器によって合成し、ＨＰＬＣ（高速液体
クロマトグラフィー）によって精製した。

これとは別に、実施例４で選択した第２のプライマー用
配列を有するオリゴヌクレオチドをｌｉｄ相トジトリエ
ステル法老°文献２３）によって、八ｐｐｌｉｅｄ　Ｂ
ｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０八ＤＮ八合
成器によって合成し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトクラ
フィー）によって精製した。

次に、実施例４と同様の方法で、診断対象としてのＩｇ
Ｄ−分泌ミエローマ患者（女性、４５才）の骨髄細胞あ
るいは末梢血リンパ細胞から分取した腫瘍細胞ＤＮＡと
上記の２種の精製オリゴヌクレオチドとを、５ａｊｋｉ
らのＰＣＲ法（参考文献２４）によって反応させた。

　６ 反応液の組成は以下のとおりであり、反応条件は５ａｉ
ｋｉらに従い、アニーリング温度は５５℃とした。また
、ＤＮＡ増幅のための反応は２５回繰り返えされた。

反応液組成； 細胞Ｄ　Ｎ　Ａ　（１００μｇ／ｍｌ）　　　　　　１
０　μｍ第１のプライマー　（２０μｇ／ｍｌ）　　　
３　μｍ第２のプライマー（２０、ｃｚｇ／ｍｌ）、　
　　１　μｍｄＮＴＰ　　　　　　　（１５０μＭ）　
　　　１８μ１Ｔａｑポリメラーゼ（１０ｕ／μｌ）１
μｍ１０Ｘ　Ｐ　ＣＲ用緩衝液　　　　　　１０μｌ蒸
留水　　　　　　　　　　　　５９μｍ合計１００μｍ （ＰＣＲ用緩衝液ニドリス塩酸（ｐ’Ｈ８，ｏ）、Ｎａ
１１５０　ｍＭ、　ＭｇＣｌ２１０ｍＭ、メルカプトエ
タノール１０ｍＭ　） 増幅反応終了後、反応混合液をアガロースゲルを用いた
電気泳動法によって展開した後、エチジウムブロマイド
でＤＮＡ断片を染色した。

その結果、２８２ｂｐに相当する位置にバンドが検　７ 出された。

なお、実施例４で選択した第１のプライマー用配列のう
ちＯあるいは■を用いた場合に、２８２ｂｐの位置に単
一のバンドが検出され、配列■あるいは■が、このＩｇ
Ｄ−分泌患者の場合には、■及び■より優れていた。

次に、この２８２ｂｐのＤＮＡ断片を必要に応して適当
な制限酵素で処理し、実施例１で用いたジデオキシ法に
よって、そのヌクレオチド配列を求めた。

得られたヌクレオチド配列を解析したところ、第１２図
と同様の配列が含まれていることが確認された。

このヌクレオチド配列を前記診断対象患者に固有のＤＮ
Ａ断片マーカーとして登録した。

実施例６ ［第３及び第４のプライマーの調製］ 第１２図に示された配列のＶ　Ｈ（Ｎ　Ｈ’　　Ｄ　Ｉ
４領域から、以下の配列を選択し、該配列を有するオリ
ゴヌクレオチドを第３のプライマー用配列とし　８ て実施例４と同様の方法により合成し、精製した。

５　−ＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＣＣＴＴＴＧＡＡ−３
更に、第１２図に示された配列のＤ　Ｈ−Ｎ　Ｈ’）Ｊ
　Ｈ領域より下流の、第２のプライマー用配列と相補的
な配列より更に下流の配列を選択し、該配列と相補的な
以下の配列を有するオリグヌクレオチドを第４のプライ
マーとして実施例４と同様の方法により合成し、精製し
た。

５−ＣへＧＧにｌ；［；ＡＡＧＡＧＴＧＧＧＩＧＡＴＴ
−３’実施例７ ［本発明の診断法の感度の検定コ 実施例５で診断対象患者から分取した腫瘍細胞ＤＮＡの
細胞１個当りの量を測定した。

