JPH0372499A

JPH0372499A - 神経栄養ペプチド

Info

Publication number: JPH0372499A
Application number: JP1080398A
Authority: JP
Inventors: Yukio Kojika; 幸生小鹿
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1989-03-30
Filing date: 1989-03-30
Publication date: 1991-03-27
Anticipated expiration: 2013-09-24
Also published as: JP2802508B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、哺乳類の海鳥組織に由来する、コリナージッ
ク・ニューロンのアセチルコリン合成能増大作用を有す
る新規な神経栄養ペプチドに関するものである。　より
詳細には、哺乳類脳海馬組織に由来し、コリナージック
・ニューロンの形成、維持のための種々の生理学的活性
を有する新規な神経栄養ペプチドに関するものである。

〔従来の技術〕

神経栄養因子は、神経末端の標的、ｍａ、ダリア細胞や
血流から供給されるものである。その作用としては神経
細胞の生存・維持、神経突起の伸長の促進及び神経伝達
物質の合成酵素を誘導する作用が認められている。特に
長い投射路を持つニューロンのネットワークの形成や維
持においては、標的細胞からの神経栄養因子の供給が不
可欠なものであると考えられており、投射ニューロン系
の変性・脱落と神経学的疾患との関連が明らかにされて
きている。代表的な例としては、前脳基底野−新皮質海
馬のコリン性神経系の変性・脱落とアルツハイマー型痴
呆、風質−線条体のドーパミン性神経系の変性・脱落と
パーキンソン病、を髄運動神経系の変性・脱落と筋萎縮
性側索硬化症との関係が挙げられる。これらの神経の変
性・脱落、つまり疾患の原因としては、標的細胞由来の
神経栄養因子の不足や欠如が原因ではないかと推定され
ており、神経栄養因子補充による神経変性疾患の治療の
可能性が示唆されている〔アラベル（＾ｐｐｅｌ、　Ｓ
、　Ｈ，）アナルス・オブ・ニーーロロジー（＾ｎｎ、
Ｎｅｕｒｏｌ、）　１０巻、４９９頁、（１９８１）　
〕。

現在までに神経栄養因子の存在が数多く確認されている
が、単離され、−次構造が明らかにされている神経栄養
因子は神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　（ａ
ｃｔａｒ、ＮＧＦ）だけである。ＮＧＦは、α、β。

Ｔの３つの異なるサブユニットからなり、構成比はα２
βＴ２で３サブユニツトのうち、βＮＧＦのみが生理活
性を示している〔バローン（Ｖａｒｏｎ　Ｓ、　ｅｔ　
ａｌｌバイオケミストリー（口ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）　７巻１２９６頁（１９６８）　］。マウスβＮＧＦ
の一次構造は１９７１年にアンゲレッティとブラッドシ
ョ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ　＆８ｒａｄｓｈａｗ）によっ
て決定され、アミノ酸の総数１１８個（分子ｆｆｉ　１
３２５（１）の蛋白である〔アンゲレツテイとブラット
′ショ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ　＆Ｂｒａｄｓｈｏｗ）プ
ロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ　）ＵＳＡ６８巻２４１巻真４１７頁１）　〕。

次に、−次構造は明らかにされていないが、その特徴が
調べられている神経栄養因子としては、脳由来神経栄養
因子（ＢＤＮＦ）と毛様体神経栄養因子（ｃＮＴＦ）が
ある。ＢＤＮＦはテーネン（Ｔｈｏｅｎｅｎ）らにより
ブタの脳から、胎児抜根神経節の感覚神経の生存を維持
する神経栄養因子として精製されている。その分子量は
１３２５０で塩基性の高い（ＰＩ＞１０．１）ポリペプ
チドであるが、その−次構造はまだ明らかにされていな
い〔パルプ（ｆＪａｒｄｅ　Ｙ、＾、　ｅｔ　ａｌ、）
エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）　　１巻５４９−
５５３頁（１９８２）］　、　ＣＮＴＦはマンソープ（
Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ）　らにより、ニワ）　ＩＪ胎児の
眼球から精製された副交感神経節（毛様体神経節）の細
胞に対して生存維持に作用する神経栄養因子である。分
子量は２０４００ダルトンで等電点は約５である〔マン
ソーブ（Ｍａｎｔｈ。

ｒｐｅ　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、）ジャーナル・オブ・二ニ
ーロケミスドリー（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　）３４
巻６９−７５頁（１９８（１）〕〔マンソーブ（Ｍａｎ
ｔｈｏｒｐｅ　Ｍ、ｅｔ　ａｌ、）ジャーナル・オブ・
ニューロサイエンス・リサーチ（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ、Ｒｅｓ、）　　８巻２３３−２３９頁（１９Ｂ２）
］　　［マンソープ（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ　Ｍ、ｅｔ　
ａｌ、）フエデレーション・プロシーデインゲス（Ｆｅ
ｄｅｒａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃ、）４４巻２７５３−２７
５９頁（１９８５）］。ＣＮＴＰはまだ一次構造及びイ
ン・ビボの効果に関しては報告されていない。

一方、未だ精製されていないが、上記３種の神経栄養因
子以外にも種々の神経栄養因子が報告されている。　そ
のうち、海馬由来あるいは海馬、中隔績に作用する神経
栄養因子としては、下記のもの等が報告されている。

■新生ラット（２〜３週令）の海馬組織より部分精製さ
れている神経栄養因子〔小鹿他（Ｏｊｉｋａ　Ｋ。

ｅｔａｌ、）プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、）ＵＳ＾８１巻２５６７−２５７
１頁（１９８４）　］、〔アアラベル＾ｐｐｅｌ、　Ｓ
、　Ｈ，）特開昭５８−１５４５１４　］、〔小鹿幸生
、薬物・精神・行動（Ｊｐｎ、　Ｊ、　ＰＳｙｃｏｐｈ
ａｒｎａｃｏｌｏｇｙ）　７巻４４７−４５１頁（１９
８７））　　：その可溶性成分は海馬組織に比較的特異
的に存在し、培養中隔中心核コリン性作動神経の発育を
促進する。部分精製の結果、分子量約９００ダルトンの
ポリペプチドであることが報告されている。

本因子の活性はＮＧＦ抗体の添加により阻害されないこ
とから、ＮＧＦとは異なっていると考えられている〔ボ
スドウ４”／り（Ｂｏｓｔｗｉｃｋ　Ｊ、Ｒｏｅｔ　ａ
ｌ、）ブレーン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）　４２２巻９２９８頁（１９８７）：ｌ。

■新生ラット脳のアストロサイトの条件培地から分離さ
れた神経栄養因子〔ミュラー他（Ｍｕｌｌｅｒ　ｔｌ。

ＩＡ、　ｅｔ　ａｌ、）ブロシーデインダス・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＬＩＳＡ　８１巻１２４８−１２
５２頁（１９８４）　：ｌ　　＋セファデックスＧ１０
０のゲル濾過カラムの溶出位置から分子量約５００と推
定され、トリプシン及びプロナーゼ処理により活性が消
失しないことから、非蛋白性因子と考えられている。

■脳弓采（ｆｉｍｂｒｉａ　ｆｏｒｎｉｃｓ）切断１４
日後のラット海馬抽出液より部分精製された神経栄養因
子〔吉田−成、慶應医学６５巻１号４５−６４頁（１９
８８））　　ニゲル濾過の結果、１万〜２万、３万〜４
万、５万〜６万ダルトンの分子量の３種の因子が報告さ
れている。

■ラット海鳥組織より抽出された神経栄養因子〔ヒーコ
ック（）！ｅａｃｏｃｋ＾０Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、）　、
ブレーン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｃｈ）　
３６３巻２９９−３０６頁（１９Ｂ６）〕　：ニットＩＪ毛様体神経節細胞の生存を維持する活性を有
する。分子量は１００００以上の酸性蛋白である。

このように、これらの海馬由来あるいは海馬中隔績に作
用する神経栄養因子は蛋白性因子や非蛋白性因子として
報告されているが、いずれも単離、精製されておらず、
−次構造も明らかにされていない。

