JPH0372896A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、モノクローナル抗体、更に詳細には、マクロ
ファージ走化活性を有するポリペプチドに特異的に反応
する新規な単クローン抗体及びその製法に関するもので
ある。

本発明に係るモノクローナル抗体は、マクロファージ走
化活性を有するリンホカイン、サイトカインに特異的に
反応する特性を有しているので、本発明は、各種免疫機
構の解明や組織染色法、鑑別診断法等医療の技術分野に
おいて特に有効に利用されるものである。

〔従来の技術〕

一般的に、マクロファージ走化性因子（以下ＭＣＦと略
す）は、リンパ球及びリンパ球系株化細胞から特異的ま
たは非特異的に分泌されるマクロファージ走化活性を有
するリンフォカインの一種として知られている。また末
梢血リンパ球（以下ＰＢＬと略す）をレクチンたとえば
フィトヘムアグルチニン（以下ＰＨＡと略す）で刺激し
た後、その刺激リンパ球を培養した上清には高いマクロ
ファージ走化活性が認められることは既に知られている
。

さらに永続生存性を持たせるために白血病細胞株と上記
刺激リンパ球を融合させて得られたハイブリドーマの培
養上清にもマクロファージ走化活性が認められる（特開
昭６０−１８１０１８号公報）。

一方、遅延型過敏症において、感作動物に惹起反応を生
じさせ、皮膚反応が最大となる約４８時間後において、
その組織中にリンパ球の他マクロファージの浸潤が著明
であることから、遅延型過敏症発症においてＭＣＦの関
与が考えられている。

このようにＭＣＦは反応局所にマクロファージを集合さ
せる活性を有することで定義されるので。

抗腫瘍剤として医薬への応用が期待されている。

このようなＭＣＦの構造解析の検討はすでに行なわれて
おり、末梢血リンパ球より得たハイブリドーマからの精
製及び−次構造の決定が本発明者らの手によって成され
（特願昭６３−１７３７８５）、また、化学的合成法に
よっても合成されており、その−次構造は、下記の式（
１）に示すとおりである。

１１−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｙ−５ｓｒ−Ｇｌｕ−ＯＨ・・・（Ｉ）（式中、ＸはＧ
ｌｕ又はＧｌｎを表わし、ＹはＴｒｐ又はＡｒｇを表わ
す、） 本発明は上記のＭＣＦ活性を有するペプチドに特異的に
結合するモノクローナル抗体及び抗血清に関するもので
あるが、このようなものは従来知られておらず、新規で
ある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

このような技術の現状において、ＭＣＦ活性を有するペ
プチドと特異的に反応する物質の開発がなされれば、こ
の物質は、ＭＣＦ活性の阻害剤としであるいはＭＣＦ活
性を有するペプチドの精製剤として有効に利用されるは
ずである。

また一方、ＭＣＦが前述したように遅延型過敏症に関与
するため、ＭＣＦ活性を有するペプチドと特異的に反応
する物質が開発されれば、この物質は、免疫機構の関与
の有無を検索するための組織染色法又は鑑別診断法にお
いて有効に利用されるはずである。

このような観点から、ＭＣＦ活性を有するペプチドと特
異的に反応する物質の開発が当業界において待望されて
いたのである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、上記した業界のニーズに応えるためになされ
たものであって１ＭＣＦ活性を有するペプチドと特異的
に反応する物質について各方面から検討した結果、この
ような物質として、抗体、特にモノクローナル抗体に着
目した。

そして本発明者らは、ＭＣＦ活性を有するペプチドを化
学合成し、これに担体蛋白質を結合せしめこれを免疫原
として動物を免疫し、その動物のリンパ球とミエローマ
細胞とを融合させることにより得られたへイブリドーマ
細胞株が、　　ＭＣＦに対し特異的に反応しそして上記
用途に十分に使用できるモノクローナル抗体を生産する
という新知見を得、本発明を完成した。