次に、正常胎盤細胞及び正常リンパ球細胞から実施例４
で用いた方法によって分取したＤＮＡから、１０２個、
１０４個、１０６個の細胞弁に相当するＤＮＡ量をそれ
ぞれ調製した。

次に、腫瘍細胞ＤＮＡと、正常胎盤細胞ＤＮＡまたは正
常リンパ球細胞ＤＮＡとを混合し、細胞　９ の個数［腫瘍細胞ＤＮＡ　（Ｘ）：正常胎盤細胞ＤＮＡ
または正常リンパ球細胞ＤＮＡ　（Ｙ）］で以下の比率
となる試料Ａ−Ｉをそれぞれ調製した。なお各試料の（
合計）ＤＮＡ量は、ＰＣＲを実施する前で一定とした。

試料Ａ　　腫瘍細胞ＤＮＡのみ 試料Ｂ　　正常胎盤細胞ＤＮＡのみ 試料Ｃ正常胎盤細胞ＤＮＡ使用、 Ｘ　：　Ｙ＝１０−２：　１　（Ｘ＝２ｎｇ　）試料Ｄ
　　正常胎盤細胞ＤＮＡ使用、 Ｘ　：　Ｙ＝１０−’：　　１　　（Ｘ＝２０ｐｇ）試
料Ｅ　　正常胎盤細胞ＤＮＡ使用、 Ｘ　：　Ｙ＝］０−６：　１　（Ｘ＝０．２ｐｇ　）試
料Ｆ　　正常リンパ球細Ｊ泡Ｄ　Ｎ　Ａのみ試料Ｇ　　
正常リンパ球細胞ＤＮＡ使用、Ｘ　：　Ｙ＝ＩＯ−２：
　１　（Ｘ＝２ｎｇ　）試料Ｈ正ＸＱ’＋　Ｊ冶盤細胞
ＤＮＡ使用、Ｘ　：　Ｙ＝］０−’：　１　（Ｘ＝２０
ｐｇ）試料Ｉ　　正常胎盤細胞ＤＮＡ使用、 ｘ　：　Ｙ＝ＩＯ−６：　ｔ　（Ｘ＝０．２ｐｇ　）　
０ 次に、各試料を個々に用い、実施例５で調製した第３及
び第４のプライマーとのＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅生
産を行なった。

ＰＣＲ用の反応液組成は以下のとおりである。

なお、試料の容量は、試料Ａ−Ｅで１１．５μＩ、Ｆ〜
Ｉで１６．２μｍとした。また、各成分の濃度は実施例
５と同様とした。

ＰＣＲ用の反応液組成 試料　　　　　　　１１．５μｍまたは１６．２μｍ第
１のプライマー　　　　　　　　　３　μｌ第２のプラ
イマー　　　　　　　　　３．５μｍｄＮＴＰ　　　　
　　　　　　　　　　　１６　　μ１Ｔａｑポリメラー
ゼ　　　　　　　　　０．５μ１１ＯＸ　Ｐ　ＣＲ用緩
衝液　　　　　　　１０μｍ蒸留水　　　　　　５５．
５μｍまたは５０．８μＩ合計１００μＩ 反応条件は５ａｉｋｉらに従い、アニーリング温度は６
５℃とした。また、ＤＮＡ増幅のための反応は５０回繰
り返えされた。

増幅反応終了後、反応混合液をアガロースゲル１ を用いた電気泳動法によって展開した後、エチジウムブ
ロマイドでＤＮＡ断片を染色した。

試料Ａ、Ｃ〜Ｅ、Ｇ−Ｈにおいていずれも＋３１ｂｐに
相当する位置に単一バンドが検出された。

また、試料Ｂ、Ｆではバンドは検出されなかった。

次に、１３１　ｂｐのＤＮＡ断片を常法により単離し、
必要に応じて制限酵素によって処理して、実施例１で用
いたジデオキシ法によって、そのヌクレオチド配列を求
めた。

