JPH0378368B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はホモカルノシンまたはその塩を有効成
分として含有する抗腫瘍剤に関するものである。 腫瘍治療剤の開発は現在大別して二つの概念に
基いて行なわれている。その一つは腫瘍組織の旺
盛な核酸生合成を阻害して癌を制圧するという考
えに基くものである。本邦においては例えばブレ
オマイシン（日本化薬株式会社）、マイトマイシ
ンＣ〔MMC（協和醗酵株式会社）〕、５−FU（協和
醗酵株式会社）などがこの考えに基き創製された
治療剤であ。その第二は宿主の免疫を利用する非
特異性能動免疫療法、いわゆる免疫促進剤によつ
て治療するという考えに基くものであり、ピシバ
ニール〔OK−432（中外製薬株式会社）〕、丸山ワ
クチン〔SSM（ゼリア新薬株式会社）〕、クレスチ
ン〔PSK（呉羽化学工業株式会社、三共製薬株式
会社）〕のごとき治療剤がこの範疇に属する。 しかしながら何れによる療法を完全な臨床目的
を達し得ない欠陥がある。前者は核酸合成の阻害
作用が癌特異性でないため腫瘍組織以外の核酸合
成をも阻害するので副作用を避け得ない難があ
る。後者の免疫促進剤による療法には免疫応答が
癌特異的でなくまた用いられる免疫促進剤の量と
質の如何にかゝわらず基本的問題は産生される免
疫応答量が網内系臓器固有の応答機能に制約され
ることである。旺盛に増殖する腫瘍を制圧するた
め何らかの方法により免疫応答効率を高める手段
が構じられなければならない。 ホモカルノシンは1961年ピサノ（pisano）らに
より牛脳から抽出されたジペプチド、すなわちＬ
−ヒスチジニル−γ−アミノ酪酸で、脳髄中に約
0.007％含有される。発見以来その生理学的存在
意義および薬理学的有用性は未解明であつた。林
ら（1965年）はホモカルノシンが脳髄に局在し、
γ−アミノ酸酪酸（以下GABAと略称する）を
その構造中に含むため、中枢運動系の抑制作用に
注目し、てんかん患者の脳脊髄腔内注入によるて
んかんの治療を試みた。藤井およびエルトン・エ
ス・クツクら（1971年）は牛脳抽出成分がマウス
のスタフイロコツカス・アウロイス
（Stapylococcus aureus）による感染に抗感染作
用のあることを発見し、その有効成分はホモカル
ノシンであることを決定した。ホモカルノシンが
インピトロで抗菌性を示さず動物に投与して抗菌
性を示すことはホモカルノシンの免疫応答に対す
る増感作用を示唆するが、その研究は以後免疫研
究に発展せず、また免疫応答増強による抗腫瘍作
用についても今日まで全く発表はなかつた。本発
明者らは同種異系DDY−Ｓ−180および同種同系
BALB／Ｃ−METH−Ａの二つの実験系を用い、
移植癌に対し癌細胞への直接作用でない、また従
来の免疫促進剤の作用と異る、非特異的能動免疫
反応（免疫促進剤）、あるいは腫瘍免疫反応を増
強するホモカルノシンの抗腫瘍作用を移植癌につ
いて確定して本発明を完成させた。 ホモカルノシンはつぎの化学構造式であらわさ
れるＬ−ヒスチジニルGABAで、脳髄中約0.007
％含有されるペプチドである。 融点242〜243℃、〔α〕²⁰ _D＝＋23.2゜の白色結晶性
粉末でその10％水溶液は無色透明で弱アルカリ性
を呈し、弱いアルカリ性味覚を有する。投与され
たホモカルノシンは加水分解されてＬ−ヒスチジ
ンとGABAになる。Ｌ−ヒスチジンは日常食品
から栄養素として多重に摂取されるアミノ酸であ
りまたGABAは脳代射促進剤として製薬化され
〔第一製薬株式会社、ガンマロン（商標）〕、安全
