KR890005072B1

KR890005072B1 - 이.콜라이 세포로부터 유용한 펩티드를 유전공학적 방법으로 생산하기 위해 제조된 발현벡터, 형질전환균주 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR890005072B1
Application number: KR1019870014289A
Authority: KR
Inventors: 한문희; 유명희; 최영철; 이상철
Original assignee: 한국과학 기술원; 이정오
Priority date: 1987-12-15
Filing date: 1987-12-15
Publication date: 1989-12-09
Also published as: KR890010197A

Abstract

내용 없음.

Description

이.콜라이 세포로부터 유용한 펩티드를 유전공학적 방법으로 생산하기 위해 제조된 발현벡터, 형질전환균주 및 그의 제조방법

제1도는 Tac 전사 활성화 서열 및 락토오즈 오페론 억제단백질의 유전자(lacI)를 포함하는 pT6-IN 를 플라스미드의 제조 과정을 보여주는 계통도.

제2도는 이.콜라이 효소 베타갈락토시다제의 아미노 말단을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pPLCT(S) 와 pPLCT(H) 플라스미드의 제조.

제3도 각각의 발현 벡터에서 이.콜라이 베타갈락토시다제의 아미노 말단 서열과 pUC18의 멀티링커가 연결된 부위를 나타내는 유전자지도.

제4도는 발현벡터 pCT1의 제조과정을 보여주는 계통도.

제5도는 발현벡터 pCT10의 제조과정을 보여주는 계통도.

제6도는 발현벡터 pCT20의 제조과정을 보여주는 계통도.

제7도는 발현벡터 pCT30의 제조과정을 보여주는 계통도.

제8도는 각 플라스미드에 의해 형질전환된 이. 클라이의 배양액으로부터 이소프로필 베타갈락토사이드로 발현을 유도하기 전과 후에 준비한 세포 추출액을 SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 전기 영동한 결과.

제9도는 제8도의 결과 중 플라스미스 pCT1, pCT10 및 pCT20를 포함하는 이.콜라이에 의해 생성된 단백질 밴드들을 덴시토미터로 스캔한 결과.

본 발명은 펩티드를 코우드화하는 외부 유전자를 이.콜라이 세포내에서 안정하게 발현시키는데 사용되는 벡터들에 관한 것이다. 이 벡터들은 대장균의 안정한 단백질인 베타갈락토시다제의 아미노 말단을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열의 3말단에 클론닝 대상의 펩티드를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열을 연결시킬수 있도록 제조된 것이다. 따라서 이러한 벡터에 의해 생성된 외부 유전자 산물은 베타갈락토시다제 효소 아미노 말단 부위의 뒷 부분에 융합된 상태로 생성된다.

재조합 플라스미드를 통해 이.콜라이 세포내에 도입한 외부 유전자들은 많은 경우에 성공적으로 발현되지 못하게 된다.

이와같은 발현의 문제점은 여러가지 요인에세 기인할 수 있다. 유전자의 전사 효율이 낮아서 전령RNA가 충분히 생산되지 않은 경우, 또한 전령RNA의 안정성이 낮은 경우, 전령RNA가 리보좀에 약하게 결합하여 해독효율이 낮아서 폴리펩티드 생산이 떨어지는 경우 등이있다. 이러한 요인들에 의한 발현의 문제점은 강한 전사 활성화 서열을 사용하거나, 전령RNA가 안정한 2차 구조를 가지도록 뉴클레오티드 서열을 치환해 주는것, 또는 최적의 리보좀 결합부위를 제공하는 방법에 의해 시정될 수 있다. 이.콜라이 세포 내에서 발현이 성공적으로 되지 못하는 이유로는 상기의 요인들 외에도 발현 단백질의 폴리펩티드는 제대로 생성되지만 안정한 3차 구조를 형성하기 어렵고 따라서 숙주 세포 내에서 단백질 산물이 분해되는 경우이다. 후자의 경우에서처럼 단백질이 불안정하여서 분해될 경우에 많이 사용되는 방법은 발현 대상의 유전자를 안정한 숙주단백질의 유전자에 번역 프레임이 맞도록 연결하여 융합 단백질 상태로 발현시키는 방법이다.

