JPH0372499A - 神経栄養ペプチド - Google Patents
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- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、哺乳類の海鳥組織に由来する、コリナージッ
ク・ニューロンのアセチルコリン合成能増大作用を有す
る新規な神経栄養ペプチドに関するものである。 より
詳細には、哺乳類脳海馬組織に由来し、コリナージック
・ニューロンの形成、維持のための種々の生理学的活性
を有する新規な神経栄養ペプチドに関するものである。
ク・ニューロンのアセチルコリン合成能増大作用を有す
る新規な神経栄養ペプチドに関するものである。 より
詳細には、哺乳類脳海馬組織に由来し、コリナージック
・ニューロンの形成、維持のための種々の生理学的活性
を有する新規な神経栄養ペプチドに関するものである。
神経栄養因子は、神経末端の標的、ma、ダリア細胞や
血流から供給されるものである。その作用としては神経
細胞の生存・維持、神経突起の伸長の促進及び神経伝達
物質の合成酵素を誘導する作用が認められている。特に
長い投射路を持つニューロンのネットワークの形成や維
持においては、標的細胞からの神経栄養因子の供給が不
可欠なものであると考えられており、投射ニューロン系
の変性・脱落と神経学的疾患との関連が明らかにされて
きている。代表的な例としては、前脳基底野−新皮質海
馬のコリン性神経系の変性・脱落とアルツハイマー型痴
呆、風質−線条体のドーパミン性神経系の変性・脱落と
パーキンソン病、を髄運動神経系の変性・脱落と筋萎縮
性側索硬化症との関係が挙げられる。これらの神経の変
性・脱落、つまり疾患の原因としては、標的細胞由来の
神経栄養因子の不足や欠如が原因ではないかと推定され
ており、神経栄養因子補充による神経変性疾患の治療の
可能性が示唆されている〔アラベル(^ppel、 S
、 H,)アナルス・オブ・ニーーロロジー(^nn、
Neurol、) 10巻、499頁、(1981)
〕。
血流から供給されるものである。その作用としては神経
細胞の生存・維持、神経突起の伸長の促進及び神経伝達
物質の合成酵素を誘導する作用が認められている。特に
長い投射路を持つニューロンのネットワークの形成や維
持においては、標的細胞からの神経栄養因子の供給が不
可欠なものであると考えられており、投射ニューロン系
の変性・脱落と神経学的疾患との関連が明らかにされて
きている。代表的な例としては、前脳基底野−新皮質海
馬のコリン性神経系の変性・脱落とアルツハイマー型痴
呆、風質−線条体のドーパミン性神経系の変性・脱落と
パーキンソン病、を髄運動神経系の変性・脱落と筋萎縮
性側索硬化症との関係が挙げられる。これらの神経の変
性・脱落、つまり疾患の原因としては、標的細胞由来の
神経栄養因子の不足や欠如が原因ではないかと推定され
ており、神経栄養因子補充による神経変性疾患の治療の
可能性が示唆されている〔アラベル(^ppel、 S
、 H,)アナルス・オブ・ニーーロロジー(^nn、
Neurol、) 10巻、499頁、(1981)
〕。
現在までに神経栄養因子の存在が数多く確認されている
が、単離され、−次構造が明らかにされている神経栄養
因子は神経成長因子(Nerve growth (a
ctar、NGF)だけである。NGFは、α、β。
が、単離され、−次構造が明らかにされている神経栄養
因子は神経成長因子(Nerve growth (a
ctar、NGF)だけである。NGFは、α、β。
Tの3つの異なるサブユニットからなり、構成比はα2
βT2で3サブユニツトのうち、βNGFのみが生理活
性を示している〔バローン(Varon S、 et
allバイオケミストリー(口iochemistry
) 7巻1296頁(1968) ]。マウスβNGF
の一次構造は1971年にアンゲレッティとブラッドシ
ョ(Angeletti &8radshaw)によっ
て決定され、アミノ酸の総数118個(分子ffi 1
325(1)の蛋白である〔アンゲレツテイとブラット
′ショ(Angeletti &Bradshow)プ
ロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス(Proc、Natl、Acad、Sc
i )USA68巻241巻真417頁1) 〕。
βT2で3サブユニツトのうち、βNGFのみが生理活
性を示している〔バローン(Varon S、 et
allバイオケミストリー(口iochemistry
) 7巻1296頁(1968) ]。マウスβNGF
の一次構造は1971年にアンゲレッティとブラッドシ
ョ(Angeletti &8radshaw)によっ
て決定され、アミノ酸の総数118個(分子ffi 1
325(1)の蛋白である〔アンゲレツテイとブラット
′ショ(Angeletti &Bradshow)プ
ロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス(Proc、Natl、Acad、Sc
i )USA68巻241巻真417頁1) 〕。
次に、−次構造は明らかにされていないが、その特徴が
調べられている神経栄養因子としては、脳由来神経栄養
因子(BDNF)と毛様体神経栄養因子(cNTF)が
ある。BDNFはテーネン(Thoenen)らにより
ブタの脳から、胎児抜根神経節の感覚神経の生存を維持
する神経栄養因子として精製されている。その分子量は
13250で塩基性の高い(PI>10.1)ポリペプ
チドであるが、その−次構造はまだ明らかにされていな
い〔パルプ(fJarde Y、^、 et al、)
エンボ・ジャーナル(EMBOJ、) 1巻549−
553頁(1982)] 、 CNTFはマンソープ(
Manthorpe) らにより、ニワ) IJ胎児の
眼球から精製された副交感神経節(毛様体神経節)の細
胞に対して生存維持に作用する神経栄養因子である。分
子量は20400ダルトンで等電点は約5である〔マン
ソーブ(Manth。
調べられている神経栄養因子としては、脳由来神経栄養
因子(BDNF)と毛様体神経栄養因子(cNTF)が
ある。BDNFはテーネン(Thoenen)らにより
ブタの脳から、胎児抜根神経節の感覚神経の生存を維持
する神経栄養因子として精製されている。その分子量は
13250で塩基性の高い(PI>10.1)ポリペプ
チドであるが、その−次構造はまだ明らかにされていな
い〔パルプ(fJarde Y、^、 et al、)
エンボ・ジャーナル(EMBOJ、) 1巻549−
553頁(1982)] 、 CNTFはマンソープ(
Manthorpe) らにより、ニワ) IJ胎児の
眼球から精製された副交感神経節(毛様体神経節)の細
胞に対して生存維持に作用する神経栄養因子である。分
子量は20400ダルトンで等電点は約5である〔マン
ソーブ(Manth。
rpe M、 et al、)ジャーナル・オブ・二ニ
ーロケミスドリー(J、Neurochem、 )34
巻69−75頁(198(1)〕〔マンソーブ(Man
thorpe M、et al、)ジャーナル・オブ・
ニューロサイエンス・リサーチ(J、 Neurosc
i、Res、) 8巻233−239頁(19B2)
] [マンソープ(Manthorpe M、et
al、)フエデレーション・プロシーデインゲス(Fe
deration Proc、)44巻2753−27
59頁(1985)]。CNTPはまだ一次構造及びイ
ン・ビボの効果に関しては報告されていない。
ーロケミスドリー(J、Neurochem、 )34
巻69−75頁(198(1)〕〔マンソーブ(Man
thorpe M、et al、)ジャーナル・オブ・
ニューロサイエンス・リサーチ(J、 Neurosc
i、Res、) 8巻233−239頁(19B2)
] [マンソープ(Manthorpe M、et
al、)フエデレーション・プロシーデインゲス(Fe
deration Proc、)44巻2753−27
59頁(1985)]。CNTPはまだ一次構造及びイ
ン・ビボの効果に関しては報告されていない。
一方、未だ精製されていないが、上記3種の神経栄養因
子以外にも種々の神経栄養因子が報告されている。 そ
のうち、海馬由来あるいは海馬、中隔績に作用する神経
栄養因子としては、下記のもの等が報告されている。
子以外にも種々の神経栄養因子が報告されている。 そ
のうち、海馬由来あるいは海馬、中隔績に作用する神経
栄養因子としては、下記のもの等が報告されている。
■新生ラット(2〜3週令)の海馬組織より部分精製さ
れている神経栄養因子〔小鹿他(Ojika K。
れている神経栄養因子〔小鹿他(Ojika K。
etal、)プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス(Proc、 Natl
、Acad Sci、)US^81巻2567−257
1頁(1984) ]、〔アアラベル^ppel、 S
、 H,)特開昭58−154514 ]、〔小鹿幸生
、薬物・精神・行動(Jpn、 J、 PSycoph
arnacology) 7巻447−451頁(19
87)) :その可溶性成分は海馬組織に比較的特異
的に存在し、培養中隔中心核コリン性作動神経の発育を
促進する。部分精製の結果、分子量約900ダルトンの
ポリペプチドであることが報告されている。
アカデミ−・オブ・サイエンス(Proc、 Natl
、Acad Sci、)US^81巻2567−257
1頁(1984) ]、〔アアラベル^ppel、 S
、 H,)特開昭58−154514 ]、〔小鹿幸生
、薬物・精神・行動(Jpn、 J、 PSycoph
arnacology) 7巻447−451頁(19
87)) :その可溶性成分は海馬組織に比較的特異
的に存在し、培養中隔中心核コリン性作動神経の発育を
促進する。部分精製の結果、分子量約900ダルトンの
ポリペプチドであることが報告されている。
本因子の活性はNGF抗体の添加により阻害されないこ
とから、NGFとは異なっていると考えられている〔ボ
スドウ4”/り(Bostwick J、Roet a
l、)ブレーン・リサーチ(Brain Re5ear
ch) 422巻9298頁(1987):l。
とから、NGFとは異なっていると考えられている〔ボ
スドウ4”/り(Bostwick J、Roet a
l、)ブレーン・リサーチ(Brain Re5ear
ch) 422巻9298頁(1987):l。
■新生ラット脳のアストロサイトの条件培地から分離さ
れた神経栄養因子〔ミュラー他(Muller tl。
れた神経栄養因子〔ミュラー他(Muller tl。
IA、 et al、)ブロシーデインダス・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス(Proc、
Natl。
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス(Proc、
Natl。
^cad、Sci、)LISA 81巻1248−12
52頁(1984) :l +セファデックスG10
0のゲル濾過カラムの溶出位置から分子量約500と推
定され、トリプシン及びプロナーゼ処理により活性が消
失しないことから、非蛋白性因子と考えられている。
52頁(1984) :l +セファデックスG10
0のゲル濾過カラムの溶出位置から分子量約500と推
定され、トリプシン及びプロナーゼ処理により活性が消
失しないことから、非蛋白性因子と考えられている。
■脳弓采(fimbria fornics)切断14
日後のラット海馬抽出液より部分精製された神経栄養因
子〔吉田−成、慶應医学65巻1号45−64頁(19
88)) ニゲル濾過の結果、1万〜2万、3万〜4
万、5万〜6万ダルトンの分子量の3種の因子が報告さ