次に本発明の詳細な説明する。

本発明のモノクローナル抗体を調製するためには、まず
、抗原を用意しなければならない０本発明において、抗
原の作製は、■生体試料又はその培養物を用いる生化学
的な方法、あるいは■化学的にアミノ酸を順次結合させ
る化学合成法によって行い、たとえばゲルタールアルデ
ヒドのような、ペプチドとタンパク質を結合させる試薬
を用い、かさ貝のヘモシアニンや血清アルブミン、卵白
アルブミンなどの担体タンパク質と結合させて用いるが
、具体的には以下に述べる方法による。

■生体試料又はその培養物を用いる生化学的な方法。

ａ）ヒト末梢血リンパ球を用いる方法。

本発明におけるＭＣＦ活性を有するペプチド（以下。

本発明のペプチドと略称することもある）を製造する原
料としては、ヒト末梢血リンパ球（以下。

ＰＢＬと略す）を用いる方法がある。

ＰＢＬは、　ヒト末梢血を用い、比重によってリンパ球
を分離する方法によって取得される。

すなわち、シグマ社Ｈｉｓｔｏｈｙｐａｑｕｅ液やファ
ルマシア社１１ＦｉｃｏｌやＰｅｒｃｏｌｌ液の適当な
比重液に末梢血を重層し、例えば１５００ｒｐｍ　Ｘ　
２０ｍ１ｎの強さの遠心をかけると、リンパ球が豊富な
画分を得ることができる。この両分をプラスチックシャ
ーレにはりつけ、非付着細胞をリンパ球として用いるこ
ともできる。

本発明のペプチドを製造するには、通常用いられる培地
たとえば１０％牛脂児血清（Ｆｅ２）含有ＲＰＭＩ１６
４０培地にＰＢＬを浮遊させ、レクチン（コンカナバリ
ンＡやフィトヘムアグルチニンなど）を加えて培養され
るが、例えば２０ｈｒなど適当な時間培養しておいたリ
ンパ球を用いる方が培養効率がよいのでより好ましい。

本発明のペプチドを得るためには、ＰＢＬを無血清培地
に再懸濁させ、通常の培養方法、たとえば５％ＣＯ１存
在下３７℃で１時間から数日間培養する方法で培養した
のち、その上清液を用いる。

ＰＢＬの無血清培地への再懸濁、培養を行なわないで、
　　ＰＢＬ細胞をそのまま破壊し、比較的大きな細胞器
管を除くための遠心分離を行なってその上清液（セルラ
イセード）を用いることもできる。この際の遠心分離は
、例えば１０　＊　０００　Ｘ　ｇ、２０分程度行なえ
ば良い。

ＰＢＬの培養上清又はセルライセードから本発明のペプ
チドを得るには、まず、培養上清又はセルライセードか
ら限外ろ過など分子のサイズでわける方法を用いて高分
子画分を除く、この溶液を陰イオン交換体に吸着させ、
塩濃度を上昇させることによりペプチドを溶出させるこ
とができる。尚、陰イオン交換体としてはＤＥＡＥ　（
ジエチルアミノエチル交換体）やＱＡＥ（第４級アミノ
エチル交換体）さらに、ファルマシア社１１Ｍ。ｎｏ　
Ｑなども用いることができる。

さらに、ここに得られる活性画分を、陽イオン交換体に
吸着させ、塩濃度を上昇させることにより溶出させるこ
とができる。尚、陽イオン交換体としてはファルマシア
社製阿。ｎｏ　Ｓやカルボキシメチル交換体などを用い
ることができる。

さらに、ここに得られる活性画分を逆相クロマトグラフ
ィーに供与し、通常アセトニトリルなどの有機溶媒の濃
度を上昇させることによって溶出してほぼ純粋なペプチ
ドを得ることができる。

ｂ）株化されている細胞を用いる方法 本発明の新規ペプチドを製造する原料としては、株化さ
れている細胞を用いることができる。原料としての効率
を考慮に入れなければ、白血病細胞株ＯＥＭなどを用い
ることもできるが、末梢血リンパ球と白血病細胞株との
ハイブリドーマを用いた方が、本発明のペプチドを効率
よく製造することができるので好ましい。