이.콜라이의 여러 단백질 중 융합대상으로 가장 많이 사용되는 것은 베타갈락토시다제 효소 단백질로서 그 이유는 잘 알려진 효소의 여러 특성과 유전적 조절, 그리고 재조합 균주를 쉽게 선별할 수 있는 장점이 있기 때문이다. 발현 대상의 단백질을 베타갈락토시다제에 융합하는 방법(silhavy 와 Beckwith, Microbiological Reviews, 제49권, 398페이지, 1985년)으로 크게 다음과 같이 두 가지로 나눌 수 있다.

첫째는 발현 대상의 유전자 산물이 베타갈락토시다제 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결되도록 하는 방법으로서 생성된 융합 단백질은 대부분의 경우 베타갈락토시다제 효소의 활성을 지니겐 된다. 따라서 아미노 말단 융합 단백질은 베타갈락토시다제 친화성 칼럼 크로마토그라피를 이용하여 쉽게 분리 정제시킬 수 있다는 장점이 있다. 그런데 이 방법은 발현 대상의 단백질만을 융합 단백질로부터 절단하여 분리하고자 할때는 여러가지 문제점이 많게 된다. 흔히 사용하는 시안브롬(CNBr)으로 메치오닌 잔기를 절단하는 방법을 사용할때 베타갈락토시다제 폴리펩티드에는 20여개의 메치오닌이 존재하므로 많은 수의 펩티드 절단 산물이 생성하기 때문에 원하는 발현 산물만을 분리해 내기가 어렵다는 단점이 있다.

두번째 방법은 발현 대상의 유전자 산물이 베타갈락토시다제 폴립펩티드의 카르복시 말단에 연결되도록 하는 방법이다. 이같은 방법은 이타쿠라(Itakura)등 (Science, 제198권, 1056페이지, 1977년)에 의해 소마토스타틴(Somatostatin) 을, 괴델(Goeddel)등 (Proc. Natl. Sci. Acad. U.S.A., 제76권, 106페이지, 1979년)에 의한 인슐린(insulin)을, 그리고 구오(Guo)등 (Gone, 제29권, 251페이지, 1984년)에 의해 프로인슐린(proinsulin)을 유전자 제조합 방법을 이용하여 이.콜라이에서 안정하게 생산해 냈을 경우에 사용되었었다. 발현 대상 단백질을 베타갈락토시다제의 카르복시 말단에 연결하여 이.콜라이 내에서 융합 단백질 상태로 생산하는 경우에는 융합 단백질이 대량으로 생산되며 세포내에 균질성의 단백질 과립(inclusion body)상태로 축적되게 된다. 이러한 융합 단백질 과립은 베테락토시다제의 효소 활성은 없게 되지만 재조합 산물이 세포 내에서 대량으로 생산될 수 있다는 점(보통세포 총 단백질의 30%이상)과 세포 추출액에서 원심분리에 의해 쉽게 분리 될수 있다는 장점이 있다.

카르복시 말단에 연결시키는 방법에 있어서 융합되는 베타갈락토시다제 폴리펩티드는 그 길이가 짧을수록 발현 대상 단백질이 차지하는 비율이 상대적으로 높아지게 된다. 또한 융합 단백질의 길이가 짧을수록 발현대상 펩티드를 융합 단백질로부터 절단하여 분리 정제하는 데에도 용이하게 된다. 하지만 융합 단백질의 길이가 너무 짧아지게 되면 단백질 함유물을 형성하지 못하고, 융합 단백질 자체가 불안정하게 되어 세포 내에서 분해되게 된다. 따라서 재조합 유전자 산물의 발현 수율이 크게 떨어지게 된다. 상기에 서술한 조마토스 타틴과 인슐린의 경우에는 베타갈락토시다제 폴립펩티드의 1005번째 아미노산 잔기에 연결시키는 방법을 사용하였으며, 프로인슐린의 경우에는 길이를 450개 아미노산까지 줄여서 연결시켜 생산하는데 성공하였다.

