JPH036795B2

JPH036795B2 -

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Publication number: JPH036795B2
Application number: JP56064201A
Authority: JP
Inventors: Haruo Sugano; Koretsugu Taniguchi
Original assignee: GAN KENKYUKAI
Current assignee: GAN KENKYUKAI
Priority date: 1981-04-30
Filing date: 1981-04-30
Publication date: 1991-01-30
Also published as: EP0064681A3; EP0064681A2; JPS57181098A; CA1197481A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は大腸菌tufB遺伝子（蛋白質合成伸長
因子Tuをコードする）のプロモータを含む新規
組換え体DNA、該プロモーターおよび真核生物
の蛋白質合成に関与する遺伝子を含む新規組換え
体DNA、ならびにこれら組換え体DNAを用いる
真核生成物の蛋白質の製造法に関する。

微生物に真核生物の蛋白質合成に関与する遺伝
子を取り込ませ、該蛋白質を微生物により大量に
生産させることを目的とする研究、開発が最近の
微生物工業において広く行なわれている。この遺
伝子組換え技法において重要な要素の１つは、プ
ロモーターである。

本発明者らは、優れたプロモーターの開発を目
的として研究を行つた結果、大腸菌tufB遺伝子
のプロモーターが真核生物の蛋白質合成を高める
ことができるプロモーターであることを見出し本
発明を完成した。

従来、tufB遺伝子からtufBプロモーターを取
出して、真核生物の蛋白質合成に関与する遺伝子
と結合させ、得られる組換え体DNAを用いて真
核生物の蛋白質製造に役立たせた例は知られてお
らず、本発明者らにより初めて見出されたもので
ある。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明の大腸菌tufB遺伝子のプロモーター
（以下“tufBプロモーター”という）を含む新規
組換え体DNAの製造法につき以下に説明する。

大腸菌tufB遺伝子は、大腸菌内で比較的多量
に生産されることが知られている蛋白合成伸長因
子であるTu遺伝子〔Gurdon、Biochemistry、
Vol、９、pp912−917（1970）〕の一つであり、そ
の存在はBacteriol.Rev.Vol.40.pp116−167
（1976）に詳細に記載されている。

さらにtufB遺伝子は大腸菌プラスミドpTUB1
にクローン化されていることがMiyajima et
al.、FEBS Letters Vol.102.No.２、pp207−210
（1979）に記載されている。このtufB遺伝子から
のtufBプロモーターの採取は次のようにして行
う。

まず、tufB遺伝子をクローン化した大腸菌プ
ラスミドpTUB1DNA〔Miyajima et.al.、FEBS、
Letters、Vol.102、No.２、pp207−210（1979）〕を
制限酵素Bgl（Ａ↓Ｇ）〔AGATCTを認識する
制限酵素、Nucleic Acide Res、３、1747
（1976）〕で切断し、生成する付着末端
（Cohesive end）をDNAポリメラーゼによつて
切断末端（blunt end）とする。これを、さらに
Cla（Ｔ↓Ｃ）〔ATCGATを認識する制限酵
素、ベーリンガーマンハイム社販売〕で切断し、
常法たとえばTabakとFlavell、Nucleic Acids
Res.Vol.5、pp2321−2332（1978）に記載の方法
によつて約１キロペース（Kb）よりなるtufBプ
ロモーターフラグメントを単離する。

一方、プラスミドpBR322DNA〔Gene、２、95
（1977）〕をEcoR（Ｇ↓Ａ）〔GAATTCを認識
する制限酵素、Methods Mol.Biol.、７、87
（1974）〕で切断し、生成する付着末端をDNAポ
リメラーゼによつて切断末端とする。これをさら
にClaで切断する。切断片に上記プロモーター
フラグメントをT₄DNAリガーゼを用いWeiss、
et.al.、J.Biol.chem 243、p4543（1968）に記載の
方法に従つて接続させる。このようにして、
tufBプロモーターを含有するプラスミド
pTUB1P−５（第１図参照）を得る。この
TUB1P−５は大腸菌HB101に挿入され、米国ア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに
ATCC31878として寄託されている。この
pTUB1P−５はClaによつて一箇所のみで切断
され、tufBプロモーターの下流に発現させたい
遺伝子を接続するために非常に便利かつ有用であ
る。