れている。
日後のラット海馬抽出液より部分精製された神経栄養因
子〔吉田−成、慶應医学65巻1号45−64頁(19
88)) ニゲル濾過の結果、1万〜2万、3万〜4
万、5万〜6万ダルトンの分子量の3種の因子が報告さ
れている。
■ラット海鳥組織より抽出された神経栄養因子〔ヒーコ
ック()!eacock^0M、 et al、) 、
ブレーン・リサーチ(Brain Re5each)
363巻299−306頁(19B6)〕 : ニットIJ毛様体神経節細胞の生存を維持する活性を有
する。分子量は10000以上の酸性蛋白である。
ック()!eacock^0M、 et al、) 、
ブレーン・リサーチ(Brain Re5each)
363巻299−306頁(19B6)〕 : ニットIJ毛様体神経節細胞の生存を維持する活性を有
する。分子量は10000以上の酸性蛋白である。
このように、これらの海馬由来あるいは海馬中隔績に作
用する神経栄養因子は蛋白性因子や非蛋白性因子として
報告されているが、いずれも単離、精製されておらず、
−次構造も明らかにされていない。
用する神経栄養因子は蛋白性因子や非蛋白性因子として
報告されているが、いずれも単離、精製されておらず、
−次構造も明らかにされていない。
しかし、これら神経栄養因子の薬理作用に着目し、神経
変性疾患治療剤として使用すべく、純化した該神経栄養
因子の開発が望まれていた。
変性疾患治療剤として使用すべく、純化した該神経栄養
因子の開発が望まれていた。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は上記従来の課題を解決するものである。
即ち、本発明の第1の目的は純粋な化合物として単離精
製された、コリナージック・ニューロンのアセチルコリ
ン合成能増大作用を有する新規な神経栄養ペプチドを提
供するものである。
製された、コリナージック・ニューロンのアセチルコリ
ン合成能増大作用を有する新規な神経栄養ペプチドを提
供するものである。
本発明の第2の目的は当該新規神経栄養ペプチドの製造
法を提供することである。
法を提供することである。
本発明の第3の目的は新規な神経変性疾患治療剤を提供
することである。
することである。
本発明者は、前記課題を解決するため種々研究を重ねて
きたところ、新規な神経栄養ペプチドの単離、精製に成
功し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。
きたところ、新規な神経栄養ペプチドの単離、精製に成
功し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。
ここで言う、本発明の神経栄養ペプチドとは、ペプチド
性の神経栄養因子を意味し、下記の理化学的性質および
生物学的性質を有する。
性の神経栄養因子を意味し、下記の理化学的性質および
生物学的性質を有する。
(a)海馬組織の水溶性画分に含まれる純粋なペプチド
。
。
ら)分子量:700〜1400 (バイオ・ゲルP−2
を用いるゲル濾過法による) (c)コリナージック・ニューロンのアセチルコリン合
成能を増大する。
を用いるゲル濾過法による) (c)コリナージック・ニューロンのアセチルコリン合
成能を増大する。
この明細書においては、アミノ酸、保護基、活性基、溶
媒等について、IUPAC−IUBに基づく略号および
、当該分野における慣用略号で表示する場合があり、そ
れらを例示すると次の通りである。
媒等について、IUPAC−IUBに基づく略号および
、当該分野における慣用略号で表示する場合があり、そ
れらを例示すると次の通りである。
アミノ酸残基に対する略号は以下の通りである。
略号 名称
Leu L−ロイシン
Ser L−セリン
Gln L−グルタミン
11e L−インロイシン
Asp L−アスパラギン酸Gly
グリシン Ala L−アラニン Pro L−プロリン Trp L−トリプトファン特に断らない限
り、本明細書で接頭辞ILで命名されているアミノ酸残
基は天然に生ずる絶対立体配置りに該当する。
グリシン Ala L−アラニン Pro L−プロリン Trp L−トリプトファン特に断らない限
り、本明細書で接頭辞ILで命名されているアミノ酸残
基は天然に生ずる絶対立体配置りに該当する。
他の略号は次の通りである。
略号 名称
Ac ア七チル
Boc t−ブチルオキシカルボニル○cH
ex シクロヘキシルエステルBzl
ベンジル DCCジシクロへキシルカルボジイ ミド DMF ジメチルホルムアミドPTCフェニ
ルチオカルバミル TFA )リフルオロ酢酸また、本明細書
において本発明の神経栄養ペプチドはHCNP (旧
ppocampal Cholinergic Neu
rotrOρhic Peptide )と略称する場
合がある。そして、海馬組織から抽出M製し、単離した
該ペプチドを特に意味する場合は°’1(cNP“と表
示する。更に、本発明の神経栄養ペプチドのアミノ酸配
列において、N末端はアセチル基でブロックされていて
もよい。この場合、特にN末端の構造上の違いを明示す
る必要のある場合は、アセチル基でブロックされている
ものをAc−HCNPと、一方ブロックされでいないフ
リーのものはf−)IC:NPと表示する。
ex シクロヘキシルエステルBzl
ベンジル DCCジシクロへキシルカルボジイ ミド DMF ジメチルホルムアミドPTCフェニ
ルチオカルバミル TFA )リフルオロ酢酸また、本明細書
において本発明の神経栄養ペプチドはHCNP (旧
ppocampal Cholinergic Neu
rotrOρhic Peptide )と略称する場
合がある。そして、海馬組織から抽出M製し、単離した
該ペプチドを特に意味する場合は°’1(cNP“と表
示する。更に、本発明の神経栄養ペプチドのアミノ酸配
列において、N末端はアセチル基でブロックされていて
もよい。この場合、特にN末端の構造上の違いを明示す
る必要のある場合は、アセチル基でブロックされている
ものをAc−HCNPと、一方ブロックされでいないフ
リーのものはf−)IC:NPと表示する。
11cNPの物理化学的性質:
(1)分子ft’1
バイオ・ゲルP−2カラムを用いるゲル濾過法により、
分子量は700〜1400である。
分子量は700〜1400である。
指標として、リボヌクレアーゼA(分子量13,70(
1)、ビタミンB12(分子flll、355)、β−
二ココチンアミドアテ°ニン・ジヌクレオチド(Nへ〇
〇〉(分子量663)Z−Glu−Tyr(分子ff1
444)、Trp(分子1204)を用い、溶出液とし
て0.05M酢酸を用いた。
1)、ビタミンB12(分子flll、355)、β−
二ココチンアミドアテ°ニン・ジヌクレオチド(Nへ〇
〇〉(分子量663)Z−Glu−Tyr(分子ff1
444)、Trp(分子1204)を用い、溶出液とし
て0.05M酢酸を用いた。
(2)アミノ酸組成
”IICNP″をフェノール含有定沸点塩酸で、110
℃、20時間加水分解してアミノM組成を調べた。
℃、20時間加水分解してアミノM組成を調べた。
Leuを基準アミノ酸として算出したアミノ酸組成は以
下の通りであった。
下の通りであった。
^SX:0.9 、Ser: 1.4 、Glx: 1
.3 、Pro: 1゜0 、Gly: IJ 、Al
a : 2.5 、lie : 0.9 、Leu:
1.0 、Trp:0.8 (3)N末端アミノ酸 ”HCNP”をAppliecl fJIasyste
ms社製477型プロティン・シーケンサ−を用いてエ
ドマン分解し、生成したPTH(フェニルチオヒダント
イン)−アミノ酸誘導体を^pplied Biosy
stems社ml[120A型PTHアナライザーで分
析した結果、サイクル1〜10でアミノ酸が全く検出さ
れなかった。従って、N末端アミノ酸はブロックされて
いると考えられる“)ICNP”のN末端アミノ酸をア
シルアミノ酸遊離酵素を用いて切断し生成したアシルア
ミノ酸を分取した。そのアシルアミノ酸を加水分解後、
アミノ酸分析した結果、Alaが検出されたことからN
末端アミノ酸はへ1aと同定された。
.3 、Pro: 1゜0 、Gly: IJ 、Al
a : 2.5 、lie : 0.9 、Leu:
1.0 、Trp:0.8 (3)N末端アミノ酸 ”HCNP”をAppliecl fJIasyste
ms社製477型プロティン・シーケンサ−を用いてエ
ドマン分解し、生成したPTH(フェニルチオヒダント
イン)−アミノ酸誘導体を^pplied Biosy
stems社ml[120A型PTHアナライザーで分
析した結果、サイクル1〜10でアミノ酸が全く検出さ
れなかった。従って、N末端アミノ酸はブロックされて
いると考えられる“)ICNP”のN末端アミノ酸をア
シルアミノ酸遊離酵素を用いて切断し生成したアシルア
ミノ酸を分取した。そのアシルアミノ酸を加水分解後、
アミノ酸分析した結果、Alaが検出されたことからN
末端アミノ酸はへ1aと同定された。
(4)アミノ酸配列
” 11 CN P ’のN末端アミノ酸はブロックさ
れていたため、アシルアミノ酸遊A′li酵素を用いて
N末端アミノ酸を切断した後、逆相系液体クロマトグラ
フィーによりN末端アミノ酸のはずれた構成ペプチドを
分取した。そのvt或ペプチドを^pρl1ed Bi
。
れていたため、アシルアミノ酸遊A′li酵素を用いて
N末端アミノ酸を切断した後、逆相系液体クロマトグラ
フィーによりN末端アミノ酸のはずれた構成ペプチドを
分取した。そのvt或ペプチドを^pρl1ed Bi
。
systems社製477型プロティン・シーケンサ−
と120A型PTHアナライザーを用いて解析した結果
、Ala−Asp−11e−3er−Gln−Trp−
Ala−Gly−Pro−Leuと同定された。
と120A型PTHアナライザーを用いて解析した結果
、Ala−Asp−11e−3er−Gln−Trp−
Ala−Gly−Pro−Leuと同定された。
(3)、 (4)の結果から、’IIcNP”のアミノ
酸配列は次のように決定された。
酸配列は次のように決定された。
(5)C末端M4造
”)IcNP″をキモトリプシンで断片化し、逆相系高
速液体クロマトグラフィーによりC末端構成ペプチドを
単離し、アミノ酸配列を解析し、Ala−GIY−Pr
o−Leuと同定した。 ペプチド合成法によりAla
−Gly−Pro−Leu−OHおよびAla−Gly
−Pro−Leu−NH2を合成し、逆相系充填剤TS
に一120Tカラムを用いる高速液体クロマトグラフィ
ー法で分析し、それらの保持時間を比較した結果、“)
ICNP“から得られたC末端構成ペプチドは前者の合
成ペプチドと一致した。この事実から”HCNP”のC
末端アミノ酸Leuは−01(体と同定された。
速液体クロマトグラフィーによりC末端構成ペプチドを
単離し、アミノ酸配列を解析し、Ala−GIY−Pr
o−Leuと同定した。 ペプチド合成法によりAla
−Gly−Pro−Leu−OHおよびAla−Gly
−Pro−Leu−NH2を合成し、逆相系充填剤TS
に一120Tカラムを用いる高速液体クロマトグラフィ
ー法で分析し、それらの保持時間を比較した結果、“)
ICNP“から得られたC末端構成ペプチドは前者の合
成ペプチドと一致した。この事実から”HCNP”のC
末端アミノ酸Leuは−01(体と同定された。
(6)N末端構造
(3)で得られたアシルアラニンと各種アシルアミノ酸
誘導体標品とを逆相系充填剤TSに一120Tカラムを
用いる高速液体クロマトグラフィー法で分析し、それら
の保持時間を比較した結果、(3)で得られたアシルア
ラニンはアセチルアラニンと一致した。この事実から”
HCNP”のN末端アミノ酸Alaはアセチル化されて
いると判断された。
誘導体標品とを逆相系充填剤TSに一120Tカラムを
用いる高速液体クロマトグラフィー法で分析し、それら
の保持時間を比較した結果、(3)で得られたアシルア