株化された細胞を用いて本発明のペプチドを製造するに
は、ＰＢＬを用いて本発明のペプチドを製造する際に採
用した手順をそのまま採用することができる。

上記ａ）及びｂ）で精製したペプチド又は部分的に精製
したペプチドを抗原として用いることができる。

■化学的にアミノ酸を順次結合させる化学合成法 ペプチドの化学合成法としては、同相合成法が広く用い
られている６本発明のペプチド類を合成する際にも、こ
の方法を用いることができる。

同相合成法においては、種々のアミノ酸部分の反応性側
鎖を適当な保護基で保護することにより、保護基が最後
に除去されるまで反応性側鎖で起こる可能性のある化学
反応を防止することができる。

例えば、ＡｓｐＪＧｌｕにおける側鎖保護基としては、
０Ｂｚ１．０ｔＢｕを用いることができ、　　Ｓｅｒ、
　Ｔｈｒ、　Ｔｙｒにおける側鎖保護基としてＢｚｌ、
　Ｂｒ−Ｚ、　ｔＢｕを用いることができる。また、Ｌ
ｙｓにおいてＣＩ−Ｚ、　Ｔｏｓが、ＡｒｇにおいてＴ
ｏｓｌＭＴＳ、　Ｍｔｒが、ＨｉｓにおいてＴｏｓ、Ｄ
ＮＰ、　Ｔｒｔ・０）１が、ＴｒｐにおいてＣＨＯが、
Ｃｙｓにおいては４−ＭｅＢｚｌ、　４−ＭｅＯＢｚｌ
が側鎖保護基として用いられる。　　Ｎｅｔはスルホキ
シドの形で保護することができる。固相合成法としては
、Ｂｏｃ法、Ｆ＋＋＋ｏｃ法が代表的であり、どちらの
方法も本発明のペプチド類合成の際に利用できる。固相
台或は、例えば、α−アミノ保護アミノ酸を用いてペプ
チドのＣ−末端から開始することができる。適当な出発
材料は、例えば必要なα−アミノ保護アミノ酸をクロロ
メチル樹脂、オキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン
樹脂に付加することにより調製できる。また。

α−アミノ基及び側鎖基が保護されたアミノ酸の付加し
た４（オキシメチル）フェニルアセタミドメチル樹脂が
市販されており１本発明のペプチド類合成の際にも使用
することができる。また、本発明のペプチド類は、自動
固相合成機を利用しても合成することができる。

典型的なりｏｃ法ペプチド合合成工程を示す０例えば、
出発材料として、α−アミノ基をＢｏａ基で保護したア
ミノ酸樹脂を使用する。

１、０ＣＭで洗浄（３回） ２、　ＴＦＡ／ＤＣＭで脱Ｂｏｃ化 ３、０ＣＮで洗浄（３回） ４、　ＤＩ［ＥＡ／ＤＭＦで中和 ５、　ＤＭＦで洗浄（５回） ６、　Ｂｏｃアミノ酸無水物と反応 ７、０ＣＭで洗浄（５回） ８、工程２〜７の繰り返し ９、０ＣＭで洗浄（２回） １０、　Ａｒガスで乾燥 １１、アニソール／メチルスルフィド添加１２、−７０
℃でＨＦを添加、−２０℃７３０分、Ｏ℃／３０分反応 １３、　ＨＦを留去 １４、クロロホルム・エーテルで洗浄（３回）１５、５
Ｎ−酢゛酸水溶液で合成ペプチドを抽出１６、合成ペプ
チドをＨＰＬＣにて精製典型的なＦ■ｏｃ法ペプチド合
成の工程を示す１例えば、出発材料として、α−アミノ
基をＢｏｃ基で保護したアミノ酸樹脂を使用する。