本発明のtufBプロモーターは、真核生物の蛋
白質合成に関与する遺伝子に接続させ、該蛋白質
の製造に利用することができる。

真核生物の蛋白質合成に関与する遺伝子として
は、tufBプロモーターの下流に接続して得られ
る組換え体DNA微生物に入れて培養したとき、
該蛋白質の製造が高められるようであれば、いか
なるものも用いることができる。

好適にはヒトのインターフエロン、インシユリ
ン、ソマトスタチンなどを用いることができる。

本発明の新規な組換え体DNAを製造するため
には、ベクターDNAが必要である。ベクター
DNAとしては、大腸菌などに由来するプラスミ
ドDNAあるいはフアージなどを用いることがで
きる。好適なベクターとしては、pBR322、
pMB9、pCRなどがあげられる。本発明におい
ては最も好適なベクターとしてpBR322を用い
る。

tufBプロモーターと真核生物の蛋白質合成に
関与する遺伝子とを含む本発明の新規組換え体
DNAをヒトβ₁−インターフエロンを真核生物の
蛋白質合成に関与する遺伝子として選び、ベクタ
ーDNAとしてプラスミドpBR322を選んで製造
する一例を以下に述べる。

まず、ヒトβ₁−インターフエロンを含みtufB₁
プロモーターを接続させるのに都合よいプラスミ
ド（pIFNβ−４）の製造について述べる。

プラスミドpTR56〔Taniguchi et.al.、Proc.
Natl.Acad.Sci.、USA.Vol.77、No.９、pp5230−
5233（1980）〕（−部欠失したヒトβ₁−インターフ
エロン遺伝子を含むプラスミド）をHind（Ａ
↓Ａ）〔AAGCTTを認識する制限酵素、J.Mol.
Biol、92、33（1975）〕で切断する。一方エキソヌ
クレアーゼBal31〔Nucleic Acids Research5、
1445〜1463（1978）〕を用いてヒトβ₁−インターフ
エロン遺伝子の上流をヌクレオチド番号89番
（Taniguchiet.al.、Gene.Vol.10、pp11−15
（1980）〕まで取り除き、そこにHindリンカー
およびBam HIリンカーを接続させる。これを
lacポータブルプロモーター〔105基材対よりなる
大腸菌β−ガラクトシターゼ遺伝子のプロモータ
ーフラグメント、参考文献１Taniguchiet.al.、
Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、Vol.77、No.９、
pp5230−5233（1980）、(2)Roberts＆Lauer、
Methods in Enzymology、Vol.68、pp473−781
（1979）〕の下流につないでプラスミドに挿入す
る。得られたプラスミドをPIE２０８−LR２
〔第２図参照〕と称する。

このPIE２０８−LR２はインターフエロン遺
伝子に存在する１箇所のPas切断部位の下流に
接するHinf切断部位より下流のインターフエ
ロン遺伝子部位を欠失している。

〔Taniguchi et.al.、proc.Natl.Acad.Sci.、
USA.Vol.77、No.９、PP5230−5233（1980）〕の
で、以下の操作によつて、この欠失したインター
フエロン遺伝子を構築する。

まずPIE208−LR2をPst（Ａ↓Ｇ）
〔CTGCAGを認識する制限酵素、Nucleic Acids
Res.、３、343（1976）〕で切断する。別に
TpIF319−13〔Taniguchi et.al.、Gene、Vol.10、
pp11−15（1980）〕DNAをPstで切断し、両者
をT₄DNAリガーゼによつて接続する。得られた
プラスミドをpIFNβ−４〔第２図参照〕と称す
る。

