JPS60181018A - ハイブリド−マｔｄ６−１８ - Google Patents
ハイブリド−マｔｄ６−１８Info
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- JPS60181018A JPS60181018A JP59036261A JP3626184A JPS60181018A JP S60181018 A JPS60181018 A JP S60181018A JP 59036261 A JP59036261 A JP 59036261A JP 3626184 A JP3626184 A JP 3626184A JP S60181018 A JPS60181018 A JP S60181018A
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- Japan
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- cell
- human
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- cells
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒ）Ｔ細胞ハイプリドーマＴＤ６−１８に関す
るものである。
るものである。
更に詳細には、本発明は、マクロファージ走化性因子Ｍ
ＣＦ−ＴＤ６−１８を著量生産するヒトＴ細胞ハイブリ
ドーマ’Ｉ’Ｄ６−１８１Ｃ関するものである。
ＣＦ−ＴＤ６−１８を著量生産するヒトＴ細胞ハイブリ
ドーマ’Ｉ’Ｄ６−１８１Ｃ関するものである。
一般に、ヒト免疫系においては、白血球中のリン／ξ秤
が１に要吟役割を演じており、このリンパ球は、骨髄由
来のＢ細胞と胸腺由来のＴ細胞に大別することができる
。このうちＢ１１１１１脂は、抗体を産生ずる事が知ら
れており、近年細胞融合の技術を用いて、とのＢ細胞由
来の抗体な極ｄ）て特異性の高い単クローン性抗体とし
て、クローン化したノ・イブリドーマより取得する方法
が確立している。
が１に要吟役割を演じており、このリンパ球は、骨髄由
来のＢ細胞と胸腺由来のＴ細胞に大別することができる
。このうちＢ１１１１１脂は、抗体を産生ずる事が知ら
れており、近年細胞融合の技術を用いて、とのＢ細胞由
来の抗体な極ｄ）て特異性の高い単クローン性抗体とし
て、クローン化したノ・イブリドーマより取得する方法
が確立している。
また、Ｔ細胞は、免疫系を制御する因子の他に、様々な
生理活性を示すと考え得る各種のリンホカインを産生ず
る事が知られているが、近年、とのＴ細胞においても細
胞融合の技術を用゛いてノ・イブリドーマを作成しよう
とする試みがなされている。
生理活性を示すと考え得る各種のリンホカインを産生ず
る事が知られているが、近年、とのＴ細胞においても細
胞融合の技術を用゛いてノ・イブリドーマを作成しよう
とする試みがなされている。
その中でヒ）Ｔ細胞ハイブリドー１作成に関しては、小
林らＫよって開発されたエメチン、アクナノマイシン法
（Ｊ 、 Ｉｒｆｆｎｕｎｏｌｏｇｙ １２Ｂ、 ２７
１４（１９８：２））は、融合効率が高く、高頻度でハ
イブリドーマを取得し得る事が知られている。
林らＫよって開発されたエメチン、アクナノマイシン法
（Ｊ 、 Ｉｒｆｆｎｕｎｏｌｏｇｙ １２Ｂ、 ２７
１４（１９８：２））は、融合効率が高く、高頻度でハ
イブリドーマを取得し得る事が知られている。
一方、遅発型過敏症に関して、本反応には、これを惹起
するにあたって、Ｔ細胞が分泌するリンホカインが関与
すると考えられてｂる。即ち、遅発型過敏症反応の特徴
として、組織学的にみたとき、反応局所にマクロファー
ジの集積が観察されるが、これは反応の時間的な推移と