１、　ＤＣＭで洗浄（３回） ２、　ＴＦＡ／ＤＣＭで脱Ｂｏｃ化 ３、　ＤＣＭで洗浄（３回） ４、　ＤＭＦで洗浄（３回） ５、　Ｆ曽ｏｃアミノ酸無水物と反応 ６、　ＤＭＦで洗浄（５回） ７、ピペリジン／　ＤＭＦで脱Ｆｍｏｃ化８、工程４〜
７の繰り返し ９、　ＤＭＦで洗浄（５回） １０、０ＣＭで洗浄（２回） １１、Ａｒガスで乾燥 １２、アニソール／メチルスルフィド添加／１゜２エタ
ンジチオール添加 １３、−７０℃でＨＦを添加、−２０℃／３０分、Ｏ℃
７３０分反応 １４、８Ｆを留去 １５、クロロホルム・エーテルで洗浄（３回）１６、５
Ｎ−酢酸水溶液で合成ペプチドを抽出１７、合成ペプチ
ドをＩ（ＰＬＯにて精製向、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基等が本明細書において記号で示される場合、
ＩＵＰＡＣ及び■ＵＰにより規定された或いは、ペプチ
ド化学の分野で使用される通常の記号を用いる。記号の
例は次の通りである。

Ａｌａ・・・Ｌ−アラニン Ａｒｇ・・・Ｌ−フルギニン Ａｓｎ・・・Ｌ−アスパラギン Ａｓρ・・・し−アスパラギン酸 Ｃｙｓ・・・Ｌ−システィン Ｇｌｎ・・・Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ・・・Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ・・・グリシン Ｈｉｓ・・・Ｌ−ヒスチジン １１ｅ・・・Ｌ−インロイシン Ｌａｕ・・・Ｌ−ロイシン Ｌｙｓ・・・し−リジン Ｎｅｔ・・・Ｌ−メチオニン Ｐｈｅ・・・Ｌ−フェニルアラニン Ｐｒｏ・・・Ｌ−プロリン Ｓｅｔ・・化−セリン Ｔｈｒ・・・Ｌ−スレオニン Ｔｒｐ・・・Ｌ−トリプトファン Ｔｙｒ・・・Ｌ−タイロシン Ｖａｌ・・・Ｌ−バリン ＨＰＬＣ・・・高速液体クロマトグラフィー００８カラ
ム・・・ＣＩ８カラム ）ＩＭＦレジン・・・ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸
レジン（樹脂） ＰＡＭレジン・・・フェニルアセタミドレジン（樹脂）
ＢＨＡレジン・・・ベンズヒドリルアミンレジン（樹脂
） ＤＣＭ・・・ジクロロメタン ＤＮＦ・・・ジメチルホルムアミド ＴＦ＾・・・トリフルオロ酢酸 Ａｒガス・・・アルゴンガス Ｂｚｌ・・・ベンジル基 ｔＢｕ・・・ｔ−ブチル基 Ｚ・・・ベンジルオキシカルボニル基 Ｂｏｃ・・・ブチルオキシカルボニル基Ｔｏｃ・・・ト
シル基 ＭＴＳ・・・メシチレン−ニースルホニル基Ｔｒｔ・・
・トリチル基 ＤＮＰ・・・２，４−ジニトロフェニル基Ｍｔｒ・・・
４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホ
ニル基 Ｆｍｏｃ・・・９−フルオレニルメトキシカルボニル基
上記化学的方法で合成したペプチドを抗原として用いる
ことができる。

また、本発明において抗原として使用するペプチドは、
上記した方法で製造するだけでなく、他の化学合成法や
当該ペプチドに対応するＤＮＡを得て、これを適当なベ
クターに挿入し、動物細胞や微生物で発現せしめる遺伝
子操作技術によって製造することもできる。

なお、当該ペプチドのみでは、これを動物に免疫しても
抗体を産生しない場合があるが、このような場合には、
担体蛋白質を利用すればよい。担体蛋白質として業界で
常用されているものが適宜使用でき１例えば、かさ貝の
ヘモシアニン、血清アルブミン、卵白アルブミン等が使
用できる６次にこのペプチドを用いてモノクローナル抗
体を製造するのであるが、それには常法、例えばケーラ
ーとミルシュタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２５６゜
４９５−４９７．１９７５）、　　特公昭５ｇ−４５４
０７号、同５９−２２７６号に記載の方法、にしたがっ
て行えばよい。

すなわち、該ペプチドを用い、必要あればアジュバント
と併用して動物を免疫する。血清をＥＬＩＳＡ法等によ
ってバイオアッセイを行い、血清が該ペプチドと反応す
ることを確認する。