このpIFNβ−４に含まれるインターフエロン
遺伝子DNAは成熟ヒトβ₁−インターフエロン蛋
白質（成熟とはインターフエロン蛋白質を総て含
むことを意味する）をコードするために必要な
DNAのうち上流側の６個のアミノ酸に相当する
DNA部分を欠損している。成熟インターフエロ
ン蛋白質をコードする遺伝子を構築するためにこ
の６個のアミノ酸に相当するDNAを一般的化学
合成法、たとえば(1)Tetrohedron Lett.Vol.28、
pp2449−2452（1978）または(2)Nucleic Acids
Research、Vol.8、pp5473−5489（1980）に記載
の方法によつて取得する。このDNAの配列は以
下の通りである。

この合成DNA、pTUB1P−５およびpIFNβ−
４を用いて、次の操作により成熟ヒトβ₁−インタ
ーフエロンの生産を指令するプラスミドを構築す
る。

まず、tufBプロモーター下流にインターフエ
ロン遺伝子を接続させるため、pTUB1P−５を
ClaおよびHindで切断する。ついでpIFNβ−
４をHpa（Ｃ↓Ｃ）〔CCGGの認識部位をもつ
制限酵素、Biochemistry、12、3055（1973）〕ま
たはHap（Ｃ↓Ｃ）〔CCGGの認識部位をもつ
制限酵素、Methods Mol.Biol.、７、113（1974）〕
およびHindで切断し、約700塩基対よりなる
DNAフラグメントを単離する。このDNAフラグ
メントは成熟ヒトβ₁−インターフエロン蛋白質の
７番目以降のアミノ酸をすべてコードし、下流に
はpBR322のHind切断部位をもつものである。

このDNAフラグメントのHapによる切断部
位と、前述の合成DNAの下流端を第３図に示す
ようにT₄DNAリガーゼによつて接続することに
よつて成熟ヒトβ₁−インターフエロン蛋白質のす
べてをコードする遺伝子が構築される。

さらに、合成DNAの上流端を前述のCla、
Hindで切断したpTuB₁P−５のCla切断部位
とをT₄DNAリガーゼによつて接続する。この接
続により、tufBプロモーターにインターフエロ
ン遺伝子を継ぐことができる。

またpTuB1P−５のHind切断部位は、前述
のpIFNβ−４からのHap−HindDNAの
Hind切断部位と接続され第３図に示すような
プラスミドを構築する。得られたプラスミド
pTuIFNβ−５と称する。

かくして得られるpTuIFNβ−５はtufBプロモ
ーターおよび成熟ヒトβ₁−インターフエロン蛋白
質のすべてをコードする遺伝子を含み、さらにア
ンピシリン、テトラサイクリンに耐性を示す遺伝
子を有している。

pTuIFNβ−５におけるtufBプロモーター、合
成DNA、インターフエロン遺伝子の下流部の接
続部位の塩基配列を第４図に示す。大腸菌リポゾ
ームが蛋白質合成を効率良く開始するためにはＡ
−Ｔ−Ｇコドンの上流にプリン塩基に富んだいわ
ゆるShine−Dalgarno（SD）配列の存在が必要で
あり、その配列とＡ−Ｔ−Ｇコドンとの距離も重
要であるが、第４図に示されるように、
pTuIFNβ−５中のインターフエロン遺伝子の最
初のアミノ酸をコードするＡ−Ｔ−ＧとSD配列
との間は、もとのtufB遺伝子中のそれと全く同
一であり、最も好ましいものである。

またヒトβ₁−インターフエロン遺伝子中６番目
のアミノ酸のコドンはＣ−Ｔ−Ｔであるが、合成
DNAを用いて構築したβ₁示−インターフエロン
遺伝子の場合はＣ−Ｔ−Ｃとなつている。この両
コドンによつてコードされるアミノ酸はともにロ
イシンであるので、pTuIENβ−５を用いて合成
される成熟β₁−インターフエロン蛋白質はヒトが
産生するそれと、アミノ酸配列において全く同一
である。