본 발명에서는 융합 단백질을 안정화하고 수율을 높게 유지하는데 필요한 최단의 베타갈락토시다제 폴리펩티드 길이를 체계적으로 조사하였으며, 이를 이용하여 짧은 길이의 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 개발하였다.

본 발명에서 이용한 베타갈락토시다제 폴리펩티드의 길이는 지금까지 발표된 융합 단백질에서 사용된 최단의 길이보다 더 줄여서 사용된 아미노 말단의 200,280 및 350개의 아미노산 서열들이며 이들 각각 서열의 카르복시 말단에 발현 대상의 펩티드가 연결될 수 있도록 발현벡터를 제조하였다. 따라서 본 발명의 특징은 생체 유용 펩티드를 이.콜라이 내에서 내에서 유전공학적 방법을 통해 생산할 때, 보다 짧은 베타갈락토시다제 아미모 말단에 연결시킬 수 있게 되어서 발현대상 펩티드의 수율이 상대적으로 높아지게 되며 펩티드를 융합 단백질로부터 절단하여 분리시킬 때에도 정제가 이용하다는 장점이 있다.

본 발명에서 제조된 벡터들은 전사 활성화 서열로 탁(tac) 프로모터(promoter)를 가지고 있으며 그 뒤에 베타갈락토시다제의 아미노 말단 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열(lacZ)을 지니고 있으며, 이 서열의 3말단에 pUC18 플라스미드로부터 유래한 여러 제한효소 부위(멀티링커 : multi-linker site)가 존재하여서 외부 유전자를 쿨론닝 하는데 사용될 수 있다. 또한 멀티링커 뒷 부분에는 pINIII-Al 플라스미드로부터 유래한 락토오즈 오페론 억제 단백질(repre-ssor)의 유전자(lacI)를 삽입하여 벡터를 제조하여서 대부분의 이.콜라이 균주에서 숙주의 제한이 없이 사용할 수 있도록 하였다. 이와같은 방법으로 제조된 pCT10, pCT20, 및 pCT30 플라스미드에 외부 유전자를 연결시켜 생산된 융합 단백질들은 총 세포 단백질의 40%이상 수율로 생산될 수 있으며, 정제를 용이하게 하기 위해서 발현 대상 펩티드의 길이에 따라 적당한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다.

[실시예 1]

Tac 전사 활성화 서열, 이.콜라이 베타갈락토시다제 효소의 아미노 말단을 코우드화하는 뉴클레티드 서열(lacZ) 및 이.콜라이 락토오즈 오페론 억제단백질(lac repressor)을 코우드화하는 서열(lacI)을 지닌 플라스미드를 전사, 해독 및 발현과정에 적합하도록 연결시키기 위해 제1도에서 제7도의 방법을 사용하였다. 첫 단계로 Tac 전사 활성화 서열과 이.콜라이 락토오즈 오페론 억제인자의 유전자 (lacl)을 지닌 플라스미드 pT61N 을 제조하였다(제1도 참조).

(a) ptac12 플라스미드(Amann 등, Gene, 제25권, 167페이지, 1985년)는 클로닝 부위가 Tac 전사 활성화 서열 바로 뒤에 존재하는 pvuII 부위만이 존재하기 때문에 ptac12 플라스미드에 여러 제한효소 부위를 삽입하기 위해 pUC7 플라스미드(Vieira Messing, Gene, 제19권, 259페이지, 1982년)로부터 유래한 멀티링커(multi-linker) 부위를 연결시켜 pT-6 플라스미드를 제조하였다. Tac 전사 활성화 서열을 지닌 ptac12 플라스미드의 DNA 4ng 을 완충용액 I(50mM Tris-Cl, pH8.0 ; 10mM MgCl₂; 50mM NaCl)에서 37℃의 온도로 2시간 동안 PvuII 제한효소로 분해한 후 페놀과 클로로포름으로 추출하였다. 추출된 용액에 2배 부피의 에탄올을 섞고 -70℃에서 30분간 방치한 후 원심분리에 의해 DNA를 회수하였다. 회수된 DNA를 10mM Tris-Cl, pH8.0완충용액에 녹인 후 박테리아의 알칼라인 포스포타제(BAP)로 처리하고 다시 페놀, 클로로포름의 추출과 에탄올 침전 과정을 반복하여 DNA를 회수하였다.