性の確認された物質である。前記ホモカルノシン
の有効量50mg／Kg（皮下注）（成人換算2.5ｇ）は
GABA換算約1.1ｇである。GABAの薬剤として
許容されている量は点滴で0.75〜１ｇ／300〜500
mlブドウ糖液／２〜３時間／１日１〜３回であ
る。したがつて、以上の両面からホモカルノシン
の抗腫瘍有効量の50mg／Kg（皮下注）は点滴注射
量の半分以下の量であり、その安全性は十分に推
測できる。 ホモカルノシンの合成については種々の方法が
知られているが、例えばつぎのようにして合成さ
れる（Journal of Biological Chemistry.，236、
No.２、499〜502、1961）。 カルボベンジルオキシ−γ−アミノ酪酸のメチ
レンクロライド中の懸濁液にトリエチルアミンを
加える。得られた溶液を−５℃に冷却したのちに
エチルクロロホーメートを加え、この混合物をこ
の温度に10分間保つ。この溶液へ、予め０℃に冷
却したメチレンクロライド中Ｌ−ヒスチジンメチ
ルエステルジハイドロクロライドの懸濁液にトリ
エチルアミンを加えることによつてつくつたＬ−
ヒスチジンメチルエステルの溶液を急速に加え
る。得られた混合物を一夜間25℃に放置する。つ
いでこれを水および1N−NaHCO₃で洗浄し、
Na₂SO₄で乾燥し、シラツプ状になるまで濃縮す
る。この生成物をメタノール中に溶解し、1N−
NaOHを加える。25℃において３時間保つた後、
その溶液を希硫酸によりPH５に調節し、減圧のも
とに濃縮乾固する。残渣を熱エタノールで２回抽
出し、この抽出物に水を加える。10％パラジウム
−チヤコールを加えて後、CO₂を吸収させるため
にカロクサイト管（Caroxite tube）を装備した
装置の中でこの混合物を水素添加する。水素添加
後この溶液を過し、減圧のもとで濃縮する。得
られた残渣状シラツプを水に溶解し、希硫酸でPH
３に調節する。エタノールを徐々に加えると、こ
のジペプチドの硫酸塩が粒状結晶として分離す
る。生成物を過し、水−エタノールから上記と
同じ方法で再結晶する。融点240℃（分解点）の
ホモカルノシン硫酸塩が得られる。 ダウエツクス50（Dowex50）をカラムに充填し
1N−HClで処理した後、チモールブルー中性ま
で水洗し、ホモカルノシン硫酸塩を10％溶液とし
て流し、チモールブルー中性まで水洗して硫酸基
を除いた後、1N−NH₄OHでホモカルノシンを
溶出する。濃縮した後エタノールを加え、冷室に
放置して、遊離ホモカルノシンの結晶を得る。 本発明はホモカルノシンの塩からなる治療剤を
も包含するが、ホモカルノシンの塩としてはカル
ボン酸基に基づく塩と、アミノ基にもとづく、薬
理学上許容される酸との酸付加塩があり、またカ
ルボン酸基とアミノ基の双方にもとずく塩があ
る。カルボン酸基にもとづく塩にはナトリウム、
カリウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛およ
びアルミニウムのような金属との塩、アンモニウ
ム塩および置換アンモニウム塩たとえばトリエチ
ルアミンのようなトリアルキルアミンその他のア
ミンとの塩があり、アミノ基にもとづく塩には塩
酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、
酒石酸、クエン酸、コハク酸、マレイン酸、ベン
ゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸などの無機
酸、有機酸との塩があるが、これらはそれ自体公
知の方法により、遊離のホモカルノシンを化学量
論的に計算された量の、選択された酸または塩基