Mandel、M.＆Higa、A.J.Mol.Biol.53、159−
162（1970）に記載された方法により大腸菌を
pTuIFNβ−５で形質転換する。得られた形質転
換株を、通常の大腸菌培養法により培養を行な
い、インターフエロン生産を調べた。その結果、
先に本発明者らが構築したプラスミドpLG117R
〔Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、Vol.77.No.９、
5230−5233（1980）〕を用いる場合よりも、さらに
効率よくインターフエロン生産をできることが明
らかになつた。

pTuIFNβ−５はClaによつてインターフエロ
ン遺伝子を完全なままで、しかも最初のＡ−Ｔ−
Ｇコドンの直前で切断し、取り出し、他のプロモ
ーターに接続することが容易であり、その点でも
pTuIFNβ−５は非常に有用性の高いものである。

さらにpTuIFNβ−５におけるtufBプロモータ
ー部分を試験管内操作によつてデレツシヨン
（deletion）などの改変を行い、インターフエロ
ン遺伝子の発現をさらに向上させることも可能で
ある。

以下本発明の実施例を示す。

実施例１プラスミドpTuBlP−５の作製プラスミドDNApTUB1〔Miyajima et.al.、
FEBS Letters、Vol.102、No.２、pp207−210
（1979）〕の260μｇを反応液500μｇ｛10ｍＭ
Tris−HCl、PH7.5；６ｍＭ MgCl₂；10ｍＭ
NaCl；６ｍＭメルカプトエタノール；100ユニツ
トのBgl〔米国ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リース（BRL）社販売〕｝中37℃で一夜インキユ
ベートする。反応液を70℃で３分間処理し、それ
ぞれ500nmolesのdATP、dCTP、dGTP、
dTTPを加え、10ユニツトのDNAポリメラーゼ
（Klenowのフラグメント）（米国BRL社販売）
と共に室温（23℃）で３時間反応させる。フエノ
ール処理し、DNAをエタノールで沈澱させた後、
そのDNAを500μの反応液〔10ｍＭ Tris−
Hcl、PH7.5；６ｍＭ MgCl₂；10ｍＭ NaCl；
６ｍＭメルカプトエタノール；100ユニツトのCa
（西ドイツ、ベーリンガー・マンハイム社販
売〕中37℃で一夜インキユベートする。このよう
に処理されたDNAを１％のアガロースゲル電気
泳動にかけ、約1000塩基対より成る、tufB遺伝
子のプロモーターを含んだDNAフラグメントを
TabakとFlavellの方法〔Nucleic Acids Res.、
Vol.5、pp2321−2332（1978）〕を用いて回収す
る。このフラグメントはtufBプロモーターの5′側
にDNAポリメラーゼによつて切断末端（blunt
end）になつたBgl切断部位を、3′側に付着末
端（Cohesiveend）そのままCla切断部位を持
つている。

一方、20μｇのpBR322DNA〔Bolivaret.al.
Gene.Vol.2、pp95−113（1977）〕を反応液100μ
〔10ｍＭ Tris−Hcl、PH7.5；６ｍＭ MgCl₂；
100ｍＭ NaCl；６ｍＭメルカプトエタノール；
20ユニツトのEcoR（宝酒造販売）〕中37℃で60
分間インキユベートする。次にその反応液を70℃
で３分間処理し、それぞれ100nmolesのdATP、
dTTpを加え３ユニツトのDNAポリメラーゼ
（Klenowのフラグメント）と共に室温（23℃）
で３時間反応させる。フエノール処理しDNAを
エタノールで沈澱させた後、そのDNAを100μ
の反応液〔10ｍＭ Tris−Hcl、PH7.5；６ｍＭ
MgCl₂；10ｍＭ NaCl；６ｍＭメルカプトンエ
タノール；220ユニツトのCla〕中37℃で60分
間インキユベートする。このDNAをフエノール
処理しエタノールで沈澱させてから50μの110
ｍＭ Tris−Hcl、PH7.5溶液にとかす。

上述のように処理したpBR322DNA1μｇと前
述のtufBプロモーターを含むDNAフラグメント
0.4μｇを20μの反応液〔66ｍＭ Tris−HCl、
PH7.6；6.6ｍＭ MgCl₂；10ｍＭ
dithiothreitol；１ｍＭ ATP；0.2ユニツトのＴ
−4DNAリガーゼ（宝酒造販売）〕中15℃で４時
間インキユベートする。