このようにして免疫された動物から、リンパ球を採取す
る。リンパ球＊製には肺臓、リンパ節、末梢血等が用い
られる。このリンパ球を骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）
と融合させる。骨髄腫細胞としては、特定酵素の欠損し
た細胞、例えばマウスミｘ　Ｏ−マＰ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−Ｕｌ　（Ｐ３−０１）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６
５３（Ｘ６３−６５３）、　Ｐ３−ＮＳＩ−１−Ａｇ４
−１　（ＮＳ−１）、ラットミエローマ２１０−ＲＣＹ
３−＾ｇ１２３等既知の株が適宜使用される。細胞融合
は、融合剤としてポリエチレングリコール、センダイウ
ィルス等を用いて常法にしたがって行う。

細胞融合の終了後、選択培地、例えばＨＡＴ　（ヒポキ
サンチン−アミノプテリン−チミジン）培地によりハイ
ブリドーマを選択する。

当該ペプチドに対する抗体を産生じているハイブリドー
マを、後記の酵素免疫測定法により選出しその後限界希
釈法によるクローニングを数回くり返すと、モノクロー
ナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞が得られる。

こうして得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ細胞株を好ましくは同系の動物の腹腔内に接種し、増
殖させたのち腹水を採取することにより、あるいは培養
器で培養することにより。

目的のモノクローナル抗体を得ることができる。

こうして得られた抗体は必要に応じ精製して使用するこ
とができる。すなわち硫安分画、イオン交換体、ゲル濾
過、アフィニティクロマトグラフイーなどの、通常タン
パク質に適用される方法を用いて精製することができる
。

次に本発明の実施例について述べる。

実施例 （１）動物の免疫と抗体生産細胞の調製８〜ＬＯ週令、
望ましくは８週令のマウスを、化学的に合成され、アミ
ノ酸配列（１）を有するペプチド（ペプチドＡ）をゲル
タールアルデヒドでカサ貝ヘモシアニンと結合させたも
の（抗原Ｂ）で免疫して、その動物の牌、リンパ節、末
梢血中の抗体産生細胞を調製する。免疫するマウスは、
担体タンパク質として用いるカサ貝ヘモシアニンで前処
理して免疫寛容にしておくのが好ましい。

免疫の方法は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔
内に、適当なアジュバント〔例えば、フロイントの完全
アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’５Ａ
ｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百
日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原Ｂを投与する。

以後、工〜２週問おきに、抗ａＢを２〜５回投与する。

各免疫後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清
がペプチドＡと反応することを以下に示す酵素免疫測定
法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）　：医学書院刊１９
７６年〕などで調べる。

酵素免疫測定法： ９６大のＥＩＡ用プレート　〔フロー・ラボラトリーズ
（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、ペ
プチドＡ（１０〜１０００μｇ／−）を１００〜２００
μｍ２／穴ずつ分注し、４℃で工〜２晩放置して、上清
を抜き去った後、ｌＯ％ＢＳＡ　（牛血清アルブミン）
−ＰＢＳを１００〜２００μ氾／穴分注し、４℃で１〜
２晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基
をブロック（ブロッキング）した。その後、ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳを捨て、第１抗体として、　ＢＳＡ　−ＰＢＳで希
釈した試料（マウス血清、ハイプリドーマ培養上清、粗
精製モノクローナル抗体）を１００μＱ／六分注し、４
℃で１晩放置する。レジン水で１回、２ＭＮａＣＱ溶液
で６回洗浄した後、第２抗体としてヤギのビオチン化抗
マウスイムノグロブリンＩｇＧ　（ベクターラボラトリ
ーズ社製、販売元フナコシ薬品（株）〕の１１００倍希
釈を１００μ息／穴分注し、室温′Ｑ１５分間放置する
。　ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ結合アビジン−
ビオチン複合体〔同上〕の５０倍希釈液を１００μに／
大分注し、室温で１５分間放置する。