と反応させることによつて製造することができ
る。 つぎに実験例をあげてホモカルノシンの優れた
抗腫瘍効果を説明する。 実験例 １ マウス肉腫に対する２種の投与方法によるホモ
カルノシンの抗腫瘍作用 材料：DDYマウス、〓５週令（静岡県実験動物
農業協同組合から入手） 腫瘍細胞：ザルコマ180（Sarcoma180）（北里研
究所制癌教室小宮山保存株） 移植：10⁵個を正中肩甲部皮下に移植した。 投与：腫瘍移植後24時間（１日）から隔日１回計
15回（29日まで）および毎日１回連続10日
間移植部から尾側に約２cm離し背部皮下に
投与した。対照動物には生理食塩水0.1ml
を移植部から約２cm離し背部皮下に投与
し、実験動物には0.1ml生理食塩水中0.01、
0.05、0.21mgのホモカルノシンを移植部か
ら約２cm離し背部皮下に投与した。

【表】 実験成績：第１表に示すように５群のマウスに対
しホモカルノシンの投与が平均生存日数、
死亡率、腫瘍の容積において抗腫瘍効果を
示した。 実験例 ２ マウス肉腫に対するホモカルノシン単独および
ホモカルノシンと免疫促進剤OK−432との併
用による抗腫瘍作用 材料：実験例１に同じ。 腫瘍細胞：実験例１に同じ。 移植：10⁵個を正中肩甲部皮下に移植した。 投与：腫瘍移植後24時間（１日）から毎日１回連
続10日間移植部から尾側に約２cm離し背部
皮下に投与した。対照動物には生理食塩水
0.1mlを移植部から約２cm離し背部皮下に
投与し、実験動物には0.1ml生理食塩水中
0.1、0.5、１mgのホモカルノシンを移植部
から約２cm離し背部皮下に投与した。また
OK−432単独使用の場合は0.1ml生理食塩
水0.5KEを腹腔内に隔日１回計５回、OK
−432とホモカルノシンとの併用の場合は
0.1ml生理食塩水中0.5KEのOK−432を腹
腔内に隔日１回計５回、１mgのホモカルノ
シンを含有するものを移植部から約２cm離
し背部皮下に毎日１回計10回投与した。

【表】 実験成績：OK−432との併用でホモカルノシン
の効果は増強された。特に消滅例は注目す
べきである。 実験例 ３ 腫瘍の重量に及ぼすホモカルノシンの効果 材料：実験例１に同じ。 腫瘍細胞：実験例１に同じ。 移植：10⁵個を正中肩甲部皮下に移正した。 投与：腫瘍移植後24時間（第１日）からホモカル
ノシン１mg／0.1ml生理食塩水を毎日１回
連続10日間移植部から約２cm離し背部皮下
に投与した。 測定：移植13日後に殺して腫瘍を摘出して秤量
し、各５例の平均値を求めた。

【表】 実験成績：第３表の各５例の平均値に示されるよ
うに、腫瘍の重量に及ぼしたホモカルノシ
ンの抑制効果はいちぢるしい。 実験例 ４ マウス肉腫に対するホモカルノシンの抗腫瘍作
用（クリーンベンチ使用） 材料：BALB／Ｃマウス、〓５週令（静岡県実
験動物農業協同組合から入手） 腫瘍細胞：METH−Ａ（３−Ａ−１−２）（北大
株、第一製薬中央研究所保存） 移植：腹水型のもの５×10⁵個（第４表の１）お
よび２×10⁵個（第４表の２）を正中肩甲
部皮下に移植した。 投与：腫瘍移植後24時間（第１日）から毎日１回
連続10日間移植部から尾側に約２cm離し背
部皮下に連続投与した。対照動物には生理
食塩水0.1mlを移植部から約２cm離し背部
皮下に投与し、実験動物には0.1ml生理食
塩水中1.0mg（第４表の１）および0.5mg
（第４表の２）のホモカルノシンを移植部
から約２cm離し背部皮下に投与した。

【表】 実験成績：BALB／Ｃ−METH−Ａにおいても
DDY−Ｓ−180の場合と同様にホモカルノ