この反応物を用いて大腸菌（E.coli）HB101株
〔J.Mol.Biol.41、459−472（1969）〕を〔Mandel.
M.＆Higa、、A.J.Mol.Biol.53、159−162（1970）〕
に記載の方法に従つて形質転換し、アンピシリン
耐性転換株のなかからプラスミドpTuB1P−５を
単離する。このプラスミドはpBR322DNAの
EcoR−Cla切断部位にtufBプロモーターを
含む約1000塩基対よりなるDNAフラグメントを
含み、Claによる切断によりtufBプロモーター
の下流がもとのtufB遺伝子と全く同一個所で切
断される。第２図に行程の概略を示す。

E.coli HB101のpTuB1P−５による形質転換
株は米国のアメリカン・タイプ・カルチヤー・コ
レクシヨンにATCC31878として寄託されている。

実施例２プラスミドpIFNβ−４の作製プラスミドpTR56〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA
Vol.77、No.９、pp5230−5233（1980）〕DNA10μ
ｇを反応液100μ〔10ｍＭ Tris−Hcl、PH
7.5；６ｍＭ MgCl₂；50ｍＭ NaCl；６ｍＭメ
ルカプトエタノール；10μｇプラスミドDNA；
10ユニツトHind（米国、BRL社販売）〕中37
℃に於て60分間インキユベートし、フエノールで
除蛋白した後、エタノールで沈澱させる。この沈
澱を反応液40μの（12ｍＭ CaCl₂；12ｍＭ
Mgcl₂；600ｍＭ NaCl；20ｍＭ Tris−Hcl、
PH8.1；１ｍＭ EDTA）に溶かし、２ユニツト
のBal31（米国BRL社販売）で10分間300℃に於て
反応させた後、フエノール処理し、エタノールで
沈殿させる。この沈殿を反応液100μ（100ｍＭ
Tris−HCl、PH7.5；６ｍＭ MgCl₂；100ｍＭ
NaCl；６ｍＭメルカプトエタノール）に溶か
し、10ユニツトのBamHI（米国BRL社販売）を
加え37℃で60分間インキユベートする。フエノー
ル処理、エタノール沈殿の後、この沈殿を50μ
の反応液（66ｍＭ Tris−HCl、PH7.6；6.6ｍＭ
MgCl₂、10ｍＭ dithiothreitol、１ｍＭ
ATP）中でそれぞれ27p.moleのBamHIリンカ
ー、Hindリンカー（それぞれ米国
Collaborative Research社販売のものであり、
それぞれのDNAの5′末満をＴ−４ポリヌクレオ
チドキナーゼによつてリン酸化してあるもの）お
よび30p.moleのlacポータブルプロモータ〔105塩
基対より成る大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子
のプロモーターフラグメント。(1)Taniguchi et.
al.、proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.77.No.９、
pp5230−5233（1980）(2)Roberts＆Lauer、
Methods in Enzymology Vol.68、pp473−481
（1979）に記載〕と共に１ユニツトのＴ−4DNA
リガーゼ（米国BRL社販売）と20℃で４時間イ
ンキユベートし反応させる。

この反応物を用いて大腸菌LG90株（Guarente
et.al.、Cell、vol.20、pp543−553）を〔Mandel、
Ｍ＆Higa、A.、J.Mol.Biol.53、159−162（1970）
に記載の方法に従つて形質転換しアンピシリン耐
性転換株のなかからプラスミドPIE208−LR2を
単離する。このプラスミドはpTR56に比べると
Hindリンカーに隣接してBamHIリンカーが挿
入されBamHIリンカーに隣接してβ−インター
フエロンcDNA〔TpIF319−13；Taniguchi et.
al.、Gene vol10、pp11−15（1980）〕のヌクレオ
チド90番目（上述の文献参照）のＡ−Ｔ塩基対が
隣接しているものである。このプラスミド
DNA1μｇを反応液20μ〔10ｍＭ Tris−HCl、
PH7.5；６ｍＭ MgCl₂；50ｍＭ NaCl；６ｍＭ
メルカプトエタノール；１ユニツトのpst（宝
酒造販売）〕中37℃で60分インキユベートする。