得られたヌクレオチド配列を解析したところ、この１３
］　ｂｐのＤＮＡ断片は第１２図に示す配列中に含まれ
るものであることが確認された。

以上の結果から、１／１０６の肺癌細胞濃度まで検出で
きることが確認できた。

実施例８ 実施例５と同一の診断対象患者の治療過程において、経
時的にリンパ系細胞を分取し、得られた細胞からＤＮＡ
を分離して、実施例７のプｆ法でリンパ系細胞中に含ま
れる腫瘍細胞の割合を検定し　２ た。

その結果、治療後、時間経過すると、増加する腫瘍細胞
も、抗癌剤の投与により、再び減少過程に入ることが確
認された。

（以下余白） 文献リスト １：黒沢良和：蛋白質　核酸　酵素、　３１．７５６−
７６８　（１９８６） ２　：　Ｋｕｒｏｓａｗａ、　Ｙ、　ａｎｄ　１’ｏｎ
ｃＨａｗａ、　Ｓ、；　、１．　ｌｉｘｐＭｅｄ、、　
１５５．２０１−２１８　（１９８２）３　：　Ｓｉ（
！ｔ）ｃｎｌｉｓｌ、、　Ｉｆ、　Ｃ１，ａｌ、；　Ｎ
ａ１．ｕｒＣ２２！１４．　ｌｉ：１ｌ−６３５（１９
８＋） ４　：　Ｉｃｈｉｈａｒａ、　Ｙ、、　Ｋｕｒｏｓａｗ
ａ、Ｙ、　ｃｌ　ａｌ、；　１Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１８．６４９−６５２　（
＋９８８）５　：　Ｌａｗｎ、　Ｒ，Ｍ、　ｅｔ　ａｌ
；　Ｃｅ１１．１５．１１５７−１１７４（１９７８） ６　：　Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｗ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｄａｖ
ｊｓ、　Ｒ，Ｗ、；　５ｃｉｅｎｃｅ。

１９６、１８０−１８２　（１９７７）７　：　Ｍａｔ
ｓｕｄａ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、；　ＥＭＢｏ　、１．
、７．１０４７１０５１　（１９８８） ８　　二　Ｂｕｌｕｗｅｌａ、　　　Ｌ、　　　ｅｔａ
ｌ、；ＩＥＭＢＯＪ、、　　７．　２００３−２０１０
（１９８８） ９　：　Ｚａｎｇ、　Ｓ、　Ｑ、　ｅＬ　ａｌ、；　Ｇ
ｅｎｅ、　３３．　ＩＯ：ｌ−１１９（１９８５） １０：　　Ｒａｖｅｔｃｈ。