ラニンはアセチルアラニンと一致した。この事実から”
HCNP”のN末端アミノ酸Alaはアセチル化されて
いると判断された。
ペプチド合成法により^cetyl−Ala−Ala−
Asp−lleSer−Gln−Trp−Ala−Gl
y−Pro−Leuを合成し、逆相系充填剤TSK−1
20Tカラムを用いる高速液体クロマトグラフィー法で
分析し、”II(:NP“と上記合成ペプチドとの保持
時間を比較した。その結果、”)IcNP”の保持時間
は合成ペプチドの保持時間と一致したことから、”II
GNP”の−次構造を以下のように決定した。即ち、こ
の配列は^c−HCNPの一次構造であることが判明し
た。
Asp−lleSer−Gln−Trp−Ala−Gl
y−Pro−Leuを合成し、逆相系充填剤TSK−1
20Tカラムを用いる高速液体クロマトグラフィー法で
分析し、”II(:NP“と上記合成ペプチドとの保持
時間を比較した。その結果、”)IcNP”の保持時間
は合成ペプチドの保持時間と一致したことから、”II
GNP”の−次構造を以下のように決定した。即ち、こ
の配列は^c−HCNPの一次構造であることが判明し
た。
Pro−Leu
しかし、本発明の神経栄養ペプチドはN末端がアセチル
基でブロックされていないフリーのもの(即ち、f−H
CNP)をも包含するものである。
基でブロックされていないフリーのもの(即ち、f−H
CNP)をも包含するものである。
本発明のIIcNP“の製造方法としては、例えば、次
のような方法が例示される。
のような方法が例示される。
(i)海馬amから抽出・精製し単離する方法:製造原
料としては、いずれの哺乳動物の脳をも使用することが
でき、ヒトのみならず、例えばマウス、ラット、イヌ、
ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ等の各種哺乳
動物が対象となる。
料としては、いずれの哺乳動物の脳をも使用することが
でき、ヒトのみならず、例えばマウス、ラット、イヌ、
ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ等の各種哺乳
動物が対象となる。
その代表例としてラット脳の海鳥組織が挙げられる。好
ましくは生後l〜2週令のラット胎児脳から海馬組織を
とり出し、使用するまで凍結保存、杼ましくは一70℃
以下で保存しておく。
ましくは生後l〜2週令のラット胎児脳から海馬組織を
とり出し、使用するまで凍結保存、杼ましくは一70℃
以下で保存しておく。
海馬組織からの抽出は冷却下、できれば0℃〜5℃で行
なうことが好ましい。海鳥組織に2〜10倍量の中性緩
衝液、好ましくは6〜7倍量のpH7,2のリンerg
衝液を加え、ガラス・テフロンホモゲナイザーを用いて
ホモゲナイズする。遠心し、好ましくは100.0OO
Gで4℃、2時間遠心して沈澱を除く。
なうことが好ましい。海鳥組織に2〜10倍量の中性緩
衝液、好ましくは6〜7倍量のpH7,2のリンerg
衝液を加え、ガラス・テフロンホモゲナイザーを用いて
ホモゲナイズする。遠心し、好ましくは100.0OO
Gで4℃、2時間遠心して沈澱を除く。
得られた上清に酸、好ましくは酢酸を最終濃度が2Mに
なるように加え酸性にし、生じた沈澱を再び遠心して除
く。
なるように加え酸性にし、生じた沈澱を再び遠心して除
く。
このようにして得られた”IIcNP”を含む上清は公
知の精製法、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、限外
濾過、透析、塩析などを単独あるいは組み合せて精製す
ることができる。#R製は冷却下、できればO℃〜5℃
で行うことが好ましい。好ましくは、得られた上清を分
子fft5000以下の低分子を通す分子フィルター、
例えばアミコン社製のYM5メンプランを用いて限外濾
過し、分子量5000以下の低分子画分を集め、凍結乾
燥する。得られた粉末を少量の酸、好ましくは0.05
M酢酸に溶解し、適当なゲル濾適用充填剤、例えば、バ
イオゲルP−2、バイオゲルP−6あるいはセファテ′
ツクスG−25、好ましくはバイオゲルP−2を用いる
ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量分画する。溶
出液についてラット中隔中心核を用いる生物学的活性測
定法によりコリナージック・ニコーロンのアセチルコリ
ン合成能への効果を測定する。活性画分を集め、適当な
逆相系充填剤、好ましくはミリポア社製の5ep−Pa
k−C18カートリッジに通液する。カートリッジを酸
、好ましくは0゜05M i’j¥酸で洗浄した後、適
当な酸性有機溶媒、好ましくは0.1%TFA−60%
アセトニトリルを用いて溶出する。溶出液を集め、凍結
乾燥し白色の粉末を得る。
知の精製法、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、限外
濾過、透析、塩析などを単独あるいは組み合せて精製す
ることができる。#R製は冷却下、できればO℃〜5℃
で行うことが好ましい。好ましくは、得られた上清を分
子fft5000以下の低分子を通す分子フィルター、
例えばアミコン社製のYM5メンプランを用いて限外濾
過し、分子量5000以下の低分子画分を集め、凍結乾
燥する。得られた粉末を少量の酸、好ましくは0.05
M酢酸に溶解し、適当なゲル濾適用充填剤、例えば、バ
イオゲルP−2、バイオゲルP−6あるいはセファテ′
ツクスG−25、好ましくはバイオゲルP−2を用いる
ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量分画する。溶
出液についてラット中隔中心核を用いる生物学的活性測
定法によりコリナージック・ニコーロンのアセチルコリ
ン合成能への効果を測定する。活性画分を集め、適当な
逆相系充填剤、好ましくはミリポア社製の5ep−Pa
k−C18カートリッジに通液する。カートリッジを酸
、好ましくは0゜05M i’j¥酸で洗浄した後、適
当な酸性有機溶媒、好ましくは0.1%TFA−60%
アセトニトリルを用いて溶出する。溶出液を集め、凍結
乾燥し白色の粉末を得る。
上記白色粉末からの″)ICNP”の単離は逆相液体ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーある
いは適当な抗体などを用いるアフィニティークロマトグ
ラフィーを単独あるいは組み合せて行なうことができる
。
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーある
いは適当な抗体などを用いるアフィニティークロマトグ
ラフィーを単独あるいは組み合せて行なうことができる
。
好ましくは上記白色粉末を適当な酸、好ましくは0゜1
%TFAに溶解し、適当な逆相系充填剤、例えば炭素数
1から18のアルキル基あるいはフェニル基の結合した
シリカゲル担体を用いる逆相系液体クロマトグラフィー
によりI!l!!する。溶出溶媒としてはTFA、酢酸
、ギ酸あるいはリン酸を含むアセトニトリル、プロパノ
ール、インプロパノール、メタノール、エタノールある
いはブタノールなどを使用することができる。例えば、
バイオラッド社製RP−304逆相系カラムを用いる高
速液体クロマトグラフィーにより分画し、アセトニトリ
ル濃度21%〜26%で溶出される画分を分取し、凍結
乾燥し、白色の粉末を得る。この白色粉末を適当な酸、
好ましくは0.05%TFAに溶解し、東ソー社製TS
に一120T逆相系カラムを用いる高速液体クロマトグ
ラフィーにより分画し、アセトニトリル濃度28%〜3
0%で溶出される両分を分取し、凍結乾燥し、白色粉末
状の”HCNP“を得る。これは通常、冷暗所に保存さ
れる。
%TFAに溶解し、適当な逆相系充填剤、例えば炭素数
1から18のアルキル基あるいはフェニル基の結合した
シリカゲル担体を用いる逆相系液体クロマトグラフィー
によりI!l!!する。溶出溶媒としてはTFA、酢酸
、ギ酸あるいはリン酸を含むアセトニトリル、プロパノ
ール、インプロパノール、メタノール、エタノールある
いはブタノールなどを使用することができる。例えば、
バイオラッド社製RP−304逆相系カラムを用いる高
速液体クロマトグラフィーにより分画し、アセトニトリ
ル濃度21%〜26%で溶出される画分を分取し、凍結
乾燥し、白色の粉末を得る。この白色粉末を適当な酸、
好ましくは0.05%TFAに溶解し、東ソー社製TS
に一120T逆相系カラムを用いる高速液体クロマトグ
ラフィーにより分画し、アセトニトリル濃度28%〜3
0%で溶出される両分を分取し、凍結乾燥し、白色粉末
状の”HCNP“を得る。これは通常、冷暗所に保存さ
れる。
(ii)化学合成による方法:
化学合成による方法では、通常のペプチド化学において
用いられる方法に準じて合成することができる。すなわ
ち、液相法、固相法いずれによっても得ることができる
。
用いられる方法に準じて合成することができる。すなわ
ち、液相法、固相法いずれによっても得ることができる
。
より詳細には、例えば固相合成法を採用する場合、C末
端アミノ酸(アミノ基を保護したもの)をそのカルボキ
シル基によって、まず不溶性担体に結合させる。次いで
、アミノ保護基を除去した後、目的ペプチドのアミノ酸
配列に従い、順次アミノ基保護アミノ酸をその反応性ア
ミノ基および反応性カルボキシル基との縮合反応により
結合させ、−段階ずつ合或し、全配列を合成した後、ペ
プチドを不溶性担体からはずすとともに保護基を除去す
ることにより、目的のペプチドを得ることができる。
端アミノ酸(アミノ基を保護したもの)をそのカルボキ
シル基によって、まず不溶性担体に結合させる。次いで
、アミノ保護基を除去した後、目的ペプチドのアミノ酸
配列に従い、順次アミノ基保護アミノ酸をその反応性ア
ミノ基および反応性カルボキシル基との縮合反応により
結合させ、−段階ずつ合或し、全配列を合成した後、ペ
プチドを不溶性担体からはずすとともに保護基を除去す
ることにより、目的のペプチドを得ることができる。
上記各種方法において、反応性の官能基は保護しておく
ことが好ましい。
ことが好ましい。
アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカ
ルボニル、t−ブチルオキシカルボニル、p−メトキシ
ベンジルオキシカルボニル、2クロルベンジルオキシカ
ルボニル、p−トルエンスルホニル、トリフルオロアセ
チル、フタリル、ホルミル、0−ニトロフェニルスルフ
ェニル、3ニトロ−2−ピリジンスルフェニル、ジフェ
ニルホスフィノチオイル基などがあげられる。カルボキ
シル基の保護基としては、例えばアルキルエステル(メ
チル、エチル、t−ブチルなどのCI−、アルキルエス
テル)、ベンジルエステル、pニトロベンジルエステル
、p−メチルベンジルエステル、シクロヘキシルエステ
ル、シクロペンチルエステルなどがあげられる。Set
の水酸基は、必ずしも保護する必要はないが、必要であ
れば、例えば、ベンジル、2.6−ジクロルベンジル、
t−ブチル、ベンジルオキシカルボニル、アセチル基な
どで保護することができる。Trpのインドリル基は必
要であれば、ホルミル、ベンジルオキシカルボニル、2
.4−ジクロルベンジルオキシカルボニル基などで保護
することも可能である。
ルボニル、t−ブチルオキシカルボニル、p−メトキシ
ベンジルオキシカルボニル、2クロルベンジルオキシカ
ルボニル、p−トルエンスルホニル、トリフルオロアセ
チル、フタリル、ホルミル、0−ニトロフェニルスルフ
ェニル、3ニトロ−2−ピリジンスルフェニル、ジフェ
ニルホスフィノチオイル基などがあげられる。カルボキ
シル基の保護基としては、例えばアルキルエステル(メ
チル、エチル、t−ブチルなどのCI−、アルキルエス
テル)、ベンジルエステル、pニトロベンジルエステル