一方、プラスミドTpIF319−13 DNA1μｇを同
様の条件下でPstで切断し、両反応液を混合し、
フエノール処理した後、DNAをエタノールで沈
澱させる。このDNAを25μの反応液（66ｍＭ
Tris−HCl、PH7.5；6.6ｍＭ MgCl₂；10ｍＭ
dithiothreitol；１ｍＭ ATP）中で0.2ユニツ
トのＴ−4DNAリガーゼ（宝酒造販売）と15℃に
於て４時間反応させた後、大腸菌HB101株を形
質転換（アンピシリン、テトラサイクリン耐性）
させた。転換株のなかからプラスミドpIFNβ−
４を単離した。第２図に全行程の概略を示す。

実施例３プラスミドpTuIFNβ−５の作製 30μｇのpTuB1P−5DNAを60μの反応液〔10
ｍＭ Tris−HCl、PH7.5；６ｍＭ MgCl₂；６
ｍＭメルカプトエタノール；30ユニツトのCla
〕中37℃で60分間インキユベートする。反応液
に50ｍＭのNaClを加え100μ（10ｍＭ Tris−
HCl、PH7.5；６ｍＭ MgCl₂；50ｍＭ NaCl；
６ｍＭメルカプトエタノールを含む）とし、30ユ
ニツトのHind（宝酒造販売）を加えて37℃で
60分間インキユベートする。フエノール処理しエ
タノールでDNAを沈澱させた後、沈澱を10μ
の10ｍＭ Trfs−HCl、PH7.5にとかす。この溶
液には1μ当り1.155μｇのDNAが含まれる。

次に400μｇのpIFNβ−4DNAを1.7mlの反応液
〔10ｍＭ Tris−TCl、PH7.5；６ｍＭ MgCl₂；
６ｍＭメルカプトエタノール；100ユニツトの
Hap（宝酒造販売）〕中37℃で一夜インキユベ
ートする。反応液に50ｍＭのNaClを加え1.8ml
（10ｍＭ Tric−HCl、PH7.5；６ｍＭ MgCl₂；
50ｍＭ NaCl；６ｍＭメルカプトエタノールを
含む）とし、128ユニツトのHindを加えて37℃
で一夜インキユベートする。このようにして処理
されたDNAを１％アガロースゲル電気泳動にか
け約700塩基対よりなるβ₁−インターフエロン
cDNAを含むフラグメントをTabakとFlavellの
方法Nucleic Acids Res.Vol、５、pp2321−2332
（1978）を用いて回収する。このフラグメントか
ら5μｇのDNAが回収される。このフラグメント
はβ₁−インターフエロンの７番目のアミノ酸（グ
リシン）以下のすべてのアミノ酸配列を指令する
配列を持し、cDNAの5′側はHap切断部位の
Stickyendを、3′側はpBR322のHind切断部位
のSticky endを持つDNAである（第３図参照）。

次に以下の様な配列を持つ２種類のDNAを(1)
Hirose et.al.；Tetranedron Lett.、Vol.28、
PP2449−2452（1978）または(2)Miyoshi et.al.；
Nucl.Acids Res.、Vol.8、pp5473（1980）に記載
の方法に従つて合成する。

１（5′）Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ
−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ
（3′）２（5′）Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ
−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ
（3′）これらのDNAそれぞれ87p.molesづつを20μ
の反応液〔50ｍＭ Tris−HCl、PH7.6；10ｍＭ
MgCl₂；５ｍＭメルカプトエタノール；0.3ｍ
Ｍ ATP；3.3ユニツトのＴ−４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（西ドイツ、ベーリンガーマンハイム
社販売）〕中30℃で20分間インキユベートし5′末
端をリン酸化する。