Ｊ。

■。

ｅｔ　　ａｌ、； 　４ Ｃｅｌｌ。

（１９８］） １１：　八ｋｉｒａ　　　Ｓ、　　ｅｔ　　ａｌ、；　
　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２３８．　１１３４１１３８　
　（１９８７） １２：　　Ｋａｂａｔ、、Ｃ，八、　　Ｃｔ　　ａｌ、
；５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　　ｏｆ　　ｐｒｏｔ−ｅｉｎｓ
　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　１ｎｔｅｒｅ
ｓｔ、　ＮＩＨ（１９８７）１３：　　５ａｋａｎｏ、
　　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、；　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２８０
．　２８８−２９４（１９７９ａ） １４：　　５ａｋａｎｏ、　　Ｉｌ、　　ｅＬ　ａｌ、
；　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２７７、　６２７−６３３（
＋９７９ｂ） １５：　Ｈｉｎｄｓ、　Ｋ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、；　Ｎ
ａｔｕｒｅ、　３２０．５４６５４９　　（１４１８６
） １６：　　Ｋｕｄｏ、　　八、　　ｅｔ　　ａｌ、；　
　Ｇｅｎｅ、３３．　１８］−１８９（１９８５） １７：　　Ｇｌｅａｒｙ、Ｍ、Ｌ、ｅｔ　　ａｌ、；　
　（：ｅｌｌ、４７．１９−２８（１９８６） １８：　八Ｉｔ、　　Ｆ、　　Ｗ、　　ｅｔ　　ａｌ、
；　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　７９．　４１１８−４１２２
　　（１９８２）＋９：　　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　　
Ｄ、；　　Ｃｅ１ｌ、　　３３．　５９２−５９３　　
（１９８］）２０：　　Ｋｏｄａｉｒａ、Ｍ、ｅｔ　ａ
ｌ、；　　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１９０゜５２９−
５４１　　（＋９８６） 　５ ２］：　　Ｇｈｏｓａｌ、　　Ｄ、　　ｅｔ　ａｌ、；
　　Ｎａｔｕｒｅ、（Ｌｏｎｄｏｎ）、　　２７５゜６
］１−６１７　　（１９７１１） ２２：Ｍａｎｉａｔｉｓ　　Ｔ、ｅｔ　　ａｌ、；　　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ：八　　］、ａ
ｂｏｒａ１．ｏｒｙ　　　Ｍａｎｕａｌ　　　　（（：
ｏｌｄ　　　Ｓｐｒｉｎｇ　　１ｌａｒｂａｒＬａｂ、
、Ｎ、Ｙ、）、１９８２ ２３：Ｓｅｌｉｎｇｅｒ、Ｊ、　　Ｃｔ　ａｌ；　　Ｃ
ｈｅｍ、Ｓｃｒ、、２［ｉ、５６９５７７（１９８６） ２４：５ａｉｋｉ、Ｒ，に、ｅｔ　　ａｌ；　　５ｃｉ
ｅｎｃｅ、２３０．　１３５０１３５４　（＋９８５） ２５：Ｓａｎｇｅｒ、　　Ｆ、　　ｅｔ　　ａｌ；　　
Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ１１．　　八にａｄ、　　Ｓｃｉ、
。

ＵＳＡ、７４．　５４６３−５４６７（１９７７）２６
：Ｈｓａｓｈｉ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ；　Ｅｕｒ、　Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１９゜１３９９−１４０３　
　（１９８９） ［発明の効果］ 従来の抗体生産の研究、実用においては、ある特定の抗
原に対応した抗体を、動物においてポリクローナル抗体
、マウス、ヒト等の抗体産生ハイブリドーマにおいてモ
ノクローナル抗体として生産することが行なわれてきた
。

本発明により得られたＤ１□遺伝子等３０種を利用　６ し、また３通りのオープンリーディングフレームを使用
して、Ｄ　Ｈ領域だけでも少なくとも９０種類の抗体を
生産できる可能性がある。ＶＨＨ領域Ｊ　Ｈ領域と組み
合せれば、膨大な種類の抗体が生産できるのであるか、
本発明により得られた知見をもとにして、細胞工学的、
遺伝子工学的手法により予め様々な抗体を人工的に作製
しておき、しかる後に、これまで未検討の抗原あるいは
新たにｊ］１現してきた抗原に対応する所望の抗体をそ
れらの中から探索、スクリーニングするという方法が考
案される。この方法が一般化すれば、緊急を要し、量的
に必要とされる特定の抗体を、所望通り、医療用、ある
いは研究用に提供することが可能となる。

また、本発明において、種々のＤＨ遺伝子を含むＶ、、
Ｄ、、Ｊ、、再配列結合部分のＤＮＡ配列がほぼ無限大
の多様性を持つという知見が明らかとされ、現実の患者
の腫瘍細胞のＤＨ領域に、本発明により同定された、Ｄ
Ｈ遺伝子も含まれていることも示された。更に、これら
の知見に基づいて、　７ 一人の腫瘍患者の腫瘍細胞はモノクローナルであること
に基づいて、Ｖ　（Ｎ−Ｄ−Ｎ）Ｊ領域は個々の患者の
腫瘍細胞に固有のＤＮＡ配列からなりたっており、それ
をメルクマールとして患者固有のＤＮＡ断片マーカーを
、ＰＣＲ１去による増巾品を行なうためにプライマーと
して合成し、患者の腫瘍細胞に固有のＤＮＡ配列を増幅
生産し、腫瘍細胞の他のリンパ系細胞に対する割合を算
出てきることが実訝され、本発明の診断法が確ぎｆされ
た。