、p−メチルベンジルエステル、シクロヘキシルエステ
ル、シクロペンチルエステルなどがあげられる。Set
の水酸基は、必ずしも保護する必要はないが、必要であ
れば、例えば、ベンジル、2.6−ジクロルベンジル、
t−ブチル、ベンジルオキシカルボニル、アセチル基な
どで保護することができる。Trpのインドリル基は必
要であれば、ホルミル、ベンジルオキシカルボニル、2
.4−ジクロルベンジルオキシカルボニル基などで保護
することも可能である。
上記各種方法において、ペプチド結合形成方法としては
、例えばジシクロへキシルカルボジイミド、1−エチル
−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
などのカルボジイミド型縮合剤を用いる方法、対称型酸
無水物法、混合酸無水物法、アジド法、活性エステル法
、酸化還元法、ジフェニルホスホリルアジド法、カルボ
ジイミド型線合剤+添加物(1−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール、N−ヒドロキシコハク酸イミドなど)法など
既知の手法があげられる。
、例えばジシクロへキシルカルボジイミド、1−エチル
−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
などのカルボジイミド型縮合剤を用いる方法、対称型酸
無水物法、混合酸無水物法、アジド法、活性エステル法
、酸化還元法、ジフェニルホスホリルアジド法、カルボ
ジイミド型線合剤+添加物(1−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール、N−ヒドロキシコハク酸イミドなど)法など
既知の手法があげられる。
保護基の除去法としては、例えば、トリフルオロ酢W法
、メタンスルホン酸法、トリフルオロメタンスルホン酸
法、フッ化水素法、液体アンモニアナ) IJウム法な
ど既知の手法があげられる。
、メタンスルホン酸法、トリフルオロメタンスルホン酸
法、フッ化水素法、液体アンモニアナ) IJウム法な
ど既知の手法があげられる。
本発明によって製造されるペプチド類の精製は、例えば
イオン交換樹脂、分配クロマトグラフィ、ゲルクロマト
グラフィー、逆相型液体クロマトグラフィーなどのペプ
チド化学の分野で通常用いられる方法を単独にまたは組
み合わせて用いることによって行うことができる。
イオン交換樹脂、分配クロマトグラフィ、ゲルクロマト
グラフィー、逆相型液体クロマトグラフィーなどのペプ
チド化学の分野で通常用いられる方法を単独にまたは組
み合わせて用いることによって行うことができる。
本発明の神経栄養ペプチドは神経細胞の分化成熟を調節
する。すなわち、コリン系神経である中隔中心核のa織
のアセチルコリン合皮を促進する。生物学的活性の測定
は、小鹿幸生ら〔薬物・精神・行動、7巻、447〜4
51頁(1985)]の方法により、行うことができる
。
する。すなわち、コリン系神経である中隔中心核のa織
のアセチルコリン合皮を促進する。生物学的活性の測定
は、小鹿幸生ら〔薬物・精神・行動、7巻、447〜4
51頁(1985)]の方法により、行うことができる
。
本発明の神経栄養ペプチドは、神経変性疾患治療剤、抗
痴呆剤として有用である。ここで神経変性疾患とは、神
経細胞が萎縮あるいは脱落する病気であり、たとえば
アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、筋萎
縮性側索硬化症、パーキンソン氏病等があげられる。
痴呆剤として有用である。ここで神経変性疾患とは、神
経細胞が萎縮あるいは脱落する病気であり、たとえば
アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、筋萎
縮性側索硬化症、パーキンソン氏病等があげられる。
また、痴呆としてはアルツハイマー型痴呆、パーキンソ
ン痴呆、脳血管性痴呆等があげられる。
ン痴呆、脳血管性痴呆等があげられる。
本発明化合物を投与される動物は特に制限されず、ヒト
のみならず、例えばマウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ
、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ等の各種哺乳動物が対象
となる。
のみならず、例えばマウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ
、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ等の各種哺乳動物が対象
となる。
これらの動物およびヒトへの投与は通常の投与経路、例
えば経口、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、鼻腔内およ
び脳内投与により行うことができる。 投与量および投
与回数は動物種、投与経路、症状の程度、体重等によっ
て異なり特に限定されないが、ヒトにおいては、通常成
人1日あたり約lμs=1gを1日1回もしくはそれ以
上の回数で投与される。投与剤型としては、例えば散剤
、細粒剤、頚粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、
経鼻剤などがあげられる。製剤化の際は、通常の製剤担
体を用い、常法により製造する。即ち、経口用製剤を調
製する場合は、生薬に賦形剤、更に必要に応じて結合剤
、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、などを加えた後、常法によ
り錠剤、頴粒剤、散剤、カプセルなどとする。 注射剤
をma?する場合は、必要によりpH調整剤、緩衝剤、
安定化剤、可溶化剤などを添加し、常法により注射剤と
する。
えば経口、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、鼻腔内およ
び脳内投与により行うことができる。 投与量および投
与回数は動物種、投与経路、症状の程度、体重等によっ
て異なり特に限定されないが、ヒトにおいては、通常成
人1日あたり約lμs=1gを1日1回もしくはそれ以
上の回数で投与される。投与剤型としては、例えば散剤
、細粒剤、頚粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、
経鼻剤などがあげられる。製剤化の際は、通常の製剤担
体を用い、常法により製造する。即ち、経口用製剤を調
製する場合は、生薬に賦形剤、更に必要に応じて結合剤
、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、などを加えた後、常法によ
り錠剤、頴粒剤、散剤、カプセルなどとする。 注射剤
をma?する場合は、必要によりpH調整剤、緩衝剤、
安定化剤、可溶化剤などを添加し、常法により注射剤と
する。
実施例1
”IIcNI’″の精製:
(1)2迎合ラット約300匹分の海鳥組織に6〜7倍
容の氷冷したリン酸緩衝液(pH7,2)を加え、ガラ
ス・テフロンホモゲナイザーを用いてホモゲナイズした
後、100,000 Xg、 4℃で2時間遠心分離し
た。上清に氷酢酸を最終濃度が2Mになるように加え、
沈澱物を100. ooox g、4℃で2時間遠心分
離した。上清をアミコン社製YM5フィルター(カット
・オフ分子量500(1)を用いて超限外濾過を実施し
た。濾液を凍結乾燥後、0.05M#酸に溶解し、予め
0.05M酢酸で平衡化させたl1lio−GeIP2
ゲルを充填したカラム(1,6X 84 cm)に注入
した。0.05M酢酸で流速16.5rd/時間で溶出
し、溶出液を1.65mf/画分で分画した。そのIR
を用いてA 280nmでの吸光度を測定し、生物学的
活性を測定した。活性の認められた画分を集め、ミリポ
ア社a!lseρ・Pak−C18カートリッジに通液
した。0. (15M酢酸で洗浄後0.1%TFA−6
0%ア七トニトリルで活性成分を溶出した。溶出液を凍
結乾燥し、6.8■の蛋白質を含む粗精製品を得た。
容の氷冷したリン酸緩衝液(pH7,2)を加え、ガラ
ス・テフロンホモゲナイザーを用いてホモゲナイズした
後、100,000 Xg、 4℃で2時間遠心分離し
た。上清に氷酢酸を最終濃度が2Mになるように加え、
沈澱物を100. ooox g、4℃で2時間遠心分
離した。上清をアミコン社製YM5フィルター(カット
・オフ分子量500(1)を用いて超限外濾過を実施し
た。濾液を凍結乾燥後、0.05M#酸に溶解し、予め
0.05M酢酸で平衡化させたl1lio−GeIP2
ゲルを充填したカラム(1,6X 84 cm)に注入
した。0.05M酢酸で流速16.5rd/時間で溶出
し、溶出液を1.65mf/画分で分画した。そのIR
を用いてA 280nmでの吸光度を測定し、生物学的
活性を測定した。活性の認められた画分を集め、ミリポ
ア社a!lseρ・Pak−C18カートリッジに通液
した。0. (15M酢酸で洗浄後0.1%TFA−6
0%ア七トニトリルで活性成分を溶出した。溶出液を凍
結乾燥し、6.8■の蛋白質を含む粗精製品を得た。
この粗fiIM品について、生物学的活性を測定した結
果、160 ng/−でコリナージック・ニューロンの
アセチルコリン合成能を 150%にまで増大させる活
性を示した。
果、160 ng/−でコリナージック・ニューロンの
アセチルコリン合成能を 150%にまで増大させる活
性を示した。
(2) (1)で得た粗精製品3.4IIgを0.1
%TFAに溶解し、予め0.1%TFAで平衡化させた
l1lio−Rad社製逆相系充填剤RP−3(14カ
ラム(4,6φX 250市)に注入した。2W類の溶
媒A l (0,1%TFA)およびBl(0,1%T
FA−95%アセトニトリル)を使用し、溶媒AIから
溶媒B1ヘアセトニトリル濃度を徐々に増加させ溶出し
た。最初の10分間で811度を0%から10%に、次
の40分間で81濃度を30%に、次の10分間でBl
濃度を40%に、次の10分間で811度を60%に、
次の3分間でBla度を 100%に、B1濃度を直線
的に増加させ、流速1.0−/分で溶出した。溶出液を
A220nmでモニターL、2−/フラクションで分画
した(第1図)。 この逆用系高速液体クロマトグラフ
ィーを2回実施した。活性画分フラクションNα21〜
26(アセトニトリル濃度21〜26%で溶出される画
分)を集め、スピード・バック・コンセントレータ−で
減圧濃縮し、白色粉末を得た。この白色粉末について生
物学的活性を測定した結果、トータルボリュームの5.
3/10’を1mlの培地中に溶かした濃度でコリナー
ジック・ニューロンのアセチルコリン合成能を150%
にまで増大させる活性を示した。
%TFAに溶解し、予め0.1%TFAで平衡化させた
l1lio−Rad社製逆相系充填剤RP−3(14カ
ラム(4,6φX 250市)に注入した。2W類の溶
媒A l (0,1%TFA)およびBl(0,1%T
FA−95%アセトニトリル)を使用し、溶媒AIから
溶媒B1ヘアセトニトリル濃度を徐々に増加させ溶出し
た。最初の10分間で811度を0%から10%に、次
の40分間で81濃度を30%に、次の10分間でBl
濃度を40%に、次の10分間で811度を60%に、
次の3分間でBla度を 100%に、B1濃度を直線
的に増加させ、流速1.0−/分で溶出した。溶出液を
A220nmでモニターL、2−/フラクションで分画
した(第1図)。 この逆用系高速液体クロマトグラフ
ィーを2回実施した。活性画分フラクションNα21〜
26(アセトニトリル濃度21〜26%で溶出される画
分)を集め、スピード・バック・コンセントレータ−で
減圧濃縮し、白色粉末を得た。この白色粉末について生
物学的活性を測定した結果、トータルボリュームの5.