しかし、これら神経栄養因子の薬理作用に着目し、神経
変性疾患治療剤として使用すべく、純化した該神経栄養
因子の開発が望まれていた。

〔発明が解決しようとする課題〕本発明は上記従来の課題を解決するものである。

即ち、本発明の第１の目的は純粋な化合物として単離精
製された、コリナージック・ニューロンのアセチルコリ
ン合成能増大作用を有する新規な神経栄養ペプチドを提
供するものである。

本発明の第２の目的は当該新規神経栄養ペプチドの製造
法を提供することである。

本発明の第３の目的は新規な神経変性疾患治療剤を提供
することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は、前記課題を解決するため種々研究を重ねて
きたところ、新規な神経栄養ペプチドの単離、精製に成
功し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。

ここで言う、本発明の神経栄養ペプチドとは、ペプチド
性の神経栄養因子を意味し、下記の理化学的性質および
生物学的性質を有する。

（ａ）海馬組織の水溶性画分に含まれる純粋なペプチド
。

ら）分子量：７００〜１４００　（バイオ・ゲルＰ−２
を用いるゲル濾過法による）（ｃ）コリナージック・ニューロンのアセチルコリン合
成能を増大する。

この明細書においては、アミノ酸、保護基、活性基、溶
媒等について、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに基づく略号および
、当該分野における慣用略号で表示する場合があり、そ
れらを例示すると次の通りである。

アミノ酸残基に対する略号は以下の通りである。

略号　　　　　　名称Ｌｅｕ　　　　　　　Ｌ−ロイシンＳｅｒ　　　　　　Ｌ−セリンＧｌｎ　　　　　　Ｌ−グルタミン１１ｅ　　　　　　Ｌ−インロイシンＡｓｐ　　　　　　Ｌ−アスパラギン酸Ｇｌｙ　　　　
　　グリシンＡｌａ　　　　　　Ｌ−アラニンＰｒｏ　　　　　　　Ｌ−プロリンＴｒｐ　　　　　　Ｌ−トリプトファン特に断らない限
り、本明細書で接頭辞ＩＬで命名されているアミノ酸残
基は天然に生ずる絶対立体配置りに該当する。

他の略号は次の通りである。

略号　　　　　　名称Ａｃ　　　　　　　ア七チルＢｏｃ　　　　　　ｔ−ブチルオキシカルボニル○ｃＨ
ｅｘ　　　　シクロヘキシルエステルＢｚｌ　　　　　
　ベンジルＤＣＣジシクロへキシルカルボジイミドＤＭＦ　　　　　　ジメチルホルムアミドＰＴＣフェニ
ルチオカルバミルＴＦＡ　　　　　　　）リフルオロ酢酸また、本明細書
において本発明の神経栄養ペプチドはＨＣＮＰ　　（旧
ｐｐｏｃａｍｐａｌ　Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ　Ｎｅｕ
ｒｏｔｒＯρｈｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　）と略称する場
合がある。そして、海馬組織から抽出Ｍ製し、単離した
該ペプチドを特に意味する場合は°’１（ｃＮＰ“と表
示する。更に、本発明の神経栄養ペプチドのアミノ酸配
列において、Ｎ末端はアセチル基でブロックされていて
もよい。この場合、特にＮ末端の構造上の違いを明示す
る必要のある場合は、アセチル基でブロックされている
ものをＡｃ−ＨＣＮＰと、一方ブロックされでいないフ
リーのものはｆ−）ＩＣ：ＮＰと表示する。

１１ｃＮＰの物理化学的性質：（１）分子ｆｔ’１バイオ・ゲルＰ−２カラムを用いるゲル濾過法により、
分子量は７００〜１４００である。

指標として、リボヌクレアーゼＡ（分子量１３，７０（
１）、ビタミンＢ１２（分子ｆｌｌｌ、３５５）、β−
二ココチンアミドアテ°ニン・ジヌクレオチド（Ｎへ〇
〇〉（分子量６６３）Ｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ（分子ｆｆ１
４４４）、Ｔｒｐ（分子１２０４）を用い、溶出液とし
て０．０５Ｍ酢酸を用いた。

（２）アミノ酸組成 ”ＩＩＣＮＰ″をフェノール含有定沸点塩酸で、１１０
℃、２０時間加水分解してアミノＭ組成を調べた。

Ｌｅｕを基準アミノ酸として算出したアミノ酸組成は以
下の通りであった。

＾ＳＸ：０．９　、Ｓｅｒ：　１．４　、Ｇｌｘ：　１
．３　、Ｐｒｏ：　１゜０　、Ｇｌｙ：　ＩＪ　、Ａｌ
ａ　：　２．５　、ｌｉｅ　：　０．９　、Ｌｅｕ：　
１．０　、Ｔｒｐ：０．８（３）Ｎ末端アミノ酸 ”ＨＣＮＰ”をＡｐｐｌｉｅｃｌ　ｆＪＩａｓｙｓｔｅ
ｍｓ社製４７７型プロティン・シーケンサ−を用いてエ
ドマン分解し、生成したＰＴＨ（フェニルチオヒダント
イン）−アミノ酸誘導体を＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ社ｍｌ［１２０Ａ型ＰＴＨアナライザーで分
析した結果、サイクル１〜１０でアミノ酸が全く検出さ
れなかった。従って、Ｎ末端アミノ酸はブロックされて
いると考えられる“）ＩＣＮＰ”のＮ末端アミノ酸をア
シルアミノ酸遊離酵素を用いて切断し生成したアシルア
ミノ酸を分取した。そのアシルアミノ酸を加水分解後、
アミノ酸分析した結果、Ａｌａが検出されたことからＮ
末端アミノ酸はへ１ａと同定された。

（４）アミノ酸配列 ”　１１　ＣＮ　Ｐ　’のＮ末端アミノ酸はブロックさ
れていたため、アシルアミノ酸遊Ａ′ｌｉ酵素を用いて
Ｎ末端アミノ酸を切断した後、逆相系液体クロマトグラ
フィーによりＮ末端アミノ酸のはずれた構成ペプチドを
分取した。そのｖｔ或ペプチドを＾ｐρｌ１ｅｄ　Ｂｉ
。

ｓｙｓｔｅｍｓ社製４７７型プロティン・シーケンサ−
と１２０Ａ型ＰＴＨアナライザーを用いて解析した結果
、Ａｌａ−Ａｓｐ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕと同定された。

（３）、　（４）の結果から、’ＩＩｃＮＰ”のアミノ
酸配列は次のように決定された。

（５）Ｃ末端Ｍ４造 ”）ＩｃＮＰ″をキモトリプシンで断片化し、逆相系高
速液体クロマトグラフィーによりＣ末端構成ペプチドを
単離し、アミノ酸配列を解析し、Ａｌａ−ＧＩＹ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕと同定した。　ペプチド合成法によりＡｌａ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＨおよびＡｌａ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＮＨ２を合成し、逆相系充填剤ＴＳ
に一１２０Ｔカラムを用いる高速液体クロマトグラフィ
ー法で分析し、それらの保持時間を比較した結果、“）
ＩＣＮＰ“から得られたＣ末端構成ペプチドは前者の合
成ペプチドと一致した。この事実から”ＨＣＮＰ”のＣ
末端アミノ酸Ｌｅｕは−０１（体と同定された。

（６）Ｎ末端構造（３）で得られたアシルアラニンと各種アシルアミノ酸
誘導体標品とを逆相系充填剤ＴＳに一１２０Ｔカラムを
用いる高速液体クロマトグラフィー法で分析し、それら
の保持時間を比較した結果、（３）で得られたアシルア
ラニンはアセチルアラニンと一致した。この事実から”
ＨＣＮＰ”のＮ末端アミノ酸Ａｌａはアセチル化されて
いると判断された。