密接に関連しているところから、マクロファージの集積
が遅発型過敏症の発症の大入な要因と考えられている。
するにあたって、Ｔ細胞が分泌するリンホカインが関与
すると考えられてｂる。即ち、遅発型過敏症反応の特徴
として、組織学的にみたとき、反応局所にマクロファー
ジの集積が観察されるが、これは反応の時間的な推移と
密接に関連しているところから、マクロファージの集積
が遅発型過敏症の発症の大入な要因と考えられている。
そ１２て、このマクロファージの集積はＴ細胞が分泌す
るリンホカインによって引き起されているのである。
るリンホカインによって引き起されているのである。
リンホカインを含めてマクロファージをその濃度勾配に
従って移動させる因子はマクロファージ走化性因子と称
されている。
従って移動させる因子はマクロファージ走化性因子と称
されている。
そこで、遅発型過敏症の研究には、マクロファージ走化
性因子の究明が必要となってくる。しかし１、このマク
ロファージ走化性因子を取得する場合、ヒト末梢血リン
パ球より取得しようとすると極＃′に多量のリンパ球が
必要となり、大量安定取得はとうてい不可能であった。
性因子の究明が必要となってくる。しかし１、このマク
ロファージ走化性因子を取得する場合、ヒト末梢血リン
パ球より取得しようとすると極＃′に多量のリンパ球が
必要となり、大量安定取得はとうてい不可能であった。
本発明者らは、マクロファージ走化性因子を多量取得す
る目的で、これを生産するヒト末梢血リンパ球を永続生
存性リンパ球とする研究を行った結果、ヒト急性Ｔ細胞
白血病細胞株ＯＥＭ−１１と融合させることによね、す
ぐれた融合株を得ることに成功したのである。
る目的で、これを生産するヒト末梢血リンパ球を永続生
存性リンパ球とする研究を行った結果、ヒト急性Ｔ細胞
白血病細胞株ＯＥＭ−１１と融合させることによね、す
ぐれた融合株を得ることに成功したのである。
本発明の融合株はマクロファージ走化性因子ＭＣＦ−Ｔ
Ｉ１６−１８ を著量生産するととにおいてきわめて特
徴的で新規な融合株と認められ、これをヒトＴ細胞ハイ
ブリドーマＴＤ６−１８と命名するに到った。
Ｉ１６−１８ を著量生産するととにおいてきわめて特
徴的で新規な融合株と認められ、これをヒトＴ細胞ハイ
ブリドーマＴＤ６−１８と命名するに到った。
本発明のヒ）Ｔ細胞ハイブリドーマＴＤ６−１８は一８
０℃の約半年間の保存殖鎚ぎによって半永久的に生存さ
せることができるが、微工研における寄託は受付けられ
なかった。
０℃の約半年間の保存殖鎚ぎによって半永久的に生存さ
せることができるが、微工研における寄託は受付けられ
なかった。
本発明のヒ）Ｔ細胞ハイブリドーマＴＤ６−１８の親株
であるヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株ＯＥＭ−１１ｔｊＫ
ｏｂａｙａｓｈｉ 、 Ｙ 、 ｅｔ ａｌ （Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ 。
であるヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株ＯＥＭ−１１ｔｊＫ
ｏｂａｙａｓｈｉ 、 Ｙ 、 ｅｔ ａｌ （Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ 。
１２８ ２７１４ １９Ｂ２）及びＨｉｇｕｃｈ ＋
Ｍ ＊ｅｔ ａｌ （Ｃｅｌｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ ７
ＥＬ ２５７１９８３）Ｋよって発表されたもので、入
手可能なものである。
Ｍ ＊ｅｔ ａｌ （Ｃｅｌｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ ７
ＥＬ ２５７１９８３）Ｋよって発表されたもので、入