3/10’を1mlの培地中に溶かした濃度でコリナー
ジック・ニューロンのアセチルコリン合成能を150%
にまで増大させる活性を示した。
(3) (2)で得た活性物質を0.1%TFAに溶
解し、予め0.1%TFAで平衡化させた東ソー社製逆
相系充填剤TSに一120Tカラム(4,0φX 25
0ml11)に注入した。(2)で使用した2種類の溶
媒AlおよびBlを使用し、溶媒A1から溶媒Blヘア
セトニトリル濃度を徐々に増加させ溶出した。最初の5
分間は溶媒Alだけを通液し、次の10分間で81濃度
を0%から25%に、次の25分間でBl′a度を30
%に、次の10分間で811度を40%に、次の10分
間でBla度を100%に、Bl濃度を直線的に増加さ
せ、流速1.tW/分で溶出した。溶出液を^220n
mでモニターし、1ml!/フラクシジンで分画した。
解し、予め0.1%TFAで平衡化させた東ソー社製逆
相系充填剤TSに一120Tカラム(4,0φX 25
0ml11)に注入した。(2)で使用した2種類の溶
媒AlおよびBlを使用し、溶媒A1から溶媒Blヘア
セトニトリル濃度を徐々に増加させ溶出した。最初の5
分間は溶媒Alだけを通液し、次の10分間で81濃度
を0%から25%に、次の25分間でBl′a度を30
%に、次の10分間で811度を40%に、次の10分
間でBla度を100%に、Bl濃度を直線的に増加さ
せ、流速1.tW/分で溶出した。溶出液を^220n
mでモニターし、1ml!/フラクシジンで分画した。
活性画分フラクションに46および47(アセトニトリ
ル濃度28〜30%で溶出される画分)を集め減圧濃縮
した。
ル濃度28〜30%で溶出される画分)を集め減圧濃縮
した。
この活性画分を逆相系充填剤TSに−[20Tカラムを
用いてリクロマトグラフィーを実施した。2種類の溶媒
A2(0,05%TFA)およびB2 (0,05%T
FA−95%アセトニトリル)を使用し、溶媒A2から
溶媒B2ヘアセトニトリル淵度を増加させ溶出した。最
初の5分間で82a1度を0%から25%に、次の30
分で82V1度を35%に、次の5分間で82a度を4
0%に、次の5分間で82W度を100%に、821度
を直線的に増加させ、流速1゜0rn1/分で溶出した
。溶出液を^220nmでモニターし、各ピークを手動
で分画した。活性は30〜31分に溶出される鋭い単一
のピーク画分(アセトニトリル濃度31〜32%)に回
収された(第2図)。この活性画分を減圧濃縮し、4μ
gの’IICNP”を得た実施例2 ”lI[NP”の構造解析: (1)アミノ酸組成 ”IIcNP”をフェノール含有定沸点塩fllo、2
−で110℃、20時間加水分解しピコ・タグ(PIC
D−TAG)法によりアミノ酸分析した。Leuを基準
として算出したアミノ酸組成は以下の通りであった。
用いてリクロマトグラフィーを実施した。2種類の溶媒
A2(0,05%TFA)およびB2 (0,05%T
FA−95%アセトニトリル)を使用し、溶媒A2から
溶媒B2ヘアセトニトリル淵度を増加させ溶出した。最
初の5分間で82a1度を0%から25%に、次の30
分で82V1度を35%に、次の5分間で82a度を4
0%に、次の5分間で82W度を100%に、821度
を直線的に増加させ、流速1゜0rn1/分で溶出した
。溶出液を^220nmでモニターし、各ピークを手動
で分画した。活性は30〜31分に溶出される鋭い単一
のピーク画分(アセトニトリル濃度31〜32%)に回
収された(第2図)。この活性画分を減圧濃縮し、4μ
gの’IICNP”を得た実施例2 ”lI[NP”の構造解析: (1)アミノ酸組成 ”IIcNP”をフェノール含有定沸点塩fllo、2
−で110℃、20時間加水分解しピコ・タグ(PIC
D−TAG)法によりアミノ酸分析した。Leuを基準
として算出したアミノ酸組成は以下の通りであった。
^SX:0,9 、 Ser:1,4 、 Glx:1
.3 、 Pro:1,0Gly:IJ 、 ^l
a:2.5 、 lie:0.9 、 Le
u:1.0Trp:0.8 (2)N末端アミノ酸 ”HCNP’ 0.5.!J gをApplied 1
Jiosystems社製477型プロティン・シーケ
ンサ−でエドマン分解し、生成したPTH(フェニルチ
オヒダントイン)−アミノ酸誘導体をApplied
Biosystems社製120^型PTHアナライザ
ーで分析した結果、サイクルl〜lOでアミノ酸が全く
検出されなかった。 従ってHCNP”のN末端はブロ
ックされていることが明らかになった。
.3 、 Pro:1,0Gly:IJ 、 ^l
a:2.5 、 lie:0.9 、 Le
u:1.0Trp:0.8 (2)N末端アミノ酸 ”HCNP’ 0.5.!J gをApplied 1
Jiosystems社製477型プロティン・シーケ
ンサ−でエドマン分解し、生成したPTH(フェニルチ
オヒダントイン)−アミノ酸誘導体をApplied
Biosystems社製120^型PTHアナライザ
ーで分析した結果、サイクルl〜lOでアミノ酸が全く
検出されなかった。 従ってHCNP”のN末端はブロ
ックされていることが明らかになった。
(3) キモトリプシン切断により得られた断片化ペ
プチドの構造解析 ”IIcNP” 0.8μgに0.05M N)1.H
CO3溶液0.1−を加え溶解し、S+、Bma社製キ
モ) IJプシン0.4μgを加え37℃でインキュベ
ートした。6時間後、更にキモ) IJプシン0,4μ
gを加え、37℃で終夜インキュベートした。
プチドの構造解析 ”IIcNP” 0.8μgに0.05M N)1.H
CO3溶液0.1−を加え溶解し、S+、Bma社製キ
モ) IJプシン0.4μgを加え37℃でインキュベ
ートした。6時間後、更にキモ) IJプシン0,4μ
gを加え、37℃で終夜インキュベートした。
反応液を予め0.05%TFAで平衡化させた逆相系充
填剤TSK−120Tカラム(4φ×250■−)に注
入した。2種類の溶媒、A2(0,05%TFA)およ
びB2 (0,05%T F A−95%アセトニト
リル)を使用し、溶媒A2から溶媒B2ヘアセトニ)
IJル濃度を増加させながら溶出した。最初の40分間
で82濃度を0%から40%に、次の15分間で82a
度をIC10%に直線的に増加させ、流速1゜0m11
分で溶出した。溶出液を^220nmおよび^280n
mでモニターした。保持時間24分および36分に溶出
されるピーク画分で分取した。それぞれをCHIおよび
ClI2とする。
填剤TSK−120Tカラム(4φ×250■−)に注
入した。2種類の溶媒、A2(0,05%TFA)およ
びB2 (0,05%T F A−95%アセトニト
リル)を使用し、溶媒A2から溶媒B2ヘアセトニ)
IJル濃度を増加させながら溶出した。最初の40分間
で82濃度を0%から40%に、次の15分間で82a
度をIC10%に直線的に増加させ、流速1゜0m11
分で溶出した。溶出液を^220nmおよび^280n
mでモニターした。保持時間24分および36分に溶出
されるピーク画分で分取した。それぞれをCHIおよび
ClI2とする。
CHIおよびCH2を減圧′a縮し、0.1%チオグリ
コール酸酸含有定点塩酸0.2dを加え、110℃で2
4時間加水分解し、アミノ酸分析した。それぞれのアミ
ノ酸組成は、次の通りであった。
コール酸酸含有定点塩酸0.2dを加え、110℃で2
4時間加水分解し、アミノ酸分析した。それぞれのアミ
ノ酸組成は、次の通りであった。
Cl11のアミノ酸組成:
Pro: 1.1?、Gly:0.61゜Ala:0.
82 、Leu:1,00、C)12のアミノ酸M或: ^sx:1,05、Ser:1,18、Glx:1.2
5、Gly:0.50、Ala:2.00、Ile:0
.83、Trpも明らかに検出されたが微攪な為、定量
不能であった。
82 、Leu:1,00、C)12のアミノ酸M或: ^sx:1,05、Ser:1,18、Glx:1.2
5、Gly:0.50、Ala:2.00、Ile:0
.83、Trpも明らかに検出されたが微攪な為、定量
不能であった。
CHIおよびCl12のアミノ酸配列を477型プロテ
イン・シーケンサ−および120A型PTHアナライザ
ーで同定した。
イン・シーケンサ−および120A型PTHアナライザ
ーで同定した。
C)IIのアミノ酸配列:
l 2 3 4
Ala−Gly−Pro−Leu
CH2はサイクル1〜10で全くアミノ酸が検出されな
かったことからN末端がブロックされていると結論され
た。
かったことからN末端がブロックされていると結論され
た。
次に、CHIのC末端の構造を明らかにするため、2種
類の合成ペプチドH−Ala−Gly−Pro−Leu
−DHおよびH−Ala−Gly−Pro−Leu−N
llzについて上述の条件で逆相系高速液体クロマトグ
ラフィー法による分析を行なった。Cl11と前者の合
成ペプチドの保持時間が一致したことからCl1lのC
末端アミノ酸Leuは−DH体であることを確認した。
類の合成ペプチドH−Ala−Gly−Pro−Leu
−DHおよびH−Ala−Gly−Pro−Leu−N
llzについて上述の条件で逆相系高速液体クロマトグ
ラフィー法による分析を行なった。Cl11と前者の合
成ペプチドの保持時間が一致したことからCl1lのC
末端アミノ酸Leuは−DH体であることを確認した。
次に、CH2に340μfのloomMピリジン酢NI
緩衝液(pH5,5)を加え溶解し、110 pmol
のカルボキシペプチダーゼYを加え、37℃でインキュ
ベートした。経時的に反応液をサンプリングし、アミノ
酸分析した結果、CH2のC末端のアミノ酸配列として
I Ie−3er−Gln−Trpの配列が同定された
。
緩衝液(pH5,5)を加え溶解し、110 pmol
のカルボキシペプチダーゼYを加え、37℃でインキュ
ベートした。経時的に反応液をサンプリングし、アミノ
酸分析した結果、CH2のC末端のアミノ酸配列として
I Ie−3er−Gln−Trpの配列が同定された
。
Cl12を0.1Mリン酸1f::衝液(pH7,2)
50μlに溶解し、宝酒造社製アシルアミノ酸遊離酵
素o4uを加え37℃でインキュベートした。5時間後
および8.5時間後に0.050ずつのアシルアミノ酸
遊離酵素を加え37℃で計22.5時間インキュベート
した。
50μlに溶解し、宝酒造社製アシルアミノ酸遊離酵
素o4uを加え37℃でインキュベートした。5時間後
および8.5時間後に0.050ずつのアシルアミノ酸
遊離酵素を加え37℃で計22.5時間インキュベート
した。
反応液を予め0.05%TFAで平衡化した逆相系充填
剤TSK−120Tカラム(4φ×250叩)に注入し
た。
剤TSK−120Tカラム(4φ×250叩)に注入し
た。
2種類の溶媒A2(0,05%TFA)およびB2(0
,05%TFA−95%アセトニトリル〉を使用し、溶
媒A2から溶媒B2ヘアセトニ) IJル濃度を増加さ
けながら溶出した。最初の5分間は溶媒A2だけを通液
し、次の40分間で82fi度を0%から40%に、次
の15分間で82a度を100%に直線的に溶出させ、
流速1.0Inl/分で溶出した。溶出液を^220n
mおよび^280nmでモニターした。保持時間37分
に溶出されたピーク画分を分取した。この画分をCH2
−ARIとする。CH2−ARIを0.1%チオグリコ
ール酸酸含有定点塩酸で110℃、24時間加水分解し
、アミノ酸分析を行なった。ff1ffiなため、分取
に使用した溶媒A2および溶媒B2を混合して調魁した
B2濃度35%の溶液についても同様に加水分解し、ア
ミノ酸分析を行ない、補正してCH2−ARIのアミノ
酸組成を求めた。
,05%TFA−95%アセトニトリル〉を使用し、溶
媒A2から溶媒B2ヘアセトニ) IJル濃度を増加さ
けながら溶出した。最初の5分間は溶媒A2だけを通液
し、次の40分間で82fi度を0%から40%に、次
の15分間で82a度を100%に直線的に溶出させ、
流速1.0Inl/分で溶出した。溶出液を^220n
mおよび^280nmでモニターした。保持時間37分
に溶出されたピーク画分を分取した。この画分をCH2
−ARIとする。CH2−ARIを0.1%チオグリコ
ール酸酸含有定点塩酸で110℃、24時間加水分解し
、アミノ酸分析を行なった。ff1ffiなため、分取
に使用した溶媒A2および溶媒B2を混合して調魁した
B2濃度35%の溶液についても同様に加水分解し、ア
ミノ酸分析を行ない、補正してCH2−ARIのアミノ
酸組成を求めた。
CH2−ARIのアミノ酸組成:
ASX:1.09、Ser:0.86、GIX:0.9
7、へla:1.oo、11e: 1.18、Trpも
明らかに検出されたが微量なため定量不能であった。
7、へla:1.oo、11e: 1.18、Trpも
明らかに検出されたが微量なため定量不能であった。
前述のC112のアミノ酸組成と比較して、ClI2−
ARIはAlaがl残基少ないことからC112のN末
端アミノ酸はAlaと同定された。
ARIはAlaがl残基少ないことからC112のN末
端アミノ酸はAlaと同定された。
CH2−へR1を477型プロテイン・シーケンサ−お
よび120A型PTIIアナライザーで解析した結果、
^!a−Asp−11e−Ser−Gln−Xと同定さ
れた。
よび120A型PTIIアナライザーで解析した結果、
^!a−Asp−11e−Ser−Gln−Xと同定さ
れた。
以上の結果から、C)12のアミノ酸配列は ^la−
Ala−Asp−l 1e−5er−Gln−Trpと
同定され、N末端アミノ酸Alaがブロックされている
ことが明らかになった。
Ala−Asp−l 1e−5er−Gln−Trpと
同定され、N末端アミノ酸Alaがブロックされている
ことが明らかになった。
(4) アシルアミノ酸遊離酵素切断により得られた
断片化ペプチドの構造解析 ”H[’NP”約2μgに0.1Mリン酸緩衝液(pH
7,2) 50μlを加え溶解し、宝酒造社製のアシル
アミノ酸遊離酵素01tUを加え、37℃でインキュベ
ートした。更に、5時間後および8.5時間後に0.0
50ずつのアシルアミノ酸遊離酵素を加え、37℃で計
22.5時間インキュベートした。反応液を予め0.
05%TF^で平衡化した逆相系充填剤TSK−120
Tカラム(4φ×250市)に注入した。
断片化ペプチドの構造解析 ”H[’NP”約2μgに0.1Mリン酸緩衝液(pH
7,2) 50μlを加え溶解し、宝酒造社製のアシル
アミノ酸遊離酵素01tUを加え、37℃でインキュベ
ートした。更に、5時間後および8.5時間後に0.0
50ずつのアシルアミノ酸遊離酵素を加え、37℃で計
22.5時間インキュベートした。反応液を予め0.