この化学合成されたDNAをそれぞれ13p.moles
ずつを前述のCla、indで切断したpTuB1p−
5DNA0.7μｇ、β₁−インターフエロンcDNAを含
む前述のHap−HindのDNAフラグメント1μ
と共に30μの反応液（66ｍＭ Tris−HCl、
PH7.6；6.6ｍＭ MgCl₂；10ｍＭ
dithiothreitol；１ｍＭ ATP）中で0.2ユニツト
のＴ−4DNAリガーゼ（宝酒造販売）と15℃で15
時間反応させる。この反応物を用いて大腸菌
HB101株を形質転換し、アンピシリン耐性転換
株のなかから第３図に示される様なプラスミド
pTuIFNβ−５を単離する。全行程の概略を第３
図に示し、またtufBプロモーター、合成DNA、
β₁−インターフエロンcDNAの接続部位の塩基配
列を第４図に示す。

Ｅ。coli HB101のpTuIFNβ−５による形質転
換株は米国のアメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨンにATCC31879として寄託されてい
る。

実施例４インターフエロン活性の測定 pTuIFNβ−５、pLG117−Ｒ〔Taniguchiet.al.、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA、Vol.77、No.９、
pp5230−52331980）〕を持つ大腸菌HB101株をそ
れぞれ100mlの25μｇ／mlのアンピシリンを含む
倍養液〔Ｌ−Broth；１％バクトトリプトン
（DIFCO）、0.5酵母エキス（DIFCO）、0.5％
NaCl〕中、37℃で振湯培養し、１〜2.5×
10⁷cells／ml程度まで培養する。培養液を遠心分
離（5000r.p.m.5分間）によつて沈澱させ沈澱物
をそれぞれ１mlの25％シユクロースを含む50ｍＭ
Tris−HCl、PH8.0（０℃）に懸濁する。次に氷
冷下0.2mlのリゾチーム（米国sigma社販売）（５
mg／ml）を加え、５分間放置する。0.2mlのNa₂
−EDTA（0.25M、PH8.0）を加え、さらに５分間
放置する。0.3mlの溶液〔５％ Brij58（和光純薬
社製）、２％Sodium7−Deoxycholic Acid、
0.3M Na₂−EDTA、0.25M Tris−HCl（PH8.0）〕
を加え氷冷下に10分間放置する。遠心分離
（4000r.p.m.30分間）し、上清（約1.8ml）のイン
ターフエロン活性を測定する。インターフエロン
活性はCPE−redding method〔Finter、N.B.、J.
Gen.Virol.vol5、pp419−425（1969）〕によつて測
定し、ヒト細胞はGM258（米国、Human
Genetic Mutant Cell Repository、Camden、
NJ、より入手）を、チヤレンジウイルスは
encephalomyocardits（EMC）ウイルス〔米国予
防衛生研究所（NIH）より入手〕を用いた。ま
た米国予防衛生研究所（NIH）より入手したβ
−インターフエロンのスタンダードを対照とし
て、上述の大腸菌抽出液中のインターフエロン活
性を測定した。三度に亘る測定の平均結果は次の
通りである。

(1) pTuIFNβ−５／HB101；1700単位／ml (2) pLG117R／HB101；400単位／ml (1)の場合大腸菌は全体で1.0×10⁸cells、インター
フエロンの総収量は約3000単位、(2)の場合は2.5
×10⁸cellsでインターフエロン収量は約700単位で
あつた。従つてpTuIFNβ−５を含むHB101株は
従来のpLG117Rを含むそれよりも約10倍程効率
良くβ−インターフエロンを生産していることが
明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のプラスミドpTuB1P−５の
製造法のフローチヤートを示す。図中矢印↓は各
制限酵素による切断部位を示す。１の矢印は、
Bgl、EcoRI切断部位が失なわれていることを
示す。第２図は、プラスミドpIFNβ−４の製造法の
フローチヤートを示す。図中矢印↓は各制限酵素
による切断部位およびリンカーの存在を示す。第
３図は、本発明のプラスミドpTuIFNβ−５の製
造法のフローチヤートを示す。図中矢印↓は各制
限酵素による切断部位およびリンカーの存在を示
す。第４図は、tufB−プロモーター、合成DNA、
β₁−インターフエロンcDNAの接続部位の塩基配
例を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１大腸菌tufBプロモーター下流にヒトβ₁−イ
ンターフエロン遺伝子を接続した新規組換え体
DNA。２プラスミドpTuIFNβ−５を含む大腸菌。