手可能なものである。
次に、本発明のヒ）Ｔ細胞ハイブリドーマＴＤ６−１８
の創製方法について述べる。
の創製方法について述べる。
本発明のＴＤ６−１８株は、ヒト急性Ｔ細胞白血病細１
１ｊ１株ｃＥＭ−１１とフイトヘムアグルチニン（ＰＨ
Ａ）で刺激したヒト末梢血リンパ球をエメチン、アチノ
マイシン法によって融合されて得られたもので、融合株
の確認は培養液のマクロファージ走化性活性の測定によ
って行なわｉ′１だ。
１ｊ１株ｃＥＭ−１１とフイトヘムアグルチニン（ＰＨ
Ａ）で刺激したヒト末梢血リンパ球をエメチン、アチノ
マイシン法によって融合されて得られたもので、融合株
の確認は培養液のマクロファージ走化性活性の測定によ
って行なわｉ′１だ。
（１）創製
まず、ヘパリン採廂したヒト静脈血２０ｍ１より、フィ
コ−ルウログラフイン法忙より、リンパ球を分離した。
コ−ルウログラフイン法忙より、リンパ球を分離した。
このリンパ球をＩ Ｘ １０’ ／ ｍｌの割合でＰＨ
Ａ−Ｐ（マイルス社製ＰＩ−ＩＡ） （１０ｐｌ／ ／
ｌｎｌ＞存在下で、Ｔ１．ＰＭ１１６４０（１０％ＦＣ
８（仔牛血清））培養液にて６７℃、５％ ＣＯ２イン
キユベータ中で２日間培養した。その後、リンパ球のブ
ラスト化が起っている事を確認し、遠心分離（’１１０
００ｒｐ。
Ａ−Ｐ（マイルス社製ＰＩ−ＩＡ） （１０ｐｌ／ ／
ｌｎｌ＞存在下で、Ｔ１．ＰＭ１１６４０（１０％ＦＣ
８（仔牛血清））培養液にて６７℃、５％ ＣＯ２イン
キユベータ中で２日間培養した。その後、リンパ球のブ
ラスト化が起っている事を確認し、遠心分離（’１１０
００ｒｐ。
５ｍ１ｎ）Ｌ、細胞を０．１Ｍラクトース溶液に分散さ
せ、５０分間３７℃に保存し、さら忙遠心洗浄（１００
０ｒｐｍ、５ｍ１ｎ ）Ｌ、ＰＨＡ−Ｐ による細胞凝
集を除去した。この様にして調製した末梢抑リンパ球を
融合に使用する。
せ、５０分間３７℃に保存し、さら忙遠心洗浄（１００
０ｒｐｍ、５ｍ１ｎ ）Ｌ、ＰＨＡ−Ｐ による細胞凝
集を除去した。この様にして調製した末梢抑リンパ球を
融合に使用する。
一方、ヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株ＣＦｆＭ−１１をＲ
ＰＭ１１６４０（無血清）に分散させ、エソチン５ＸＩ
Ｏ−’ 在条件下で、３７℃２時間保存し、リン酸等張バッファ
ー（ＰＢ８）にて６回洗浄した。この細胞と、前述の末
梢崩リンパ細胞を１：１０の割合で混合し、ゆるいぼレ
ットを作り、この中ＩＣ４５％ポリエチレングリコール
−４０００と、ポリーＬーアルギニン５μｇ／−の溶液
を６７℃の条件下で除々に入れて融合した。遠心分離（
８００ｒｐｍ４分）後、上清を十分に除去し、ＲＰＭ１
１６４０（１０チＦＣ８．２ｍＭグルタミン、５Ｘ１０
４Ｍ２−メルカプトエタノール）中にＩ Ｘ １ ０Ｉ
Ｉ／ １ｌｒｔ割合で分散させ、この０．１に／を９
６ ｗｅｌｌ（穴）フラットマイクロプレートに入れた
。さらにフィーダー細胞として、マイトマイシン−〇処
理（５μｇ／ｄ）した細胞株ＣＢＭ−５を４Ｘ１０１／
ｄ の割合で０．１ ｍ、ｌ！加え六〇このプレートを
３７℃、５チＣ０２の条件下培養した。その後、約１日
おきに培養液を交換し１、約２週ｍ１移、ろ２ ／ ６
０ ｗｅｌｌの割合でハイブリドーマを取得した。
ＰＭ１１６４０（無血清）に分散させ、エソチン５ＸＩ
Ｏ−’ 在条件下で、３７℃２時間保存し、リン酸等張バッファ
ー（ＰＢ８）にて６回洗浄した。この細胞と、前述の末
梢崩リンパ細胞を１：１０の割合で混合し、ゆるいぼレ
ットを作り、この中ＩＣ４５％ポリエチレングリコール
−４０００と、ポリーＬーアルギニン５μｇ／−の溶液
を６７℃の条件下で除々に入れて融合した。遠心分離（
８００ｒｐｍ４分）後、上清を十分に除去し、ＲＰＭ１
１６４０（１０チＦＣ８．２ｍＭグルタミン、５Ｘ１０