ペプチド合成法により＾ｃｅｔｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ａｓｐ−ｌｌｅＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕを合成し、逆相系充填剤ＴＳＫ−１
２０Ｔカラムを用いる高速液体クロマトグラフィー法で
分析し、”ＩＩ（：ＮＰ“と上記合成ペプチドとの保持
時間を比較した。その結果、”）ＩｃＮＰ”の保持時間
は合成ペプチドの保持時間と一致したことから、”ＩＩ
ＧＮＰ”の−次構造を以下のように決定した。即ち、こ
の配列は＾ｃ−ＨＣＮＰの一次構造であることが判明し
た。

Ｐｒｏ−Ｌｅｕしかし、本発明の神経栄養ペプチドはＮ末端がアセチル
基でブロックされていないフリーのもの（即ち、ｆ−Ｈ
ＣＮＰ）をも包含するものである。

〔製造方法〕

本発明のＩＩｃＮＰ“の製造方法としては、例えば、次
のような方法が例示される。

（ｉ）海馬ａｍから抽出・精製し単離する方法：製造原
料としては、いずれの哺乳動物の脳をも使用することが
でき、ヒトのみならず、例えばマウス、ラット、イヌ、
ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ等の各種哺乳
動物が対象となる。

その代表例としてラット脳の海鳥組織が挙げられる。好
ましくは生後ｌ〜２週令のラット胎児脳から海馬組織を
とり出し、使用するまで凍結保存、杼ましくは一７０℃
以下で保存しておく。

海馬組織からの抽出は冷却下、できれば０℃〜５℃で行
なうことが好ましい。海鳥組織に２〜１０倍量の中性緩
衝液、好ましくは６〜７倍量のｐＨ７，２のリンｅｒｇ
衝液を加え、ガラス・テフロンホモゲナイザーを用いて
ホモゲナイズする。遠心し、好ましくは１００．０ＯＯ
Ｇで４℃、２時間遠心して沈澱を除く。

得られた上清に酸、好ましくは酢酸を最終濃度が２Ｍに
なるように加え酸性にし、生じた沈澱を再び遠心して除
く。

このようにして得られた”ＩＩｃＮＰ”を含む上清は公
知の精製法、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、限外
濾過、透析、塩析などを単独あるいは組み合せて精製す
ることができる。＃Ｒ製は冷却下、できればＯ℃〜５℃
で行うことが好ましい。好ましくは、得られた上清を分
子ｆｆｔ５０００以下の低分子を通す分子フィルター、
例えばアミコン社製のＹＭ５メンプランを用いて限外濾
過し、分子量５０００以下の低分子画分を集め、凍結乾
燥する。得られた粉末を少量の酸、好ましくは０．０５
Ｍ酢酸に溶解し、適当なゲル濾適用充填剤、例えば、バ
イオゲルＰ−２、バイオゲルＰ−６あるいはセファテ′
ツクスＧ−２５、好ましくはバイオゲルＰ−２を用いる
ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量分画する。溶
出液についてラット中隔中心核を用いる生物学的活性測
定法によりコリナージック・ニコーロンのアセチルコリ
ン合成能への効果を測定する。活性画分を集め、適当な
逆相系充填剤、好ましくはミリポア社製の５ｅｐ−Ｐａ
ｋ−Ｃ１８カートリッジに通液する。カートリッジを酸
、好ましくは０゜０５Ｍ　ｉ’ｊ￥酸で洗浄した後、適
当な酸性有機溶媒、好ましくは０．１％ＴＦＡ−６０％
アセトニトリルを用いて溶出する。溶出液を集め、凍結
乾燥し白色の粉末を得る。

上記白色粉末からの″）ＩＣＮＰ”の単離は逆相液体ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーある
いは適当な抗体などを用いるアフィニティークロマトグ
ラフィーを単独あるいは組み合せて行なうことができる
。

好ましくは上記白色粉末を適当な酸、好ましくは０゜１
％ＴＦＡに溶解し、適当な逆相系充填剤、例えば炭素数
１から１８のアルキル基あるいはフェニル基の結合した
シリカゲル担体を用いる逆相系液体クロマトグラフィー
によりＩ！ｌ！！する。溶出溶媒としてはＴＦＡ、酢酸
、ギ酸あるいはリン酸を含むアセトニトリル、プロパノ
ール、インプロパノール、メタノール、エタノールある
いはブタノールなどを使用することができる。例えば、
バイオラッド社製ＲＰ−３０４逆相系カラムを用いる高
速液体クロマトグラフィーにより分画し、アセトニトリ
ル濃度２１％〜２６％で溶出される画分を分取し、凍結
乾燥し、白色の粉末を得る。この白色粉末を適当な酸、
好ましくは０．０５％ＴＦＡに溶解し、東ソー社製ＴＳ
に一１２０Ｔ逆相系カラムを用いる高速液体クロマトグ
ラフィーにより分画し、アセトニトリル濃度２８％〜３
０％で溶出される両分を分取し、凍結乾燥し、白色粉末
状の”ＨＣＮＰ“を得る。これは通常、冷暗所に保存さ
れる。

（ｉｉ）化学合成による方法：化学合成による方法では、通常のペプチド化学において
用いられる方法に準じて合成することができる。すなわ
ち、液相法、固相法いずれによっても得ることができる
。

より詳細には、例えば固相合成法を採用する場合、Ｃ末
端アミノ酸（アミノ基を保護したもの）をそのカルボキ
シル基によって、まず不溶性担体に結合させる。次いで
、アミノ保護基を除去した後、目的ペプチドのアミノ酸
配列に従い、順次アミノ基保護アミノ酸をその反応性ア
ミノ基および反応性カルボキシル基との縮合反応により
結合させ、−段階ずつ合或し、全配列を合成した後、ペ
プチドを不溶性担体からはずすとともに保護基を除去す
ることにより、目的のペプチドを得ることができる。

上記各種方法において、反応性の官能基は保護しておく
ことが好ましい。

アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカ
ルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシ
ベンジルオキシカルボニル、２クロルベンジルオキシカ
ルボニル、ｐ−トルエンスルホニル、トリフルオロアセ
チル、フタリル、ホルミル、０−ニトロフェニルスルフ
ェニル、３ニトロ−２−ピリジンスルフェニル、ジフェ
ニルホスフィノチオイル基などがあげられる。カルボキ
シル基の保護基としては、例えばアルキルエステル（メ
チル、エチル、ｔ−ブチルなどのＣＩ−、アルキルエス
テル）、ベンジルエステル、ｐニトロベンジルエステル
、ｐ−メチルベンジルエステル、シクロヘキシルエステ
ル、シクロペンチルエステルなどがあげられる。Ｓｅｔ
の水酸基は、必ずしも保護する必要はないが、必要であ
れば、例えば、ベンジル、２．６−ジクロルベンジル、
ｔ−ブチル、ベンジルオキシカルボニル、アセチル基な
どで保護することができる。Ｔｒｐのインドリル基は必
要であれば、ホルミル、ベンジルオキシカルボニル、２
．４−ジクロルベンジルオキシカルボニル基などで保護
することも可能である。

上記各種方法において、ペプチド結合形成方法としては
、例えばジシクロへキシルカルボジイミド、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
などのカルボジイミド型縮合剤を用いる方法、対称型酸
無水物法、混合酸無水物法、アジド法、活性エステル法
、酸化還元法、ジフェニルホスホリルアジド法、カルボ
ジイミド型線合剤＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドなど）法など
既知の手法があげられる。

保護基の除去法としては、例えば、トリフルオロ酢Ｗ法
、メタンスルホン酸法、トリフルオロメタンスルホン酸
法、フッ化水素法、液体アンモニアナ）　ＩＪウム法な
ど既知の手法があげられる。

本発明によって製造されるペプチド類の精製は、例えば
イオン交換樹脂、分配クロマトグラフィ、ゲルクロマト
グラフィー、逆相型液体クロマトグラフィーなどのペプ
チド化学の分野で通常用いられる方法を単独にまたは組
み合わせて用いることによって行うことができる。