この診断法は、従来の形態学的、細胞遺伝学的診断法に
比べ、はるかに感度か良く、精度良い検査法であり、リ
ンパ系腫瘍、白血病等の早期診断および化学的療法の奏
功度のチエツクに有用である。

更に、本発明により得られた各種のＤ□プローブは様々
な患者に対応する患者リンパ球の細胞タイピングに使用
される診断薬として有用である。

また、免疫グロブリン遺伝子及び関連遺伝子の　８ 調製も本発明のＤ□プローブを用いることによりより簡
便に行なえる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片における１２
個のＤＩｌ遺伝子の配列付置を模式的に示した円、第２
図（ａ）〜（ｃ）は第１図に示した１２個のＤＨ遺伝子
を含む１５ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片のヌクレオチド配列、第
３図は実施例３で行なったサザーンハイプリダイゼーシ
ョンの結果を示す図、第４図は第１図の１５ｋｂＤ　Ｎ
　Ａ断片中に見い出されたＤＨ遺伝子を含む１７個のヒ
ト胎児型遺伝子のヌクレオチド配列、第５図は胎児型Ｄ
　Ｉ４遺伝子と体細胞型ＤＨ遺伝子のヌクレオチド配列
の比較図、第６図はアミノ酸レベルでの体細胞型Ｄ　Ｈ
配列と胎児型り、配列の比較図、第７図（ａ）及び（ｂ
）はＤＩＲ遺伝子ファミリーの構成を示す図、第８図（
ａ）及び（ｂ）はマウスとヒトＤＨ配列の比較図、第９
図（ａ）及び（ｂ）はり、遺伝子の隣接する配列間での
ヌクレオチド配列の比較図、第１０図はＤ□遺伝子誕生
のモデルを模式的に示す図（四角枠内の　９ 数字はメクレオチド数を示す）、第１１図はＤＩ＋遺伝
子の両隣接領域の配列と胎児型Ｖ、遺伝子の３′側隣接
領域との比較図、第１２図はＩｇＤ−分泌ミエローマ患
者のＶｌｌ　ＤＩｌ　ＪＨ領域のＤＮＡ配列を示１−図
（■〜■はプライマーの選択に用いた配列を示し、ヌク
レオチド配列直上のアルファベットはその直下のコドン
に対応するアミノ酸を示し、第６図におけるのと同様に
定義される）、第１３図は第１２図のＤＨ領域のＤＮＡ
配列のみを示す図（■はＤｏに相当する部分、■はＤＸ
Ｐ１に相当する配列）、第１４図は同定された各種Ｊ、
＋領域の結果の一部を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒト免疫グロブリンＤ＿Ｈ遺伝子ファミリーＤ＿Ａ
   、Ｄ＿Ｋ及びＤＩＲに属するＤ＿Ｈ遺伝子の１以上を少
   なくとも含むことを特徴とするＤＮＡ断片。 ２）Ｄ＿Ｘ＿Ｐ＿４遺伝子、Ｄ＿Ａ＿４遺伝子、Ｄ＿Ｋ
   ＿４遺伝子、Ｄ＿Ｎ＿４遺伝子、ＤＩＲ＿１遺伝子、Ｄ
   ＿Ｍ＿１遺伝子、Ｄ＿Ｌ＿Ｒ＿１遺伝子、Ｄ＿Ｘ＿Ｐ＿
   １遺伝子、Ｄ＿Ｘ＿Ｐ＿１遺伝子、Ｄ＿Ａ＿１遺伝子、
   Ｄ＿Ｋ＿１遺伝子、Ｄ＿Ｎ＿１遺伝子、ＤＩＲ＿２遺伝
   子及びＤ＿Ｍ＿２遺伝子を含む１５ｋｂからなるＤＮＡ
   断片。 ３）請求項２記載のＤＮＡ断片を含むλファージクロー
   ン。 ４）Ｄ＿Ａ、Ｄ＿Ｎ、Ｄ＿Ｌ＿Ｒ、Ｄ＿Ｘ＿Ｐ、Ｄ＿Ｋ
   またはＤ＿Ｍ遺伝子ファミリーを含む組み換え体ＤＮＡ