４Ｍ２−メルカプトエタノール）中にＩ Ｘ １ ０Ｉ
Ｉ／ １ｌｒｔ割合で分散させ、この０．１に／を９
６ ｗｅｌｌ（穴）フラットマイクロプレートに入れた
。さらにフィーダー細胞として、マイトマイシン−〇処
理（５μｇ／ｄ）した細胞株ＣＢＭ−５を４Ｘ１０１／
ｄ の割合で０．１ ｍ、ｌ！加え六〇このプレートを
３７℃、５チＣ０２の条件下培養した。その後、約１日
おきに培養液を交換し１、約２週ｍ１移、ろ２ ／ ６
０ ｗｅｌｌの割合でハイブリドーマを取得した。
（２）得チれたハイプリドーマ培養上清のマクロファー
ジ走化性活性 前述（１）のｕ％ Ｋ ＋、、て得らり、た３２のハイ
ブリドーマに関【２てその培養上清のマクロファージ走
化性活性を検討し、た。活性測定法としては、改良ボイ
デン法を用いた。すなわち、ポアサイズ５μｍのメンブ
ランフィルタ−で区切った、上下２室より成るチャンバ
ーを用いた。上室には、流動／セラフイン（２０ｍ／’
）で刺激し′ｆＣ５〜４日後のモルモット腹腔浸出細胞
（９０％以上マクロファージ）を２ Ｘ １０’ ／ｍ
ｌ！で入れ、王室妃ノ・イブリド−マロ２株の各培養上
清と対照として、ＰＨＡ−Ｐ Ｓｕｐ。
ジ走化性活性 前述（１）のｕ％ Ｋ ＋、、て得らり、た３２のハイ
ブリドーマに関【２てその培養上清のマクロファージ走
化性活性を検討し、た。活性測定法としては、改良ボイ
デン法を用いた。すなわち、ポアサイズ５μｍのメンブ
ランフィルタ−で区切った、上下２室より成るチャンバ
ーを用いた。上室には、流動／セラフイン（２０ｍ／’
）で刺激し′ｆＣ５〜４日後のモルモット腹腔浸出細胞
（９０％以上マクロファージ）を２ Ｘ １０’ ／ｍ
ｌ！で入れ、王室妃ノ・イブリド−マロ２株の各培養上
清と対照として、ＰＨＡ−Ｐ Ｓｕｐ。
（ヒト末梢血リンパ球をＰＨＡ−Ｐで刺激した培養上ｉ
ｌ＋ＩＦ） ｃｏｎｅ、 、 （ＰＨＡ−Ｐで刺激して
いないヒト末梢血リンパ球培養上清ＫＰＨＡ−Ｐを入れ
たもの）、ＣＥＭ、−１１Ｓｕｐ、（細胞株ＣＢＭ−１
１の培養上清）を入れ、！１７℃９０分間培養した。培
養終了後、フィルターをＰＢＳでよく洗った後、メタノ
ールで固定し、さらにギムザ染色し、水洗し、ヌライド
ガラス上にて風乾してさらにキシレンでゆるくしたパル
サムで封入した。フィルターの上面より下面に遊走し、
けりついた細胞を顕微鏡を用いて４００倍で観察し、０
．２５ＸＯ１２５闘の範囲内のマクロファージ数を計測
した。
ｌ＋ＩＦ） ｃｏｎｅ、 、 （ＰＨＡ−Ｐで刺激して
いないヒト末梢血リンパ球培養上清ＫＰＨＡ−Ｐを入れ
たもの）、ＣＥＭ、−１１Ｓｕｐ、（細胞株ＣＢＭ−１
１の培養上清）を入れ、！１７℃９０分間培養した。培
養終了後、フィルターをＰＢＳでよく洗った後、メタノ
ールで固定し、さらにギムザ染色し、水洗し、ヌライド
ガラス上にて風乾してさらにキシレンでゆるくしたパル
サムで封入した。フィルターの上面より下面に遊走し、
けりついた細胞を顕微鏡を用いて４００倍で観察し、０
．２５ＸＯ１２５闘の範囲内のマクロファージ数を計測
した。
本方法に従って、前述（１）にて作成したノ・イブリド
ーマの培養上清のマクロファージ走化性活性の測定をし
た結果が第１図である。その結果、ノ・イブリドーマ扁
１）−６に勃に強い活性を認めた。本活性は、陽性対象
であるリンパ球をＰＨＡ −Ｐ で刺激した培養上清よ
りも高く、約３倍の活性を認めた。
ーマの培養上清のマクロファージ走化性活性の測定をし
た結果が第１図である。その結果、ノ・イブリドーマ扁
１）−６に勃に強い活性を認めた。本活性は、陽性対象
であるリンパ球をＰＨＡ −Ｐ で刺激した培養上清よ
りも高く、約３倍の活性を認めた。
（３）ハイブリドーマのクローニング
マクロファージ走化性因子を単クローン性の因子として
取得するため、マクロファージ走化性活性の高いハイブ