05%TF^で平衡化した逆相系充填剤TSK−120
Tカラム(4φ×250市)に注入した。
2種類の溶媒A2(0,05%TFA)およびB2(0
,05%TFA−95%アセトニトリル)を使用し、溶
媒A2から溶媒口2ヘアセトニ) IJル濃度を増加さ
せながら溶出した。最初の5分間は溶媒式2だけを通液
し、次の40分間で82fi度を0%から40%に、次
の15分間で82a度を100%に直線的に増加させ、
流速1.0eg/分で溶出した。溶出液を^220nm
および^280nmでモニターし、l++f/フラクシ
ョンで分画した。保持時間43分のピーク画分について
は手動で分取した。この画分をARIとする。ARIを
0.1%チオグリコール酸酸含有定点塩酸0.2−で1
10℃、24時間加水分解し、アミノ酸分析した。
,05%TFA−95%アセトニトリル)を使用し、溶
媒A2から溶媒口2ヘアセトニ) IJル濃度を増加さ
せながら溶出した。最初の5分間は溶媒式2だけを通液
し、次の40分間で82fi度を0%から40%に、次
の15分間で82a度を100%に直線的に増加させ、
流速1.0eg/分で溶出した。溶出液を^220nm
および^280nmでモニターし、l++f/フラクシ
ョンで分画した。保持時間43分のピーク画分について
は手動で分取した。この画分をARIとする。ARIを
0.1%チオグリコール酸酸含有定点塩酸0.2−で1
10℃、24時間加水分解し、アミノ酸分析した。
ARIのアミノ酸組成;
ブチドであることが明らかになった。
ASX:0.98.5ervo、 87、GIX:1.
01、Pro:0.92、Gly:1.03、Ala:
1.813、lie:0.95、Leu:I、00、T
rp:0.63 ARIのアミノ酸配列を^pplied Biosys
tems社製477型プロティン・シーケンサ−および
120A型PTHアナライザーを用いて同定した。
01、Pro:0.92、Gly:1.03、Ala:
1.813、lie:0.95、Leu:I、00、T
rp:0.63 ARIのアミノ酸配列を^pplied Biosys
tems社製477型プロティン・シーケンサ−および
120A型PTHアナライザーを用いて同定した。
ARIのアミノ酸配列:
次に、アシルアミノ酸遊離酵素により切断されたアシル
アミノ酸を調べるため、フラクションNαl−20につ
いて、0.1%チオグリコール酸酸含有定点塩酸0.2
mRで110℃、24時間加水分解し、アミノ酸分析を
実施した。フラクションNα3およびNo、 4にAl
aが検出された。他のフラクションには有意なアミノ酸
は検出されなかった。 従って、”HCNP’のN末端
アミノ酸をAlaと同定した。
アミノ酸を調べるため、フラクションNαl−20につ
いて、0.1%チオグリコール酸酸含有定点塩酸0.2
mRで110℃、24時間加水分解し、アミノ酸分析を
実施した。フラクションNα3およびNo、 4にAl
aが検出された。他のフラクションには有意なアミノ酸
は検出されなかった。 従って、”HCNP’のN末端
アミノ酸をAlaと同定した。
以上の結果から、”HCNP″はN末端アミノ酸がアシ
ル化されており、次のアミノ酸配列を有するべ” 11
G N P ”のアミノ酸配列:次に、アシル化の種
類を明らかにするため、フラクションNα3および4に
含まれていたアシルアラニンと各種アシルアラニン誘導
体とを逆相系高速液体クロマトグラフィー法(Meth
od in Enzym。
ル化されており、次のアミノ酸配列を有するべ” 11
G N P ”のアミノ酸配列:次に、アシル化の種
類を明らかにするため、フラクションNα3および4に
含まれていたアシルアラニンと各種アシルアラニン誘導
体とを逆相系高速液体クロマトグラフィー法(Meth
od in Enzym。
ogy)で分析し、保持時間を比較した結果、アセチル
アラニンの保持時間と一致した。従がってHCtllP
のNJ[アミノ酸Alaはアセチル化されていることが
明らかになった。
アラニンの保持時間と一致した。従がってHCtllP
のNJ[アミノ酸Alaはアセチル化されていることが
明らかになった。
更に、ペプチド合成法により得た^cetyl−Ala
−Ala−Asp−11e−3er−Gln−Trp−
Ala−Gly−Pro−Leuについて逆相系充填剤
TSK−120Tカラムを用いる高速液体クロマトグラ
フィー法で分析した結果、”HGNP’″の保持時間は
合成ペプチドの保持時間と一致した実施例3 Ala−Gly−Pro−Leu(IIcNP”’)の
合成:”HCNP’化学合或化学合体として、HCNP
の8番目から11番目のアミノ酸配列に相当するペプチ
ドを合成したく以後、HCNP’−”と略す)。
−Ala−Asp−11e−3er−Gln−Trp−
Ala−Gly−Pro−Leuについて逆相系充填剤
TSK−120Tカラムを用いる高速液体クロマトグラ
フィー法で分析した結果、”HGNP’″の保持時間は
合成ペプチドの保持時間と一致した実施例3 Ala−Gly−Pro−Leu(IIcNP”’)の
合成:”HCNP’化学合或化学合体として、HCNP
の8番目から11番目のアミノ酸配列に相当するペプチ
ドを合成したく以後、HCNP’−”と略す)。
使用した樹脂は粒径100−200メツシユのクロロメ
チル化されたポリスチレンビニルベンゼン樹脂である(
1%ジビニルベンゼンで架橋、樹脂1g当たり0.68
ミリモルのクロライドを含有〉。ポリペプチドを合成す
るに当たり3.05gのBoc−Leu−OHをエチル
アルコール20d、水7−へ溶解し、20%炭酸セシウ
ム水溶液にてpH7とし、減圧濃縮し、乾燥させた。こ
れにDMFI 20dを加え、15gのクロロメチル化
樹脂を加え、50℃にて12時間、さらに室温にて12
時間撹拌し、エステル化した。得られたアミノ酸結合樹
脂を濾過し、DMF、90%DMF、DMF、エチルア
ルコールにて順次洗浄し、かつ乾燥した。収量16.9
g。
チル化されたポリスチレンビニルベンゼン樹脂である(
1%ジビニルベンゼンで架橋、樹脂1g当たり0.68
ミリモルのクロライドを含有〉。ポリペプチドを合成す
るに当たり3.05gのBoc−Leu−OHをエチル
アルコール20d、水7−へ溶解し、20%炭酸セシウ
ム水溶液にてpH7とし、減圧濃縮し、乾燥させた。こ
れにDMFI 20dを加え、15gのクロロメチル化
樹脂を加え、50℃にて12時間、さらに室温にて12
時間撹拌し、エステル化した。得られたアミノ酸結合樹
脂を濾過し、DMF、90%DMF、DMF、エチルア
ルコールにて順次洗浄し、かつ乾燥した。収量16.9
g。
このアミノ酸結合樹脂6gを固相合成反応容器に入れ後
記スケジュールlに従って Boc−Pro−〇H%
Boc−Gl y−OH,Boc−へ1a−OH1を順
次、当量のDCCを用いてカップリングさせた。この際
、添加剤として当量のN−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ルを加えた。その結果、HCNP’−”ペプチド樹脂6
.7gが得られt二。
記スケジュールlに従って Boc−Pro−〇H%
Boc−Gl y−OH,Boc−へ1a−OH1を順
次、当量のDCCを用いてカップリングさせた。この際
、添加剤として当量のN−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ルを加えた。その結果、HCNP’−”ペプチド樹脂6
.7gが得られt二。
このIIcNP’−’lペプチド樹脂1.1gにアニソ
ール3tt’、エチルメチルスルフィド0.5−1無水
フツ化水素20rnlを加え、−20℃60分間、0t
60分間反応させた。減圧a!8後、ジエチルエーテル
200−を加え30分間撹拌し、濾過しジエチルエーテ
ル100−で洗浄した。謹上物に5%酢酸水100−を
加えて30分間撹拌後、樹脂を濾過し、5%酢酸水10
0mfで洗浄した。濾洗液を凍結乾燥後、得られた粗ペ
プチドを水に溶解し、予めO,1%トリフルオロ酢酸水
で平衡化させた逆相系充填剤YMC−A363 (S−
5)ODSカラム(30φ×250帥)に注入し、カラ
ムを0.1%トリフルオロ酢酸水で洗浄後、アセトニト
リル濃度を18%まで増加させ、流速7゜0−7分で溶
出した。溶出液をA230nmでモニターし、目的物を
含む両分を集め、凍結乾燥し、HCNP”’ : l
82. 3mgを得た。
ール3tt’、エチルメチルスルフィド0.5−1無水
フツ化水素20rnlを加え、−20℃60分間、0t
60分間反応させた。減圧a!8後、ジエチルエーテル
200−を加え30分間撹拌し、濾過しジエチルエーテ
ル100−で洗浄した。謹上物に5%酢酸水100−を
加えて30分間撹拌後、樹脂を濾過し、5%酢酸水10
0mfで洗浄した。濾洗液を凍結乾燥後、得られた粗ペ
プチドを水に溶解し、予めO,1%トリフルオロ酢酸水
で平衡化させた逆相系充填剤YMC−A363 (S−
5)ODSカラム(30φ×250帥)に注入し、カラ
ムを0.1%トリフルオロ酢酸水で洗浄後、アセトニト
リル濃度を18%まで増加させ、流速7゜0−7分で溶
出した。溶出液をA230nmでモニターし、目的物を
含む両分を集め、凍結乾燥し、HCNP”’ : l
82. 3mgを得た。
得うレタHCNPs−11ハ逆相系充[+1YMC−A
211−〇DSカラム(4,6φX250mm)を用
いた、10%から50%までの0.1%トリフルオロ酢
酸を含むアセトニ) Uルの直線濃度勾配溶出法による
分析において保持時間14.7分を示し、そのアミノ酸
分析位は理論値と一致した。
211−〇DSカラム(4,6φX250mm)を用
いた、10%から50%までの0.1%トリフルオロ酢
酸を含むアセトニ) Uルの直線濃度勾配溶出法による
分析において保持時間14.7分を示し、そのアミノ酸
分析位は理論値と一致した。
アミノ酸分析
加水分解;4Nメタンスルホン酸−2%トリプタミン、
110℃ 24峙間 分析方法:PIC〇−TAG (逆相−PTCアミノ酸
)法 *基準アミノ酸 ()内理論値 Gly:1.00 (1) Ala:0.90 (1) Pro:0.95 (1) *Leu:1.00 (1) スケジュールl 工程 時間(分)×処理回数1、(洗
浄)塩化メチレン60tJ’ 2、(脱保護)50%’I” F A −5%エタンジ
チオール− 45%塩化メチレン(V/V) 0rrf1 3、 (?jc浄)塩化メチレン60me4、 (&
浄)メタノール60− 5、 〈中和ン 10%トリエチルアミン−90%塩化
メチレン(V/V) 60I71i! 6、(洗浄)メタノール60m!! フ、(中和)10%トリエチルアミン 90%塩化メチレン(V/V) 6〇− 8、(洗浄〉メタノール60m1 9、(洗浄)塩化メチレン6〇− 1O1(カップリング)各アミノ基 保護アミノi!112(6ミリモル)、50%DMF−
50%塩化メチレン (V/V)30m、 X3 X1 0X1 X2 2×2 XI X1 XI X2 2×3 5×1 DCC(6ミリモル)の 塩化メチレン溶液12d 120X111、(洗
浄)50%DMF−50% 塩化メチレン(V/V) 60rrd! 2 X
212、(洗浄)メタノール60m1! 2xl
13、(中和)10%トリエチルアミン90%塩化メチ
レン(V/V) 60d I X 114、
(洗浄)メタノール60mg 2x215、(&
浄〉塩化メチレン60m1 2X216、(アセチル
化)25%無水酢酸 75%塩化メチレン(V/V) 60mf 15X117、(洗
浄〉塩化メチレン60m+! 2X218、(洗浄
)メタノール60mg 2X2但し、工程■0で
2回目以降のカップリングの場合には、50%DMF−
50%塩化メチレン(V/V)の代わりにDMF、また
はl−メチル−2−ピロリジノンを用い、反応時間を最
大12時間まで延長した。
110℃ 24峙間 分析方法:PIC〇−TAG (逆相−PTCアミノ酸
)法 *基準アミノ酸 ()内理論値 Gly:1.00 (1) Ala:0.90 (1) Pro:0.95 (1) *Leu:1.00 (1) スケジュールl 工程 時間(分)×処理回数1、(洗
浄)塩化メチレン60tJ’ 2、(脱保護)50%’I” F A −5%エタンジ
チオール− 45%塩化メチレン(V/V) 0rrf1 3、 (?jc浄)塩化メチレン60me4、 (&
浄)メタノール60− 5、 〈中和ン 10%トリエチルアミン−90%塩化