〔薬理作用〕

本発明の神経栄養ペプチドは神経細胞の分化成熟を調節
する。すなわち、コリン系神経である中隔中心核のａ織
のアセチルコリン合皮を促進する。生物学的活性の測定
は、小鹿幸生ら〔薬物・精神・行動、７巻、４４７〜４
５１頁（１９８５）］の方法により、行うことができる
。

〔治療剤への適用〕

本発明の神経栄養ペプチドは、神経変性疾患治療剤、抗
痴呆剤として有用である。ここで神経変性疾患とは、神
経細胞が萎縮あるいは脱落する病気であり、たとえば　
アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、筋萎
縮性側索硬化症、パーキンソン氏病等があげられる。

また、痴呆としてはアルツハイマー型痴呆、パーキンソ
ン痴呆、脳血管性痴呆等があげられる。

本発明化合物を投与される動物は特に制限されず、ヒト
のみならず、例えばマウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ
、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ等の各種哺乳動物が対象
となる。

これらの動物およびヒトへの投与は通常の投与経路、例
えば経口、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、鼻腔内およ
び脳内投与により行うことができる。　投与量および投
与回数は動物種、投与経路、症状の程度、体重等によっ
て異なり特に限定されないが、ヒトにおいては、通常成
人１日あたり約ｌμｓ＝１ｇを１日１回もしくはそれ以
上の回数で投与される。投与剤型としては、例えば散剤
、細粒剤、頚粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、
経鼻剤などがあげられる。製剤化の際は、通常の製剤担
体を用い、常法により製造する。即ち、経口用製剤を調
製する場合は、生薬に賦形剤、更に必要に応じて結合剤
、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、などを加えた後、常法によ
り錠剤、頴粒剤、散剤、カプセルなどとする。　注射剤
をｍａ？する場合は、必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、
安定化剤、可溶化剤などを添加し、常法により注射剤と
する。

〔実施例〕

実施例１ ”ＩＩｃＮＩ’″の精製：（１）２迎合ラット約３００匹分の海鳥組織に６〜７倍
容の氷冷したリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を加え、ガラ
ス・テフロンホモゲナイザーを用いてホモゲナイズした
後、１００，０００　Ｘｇ、　４℃で２時間遠心分離し
た。上清に氷酢酸を最終濃度が２Ｍになるように加え、
沈澱物を１００．　ｏｏｏｘ　ｇ、４℃で２時間遠心分
離した。上清をアミコン社製ＹＭ５フィルター（カット
・オフ分子量５００（１）を用いて超限外濾過を実施し
た。濾液を凍結乾燥後、０．０５Ｍ＃酸に溶解し、予め
０．０５Ｍ酢酸で平衡化させたｌ１ｌｉｏ−ＧｅＩＰ２
ゲルを充填したカラム（１，６Ｘ　８４　ｃｍ）に注入
した。０．０５Ｍ酢酸で流速１６．５ｒｄ／時間で溶出
し、溶出液を１．６５ｍｆ／画分で分画した。そのＩＲ
を用いてＡ　２８０ｎｍでの吸光度を測定し、生物学的
活性を測定した。活性の認められた画分を集め、ミリポ
ア社ａ！ｌｓｅρ・Ｐａｋ−Ｃ１８カートリッジに通液
した。０．　（１５Ｍ酢酸で洗浄後０．１％ＴＦＡ−６
０％ア七トニトリルで活性成分を溶出した。溶出液を凍
結乾燥し、６．８■の蛋白質を含む粗精製品を得た。

この粗ｆｉＩＭ品について、生物学的活性を測定した結
果、１６０　ｎｇ／−でコリナージック・ニューロンの
アセチルコリン合成能を　１５０％にまで増大させる活
性を示した。

（２）　　（１）で得た粗精製品３．４ＩＩｇを０．１
％ＴＦＡに溶解し、予め０．１％ＴＦＡで平衡化させた
ｌ１ｌｉｏ−Ｒａｄ社製逆相系充填剤ＲＰ−３（１４カ
ラム（４，６φＸ　２５０市）に注入した。２Ｗ類の溶
媒Ａ　ｌ　（０，１％ＴＦＡ）およびＢｌ（０，１％Ｔ
ＦＡ−９５％アセトニトリル）を使用し、溶媒ＡＩから
溶媒Ｂ１ヘアセトニトリル濃度を徐々に増加させ溶出し
た。最初の１０分間で８１１度を０％から１０％に、次
の４０分間で８１濃度を３０％に、次の１０分間でＢｌ
濃度を４０％に、次の１０分間で８１１度を６０％に、
次の３分間でＢｌａ度を　１００％に、Ｂ１濃度を直線
的に増加させ、流速１．０−／分で溶出した。溶出液を
Ａ２２０ｎｍでモニターＬ、２−／フラクションで分画
した（第１図）。　この逆用系高速液体クロマトグラフ
ィーを２回実施した。活性画分フラクションＮα２１〜
２６（アセトニトリル濃度２１〜２６％で溶出される画
分）を集め、スピード・バック・コンセントレータ−で
減圧濃縮し、白色粉末を得た。この白色粉末について生
物学的活性を測定した結果、トータルボリュームの５．
３／１０’を１ｍｌの培地中に溶かした濃度でコリナー
ジック・ニューロンのアセチルコリン合成能を１５０％
にまで増大させる活性を示した。

（３）　　（２）で得た活性物質を０．１％ＴＦＡに溶
解し、予め０．１％ＴＦＡで平衡化させた東ソー社製逆
相系充填剤ＴＳに一１２０Ｔカラム（４，０φＸ　２５
０ｍｌ１１）に注入した。（２）で使用した２種類の溶
媒ＡｌおよびＢｌを使用し、溶媒Ａ１から溶媒Ｂｌヘア
セトニトリル濃度を徐々に増加させ溶出した。最初の５
分間は溶媒Ａｌだけを通液し、次の１０分間で８１濃度
を０％から２５％に、次の２５分間でＢｌ′ａ度を３０
％に、次の１０分間で８１１度を４０％に、次の１０分
間でＢｌａ度を１００％に、Ｂｌ濃度を直線的に増加さ
せ、流速１．ｔＷ／分で溶出した。溶出液を＾２２０ｎ
ｍでモニターし、１ｍｌ！／フラクシジンで分画した。

活性画分フラクションに４６および４７（アセトニトリ
ル濃度２８〜３０％で溶出される画分）を集め減圧濃縮
した。

この活性画分を逆相系充填剤ＴＳに−［２０Ｔカラムを
用いてリクロマトグラフィーを実施した。２種類の溶媒
Ａ２（０，０５％ＴＦＡ）およびＢ２　（０，０５％Ｔ
ＦＡ−９５％アセトニトリル）を使用し、溶媒Ａ２から
溶媒Ｂ２ヘアセトニトリル淵度を増加させ溶出した。最
初の５分間で８２ａ１度を０％から２５％に、次の３０
分で８２Ｖ１度を３５％に、次の５分間で８２ａ度を４
０％に、次の５分間で８２Ｗ度を１００％に、８２１度
を直線的に増加させ、流速１゜０ｒｎ１／分で溶出した
。溶出液を＾２２０ｎｍでモニターし、各ピークを手動
で分画した。活性は３０〜３１分に溶出される鋭い単一
のピーク画分（アセトニトリル濃度３１〜３２％）に回
収された（第２図）。この活性画分を減圧濃縮し、４μ
ｇの’ＩＩＣＮＰ”を得た実施例２ ”ｌＩ［ＮＰ”の構造解析：（１）アミノ酸組成 ”ＩＩｃＮＰ”をフェノール含有定沸点塩ｆｌｌｏ、２
−で１１０℃、２０時間加水分解しピコ・タグ（ＰＩＣ
Ｄ−ＴＡＧ）法によりアミノ酸分析した。Ｌｅｕを基準
として算出したアミノ酸組成は以下の通りであった。