リドーマＡＤ−６のクローニングを限界希釈法にて行っ
た。すなわち、９６ｗｅｌｌのフラットマイクロプレー
トを用い、０．５／ｗｅ１１の割合で希釈した１Ｄ−６
細胞分散液をすき、マイトマイシンＣ処ｔ＝ Ｌ、た細
胞株ＣＥＭ −’１ ’１をフィーダー細胞として入れ
、３７°Ｃ５ｃｍ ｃｏｔの条件下で２週間放猶し、６
９コのクローンを得た。
取得するため、マクロファージ走化性活性の高いハイブ
リドーマＡＤ−６のクローニングを限界希釈法にて行っ
た。すなわち、９６ｗｅｌｌのフラットマイクロプレー
トを用い、０．５／ｗｅ１１の割合で希釈した１Ｄ−６
細胞分散液をすき、マイトマイシンＣ処ｔ＝ Ｌ、た細
胞株ＣＥＭ −’１ ’１をフィーダー細胞として入れ
、３７°Ｃ５ｃｍ ｃｏｔの条件下で２週間放猶し、６
９コのクローンを得た。
（４）得られた各ハイブリドーマクローン上清のマクロ
ファージ沖化性活性 前述（３）の様［１，、て４Ｇらｉ′Ｌだハイブリドー
マクローンの培養上清を前述（２）と’（Ｗ＋ ａ！の
方法を用いて、マクロファージ走什性活性を測定した。
ファージ沖化性活性 前述（３）の様［１，、て４Ｇらｉ′Ｌだハイブリドー
マクローンの培養上清を前述（２）と’（Ｗ＋ ａ！の
方法を用いて、マクロファージ走什性活性を測定した。
対傅とｌで、ｃ、 ｐ。
（ｃｈｅｎｌ（＋ｔａｃｔｉｒ ｐｅｐｔｉｄｅ １
０”λ（）、Ｍｅｄｉｕｍ （ＩＬＰＭ１１６４０．１
０チＦＣ８，２ｍＭグルタミン５Ｘ１０−’Ｍ２−メル
カプトエタノール）を用いた。
０”λ（）、Ｍｅｄｉｕｍ （ＩＬＰＭ１１６４０．１
０チＦＣ８，２ｍＭグルタミン５Ｘ１０−’Ｍ２−メル
カプトエタノール）を用いた。
その結果はｆ！′Ｅ２図に示されるが、Ａ１８に高いマ
クロファージ走化性活性を認めた。
クロファージ走化性活性を認めた。
ことに得られたハイプリドーマクローン扁１８は、その
創製手段及び著しるしく高いマクロファージ走化性活性
から新規か細胞株と認められ、ハイブリドーマＴＤ６−
１８と命名さト、た。ハイブリドーマＴＤ６−１８はそ
の親株がヒト急ｅｌＴ細胞白血ＴＤ６−１８とも呼ばれ
る。
創製手段及び著しるしく高いマクロファージ走化性活性
から新規か細胞株と認められ、ハイブリドーマＴＤ６−
１８と命名さト、た。ハイブリドーマＴＤ６−１８はそ
の親株がヒト急ｅｌＴ細胞白血ＴＤ６−１８とも呼ばれ
る。
ヒトＴ細胞ハイプリドーマＴＤ６−１８は次の特徴を有
している。
している。
１ ヒト急性Ｔ細胞白皇病細胞株ＯＥＭ−１１とヒト末
梢血リンパ球との融合株である。
梢血リンパ球との融合株である。
２、比較的均一な円形状の細胞で、す７２球よ、りやや
大きい。
大きい。
３ 壁面等に非付着性の細胞である。
４−８０℃で長期間保存することができる。
十分数の細胞を、１ｏチＩ）ＭＳＯ（ジメチルスルフォ
キサイド）を含むＲＰＭ１１６４０（１０％ＦＣ８，２
ｍＭグルタミン、５Ｘ１０−’Ｍ２−メルカプトエタノ
ール）中に分散し、これをセラムチューブに入れ、−８
０℃のデージフリーザーに入れて保存する。
キサイド）を含むＲＰＭ１１６４０（１０％ＦＣ８，２
ｍＭグルタミン、５Ｘ１０−’Ｍ２−メルカプトエタノ
ール）中に分散し、これをセラムチューブに入れ、−８
０℃のデージフリーザーに入れて保存する。
５、マクロファージ走化性因子ＭＣＦ−ＴＤ６−１８を
著量生産する。
著量生産する。
６、継代培養：
培養液は１１．、ＰＭＩ １６４０ （１０％ Ｆｅ２
゜２ ｍＭグルタミン、５Ｘ１０−’Ｍ２−メルカプト
エタノール）を用い、プラスチック項部フラスコ（Ｃて
、３日ごとに、液邦・を１１５にし７．４１５の培養液
を加えて継代培養することができる。
゜２ ｍＭグルタミン、５Ｘ１０−’Ｍ２−メルカプト
エタノール）を用い、プラスチック項部フラスコ（Ｃて
、３日ごとに、液邦・を１１５にし７．４１５の培養液