シンによる抗腫瘍作用を認めた。また２×
10⁵の移植例で１例の消滅を認めた。 総 括 (1) DDY−Ｓ−180の系に対し腫瘍移植後第１日
ないし第30日の間、隔日１回、計15回投与およ
び移植後第１日ないし第10日の間、連続１日１
回、計10回投与により、ホモカルノシンは対照
に比し、平均生存日数の延長効果、腫瘍容積に
おいて抗腫瘍作用を示し、また連続１日１回、
計10回投与での13日における測定結果で腫瘍重
量は対照に比しいちぢるしく抑制されていた。
特に北里研究所制癌教室の小宮山保存株は本邦
では他の研究所に保存されているどのザルコマ
180よりも極めて強力な増殖性を有する癌株で
あるといわれており、従来の免疫促進癌治瘉剤
では容易に抑制出来ない株であるから、小宮山
株（Ｓ−180）で示されるホモカルノシンの効
果はその人癌に対する有効性を充分に実証す
る。 (2) ホモカルノシンと免疫促進剤の代表例として
用いたOK−432との併用投与は何れの単独投
与よりも著名な平均生存日数の延長と消滅の効
果を示す。第２表に示す実験結果を米国国立癌
研究所に抗癌化学物質効果判定の規準に従い計
算すれば第５表のごとくである。Ｔ／Ｃ％評価
法でもホモカルノシンはOK−432よりもすぐ
れた効果を示した。更にホモカルノシンとOK
−432との併用はホモカルノシン単独よりも、
またアクテイブプラセーボとして使用したOK
−432よりも効果を示し、両者の併用によつて
効果は33％増強した。 第５表 処 置 Ｔ／Ｃ％ H.C.1mg 136 OK−4320.5KE 113 OK−4320.5KE⁺ H.C.1mg 181 評価の方法 Ｔ／Ｃ％＝処置群の中央値／対照群の中央値（ここで
は対照） ×100で評価する。 判定の最終日は第60日である。生存日数中央
値（M.S.T.median survival time）は Ｍ・Ｓ・Ｔ・＝Ｌ＋Ｃ×Ｊ／fMで表わされる。 （但しＬは中間のマウスの死亡日の下限値、 Ｃは死亡日の１区切、したがつて普通は１、 fMは中間のマウスの死亡日に死亡したマウ
スの総数、 Ｊは中間のマウスの死亡日のマウスの中で中
間マウスに到達するまでのマウス数である。） 抗癌化学物質のスクリーニングでＴ／Ｃ％120
以上が有効として評価される。 (3) BALB／Ｃ−METH−Ａ系の２群に対する
ホモカルノシンの投与は生存日数を延長し、か
つ消滅例があり抗腫瘍効果を示した。 BALB／Ｃ−METH−Ａ系は同種同系であ
るから、移植免疫のない同種同系に対する抗腫
瘍作用は人癌に対する有効性を更に確実とす
る。 以上のようなホモカルノシンの抗腫瘍作用はホ
モカルノシンを各種臓器癌、例えば胃癌、直腸
癌、乳癌、子宮癌、口腔癌、食道癌、胆癌、胆管
癌、胆道癌、膵臓癌、前立腺癌、悪性甲状腺腫
瘍、肺癌、脳腫瘍、肝臓癌、舌癌、胸腺腫、皮崩
癌などの治療に単独で、或いは例えばOK−432
のような免疫促進剤と併用してその作用を増強す
ることにより非常にすぐれた治療効果が期待でき
る。 本発明の抗腫瘍剤は疾患に対するホモカルノシ
ンの経口投与または非経口投与が都合よく行われ
るのであればどんな剤形のものであつてもよく、
例えば注射液、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル
剤、腸溶剤、軟膏剤、坐剤、注腸剤、トローチな
どの種々の剤形をあげることができるが、これら
を患者とその腫瘍の種類、症状などに応じてそれ
ぞれ単独で、または組合せて使用する。基礎的効
力実験から推定される成人の臨床用量は１日当
り、一般的には0.5〜３ｇ（経口）で、症状に応