＾ＳＸ：０，９　、　Ｓｅｒ：１，４　、　Ｇｌｘ：１
．３　、　Ｐｒｏ：１，０Ｇｌｙ：ＩＪ　　、　　＾ｌ
ａ：２．５　　、　　　ｌｉｅ：０．９　　、　　Ｌｅ
ｕ：１．０Ｔｒｐ：０．８（２）Ｎ末端アミノ酸 ”ＨＣＮＰ’　０．５．！Ｊ　ｇをＡｐｐｌｉｅｄ　１
Ｊｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製４７７型プロティン・シーケ
ンサ−でエドマン分解し、生成したＰＴＨ（フェニルチ
オヒダントイン）−アミノ酸誘導体をＡｐｐｌｉｅｄ　
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製１２０＾型ＰＴＨアナライザ
ーで分析した結果、サイクルｌ〜ｌＯでアミノ酸が全く
検出されなかった。　従ってＨＣＮＰ”のＮ末端はブロ
ックされていることが明らかになった。

（３）　　キモトリプシン切断により得られた断片化ペ
プチドの構造解析 ”ＩＩｃＮＰ”　０．８μｇに０．０５Ｍ　Ｎ）１．Ｈ
ＣＯ３溶液０．１−を加え溶解し、Ｓ＋、Ｂｍａ社製キ
モ）　ＩＪプシン０．４μｇを加え３７℃でインキュベ
ートした。６時間後、更にキモ）　ＩＪプシン０，４μ
ｇを加え、３７℃で終夜インキュベートした。

反応液を予め０．０５％ＴＦＡで平衡化させた逆相系充
填剤ＴＳＫ−１２０Ｔカラム（４φ×２５０■−）に注
入した。２種類の溶媒、Ａ２（０，０５％ＴＦＡ）およ
びＢ２　　（０，０５％Ｔ　Ｆ　Ａ−９５％アセトニト
リル）を使用し、溶媒Ａ２から溶媒Ｂ２ヘアセトニ）　
ＩＪル濃度を増加させながら溶出した。最初の４０分間
で８２濃度を０％から４０％に、次の１５分間で８２ａ
度をＩＣ１０％に直線的に増加させ、流速１゜０ｍ１１
分で溶出した。溶出液を＾２２０ｎｍおよび＾２８０ｎ
ｍでモニターした。保持時間２４分および３６分に溶出
されるピーク画分で分取した。それぞれをＣＨＩおよび
ＣｌＩ２とする。

ＣＨＩおよびＣＨ２を減圧′ａ縮し、０．１％チオグリ
コール酸酸含有定点塩酸０．２ｄを加え、１１０℃で２
４時間加水分解し、アミノ酸分析した。それぞれのアミ
ノ酸組成は、次の通りであった。

Ｃｌ１１のアミノ酸組成：Ｐｒｏ：　１．１？、Ｇｌｙ：０．６１゜Ａｌａ：０．
８２　、Ｌｅｕ：１，００、Ｃ）１２のアミノ酸Ｍ或：＾ｓｘ：１，０５、Ｓｅｒ：１，１８、Ｇｌｘ：１．２
５、Ｇｌｙ：０．５０、Ａｌａ：２．００、Ｉｌｅ：０
．８３、Ｔｒｐも明らかに検出されたが微攪な為、定量
不能であった。

ＣＨＩおよびＣｌ１２のアミノ酸配列を４７７型プロテ
イン・シーケンサ−および１２０Ａ型ＰＴＨアナライザ
ーで同定した。

Ｃ）ＩＩのアミノ酸配列：ｌ　　２　３　４Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＬｅｕＣＨ２はサイクル１〜１０で全くアミノ酸が検出されな
かったことからＮ末端がブロックされていると結論され
た。

次に、ＣＨＩのＣ末端の構造を明らかにするため、２種
類の合成ペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−ＤＨおよびＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｎ
ｌｌｚについて上述の条件で逆相系高速液体クロマトグ
ラフィー法による分析を行なった。Ｃｌ１１と前者の合
成ペプチドの保持時間が一致したことからＣｌ１ｌのＣ
末端アミノ酸Ｌｅｕは−ＤＨ体であることを確認した。

次に、ＣＨ２に３４０μｆのｌｏｏｍＭピリジン酢ＮＩ
緩衝液（ｐＨ５，５）を加え溶解し、１１０　ｐｍｏｌ
のカルボキシペプチダーゼＹを加え、３７℃でインキュ
ベートした。経時的に反応液をサンプリングし、アミノ
酸分析した結果、ＣＨ２のＣ末端のアミノ酸配列として
Ｉ　Ｉｅ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐの配列が同定された
。

Ｃｌ１２を０．１Ｍリン酸１ｆ：：衝液（ｐＨ７，２）
　５０μｌに溶解し、宝酒造社製アシルアミノ酸遊離酵
素ｏ４ｕを加え３７℃でインキュベートした。５時間後
および８．５時間後に０．０５０ずつのアシルアミノ酸
遊離酵素を加え３７℃で計２２．５時間インキュベート
した。

反応液を予め０．０５％ＴＦＡで平衡化した逆相系充填
剤ＴＳＫ−１２０Ｔカラム（４φ×２５０叩）に注入し
た。

２種類の溶媒Ａ２（０，０５％ＴＦＡ）およびＢ２（０
，０５％ＴＦＡ−９５％アセトニトリル〉を使用し、溶
媒Ａ２から溶媒Ｂ２ヘアセトニ）　ＩＪル濃度を増加さ
けながら溶出した。最初の５分間は溶媒Ａ２だけを通液
し、次の４０分間で８２ｆｉ度を０％から４０％に、次
の１５分間で８２ａ度を１００％に直線的に溶出させ、
流速１．０Ｉｎｌ／分で溶出した。溶出液を＾２２０ｎ
ｍおよび＾２８０ｎｍでモニターした。保持時間３７分
に溶出されたピーク画分を分取した。この画分をＣＨ２
−ＡＲＩとする。ＣＨ２−ＡＲＩを０．１％チオグリコ
ール酸酸含有定点塩酸で１１０℃、２４時間加水分解し
、アミノ酸分析を行なった。ｆｆ１ｆｆｉなため、分取
に使用した溶媒Ａ２および溶媒Ｂ２を混合して調魁した
Ｂ２濃度３５％の溶液についても同様に加水分解し、ア
ミノ酸分析を行ない、補正してＣＨ２−ＡＲＩのアミノ
酸組成を求めた。

ＣＨ２−ＡＲＩのアミノ酸組成：ＡＳＸ：１．０９、Ｓｅｒ：０．８６、ＧＩＸ：０．９
７、へｌａ：１．ｏｏ、１１ｅ：　１．１８、Ｔｒｐも
明らかに検出されたが微量なため定量不能であった。

前述のＣ１１２のアミノ酸組成と比較して、ＣｌＩ２−
ＡＲＩはＡｌａがｌ残基少ないことからＣ１１２のＮ末
端アミノ酸はＡｌａと同定された。

ＣＨ２−へＲ１を４７７型プロテイン・シーケンサ−お
よび１２０Ａ型ＰＴＩＩアナライザーで解析した結果、
＾！ａ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｘと同定さ
れた。

以上の結果から、Ｃ）１２のアミノ酸配列は　＾ｌａ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−ｌ　１ｅ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐと
同定され、Ｎ末端アミノ酸Ａｌａがブロックされている
ことが明らかになった。

（４）　　アシルアミノ酸遊離酵素切断により得られた
断片化ペプチドの構造解析 ”Ｈ［’ＮＰ”約２μｇに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）　５０μｌを加え溶解し、宝酒造社製のアシル
アミノ酸遊離酵素０１ｔＵを加え、３７℃でインキュベ
ートした。更に、５時間後および８．５時間後に０．０
５０ずつのアシルアミノ酸遊離酵素を加え、３７℃で計
　２２．５時間インキュベートした。反応液を予め０．
０５％ＴＦ＾で平衡化した逆相系充填剤ＴＳＫ−１２０
Ｔカラム（４φ×２５０市）に注入した。