を加えて継代培養することができる。
Ｚ 無血清培養：
本細胞株ＴＤ６−１８は、５Ｘ１０’／ｄでＲ，ＰＭ１
１６４０（無血清）中で３日まで細胞生存数に変什は無
く、しかも培養中にマクロファージ走化性因子ＭＣＦ−
ＴＤ６−１８を生産させることができる。
１６４０（無血清）中で３日まで細胞生存数に変什は無
く、しかも培養中にマクロファージ走化性因子ＭＣＦ−
ＴＤ６−１８を生産させることができる。
ハイブリドーマＴＤ６−１８ｉｄ’Ｒ，ＰＭＩ １６４
０（１０％ＦＣ８，２ｍＭグルタミン、５Ｘ１０−’Ｍ
２−メルカプトエタノール）培養液を用い、６７℃、５
％ＣＯ２下にインキュベーター中で約６日間静置１（５
４［］（無血清）培養液を用い、３７℃、５チＣＯ，下
にインキュベーター中で約３日間静置培養することによ
って培養液に著量のマクロファージ走化性因子ＭＣＦ−
ＴＤ６−１８を生産蓄積させることができる。
０（１０％ＦＣ８，２ｍＭグルタミン、５Ｘ１０−’Ｍ
２−メルカプトエタノール）培養液を用い、６７℃、５
％ＣＯ２下にインキュベーター中で約６日間静置１（５
４［］（無血清）培養液を用い、３７℃、５チＣＯ，下
にインキュベーター中で約３日間静置培養することによ
って培養液に著量のマクロファージ走化性因子ＭＣＦ−
ＴＤ６−１８を生産蓄積させることができる。
得られた培養液を濾過した培養上清は、そのままでマク
ロファージ走化性因子ＭＣＦ−ＴＤ６−１８含有物とし
、て実験等に供することができるが、透析、塩析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、分子篩処理、アフィニティ
ークロマトグラフィー等のｎＩ製処理やそれらの組合せ
処理によって精製することができる。
ロファージ走化性因子ＭＣＦ−ＴＤ６−１８含有物とし
、て実験等に供することができるが、透析、塩析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、分子篩処理、アフィニティ
ークロマトグラフィー等のｎＩ製処理やそれらの組合せ
処理によって精製することができる。
次に、マクロファージ走化性因子ＭＣＦ−ＴＤ６−１８
の理化学的性質を示す。
の理化学的性質を示す。
１、 ヒトＴ細胞ハイブリドーマＴＤ６−１８によって
培地中に生産される。
培地中に生産される。
２、マクロファージを強力に集める性質を有する。
３、多形核白血球（好中球）を集める作用はない。
４、分子量は［）、０［］０以上の物質を濃縮する限外
濾過フィルター（ＰＭ−１０）にヨ／−沖過で、活性は
炉液に回収される。
濾過フィルター（ＰＭ−１０）にヨ／−沖過で、活性は
炉液に回収される。
５、ｐＨ安定性
培養上清をＩ Ｎ ＨＣＩＴ ＩＡｌ ＝ ２とし、１
６時間４℃に保存すると、後１）１１＝７にもどしても
、本物質のマクロファージ走化性活性は著じる１、＜低
下する。
６時間４℃に保存すると、後１）１１＝７にもどしても
、本物質のマクロファージ走化性活性は著じる１、＜低
下する。
６、分子量ｉｏ、ｏｏｏ以上の物質を濃縮する限外濾過
フィルター（ＰＭ−１ｏ）による濾過で内液にはマクロ
ファージ走化性活性は認められない。
フィルター（ＰＭ−１ｏ）による濾過で内液にはマクロ
ファージ走化性活性は認められない。
Ｚ 熱安定刊
培養上清を５６℃、３０分間熱処理してもマクロファー
ジ走化性活性は失活しない。
ジ走化性活性は失活しない。
８、凍結融解してもマクロファージ走化性活性は失活し
なめ。
なめ。
９ マクロファージ走化性に対する特異性マクロファー
ジの他に走化性を有する細胞とＬ２てけ、多形核白血球
（好中球）が知られている。そこでマクロファージ走化
性因子ＭＣＦ−’［’１）６−１８が、この多形核白血
球に対しても走化性活性を示すか否かを検討した。
ジの他に走化性を有する細胞とＬ２てけ、多形核白血球