じて適当な時間間隔で分割投与するのが好まし
い。 ホモカルノシンは水に易溶であるため、無菌的
操作のもとに容易にホモカルノシンの３％、５％
または10％水溶液をつくることができる。これを
不活性ガス気流下にアンプルに封入したものを普
通の注射器によつて注射する。また予め無菌的操
作によりアンプルあるいはバイアル瓶に凍結乾燥
して封入したホモカルノシン粉末を注射直前に無
菌蒸留水で溶解し、３％、５％または10％の水溶
液として直ちに注射に使用してもよい。 経口投与の粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセ
ル剤は結合剤例えばシロツプ、アラビヤゴム、ゼ
ラチン、ソルビツト、トラガントまたはポリビニ
ルピロリドン、賦形剤例えば乳糖、とうもろこし
デンプン、リン酸カルシウム、ソルビツトまたは
グリシン、潤滑剤例えばステアリン酸マグネシウ
ム、タルク、ポリエチレングリコール、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロースまたはシリカ、崩壊
剤例えば馬鈴薯デンプン、或は湿潤剤例えばラウ
リル硫酸ナトリウムなどを使用し、当業界では慣
用の方法で製剤する。錠剤は当業界において周知
の方法でコーテイングしてもよい。 軟膏剤を製造するには、製剤界に公知の技術に
したがい、所望濃度の軟膏となる量のホモカルノ
シンの微粉末を軟膏基剤例えばサラシ密ロウ、鯨
ロウ、脱水ラノリン、白色ワセリン、高級アルコ
ール、マクロゴール類あるいはプラスチベース
（大正製薬K.K.製ハイドロカーボンゲル軟膏基
剤）、日本薬局法収載の親水性軟膏、吸水軟膏ま
たはこれらの混和物と混和し、これに必要に応じ
ゴム油、落花生油、オリーブ油等の油類、樹脂
類、グリセリン、プロピレングリコール、界面活
性剤、殺菌剤、防微剤、酸化防止剤等を添加し、
均質となるまで十分にかきまぜて練り合わせる。 坐剤も軟膏剤とほぼ同じ様につくられ、例えば
溶解した坐剤基剤中に防腐剤とホモカルノシンと
を加えて均一に混合し、鋳型に流し込み、固化さ
せて取り出す。 つぎに本発明の抗腫瘍剤の製剤例をあげる。 製剤例 １ （注射剤） 無菌的操作のもとに、合成したホモカルノシン
を３％、５％または10％（いずれもホモカルノシ
ンとして）の水溶液としてアンプルに充填した。 製剤例 ２ （顆粒剤） 合成したホモカルノシンを用い下記処方 ホモカルノシン 0.2ｇ 乳 糖 0.34ｇ とうもろこしデンプン 0.45ｇ ヒドロキシプロピルメチルセルロース
0.01ｇ 顆粒剤 1.00ｇ で顆粒剤を製造した。 製剤例 ３ （軟膏剤） 合成したホモカルノシンを用い、ハイドロカー
ボンゲル軟膏基剤を基剤として下記処方 ホモカルノシン 0.2ｇ ハイドロカーボンゲル軟膏基剤 99.8ｇ 100ｇ で0.2％軟膏剤を製造した。 製剤例 ４ （坐剤） 合成したホモカルノシンを用いホスコＳ−55
（丸石製薬KK）を基剤として下記処方（坐剤１
ケ分） ホモカルノシン 0.02ｇ パラオキシ安息香酸エチル 0.00085ｇ ホスコＳ−55 適量 で坐剤を製造した。 ホモカルノシンとパラオキシ安息香酸エチルを
200メツシユで篩過し、50℃で溶解させたホスコ
Ｓ−55に少量づつ加え均一になるように調製し
た。鋳型への注加は38℃で行ない、室温で放冷固
化後冷蔵庫で冷却した。これを鋳型から除き、パ
ラフイン紙で包装した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ホモカルノシンまたはその塩を有効成分とし
   て含有する抗腫瘍剤。