２種類の溶媒Ａ２（０，０５％ＴＦＡ）およびＢ２（０
，０５％ＴＦＡ−９５％アセトニトリル）を使用し、溶
媒Ａ２から溶媒口２ヘアセトニ）　ＩＪル濃度を増加さ
せながら溶出した。最初の５分間は溶媒式２だけを通液
し、次の４０分間で８２ｆｉ度を０％から４０％に、次
の１５分間で８２ａ度を１００％に直線的に増加させ、
流速１．０ｅｇ／分で溶出した。溶出液を＾２２０ｎｍ
および＾２８０ｎｍでモニターし、ｌ＋＋ｆ／フラクシ
ョンで分画した。保持時間４３分のピーク画分について
は手動で分取した。この画分をＡＲＩとする。ＡＲＩを
０．１％チオグリコール酸酸含有定点塩酸０．２−で１
１０℃、２４時間加水分解し、アミノ酸分析した。

ＡＲＩのアミノ酸組成；ブチドであることが明らかになった。

ＡＳＸ：０．９８．５ｅｒｖｏ、　８７、ＧＩＸ：１．
０１、Ｐｒｏ：０．９２、Ｇｌｙ：１．０３、Ａｌａ：
１．８１３、ｌｉｅ：０．９５、Ｌｅｕ：Ｉ、００、Ｔ
ｒｐ：０．６３ＡＲＩのアミノ酸配列を＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社製４７７型プロティン・シーケンサ−および
１２０Ａ型ＰＴＨアナライザーを用いて同定した。

ＡＲＩのアミノ酸配列：次に、アシルアミノ酸遊離酵素により切断されたアシル
アミノ酸を調べるため、フラクションＮαｌ−２０につ
いて、０．１％チオグリコール酸酸含有定点塩酸０．２
ｍＲで１１０℃、２４時間加水分解し、アミノ酸分析を
実施した。フラクションＮα３およびＮｏ、　４にＡｌ
ａが検出された。他のフラクションには有意なアミノ酸
は検出されなかった。　従って、”ＨＣＮＰ’のＮ末端
アミノ酸をＡｌａと同定した。

以上の結果から、”ＨＣＮＰ″はＮ末端アミノ酸がアシ
ル化されており、次のアミノ酸配列を有するべ”　１１
　Ｇ　Ｎ　Ｐ　”のアミノ酸配列：次に、アシル化の種
類を明らかにするため、フラクションＮα３および４に
含まれていたアシルアラニンと各種アシルアラニン誘導
体とを逆相系高速液体クロマトグラフィー法（Ｍｅｔｈ
ｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ。

ｏｇｙ）で分析し、保持時間を比較した結果、アセチル
アラニンの保持時間と一致した。従がってＨＣｔｌｌＰ
のＮＪ［アミノ酸Ａｌａはアセチル化されていることが
明らかになった。

更に、ペプチド合成法により得た＾ｃｅｔｙｌ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｓｐ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕについて逆相系充填剤
ＴＳＫ−１２０Ｔカラムを用いる高速液体クロマトグラ
フィー法で分析した結果、”ＨＧＮＰ’″の保持時間は
合成ペプチドの保持時間と一致した実施例３Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（ＩＩｃＮＰ”’）の
合成：”ＨＣＮＰ’化学合或化学合体として、ＨＣＮＰ
の８番目から１１番目のアミノ酸配列に相当するペプチ
ドを合成したく以後、ＨＣＮＰ’−”と略す）。

使用した樹脂は粒径１００−２００メツシユのクロロメ
チル化されたポリスチレンビニルベンゼン樹脂である（
１％ジビニルベンゼンで架橋、樹脂１ｇ当たり０．６８
ミリモルのクロライドを含有〉。ポリペプチドを合成す
るに当たり３．０５ｇのＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨをエチル
アルコール２０ｄ、水７−へ溶解し、２０％炭酸セシウ
ム水溶液にてｐＨ７とし、減圧濃縮し、乾燥させた。こ
れにＤＭＦＩ　２０ｄを加え、１５ｇのクロロメチル化
樹脂を加え、５０℃にて１２時間、さらに室温にて１２
時間撹拌し、エステル化した。得られたアミノ酸結合樹
脂を濾過し、ＤＭＦ、９０％ＤＭＦ、ＤＭＦ、エチルア
ルコールにて順次洗浄し、かつ乾燥した。収量１６．９
ｇ。

このアミノ酸結合樹脂６ｇを固相合成反応容器に入れ後
記スケジュールｌに従って　　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−〇Ｈ％
Ｂｏｃ−Ｇｌ　ｙ−ＯＨ，Ｂｏｃ−へ１ａ−ＯＨ１を順
次、当量のＤＣＣを用いてカップリングさせた。この際
、添加剤として当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ルを加えた。その結果、ＨＣＮＰ’−”ペプチド樹脂６
．７ｇが得られｔ二。

このＩＩｃＮＰ’−’ｌペプチド樹脂１．１ｇにアニソ
ール３ｔｔ’、エチルメチルスルフィド０．５−１無水
フツ化水素２０ｒｎｌを加え、−２０℃６０分間、０ｔ
６０分間反応させた。減圧ａ！８後、ジエチルエーテル
２００−を加え３０分間撹拌し、濾過しジエチルエーテ
ル１００−で洗浄した。謹上物に５％酢酸水１００−を
加えて３０分間撹拌後、樹脂を濾過し、５％酢酸水１０
０ｍｆで洗浄した。濾洗液を凍結乾燥後、得られた粗ペ
プチドを水に溶解し、予めＯ，１％トリフルオロ酢酸水
で平衡化させた逆相系充填剤ＹＭＣ−Ａ３６３　（Ｓ−
５）ＯＤＳカラム（３０φ×２５０帥）に注入し、カラ
ムを０．１％トリフルオロ酢酸水で洗浄後、アセトニト
リル濃度を１８％まで増加させ、流速７゜０−７分で溶
出した。溶出液をＡ２３０ｎｍでモニターし、目的物を
含む両分を集め、凍結乾燥し、ＨＣＮＰ”’　：　ｌ　
８２．　３ｍｇを得た。

得うレタＨＣＮＰｓ−１１ハ逆相系充［＋１ＹＭＣ−Ａ
　２１１−〇ＤＳカラム（４，６φＸ２５０ｍｍ）を用
いた、１０％から５０％までの０．１％トリフルオロ酢
酸を含むアセトニ）　Ｕルの直線濃度勾配溶出法による
分析において保持時間１４．７分を示し、そのアミノ酸
分析位は理論値と一致した。

アミノ酸分析加水分解；４Ｎメタンスルホン酸−２％トリプタミン、
１１０℃　２４峙間分析方法：ＰＩＣ〇−ＴＡＧ　（逆相−ＰＴＣアミノ酸
）法＊基準アミノ酸　　　　（）内理論値Ｇｌｙ：１．００　　（１）Ａｌａ：０．９０　　（１）Ｐｒｏ：０．９５　（１）＊Ｌｅｕ：１．００　　（１）スケジュールｌ工程　　　　　　　　　時間（分）×処理回数１、（洗
浄）塩化メチレン６０ｔＪ’ ２、（脱保護）５０％’Ｉ”　Ｆ　Ａ　−５％エタンジ
チオール− ４５％塩化メチレン（Ｖ／Ｖ）０ｒｒｆ１３、　　（？ｊｃ浄）塩化メチレン６０ｍｅ４、　（＆
浄）メタノール６０− ５、　〈中和ン　１０％トリエチルアミン−９０％塩化
メチレン（Ｖ／Ｖ）６０Ｉ７１ｉ！６、（洗浄）メタノール６０ｍ！！フ、（中和）１０％トリエチルアミン９０％塩化メチレン（Ｖ／Ｖ）６〇− ８、（洗浄〉メタノール６０ｍ１９、（洗浄）塩化メチレン６〇− １Ｏ１（カップリング）各アミノ基保護アミノｉ！１１２（６ミリモル）、５０％ＤＭＦ−
５０％塩化メチレン（Ｖ／Ｖ）３０ｍ、Ｘ３Ｘ１０Ｘ１Ｘ２２×２ＸＩＸ１ＸＩＸ２２×３５×１ＤＣＣ（６ミリモル）の塩化メチレン溶液１２ｄ　　　　１２０Ｘ１１１、（洗
浄）５０％ＤＭＦ−５０％塩化メチレン（Ｖ／Ｖ）　６０ｒｒｄ！　　　２　Ｘ　
２１２、（洗浄）メタノール６０ｍ１！　　　　２ｘｌ
１３、（中和）１０％トリエチルアミン９０％塩化メチ
レン（Ｖ／Ｖ）６０ｄ　　　　　　　　　　　　　Ｉ　Ｘ　１１４、　
（洗浄）メタノール６０ｍｇ　　　　２ｘ２１５、（＆
浄〉塩化メチレン６０ｍ１　　２Ｘ２１６、（アセチル
化）２５％無水酢酸７５％塩化メチレン（Ｖ／Ｖ）６０ｍｆ　　　　　　　　　　　　１５Ｘ１１７、（洗
浄〉塩化メチレン６０ｍ＋！　　　２Ｘ２１８、（洗浄
）メタノール６０ｍｇ　　　　２Ｘ２但し、工程■０で
２回目以降のカップリングの場合には、５０％ＤＭＦ−
５０％塩化メチレン（Ｖ／Ｖ）の代わりにＤＭＦ、また
はｌ−メチル−２−ピロリジノンを用い、反応時間を最
大１２時間まで延長した。