（好中球）が知られている。そこでマクロファージ走化
性因子ＭＣＦ−’［’１）６−１８が、この多形核白血
球に対しても走化性活性を示すか否かを検討した。
すなわち、プロテオースはゾトン１０ｍ／を腹腔内投与
後１日後のモルモット腹腔浸出細胞（８０％以上多形核
白血球）を採取［、ポアサイズ２ｍμのメンブランフィ
ルタ−を用いて、前述（２）と同様の方法を用いてその
活性を測定１７た。その結果は卯３図忙示されるが、本
因子ＭＣＦ−ＴＩ）６−１８Ｆｉ多形核白抑球には作用
せず、マクロファージのみに作用する因子である坐が判
明し、た。
後１日後のモルモット腹腔浸出細胞（８０％以上多形核
白血球）を採取［、ポアサイズ２ｍμのメンブランフィ
ルタ−を用いて、前述（２）と同様の方法を用いてその
活性を測定１７た。その結果は卯３図忙示されるが、本
因子ＭＣＦ−ＴＩ）６−１８Ｆｉ多形核白抑球には作用
せず、マクロファージのみに作用する因子である坐が判
明し、た。
従来知らり、てい石走化性因子であるＣｓａ、ｃｈｅｍ
ｏｔａｃｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ 等は多形核白血球に
も作用するので、本因子ＭＣＦ−１’Ｄ６−１８は新規
なものと認め戯れ、マクロファージ走化性因子ＭＣＦ−
ＴＤ（Ｓ−１８と命名されるに到った。
ｏｔａｃｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ 等は多形核白血球に
も作用するので、本因子ＭＣＦ−１’Ｄ６−１８は新規
なものと認め戯れ、マクロファージ走化性因子ＭＣＦ−
ＴＤ（Ｓ−１８と命名されるに到った。
次に本発明の実施例を示す＠
実施例
ヒトＴ細胞ハイブリドーマＴＤ６−１８を、５×１０５
ケ／ｒｎｌでＲ，ＰＭＩ １６４０（１０％ＦＣ８，２
ｍＭグルタミン、 ５ Ｘ １０−、Ｍ２−メルカプト
エタノール）培養液５０ｒｄＫ分散させ、プラスチック
培養フラスコにて３７℃、５％Ｃ０２下で６日間静習培
養し、培養液の４１５だはを抜きとり、新らたに４１５
の上記と同じ培養液を入力、６７℃、５％ＣＯ３下で３
日間静置培養（，７た。
ケ／ｒｎｌでＲ，ＰＭＩ １６４０（１０％ＦＣ８，２
ｍＭグルタミン、 ５ Ｘ １０−、Ｍ２−メルカプト
エタノール）培養液５０ｒｄＫ分散させ、プラスチック
培養フラスコにて３７℃、５％Ｃ０２下で６日間静習培
養し、培養液の４１５だはを抜きとり、新らたに４１５
の上記と同じ培養液を入力、６７℃、５％ＣＯ３下で３
日間静置培養（，７た。
得られた培養液を遠心分離して、多量のヒ）ＴＴＤ６−
１８細胞２５Ｘ１０”ケ／ｍ、ｌでＲ１ＰＭ■１６４０
（無血１「ｒ）培養液５０ ｍｌに分散させプラスチッ
ク培養フラスコにて、３７℃、５ ％ Ｃｏ２下で６日
間静置培養した。
１８細胞２５Ｘ１０”ケ／ｍ、ｌでＲ１ＰＭ■１６４０
（無血１「ｒ）培養液５０ ｍｌに分散させプラスチッ
ク培養フラスコにて、３７℃、５ ％ Ｃｏ２下で６日
間静置培養した。
得られた培養液を遠心分離し、培養上清を分子量１０，
０００以上を濃縮する限外濾過ノイルター（ＰＭ−１０
）ＩＣてｐ過し、得られたｐ液を凍結乾燥し、ＭＣＦ−
ＴＤ＜Ｓ−１８の相物質を得た。
０００以上を濃縮する限外濾過ノイルター（ＰＭ−１０
）ＩＣてｐ過し、得られたｐ液を凍結乾燥し、ＭＣＦ−
ＴＤ＜Ｓ−１８の相物質を得た。
第１図は、本発明ハイブリドーマＴＤ６−１８の創Ｍｊ
Ｋ際し、前述（１）にて作成し、ｆＣハイブリドーマの
培養上清のマクロファージ走化性活性を測定した図であ
り、第２図は前ｍ（１）にて作成したハイプリドーマＡ
Ｄ−６のクローニングで各株の培養上清のマクロファー
ジ走化性活性を側室した図であり、第６図はマクロファ
ーゾ走化性因子ＭＣＦ−ＴＤ６−１８の多形核白血球に
対する走化性活性を検ホ１【７た図である。 代理・人 弁理士 戸 １）親 男