メチレン(V/V) 60I71i! 6、(洗浄)メタノール60m!! フ、(中和)10%トリエチルアミン 90%塩化メチレン(V/V) 6〇− 8、(洗浄〉メタノール60m1 9、(洗浄)塩化メチレン6〇− 1O1(カップリング)各アミノ基 保護アミノi!112(6ミリモル)、50%DMF−
50%塩化メチレン (V/V)30m、 X3 X1 0X1 X2 2×2 XI X1 XI X2 2×3 5×1 DCC(6ミリモル)の 塩化メチレン溶液12d 120X111、(洗
浄)50%DMF−50% 塩化メチレン(V/V) 60rrd! 2 X
212、(洗浄)メタノール60m1! 2xl
13、(中和)10%トリエチルアミン90%塩化メチ
レン(V/V) 60d I X 114、
(洗浄)メタノール60mg 2x215、(&
浄〉塩化メチレン60m1 2X216、(アセチル
化)25%無水酢酸 75%塩化メチレン(V/V) 60mf 15X117、(洗
浄〉塩化メチレン60m+! 2X218、(洗浄
)メタノール60mg 2X2但し、工程■0で
2回目以降のカップリングの場合には、50%DMF−
50%塩化メチレン(V/V)の代わりにDMF、また
はl−メチル−2−ピロリジノンを用い、反応時間を最
大12時間まで延長した。
実施例4
)ICNP”−” N H2の合成:
使用した樹脂は粒径200−400メツシユの4−メチ
ルベンズヒドリルアミン樹脂である(1%ジビニルベン
ゼンで架橋、樹脂1g当たり0゜73ミリモルのアミノ
基を含有)。この樹脂6gを固相合成反応容器に入れ、
実施例3に記載のスケジュール1に従って工程3より合
成を開始し、Boc−Leu−OH,Boc−Pro−
〇F【、Boc−Gly−○H,Boc−Al a−O
H。
ルベンズヒドリルアミン樹脂である(1%ジビニルベン
ゼンで架橋、樹脂1g当たり0゜73ミリモルのアミノ
基を含有)。この樹脂6gを固相合成反応容器に入れ、
実施例3に記載のスケジュール1に従って工程3より合
成を開始し、Boc−Leu−OH,Boc−Pro−
〇F【、Boc−Gly−○H,Boc−Al a−O
H。
を順次、当量のDCCを用いてカップリングさせた。こ
の際、添加剤として当量のN−ヒドロキシベンゾトリア
ゾールを加えた。その結果、中間体HCNP’−”NH
t ヘフチ)’樹脂7.6gが得られたこの)ICNI
”−” N H2ペプチド樹脂1gにアニソール3rn
1、エチルメチルスルフィド0.5−1無水フッ化水素
20−を加え、−20℃60分間、0℃60分間反応さ
せた。減圧濃縮後、ジエチルエーテル200rnlを加
え30分間撹拌し、濾過しジエチルエーテル100mf
fで洗浄した。謹上物に5%酢酸水100−を加えて3
0分間撹拌後、樹脂を濾過し、5%酢酸水100−で洗
浄した。
の際、添加剤として当量のN−ヒドロキシベンゾトリア
ゾールを加えた。その結果、中間体HCNP’−”NH
t ヘフチ)’樹脂7.6gが得られたこの)ICNI
”−” N H2ペプチド樹脂1gにアニソール3rn
1、エチルメチルスルフィド0.5−1無水フッ化水素
20−を加え、−20℃60分間、0℃60分間反応さ
せた。減圧濃縮後、ジエチルエーテル200rnlを加
え30分間撹拌し、濾過しジエチルエーテル100mf
fで洗浄した。謹上物に5%酢酸水100−を加えて3
0分間撹拌後、樹脂を濾過し、5%酢酸水100−で洗
浄した。
濾洗液を凍結乾燥後、得られた粗ペプチドを水に溶解し
、予め0. 1%トリフルオロ酢酸水で平衡化させた逆
相系充填剤YMC−A363 (S−5)ODSカラム
(30φX250mm)に注入し、カラムを0,1%ト
リフルオロ酢酸水で洗浄後、アセトニ) IJル濃度を
17%まで増加させ、流速7、 0−/分で溶出した。
、予め0. 1%トリフルオロ酢酸水で平衡化させた逆
相系充填剤YMC−A363 (S−5)ODSカラム
(30φX250mm)に注入し、カラムを0,1%ト
リフルオロ酢酸水で洗浄後、アセトニ) IJル濃度を
17%まで増加させ、流速7、 0−/分で溶出した。
溶出液をA230nmでモニターし、目的物を含む両分
を集め、凍結乾燥し、tlcNP’−”NHz 17
7. 4 mgを得た。
を集め、凍結乾燥し、tlcNP’−”NHz 17
7. 4 mgを得た。
得られたHCNP 8−” N H2は、逆相系充填剤
YMC−A211−ODSカラム(4,6φ×250m
m1を用いた、10%から50%までの0. 1%トリ
フルオロ酢酸を含むアセトニ) IJルの直!!!濃度
勾配溶出法による分析において保持時間12゜5分を示
し、そのアミノ酸分析値は理論値と一致した。
YMC−A211−ODSカラム(4,6φ×250m
m1を用いた、10%から50%までの0. 1%トリ
フルオロ酢酸を含むアセトニ) IJルの直!!!濃度
勾配溶出法による分析において保持時間12゜5分を示
し、そのアミノ酸分析値は理論値と一致した。
アミノ酸分析
加水分解:4Nメタンスルホン酸−2%トリプタミン、
110℃ 24時間 分析方法: P I Co−TAG (逆相−PTCア
ミノ酸〉法 *基準アミノN1()内理論値 Gly:1.Of (1) Ala:0.91 (1) Pro:0,97 (1) *Leu:1.00 (1) 実施例5 へc−HCNPの合成: 実施例3に記載のHGNP’−”ペプチド樹脂4.5g
を固相合成反応容器に入れ、実施例3に記載のスケジュ
ールlに従って、Boc−Trp−OH1Boc−Gl
n−OH,BoC−3er (Bzl)−OH,Boc
−11e−OH,Boc−Asp (OcHex)−O
H,Boc−Ala−OH1を順次、当量のDCCを用
いてカップリングさせた。この時添加剤として当量のN
−ヒドロキシベンゾトリアゾールを加えた。各カップリ
ング反応後、少量の樹脂をニンヒドリンで試験し、陽性
青色となった場合には、カップリング不完全であるとし
て同一の保護形アミノ酸を用い反応を繰り還した。この
際添加剤としてN−ヒドロキシベンゾトリアゾールまた
はp−ニトロフェノールを加えた。最後のアミノ酸のカ
ップリング及びアセチル化工程終了後、約3/4の樹脂
を取りだした残りの樹脂はさらに下記スケジュールlに
従って、Boc −A I a−OH,をカップリング
させた。約1/2の樹脂を取りだし、f−HCNPペプ
チド樹脂0.72gが得られた。残りの樹脂はさらにス
ケジュール1の工程1〜9、続いて工程16〜18を繰
り返し、脱保護及びアセチル化を行った。その結果、^
c−11cNPペプチド樹脂0.97gが得られた。
110℃ 24時間 分析方法: P I Co−TAG (逆相−PTCア
ミノ酸〉法 *基準アミノN1()内理論値 Gly:1.Of (1) Ala:0.91 (1) Pro:0,97 (1) *Leu:1.00 (1) 実施例5 へc−HCNPの合成: 実施例3に記載のHGNP’−”ペプチド樹脂4.5g
を固相合成反応容器に入れ、実施例3に記載のスケジュ
ールlに従って、Boc−Trp−OH1Boc−Gl
n−OH,BoC−3er (Bzl)−OH,Boc
−11e−OH,Boc−Asp (OcHex)−O
H,Boc−Ala−OH1を順次、当量のDCCを用
いてカップリングさせた。この時添加剤として当量のN
−ヒドロキシベンゾトリアゾールを加えた。各カップリ
ング反応後、少量の樹脂をニンヒドリンで試験し、陽性
青色となった場合には、カップリング不完全であるとし
て同一の保護形アミノ酸を用い反応を繰り還した。この
際添加剤としてN−ヒドロキシベンゾトリアゾールまた
はp−ニトロフェノールを加えた。最後のアミノ酸のカ
ップリング及びアセチル化工程終了後、約3/4の樹脂
を取りだした残りの樹脂はさらに下記スケジュールlに
従って、Boc −A I a−OH,をカップリング
させた。約1/2の樹脂を取りだし、f−HCNPペプ
チド樹脂0.72gが得られた。残りの樹脂はさらにス
ケジュール1の工程1〜9、続いて工程16〜18を繰
り返し、脱保護及びアセチル化を行った。その結果、^
c−11cNPペプチド樹脂0.97gが得られた。
このへC−11cNPペプチド樹脂0.97gにアニソ
ール3−、エチルメチルスルフィド0.5−1無水フッ
化水素20−を加え、−20℃60分間、a℃60分間
反応させた。 減圧濃縮後、ジエチルエーテル200d
を加え30分間撹拌し、濾過しジエチルエーテル100
−で洗浄した。謹上物に5%酢酸水100−を加えて3
0分間撹拌後、樹脂を濾過し、5%酢酸水100−で洗
浄した。
ール3−、エチルメチルスルフィド0.5−1無水フッ
化水素20−を加え、−20℃60分間、a℃60分間
反応させた。 減圧濃縮後、ジエチルエーテル200d
を加え30分間撹拌し、濾過しジエチルエーテル100
−で洗浄した。謹上物に5%酢酸水100−を加えて3
0分間撹拌後、樹脂を濾過し、5%酢酸水100−で洗
浄した。
濾洗液を凍結乾燥後、得られた粗ペプチドを05%5%
トリフルオロ酢酸水解し、予め0.1%トリフルオロ酢
酸水で平衡化させた逆相系充填剤YMC−A363 (
S−5)ODSカラム(30φX250mm)に注入し
、カラムを0.1%トリフルオロ酢酸水で洗浄後、アセ
トニ) IJル濃度を33%まで増加させ、流速7.0
−/分で溶出した。溶出液をA280nmでモニターし
、目的物を含む両分を集め、凍結乾燥し、Ac−flc
NPを76゜6mg得た。
トリフルオロ酢酸水解し、予め0.1%トリフルオロ酢
酸水で平衡化させた逆相系充填剤YMC−A363 (
S−5)ODSカラム(30φX250mm)に注入し
、カラムを0.1%トリフルオロ酢酸水で洗浄後、アセ
トニ) IJル濃度を33%まで増加させ、流速7.0
−/分で溶出した。溶出液をA280nmでモニターし
、目的物を含む両分を集め、凍結乾燥し、Ac−flc
NPを76゜6mg得た。
得られた^c−HCNPは逆相系充填剤YMC−A21
1−ODSカラム(4,6φX250mm)を用いた、
10%から50%までの0. 1%トリフルオロ酢酸を
含むアセトニトリルの直線濃度勾配溶出法による分析に
おいて保持時間28.9分を示し、そのアミノ酸分析値
は理論値と一致した。
1−ODSカラム(4,6φX250mm)を用いた、
10%から50%までの0. 1%トリフルオロ酢酸を
含むアセトニトリルの直線濃度勾配溶出法による分析に
おいて保持時間28.9分を示し、そのアミノ酸分析値
は理論値と一致した。
アミノ酸分析
加水分解:4Nメタンスルホン酸−2%トリプタミン、
110℃ 24時間 分析方法: P IC0−TAG (逆相−PTCアミ
ノ酸)法 *基?S+!アミノ酸 (〉内理論値Asp+0
.92 (I Glu:0.93 (I Ser:0.91 (I Gly:1.03 (I Ala:2.67 (3 Pro:1.04 (+ 11e:1.04 (1 *Leu : 1.00 (1) Trp:0,58 (1) 実施例6 f−HCNPの合F&、: 実施例5に記載のf−HCNPペプチド樹脂0.72g
にアニソール3me、エチルメチルスルフィド05−1
無水フッ化水素20−を加え、−20℃60分間、0℃
60分間反応させた。減圧濃縮後、ジエチルエーテル2
00−を加え30分間撹拌し、濾過しジエチルエーテル
loOm!で洗浄した。濾上物に5%酢酸水100rn
lを、1lffえて30分間撹拌後、樹脂を濾過し、5
%酢酸水100−で洗浄した。濾洗液を凍結乾燥後、得
られた粗ペプチドを50%酢酸水20−に溶解し、水8
0−にて希釈後、予め0.1%トリフルオロ酢酸水で平
衡化させた逆相系充填剤YMC−A363 (S−5)
ODSカラム(30φX250mm)に注入した。カラ
ムを0.1%トリフルオロ酢酸水で洗浄後、アセトニ)
IJル濃度を30%まで増加させ、流速7. 0at
!/分で溶出した。溶出液をA280nmでモニターし
、目的物を含む両分を集め、凍結乾燥し、f−)ICM
Pを78.0mg得た。
110℃ 24時間 分析方法: P IC0−TAG (逆相−PTCアミ
ノ酸)法 *基?S+!アミノ酸 (〉内理論値Asp+0
.92 (I Glu:0.93 (I Ser:0.91 (I Gly:1.03 (I Ala:2.67 (3 Pro:1.04 (+ 11e:1.04 (1 *Leu : 1.00 (1) Trp:0,58 (1) 実施例6 f−HCNPの合F&、: 実施例5に記載のf−HCNPペプチド樹脂0.72g
にアニソール3me、エチルメチルスルフィド05−1