さらにＰＢＳでよく洗浄後、ＡＢＴＳＢ質液［２，２’
−７ジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸）ニアンモニウム５５０Ｂを０．１１４クエン酸
緩衝液（ｐＨ４，２）　Ｉ　Ｑに溶かした溶液に、使用
直前に過酸化水素ｌμＱ／ｍＱを加えた溶液〕を用い、
発色を０Ｄ４１Ｓｎｌｌｌの吸光度で測定する。このと
き、ペプチドＡに対して強く反応するマウスを免疫マウ
スとしてハイブリドーマ作製のための抗体産生細胞の供
給源として用いる。

酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞そ
のものを用いる場合は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　
３０７２プレート中で、標的、１８１１ｍヲ培１１Ｌ、
０．２５％ゲルタールアルデヒド−ＰＢＳを加え、室温
に１〜２時間放置し、ＰＢＳでよく洗浄後、１％ＢＳＡ
−ＰＢＳ　１００〜２００μ悲を加え、２時間放置し、
レジン水またはＰＢＳでよく洗浄し、そのプレートを用
いて、一般の抗原コートプレートを用いるのと同様の方
法にて、抗体価の測定を行った。

細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４日前に、抗原Ｂを２０〜４００μｇ／匹腹腔内
に投与し、＊Ｓを摘出し、肺細胞を調製する。すなわち
、肺臓をｌｌＩＥＭ（日本製薬社製）中で細断し、ビン
セットでほぐし、　　１２００ｒｐｍ、　５分間遠心分
離にかけ、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝
液（ＰＨ７，６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し
、’ＭＥＭで３回洗浄して融合用肺細胞として提供する
。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕｌ
（Ｐ３−Ｕｌ）（カレント・トピックス・イン・ミクロ
バイオロジイ・アンド・イムノロシイ−１（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｎｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　
ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−１））（ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ
　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　６．５１１−５１９
（１９７６））、ＳＰ２１０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（
ネイチ’ｒ　　（Ｎａｔｕｒｅ）２７６、２６９−２７
０（１９７８））、　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３　（
６５３）（ジャーナ／ｌ／　−オプ・イムノロシイ（Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１２３．１５４８−１５５
０　（１９７９））、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）
（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６．４９５−４９７
（１９７５））、ＭＳ−１（正式名称：Ｐ３／ＮＳＩ／
１−Ａｇ４−１）（（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｕｎｏｌ、
　ｖｏＱ　６．　ｐｓｉｌ、　１９７６）　（購入先大
日本製薬株式会社）〕などが用いられる。

これらの細胞株は、８−アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−
１６４０培地にグルタミン（１，５ｍＭ）、　２メルカ
プトエタノール（５Ｘ１０−’Ｍ）、ジェンタマイシン
（ｉｏμｇ／ｍＱ）および牛胎児血清（Ｆｅ２）（ハイ
クローンラボラトリーズ社製）（１０％）を加えた正常
培地に、さらに８−アザグアニン（１５％ｇ／ｍＲ）を
加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正
常培地に継代し、融合当日２Ｘ１０’以上の細胞数を確
保する。

なお１本実施例では、上記細胞株の内、Ｎ５−１を使用
した。

（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＮ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数
が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよ
うに混合し、遠心分離（１，２０Ｏｒｐｍ、　５分）し
た後、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、
攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール１
，０００（ＰＥＧ−１，０００）　２　ｇ　、　ＭＥＭ
　２ｍＡおよびジメチルスルホキト０　、７ｍＭの混液
０．２〜１　ｍｕ／１０３抗体産生細胞を加え、１〜２
分間毎にＨＥＭ　１〜２−を数回加えた後、ＭＥＮを加
えて全量が５０−になるようにする、遠心分離（９００
ｒｐｍ、　５分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほ
ぐした後、正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０、ＦＣ３ＩＯ
％）　１００＋ａ塁を加え、メスピペットによる吸込み
、吹出しでゆるやかに細胞を懸濁する。

この懸濁液を２４穴培養用プレートに１　ｒａＱ／穴ず
つ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２
４時間培養する。培養プレートに１−／穴の）ＩＡＴ培
地〔正常培地にヒポキサンチン（１０″−４ｓ）、チミ
ジン（１，５Ｘ　１０−’Ｍ）およびアミノプテリン（
４Ｘｌ０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さらに２４時
間培養する。