Ｋ際し、前述（１）にて作成し、ｆＣハイブリドーマの
培養上清のマクロファージ走化性活性を測定した図であ
り、第２図は前ｍ（１）にて作成したハイプリドーマＡ
Ｄ−６のクローニングで各株の培養上清のマクロファー
ジ走化性活性を側室した図であり、第６図はマクロファ
ーゾ走化性因子ＭＣＦ−ＴＤ６−１８の多形核白血球に
対する走化性活性を検ホ１【７た図である。 代理・人 弁理士 戸 １）親 男
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下肥の特徴を有するヒ）Ｔ＃Ｉ胞バイブリド−１ＴＤ６
−１８゜ １、 ヒト急性ＴＩＩＩＩＩ胞白血病細胞株ＣＦｉＭ
−１１とヒト末梢血リンパ球との融合株である。 ２、比較的均一・な円形状のＪｕｌ胞で、リンパ球より
やや大きい。 ３、壁面等に非付着性の細胞である。 ４、−８０℃で長期間保存することができる。 ５、マクロファージ走化性因子ＭＣＦ−ＴＤ６−１８を
茗量生産する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59036261A JPS60181018A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | ハイブリド−マｔｄ６−１８ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59036261A JPS60181018A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | ハイブリド−マｔｄ６−１８ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60181018A true JPS60181018A (ja) | 1985-09-14 |
| JPH0558708B2 JPH0558708B2 (ja) | 1993-08-27 |
Family
ID=12464822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59036261A Granted JPS60181018A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | ハイブリド−マｔｄ６−１８ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60181018A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5126434A (en) * | 1989-08-14 | 1992-06-30 | Kao Corporation | Monoclonal antibody specific for a human macrophage chemotactic factor |
-
1984
- 1984-02-29 JP JP59036261A patent/JPS60181018A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5126434A (en) * | 1989-08-14 | 1992-06-30 | Kao Corporation | Monoclonal antibody specific for a human macrophage chemotactic factor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0558708B2 (ja) | 1993-08-27 |
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