無水フッ化水素20−を加え、−20℃60分間、0℃
60分間反応させた。減圧濃縮後、ジエチルエーテル2
00−を加え30分間撹拌し、濾過しジエチルエーテル
loOm!で洗浄した。濾上物に5%酢酸水100rn
lを、1lffえて30分間撹拌後、樹脂を濾過し、5
%酢酸水100−で洗浄した。濾洗液を凍結乾燥後、得
られた粗ペプチドを50%酢酸水20−に溶解し、水8
0−にて希釈後、予め0.1%トリフルオロ酢酸水で平
衡化させた逆相系充填剤YMC−A363 (S−5)
ODSカラム(30φX250mm)に注入した。カラ
ムを0.1%トリフルオロ酢酸水で洗浄後、アセトニ)
IJル濃度を30%まで増加させ、流速7. 0at
!/分で溶出した。溶出液をA280nmでモニターし
、目的物を含む両分を集め、凍結乾燥し、f−)ICM
Pを78.0mg得た。
得られたf−)1[”NPは逆相系充填剤YMC−A2
11−00Sカラム(4,6φX250mm)を用いた
、10%から50%までの0.1%トリフルオロ酢酸を
含むアセトニ) IJルの直線濃度勾配溶出法による分
析において保持時間25.9分を示し、そのアミノ酸分
析値は理論値と一致した。
11−00Sカラム(4,6φX250mm)を用いた
、10%から50%までの0.1%トリフルオロ酢酸を
含むアセトニ) IJルの直線濃度勾配溶出法による分
析において保持時間25.9分を示し、そのアミノ酸分
析値は理論値と一致した。
アミノ酸分析
加水分解:4Nメタンスルホン酸−2%トリプタミン、
110℃ 24時間 分析方法: P IC0−TAG (逆相−PTCアミ
ノ酸)法 *基準アミノ酸 ()内理論値Asp:0.9
3 (1) Glu:0.91 (1) Ser:0.91 (1) Gly:1.oo (1) Ala:2.63 (3) Pro : 1.02 (1) 11e:1.05 (1) *Leu:1.oo (1) Trp:0.Go (1) 実施例7 生物学的活性の測定: 生物学的活性の測定法:ま、小鹿幸生ら(薬物・精神・
行動、7巻、447−451.1985)の方法に準じ
て行った。即ち、胎令16日目のラット脳から摘出した
中隔中心核を細切後、ファルコン社製35+nmプラス
チック製培養血中で、1%FC5を含むボッテンシュタ
イン(Bottenstein)等の改変N2培養液を
用いて、7%炭炭酸ガス台空気、36°Cの条件下で培
養した。培養3日目より、検体として実施例1.5.6
により得た神経栄養ペプチドを培養系に添加しく対照群
は無添加〉、培養9日目に培養組織のアセチルコリン(
ACh)産生能を測定し、生物学的活性とした。
110℃ 24時間 分析方法: P IC0−TAG (逆相−PTCアミ
ノ酸)法 *基準アミノ酸 ()内理論値Asp:0.9
3 (1) Glu:0.91 (1) Ser:0.91 (1) Gly:1.oo (1) Ala:2.63 (3) Pro : 1.02 (1) 11e:1.05 (1) *Leu:1.oo (1) Trp:0.Go (1) 実施例7 生物学的活性の測定: 生物学的活性の測定法:ま、小鹿幸生ら(薬物・精神・
行動、7巻、447−451.1985)の方法に準じ
て行った。即ち、胎令16日目のラット脳から摘出した
中隔中心核を細切後、ファルコン社製35+nmプラス
チック製培養血中で、1%FC5を含むボッテンシュタ
イン(Bottenstein)等の改変N2培養液を
用いて、7%炭炭酸ガス台空気、36°Cの条件下で培
養した。培養3日目より、検体として実施例1.5.6
により得た神経栄養ペプチドを培養系に添加しく対照群
は無添加〉、培養9日目に培養組織のアセチルコリン(
ACh)産生能を測定し、生物学的活性とした。
ACh産生能は培養組織をトリス塩酸(pH7゜4)を
atrr系とするタイロード液にてブレインキュベーシ
ョンした後、100nM [3H]コリンクロライド(
15Ci/mmo l)を含む緩衝液で37°C130
分インキュベート後、フリーの〔’HEコリンを洗浄除
去後、INギ酸/ア七トン(15:85)溶液で組織を
溶解し、フリー〔3H〕コリンをコリンキナーゼ(0,
1ユニツト/In1)でフォスフォコリンに転換、[’
H]AChをテトラフェニルボロン(5rn g /−
アセトニトリル)で抽出し、培#Mi織のACh産生能
を検討した。培養組織のACh産生能は単位培養組織片
当たりのACh量で表現した。
atrr系とするタイロード液にてブレインキュベーシ
ョンした後、100nM [3H]コリンクロライド(
15Ci/mmo l)を含む緩衝液で37°C130
分インキュベート後、フリーの〔’HEコリンを洗浄除
去後、INギ酸/ア七トン(15:85)溶液で組織を
溶解し、フリー〔3H〕コリンをコリンキナーゼ(0,
1ユニツト/In1)でフォスフォコリンに転換、[’
H]AChをテトラフェニルボロン(5rn g /−
アセトニトリル)で抽出し、培#Mi織のACh産生能
を検討した。培養組織のACh産生能は単位培養組織片
当たりのACh量で表現した。
(1)実施例1により得た”HCNP“の生物学的活性
を表1に示す。“HCNP”300ρg/m lの濃度
において、対照の202%の培養組織のACh産生能が
みられ、生物学的活性が認められた。
を表1に示す。“HCNP”300ρg/m lの濃度
において、対照の202%の培養組織のACh産生能が
みられ、生物学的活性が認められた。
(11)実施例5により11′PたAc−tlcNr’
の結果は表2に示す。Ac−11[:NPの300pg
/mfの濃度において、対j1αの159%の培養組織
のACh産生能がみられ。
の結果は表2に示す。Ac−11[:NPの300pg
/mfの濃度において、対j1αの159%の培養組織
のACh産生能がみられ。
生物学的活性が認められた。
表2 ラット中隔中心核培養系におけるACh産生能に
対する作用。
対する作用。
表1 ラット中隔中心核培養系におけるACh産生能に
対する作用。
対する作用。
(各検体は3回の試験結果)
(iii)実施例6により得たf−HCNI’の結果は
表3に示す。 f−ICNPの2.5pg/−の濃度に
おいて、対唄の159%の培養組織のACh産生能がみ
られ、生物学的活性が認められた。
表3に示す。 f−ICNPの2.5pg/−の濃度に
おいて、対唄の159%の培養組織のACh産生能がみ
られ、生物学的活性が認められた。
表3 ラット中隔中心核培養系におけるACh産生能に
対する作用。
対する作用。
(各検体は3回の試験結果)
第1図
第1図は”HCN P”粗精製品の逆相系充填剤11P
−304カラム(46φX 250a++a)での溶出
パターンを示した図である。縦軸はA220nmでモニ
ターしたペプチド濃度、横軸は保持時間を表す。 第2図は”+1 CN P”高度精製品の東ソー社製逆
相系充填剤1’5K−120Tカラム(4,OφX25
0關)での溶出パターンを示した図である。
−304カラム(46φX 250a++a)での溶出
パターンを示した図である。縦軸はA220nmでモニ
ターしたペプチド濃度、横軸は保持時間を表す。 第2図は”+1 CN P”高度精製品の東ソー社製逆
相系充填剤1’5K−120Tカラム(4,OφX25
0關)での溶出パターンを示した図である。
Claims (6)
- (1)下記の理化学的性質および生物学的性質を有する
神経栄養ペプチド。 (a)海馬組織の水溶性画分に含まれる純粋なペプチド
。 (b)分子量:700〜1400(バイオ・ゲルP−2
を用いるゲル濾過法による) (c)コリナージック・ニューロンのアセチルコリン合
成能を増大する。 - (2)アミノ酸組成がAsp、Ile、Ser、Gln
、Trp、Gly、Pro、Leu各1残基およびAl
a3残基である請求項(1)記載の神経栄養ペプチド。 - (3)下記のアミノ酸配列を有する神経栄養ペプチド。 X−Ala−Asp−Ile−Ser−Gln−Trp
−Ala−Gly−Pro−Leu(XはフリーのAl
a又はアセチル基でブロックされているAlaを表す。 ) - (4)海馬組織の抽出液から逆相液体クロマトグラフィ
ーを含む工程により、ペプチドを分離、採取することを
特徴とする請求項(1)、(2)又は(3)記載のペプ
チドの製造法。 - (5)請求項(1)、(2)又は(3)記載のペプチド
を有効成分とする神経変性疾患治療剤。 - (6)請求項(1)、(2)又は(3)記載のペプチド
を有効成分とする抗痴呆剤。
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1080398A JP2802508B2 (ja) | 1989-03-30 | 1989-03-30 | 神経栄養ペプチド |
NZ233071A NZ233071A (en) | 1989-03-30 | 1990-03-23 | Neurotrophic peptides, extraction from mammalian hippocampal tissue and pharmaceutical compositions thereof |
AU52189/90A AU628500B2 (en) | 1989-03-30 | 1990-03-26 | Neurotrophic peptides |
FI901547A FI901547A0 (fi) | 1989-03-30 | 1990-03-28 | Neurotropiska peptider. |
CA002013300A CA2013300A1 (en) | 1989-03-30 | 1990-03-29 | Neurotrophic peptides |
NO90901434A NO901434L (no) | 1989-03-30 | 1990-03-29 | Neurotrofiske peptider. |
EP90303470A EP0390602A1 (en) | 1989-03-30 | 1990-03-30 | Neurotrophic peptides |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1080398A JP2802508B2 (ja) | 1989-03-30 | 1989-03-30 | 神経栄養ペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0372499A true JPH0372499A (ja) | 1991-03-27 |
JP2802508B2 JP2802508B2 (ja) | 1998-09-24 |
Family
ID=13717183
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1080398A Expired - Fee Related JP2802508B2 (ja) | 1989-03-30 | 1989-03-30 | 神経栄養ペプチド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2802508B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5759991A (en) * | 1990-03-29 | 1998-06-02 | Sumitomo Pharmaceutical Company, Limited. | Neurotrophic peptide derivatives |
-
1989
- 1989-03-30 JP JP1080398A patent/JP2802508B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BRAIN RESEARCH=1987 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5759991A (en) * | 1990-03-29 | 1998-06-02 | Sumitomo Pharmaceutical Company, Limited. | Neurotrophic peptide derivatives |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2802508B2 (ja) | 1998-09-24 |
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