   。 ５）前記遺伝子ファミリーに属するＤ＿Ｈ遺伝子がプラ
   スミド中にクローン化されている請求項４記載の組み換
   え体ＤＮＡ。 ６）請求項５記載の組み換え体ＤＮＡを有する大腸菌。 ７）前記ＤＨ遺伝子がＤ＿Ａ＿４、Ｄ＿Ｎ＿４、Ｄ＿Ｌ
   ＿Ｒ＿１、Ｄ＿Ｘ＿Ｐ＿１、Ｄ＿Ｋ＿１またはＤ＿Ｍ＿
   ２遺伝子である請求項５記載の組み換え体ＤＮＡ。 ８）前記ＤＨ遺伝子がＤ＿Ａ＿４、Ｄ＿Ｎ＿４、Ｄ＿Ｌ
   ＿Ｒ＿１、Ｄ＿Ｘ＿Ｐ＿１、Ｄ＿Ｋ＿１またはＤ＿Ｍ＿
   ２遺伝子である請求項６記載の大腸菌。 ９）リンパ系腫瘍細胞を検出する過程を含むリンパ系腫
   瘍の診断方法において、診断対象患者特有のＶ＿ＨＤ＿
   ＨＪ＿Ｈ結合部に含まれるＤＮＡ配列をマカーとして前
   記リンパ系腫瘍細胞を検出することを特徴とするリンパ
   系腫瘍の診断方法。 １０）リンパ系腫瘍がＢ細胞系である請求項９に記載の
   リンパ系腫瘍の診断方法。 １１）リンパ系腫瘍がＴ細胞系である請求項９に記載の
   リンパ系腫瘍の診断方法。 １２）以下の過程ａ〜ｈ： ａ）リンパ系腫瘍細胞のＤＮＡにおけるＶ＿ＨＤ＿ＨＪ
   ＿Ｈ結合部からＶ＿Ｈに頻度の高いＤＮＡ配列を選択し
   、該配列を有するオリグヌクレオチドを調製する過程と
   、 ｂ）前記Ｖ＿ＨＤ＿ＨＪ＿Ｈ結合部からＪ＿Ｈに頻度の
   高いＤＮＡ配列を選択し、該配列に相補的な配列を有す
   るオリグヌクレオチドを調製する過程と、ｃ）前記過程
   ａで得られたオリグヌクレオチドを第１のプライマーと
   し、前記過程をで得られたオリグヌクレオチドを第２の
   プライマーとし、これらプライマーと診断対象患者から
   分離したＤＮＡとを反応させて、ＤＮＡ増幅を行なう過
   程と、ｄ）過程ｃで増幅されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列
   を同定し、該診断対象患者固有の診断用マーカーとする
   過程と、 ｅ）過程ｃで増幅されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列のＶ＿
   ＨＤ＿Ｈ結合領域から選択されたＤＮＡ配列を有するオ
   リゴヌクレオチドを調製する過程と、ｆ）過程ｃで増幅
   されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列のＤ＿ＨＪ＿Ｈ結合領域
   から選択されたＤＮＡ配列に相補的な配列を有するオリ
   ゴヌクレオチドを調製する過程と、 ｇ）前記過程ｅで得られたオリグヌクレオチドを第３の
   プライマーとし、前記過程ｆで得られたオリグヌクレオ
   チドを第４のプライマーとし、これらプライマーと治療
   処置後の診断対象患者から分離したＤＮＡとを反応させ
   て、ＤＮＡ増幅を行なう過程と、 ｈ）過程ｇで増幅されるＤＮＡ断片の有無を検出して、
   過程ｇにおいて診断対象患者から分離したＤＮＡ中での
   腫瘍細胞由来のＤＮＡの有無を判定する過程と を含む請求項９〜１１のいずれかに記載のリンパ系腫瘍
   の診断方法。