또한 pUC7 플라스미드 DNA 6ug 을 완충용액I에서 37℃의 온도로 2시간 동안 PvuII 제한효소로 분해하여 생겨난 DNA 단편들을 1.5%아가로즈 젤(agarose gel)전기영동법에 의해 크기에 따라 분리한 후 멀티링커 부위를 포함하고 있는 310bp DNA 단편을 분리하였다. 분리된 DNA 단편 600ng을 완충용액I에서 37℃의 온도로 2시간 동안 AluI 제한효소를 분해한 후 1.8%아가로즈 젤에서 150bp 단편을 분리하였다. 분리된 DNA 단편 100ng과 위에서 회수한 PvuII 제한효소 및 포스포타제(BAP)로 처리된 ptac12 플라스미드 DNA 800ng 을 섞고 완충용액 III(66mM Tris-Cl, pH7.6 ; 5mM MgCl₂; 5mM dithiothreitol ; 1mM ATP)에서 T4 DNA 리가아제로 25℃ 에서 12시간 동안 반응시킨 후 칼슘클로리드 (CaCl₂)로 처리된 이.콜라이 J.M109균주(Yanisch-Perron 등, Gene, 제33권, 103페이지, 1985년)를 형질전환시켰다. 앰피실린에 저항성을 지닌 형질전환된 균주를 앰피실린(50mg/ml)이 포함된 배지에서 선별하고 플라스미드 DNA를 분리하여 원하는 DNA의 삽입을 확인하고 pT-6 플라스미드를 분리하였다(제1도 참조).

(b) 락토오즈 오페론 억제단백질을 코우드화하는 서열(lacI)을 얻기위해 pINⅢ-AI 플라스미드 (Masui등, Bio/Technology, 제2권, 1페이지, 1984년) DNA 12ug을 완충용액II(50mM Tris-Cl, pH8.0 ; 10mM MgCl₂; 100mM NaCl)에서 37℃의 온도로 2시간 동안 PstI 및 SalI 제한효소로 분해한 후 0.8% 아가로즈 젤 전기 영동법에 의해 5.3kbp DNA단편을 분리하였다.(제1도 참조). Tac 전사 활성화 서열은 상기에서 제조된 pT-6 플라스미드 DNA 5ug을 완충용액II에서 37℃의 온도로 2시간 동안 PstI 및 SalI 제한효소로 분해한 후 1.2% 아가로즈 젤 전기 영동법에 의해 약 800bp의 Tac 서열을 포함하는 PstI-SalI DNA 단편을 분리하였다. 이 DNA 단편 20ug과 위의 5.3kbp PstI-SalI DNA단편 150ug을 완충용액III의 조건하에서 T4 DNA 라가아제로 10℃에서 12시간 동안 처리하여 PT-6IN 플라스미드를 제조하였다.(제1도 참조).위의 방법으로 제조된 PT-6IN 플라스미드는 Tac 전사 활성화 서열, EcoRI, BamHI, SalI 제한효소의 클로닝 부위 및 이.콜라이 락토오즈 억제인자를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 순서대로 전사, 해독 및 발현과정에 적합하도록 연결되어 있다(제1도 참조).

[실시예 2]

이.콜라이 베타갈락토시다제 효소의 아미노 말단을 코우드화하는 서열을 얻기 위해서 제2도 방법을 사용하였다. 베타갈락토시다제 효소의 유전자를 포함하는 플라스미드 pABG는 pASI 플라스미드(Rosenberg 등, Methods in Enzymology, 제101권, 123페이지, 1983년)와 pORFI 플라스미드(Weinstock 등, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 제80권, 4432페이지, 1983년)로부터 재조합 되었다. pASI 플라스미드 DNA를 PstI 및 BamHI 제한효소 절단하여 PL 프로모터를 포함하는 DNA 절편을 분리하고, 이것을 pORF1 플라스미드를 PstI 및 BamHI 제한효소로 절단하여 분리된 베타갈락토시다제 유전자를 포함하는 DNA 절편과 함께 연결하여 pABG 플라미드를 제조하였다.