以後２日間、２４時間毎に、培養上清１−を捨て、新た
に同量の）ＩＡＴ培地を加え、ＣＯ，インキュベーター
中、３７℃で１０〜１４日間培養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清１−を捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミ
ノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間２４
時間毎にＨＴ培地への変換を行う。

ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫測定法により、ペプチドＡに対する抗体価
を測定する。限界希釈法によりクローニングを２回くり
返し、安定してペプチドＡに強い抗体価の認められたも
のを抗ＭＣＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株
として選択する。

（４）モノクローナル抗体の調製 プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　０．５−を腹腔内投
与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のＣ５７ＢＬ
／　６雌マウスに、（３）で得られた抗ＭＣＦモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４Ｘ１０’細胞
７匹を腹腔内注射する。　１０〜２１日でハイブリドー
マは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心
分離（３，０００ｒｐｍ、５分）して固形分を除去後、
５０％硫酸アンモニウムにて塩析し、ＰＢＳにＮａＣＱ
　Ｏ，５Ｍを加えた液で透析し、セファクリル５３００
　（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）（ベット
ボリューム７５０ｍＡ）のカラムに流速１５ｍＡ／ｈｒ
で通塔し、ＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体
とする。

抗体のイソタイプの決定は、オクタロニイ（Ｏｕｃｈｔ
ｅｒｌｏｎｙ）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門
、生物化学実験法１５、学会出版センター刊、Ｐ、７４
．１９８１年）によって行う。

蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍの吸光
度［１−４（ＯＤｚｓｏ）’；イムノグロブリン１　ｍ
ｇ／ｍＱ）より算出する。

以上の如く得られたモノクローナル抗体のペプチドＡに
対する結合性とイムノグロブリンのサブタイプを第１表
に示す・ （ここでペプチドＡはＴｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−３ａｒ−Ｇｌｕを、ペプチ
ドＮはＴｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕを、ペ
プチドＣはＧｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕを
表わす、） （発明の効果） 本発明に係るモノクローナル抗体は、従来未知の新規物
質であって、マクロファージ走化活性を有するリンホカ
イン、サイトカインに特異的に反応する特性を有してい
るので１本発明は、ＭＣＦの分離精製のほか、各種免疫
機構の解明や組織染色法、鑑別診断法等医療や生化学の
技術分野において特に有効に利用されるものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）マクロファージ走化活性（ＭＣＦ活性）を有する
   リンフォカイン又はサイトカインに特異的に結合するモ
   ノクローナル抗体。 （２）マクロファージ走化活性（ＭＣＦ活性）を有する
   リンフォカイン又はサイトカインに特異的に結合し、Ｍ
   ＣＦ活性を阻害するモノクローナル抗体。 （３）下記アミノ酸配列（ I ）で表わされるペプチド
   に特異的に結合するモノクローナル抗体。 Ｈ−Ｖ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ
   −Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−ＯＨ・・・（ I ）（式中、ＸはＧ
   ｌｕ又はＧｌｎを表わし、ＹはＴｒｐ又はＡｒｇを表わ
   す。） （４）アミノ酸配列（ I ）又はこのアミノ酸配列の中
   で少なくとも連続する４個のアミノ酸配列を部分的に有
   するペプチド又は蛋白質に特異的に結合するモノクロー
   ナル抗体。（５）マクロファージ走化活性を有するリン
   フォカイン又はサイトカインを抗原として哺乳動物を免
   疫して該哺乳動物から抗体産生細胞を得、次いでこの細
   胞を培養し、培養液中からマクロファージ走化活性を有
   するリンフォカイン又はサイトガイシに特異的に結合す
   るモノクローナル抗体を取得することを特徴とする該抗
   体の製造法。 （６）マクロファージ走化活性を有するリンフォカイン
   又はサイトカインが、アミノ酸配列（ I ）のうちの少
   なくとも連続する４個のアミノ酸配列を部分的に有する
   ペプチド又は蛋白質である請求項５記載の製造法。 （７）請求項１乃至４のモノクローナル抗体を産生する
   ハイブリドーマ。