実施例４）ＩＣＮＰ”−”　Ｎ　Ｈ２の合成：使用した樹脂は粒径２００−４００メツシユの４−メチ
ルベンズヒドリルアミン樹脂である（１％ジビニルベン
ゼンで架橋、樹脂１ｇ当たり０゜７３ミリモルのアミノ
基を含有）。この樹脂６ｇを固相合成反応容器に入れ、
実施例３に記載のスケジュール１に従って工程３より合
成を開始し、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−
〇Ｆ【、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−○Ｈ，Ｂｏｃ−Ａｌ　ａ−Ｏ
Ｈ。

を順次、当量のＤＣＣを用いてカップリングさせた。こ
の際、添加剤として当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリア
ゾールを加えた。その結果、中間体ＨＣＮＰ’−”ＮＨ
ｔ　ヘフチ）’樹脂７．６ｇが得られたこの）ＩＣＮＩ
”−”　Ｎ　Ｈ２ペプチド樹脂１ｇにアニソール３ｒｎ
１、エチルメチルスルフィド０．５−１無水フッ化水素
２０−を加え、−２０℃６０分間、０℃６０分間反応さ
せた。減圧濃縮後、ジエチルエーテル２００ｒｎｌを加
え３０分間撹拌し、濾過しジエチルエーテル１００ｍｆ
ｆで洗浄した。謹上物に５％酢酸水１００−を加えて３
０分間撹拌後、樹脂を濾過し、５％酢酸水１００−で洗
浄した。

濾洗液を凍結乾燥後、得られた粗ペプチドを水に溶解し
、予め０．　１％トリフルオロ酢酸水で平衡化させた逆
相系充填剤ＹＭＣ−Ａ３６３　（Ｓ−５）ＯＤＳカラム
（３０φＸ２５０ｍｍ）に注入し、カラムを０，１％ト
リフルオロ酢酸水で洗浄後、アセトニ）　ＩＪル濃度を
１７％まで増加させ、流速７、　０−／分で溶出した。

溶出液をＡ２３０ｎｍでモニターし、目的物を含む両分
を集め、凍結乾燥し、ｔｌｃＮＰ’−”ＮＨｚ　　１７
７．　４　ｍｇを得た。

得られたＨＣＮＰ　８−”　Ｎ　Ｈ２は、逆相系充填剤
ＹＭＣ−Ａ２１１−ＯＤＳカラム（４，６φ×２５０ｍ
ｍ１を用いた、１０％から５０％までの０．　１％トリ
フルオロ酢酸を含むアセトニ）　ＩＪルの直！！！濃度
勾配溶出法による分析において保持時間１２゜５分を示
し、そのアミノ酸分析値は理論値と一致した。

アミノ酸分析加水分解：４Ｎメタンスルホン酸−２％トリプタミン、
１１０℃　２４時間分析方法：　Ｐ　Ｉ　Ｃｏ−ＴＡＧ　（逆相−ＰＴＣア
ミノ酸〉法＊基準アミノＮ１（）内理論値Ｇｌｙ：１．Ｏｆ　　（１）Ａｌａ：０．９１　　（１）Ｐｒｏ：０，９７　　（１）＊Ｌｅｕ：１．００　（１）実施例５へｃ−ＨＣＮＰの合成：実施例３に記載のＨＧＮＰ’−”ペプチド樹脂４．５ｇ
を固相合成反応容器に入れ、実施例３に記載のスケジュ
ールｌに従って、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ１Ｂｏｃ−Ｇｌ
ｎ−ＯＨ，ＢｏＣ−３ｅｒ　（Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ
−１１ｅ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓｐ　（ＯｃＨｅｘ）−Ｏ
Ｈ，Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ１を順次、当量のＤＣＣを用
いてカップリングさせた。この時添加剤として当量のＮ
−ヒドロキシベンゾトリアゾールを加えた。各カップリ
ング反応後、少量の樹脂をニンヒドリンで試験し、陽性
青色となった場合には、カップリング不完全であるとし
て同一の保護形アミノ酸を用い反応を繰り還した。この
際添加剤としてＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまた
はｐ−ニトロフェノールを加えた。最後のアミノ酸のカ
ップリング及びアセチル化工程終了後、約３／４の樹脂
を取りだした残りの樹脂はさらに下記スケジュールｌに
従って、Ｂｏｃ　−Ａ　Ｉ　ａ−ＯＨ，をカップリング
させた。約１／２の樹脂を取りだし、ｆ−ＨＣＮＰペプ
チド樹脂０．７２ｇが得られた。残りの樹脂はさらにス
ケジュール１の工程１〜９、続いて工程１６〜１８を繰
り返し、脱保護及びアセチル化を行った。その結果、＾
ｃ−１１ｃＮＰペプチド樹脂０．９７ｇが得られた。

このへＣ−１１ｃＮＰペプチド樹脂０．９７ｇにアニソ
ール３−、エチルメチルスルフィド０．５−１無水フッ
化水素２０−を加え、−２０℃６０分間、ａ℃６０分間
反応させた。　減圧濃縮後、ジエチルエーテル２００ｄ
を加え３０分間撹拌し、濾過しジエチルエーテル１００
−で洗浄した。謹上物に５％酢酸水１００−を加えて３
０分間撹拌後、樹脂を濾過し、５％酢酸水１００−で洗
浄した。

濾洗液を凍結乾燥後、得られた粗ペプチドを０５％５％
トリフルオロ酢酸水解し、予め０．１％トリフルオロ酢
酸水で平衡化させた逆相系充填剤ＹＭＣ−Ａ３６３　（
Ｓ−５）ＯＤＳカラム（３０φＸ２５０ｍｍ）に注入し
、カラムを０．１％トリフルオロ酢酸水で洗浄後、アセ
トニ）　ＩＪル濃度を３３％まで増加させ、流速７．０
−／分で溶出した。溶出液をＡ２８０ｎｍでモニターし
、目的物を含む両分を集め、凍結乾燥し、Ａｃ−ｆｌｃ
ＮＰを７６゜６ｍｇ得た。

得られた＾ｃ−ＨＣＮＰは逆相系充填剤ＹＭＣ−Ａ２１
１−ＯＤＳカラム（４，６φＸ２５０ｍｍ）を用いた、
１０％から５０％までの０．　１％トリフルオロ酢酸を
含むアセトニトリルの直線濃度勾配溶出法による分析に
おいて保持時間２８．９分を示し、そのアミノ酸分析値
は理論値と一致した。

アミノ酸分析加水分解：４Ｎメタンスルホン酸−２％トリプタミン、
１１０℃　２４時間分析方法：　Ｐ　ＩＣ０−ＴＡＧ　（逆相−ＰＴＣアミ
ノ酸）法＊基？Ｓ＋！アミノ酸　　　　（〉内理論値Ａｓｐ＋０
．９２　　（ＩＧｌｕ：０．９３　　（ＩＳｅｒ：０．９１　　（ＩＧｌｙ：１．０３　　（ＩＡｌａ：２．６７　　（３Ｐｒｏ：１．０４　　（＋１１ｅ：１．０４　　（１＊Ｌｅｕ　：　１．００　　（１）Ｔｒｐ：０，５８　　（１）実施例６ｆ−ＨＣＮＰの合Ｆ＆、：実施例５に記載のｆ−ＨＣＮＰペプチド樹脂０．７２ｇ
にアニソール３ｍｅ、エチルメチルスルフィド０５−１
無水フッ化水素２０−を加え、−２０℃６０分間、０℃
６０分間反応させた。減圧濃縮後、ジエチルエーテル２
００−を加え３０分間撹拌し、濾過しジエチルエーテル
ｌｏＯｍ！で洗浄した。濾上物に５％酢酸水１００ｒｎ
ｌを、１ｌｆｆえて３０分間撹拌後、樹脂を濾過し、５
％酢酸水１００−で洗浄した。濾洗液を凍結乾燥後、得
られた粗ペプチドを５０％酢酸水２０−に溶解し、水８
０−にて希釈後、予め０．１％トリフルオロ酢酸水で平
衡化させた逆相系充填剤ＹＭＣ−Ａ３６３　（Ｓ−５）
ＯＤＳカラム（３０φＸ２５０ｍｍ）に注入した。カラ
ムを０．１％トリフルオロ酢酸水で洗浄後、アセトニ）
　ＩＪル濃度を３０％まで増加させ、流速７．　０ａｔ
！／分で溶出した。溶出液をＡ２８０ｎｍでモニターし
、目的物を含む両分を集め、凍結乾燥し、ｆ−）ＩＣＭ
Ｐを７８．０ｍｇ得た。

得られたｆ−）１［”ＮＰは逆相系充填剤ＹＭＣ−Ａ２
１１−００Ｓカラム（４，６φＸ２５０ｍｍ）を用いた
、１０％から５０％までの０．１％トリフルオロ酢酸を
含むアセトニ）　ＩＪルの直線濃度勾配溶出法による分
析において保持時間２５．９分を示し、そのアミノ酸分
析値は理論値と一致した。

アミノ酸分析加水分解：４Ｎメタンスルホン酸−２％トリプタミン、
１１０℃　２４時間分析方法：　Ｐ　ＩＣ０−ＴＡＧ　（逆相−ＰＴＣアミ
ノ酸）法＊基準アミノ酸　　　　　（）内理論値Ａｓｐ：０．９
３　　（１）Ｇｌｕ：０．９１　　（１）Ｓｅｒ：０．９１　　（１）Ｇｌｙ：１．ｏｏ　　（１）Ａｌａ：２．６３　　（３）Ｐｒｏ　：　１．０２　　（１）１１ｅ：１．０５　　（１）＊Ｌｅｕ：１．ｏｏ　　（１）Ｔｒｐ：０．Ｇｏ　　（１）実施例７生物学的活性の測定：生物学的活性の測定法：ま、小鹿幸生ら（薬物・精神・
行動、７巻、４４７−４５１．１９８５）の方法に準じ
て行った。即ち、胎令１６日目のラット脳から摘出した
中隔中心核を細切後、ファルコン社製３５＋ｎｍプラス
チック製培養血中で、１％ＦＣ５を含むボッテンシュタ
イン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ）等の改変Ｎ２培養液を
用いて、７％炭炭酸ガス台空気、３６°Ｃの条件下で培
養した。培養３日目より、検体として実施例１．５．６
により得た神経栄養ペプチドを培養系に添加しく対照群
は無添加〉、培養９日目に培養組織のアセチルコリン（
ＡＣｈ）産生能を測定し、生物学的活性とした。

ＡＣｈ産生能は培養組織をトリス塩酸（ｐＨ７゜４）を
ａｔｒｒ系とするタイロード液にてブレインキュベーシ
ョンした後、１００ｎＭ　［３Ｈ］コリンクロライド（
１５Ｃｉ／ｍｍｏ　ｌ）を含む緩衝液で３７°Ｃ１３０
分インキュベート後、フリーの〔’ＨＥコリンを洗浄除
去後、ＩＮギ酸／ア七トン（１５：８５）溶液で組織を
溶解し、フリー〔３Ｈ〕コリンをコリンキナーゼ（０，
１ユニツト／Ｉｎ１）でフォスフォコリンに転換、［’
Ｈ］ＡＣｈをテトラフェニルボロン（５ｒｎ　ｇ　／−
アセトニトリル）で抽出し、培＃Ｍｉ織のＡＣｈ産生能
を検討した。培養組織のＡＣｈ産生能は単位培養組織片
当たりのＡＣｈ量で表現した。

（１）実施例１により得た”ＨＣＮＰ“の生物学的活性
を表１に示す。“ＨＣＮＰ”３００ρｇ／ｍ　ｌの濃度
において、対照の２０２％の培養組織のＡＣｈ産生能が
みられ、生物学的活性が認められた。

（１１）実施例５により１１′ＰたＡｃ−ｔｌｃＮｒ’
の結果は表２に示す。Ａｃ−１１［：ＮＰの３００ｐｇ
／ｍｆの濃度において、対ｊ１αの１５９％の培養組織
のＡＣｈ産生能がみられ。

生物学的活性が認められた。

表２　ラット中隔中心核培養系におけるＡＣｈ産生能に
対する作用。

表１　ラット中隔中心核培養系におけるＡＣｈ産生能に
対する作用。

（各検体は３回の試験結果）（ｉｉｉ）実施例６により得たｆ−ＨＣＮＩ’の結果は
表３に示す。　ｆ−ＩＣＮＰの２．５ｐｇ／−の濃度に
おいて、対唄の１５９％の培養組織のＡＣｈ産生能がみ
られ、生物学的活性が認められた。

表３　ラット中隔中心核培養系におけるＡＣｈ産生能に
対する作用。

（各検体は３回の試験結果）第１図

【図面の簡単な説明】

第１図は”ＨＣＮ　Ｐ”粗精製品の逆相系充填剤１１Ｐ
−３０４カラム（４６φＸ　２５０ａ＋＋ａ）での溶出
パターンを示した図である。縦軸はＡ２２０ｎｍでモニ
ターしたペプチド濃度、横軸は保持時間を表す。第２図は”＋１　ＣＮ　Ｐ”高度精製品の東ソー社製逆
相系充填剤１’５Ｋ−１２０Ｔカラム（４，ＯφＸ２５
０關）での溶出パターンを示した図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記の理化学的性質および生物学的性質を有する
神経栄養ペプチド。（ａ）海馬組織の水溶性画分に含まれる純粋なペプチド
。（ｂ）分子量：７００〜１４００（バイオ・ゲルＰ−２
を用いるゲル濾過法による）（ｃ）コリナージック・ニューロンのアセチルコリン合
成能を増大する。
（２）アミノ酸組成がＡｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ
、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ各１残基およびＡｌ
ａ３残基である請求項（１）記載の神経栄養ペプチド。
（３）下記のアミノ酸配列を有する神経栄養ペプチド。Ｘ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（ＸはフリーのＡｌ
ａ又はアセチル基でブロックされているＡｌａを表す。）
（４）海馬組織の抽出液から逆相液体クロマトグラフィ
ーを含む工程により、ペプチドを分離、採取することを
特徴とする請求項（１）、（２）又は（３）記載のペプ
チドの製造法。
（５）請求項（１）、（２）又は（３）記載のペプチド
を有効成分とする神経変性疾患治療剤。
（６）請求項（１）、（２）又は（３）記載のペプチド
を有効成分とする抗痴呆剤。