베타갈락토시다제 효소의 전체 유전자가 삽입된 pABG 플라미드 DNA 3ug을 EcoRI, SalI 제한효소로 완충용액I에서 37℃의 온도로 2시간 동안 분해한 후 베타갈락토시다제의 아미노 말단을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 4.8kbp 단편을 0.8% 아가로즈 젤 전기영동법에 의해 분리하였다. pUC18 플라스미드(Yanisch-Perron등, Gene, 제33권, 103페이지, 1985년) DNA 2ug을 EcoRI, SstI 제한효소로 분해한 후 페놀 및 클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전법으로 회수하였다. 회수한 pUC18 DNA 400ng과 위에서 분리한 4.8kbp EcoRI-Sstl DNA단편 800ng을 완충용액III의 조건하에서 T4 DNA 리가아제로 10℃에서 12시간 반응 시키고 PL 전사 활성화 억제인자(CI rpre ssor) 유전자를 지닌 이.콜라이 균주 JM109(PRK-pressor)에 형질전환시킨 후 앰피실린에 저항성을 지닌 균주를 선택하였다(제2도 참조).이와같이 제조된 pPLCT(S) 플라스미드에 포함된 베타갈락토시다제 유전자 서열은 효모의 아미노 말단 650개 아미노산을 코우드할 수 있으며 그 뒤에 pUC18 플라스미드의 멀티링커 부위에서 유래한 여러 제한효소 부위가 존재하게 된다(제2도 및 제3도 참조). 베타갈락토시다제의 아미노 말단 부위의 길이를 좀 더 줄이기 위해 pPLCT(S) 플라스미드 DNA 4ug을 완충용액IV(15mM Tris-Cl, pH8.0 ; 15mM KCl, 6mM MgCl₂)에서 30℃의 온도로 2시간 동안 SmaI 제한효소로 분해한 후 페놀, 클로로포름의 추출 및 에탄올 침전법을 통해 회수한 DNA를 완충용액 V(20mM Tris-Cl, pH7.4 ; 20mM KCl, 10mM MgCl₂; 1mM DTT)에서 37℃의 온도로 30분간 부분 분해하여 0.8% 아가로즈젤 전기영동법으로 6.5Kbp DNA 절편을 분리한 후 완충용액 III의 조건하에서 T4 DNA 리가아제로 10℃에서 12시간 동안 처리하여 pPLCT(H) 플라스미드를 제조하였다.

pPLCT(H) 플라스미드에 포함된 베타갈락토시다제 효소의 유전자는 효소의 아미노 말단 354개 아미노산을 코우드할 수 있으며 그 뒤에 pUC18의 멀티링커에서 유래한 BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI, 및 HindII 제한효소 부위가 존재하게 된다(제2도 및 제3도 참조).

[실시예 3]

Tac 전사 화성화 서열과 이.콜라이 베타갈락토시다제 효소의 아미노 말단 650개 및 354개 아미노산을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열(lacZ')을 갖는 플라스미드를 제조하기 위해 제4도 및 제5도의 방법을 사용하였다. 실시예 1에서 제조된 PT-6IN 플라스미드 DNA 2ug을 완충용액II의 조건하에서 BamHI 제한효소로 분해하고 박테리아의 알칼라인 포스포타제(BAP)를 처리한 후 페놀과 클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전법을 거쳐 DNA를 회수하였다. 또한 실시예 2에서 제조된 pPLCT(H) 플라스미드 DNA 2ug을 BamHI으로 분해하고 1% 아가로즈 젤에서 전기영동법으로 분리하여 약 1.1kbp DNA 단편을 분리하였다.

분리된 DNA는 위에서 회수한 PT-6IN 플라스미드 DNA와 함께 완충용액III의 조건하에 T4 DNA 리가아제로 10℃에서 12시간 반응시킨 후 칼슘클로티드로 처리된 이.콜라이 JM109 균주를 형질전환시켰다. 엠피실린에 저항성을 지닌 균주를 선별하여 플라스미드 DNA를 분리하고 원하는 단편의 삽입을 확인한 후 pCT1이라 명명하였다(제4도 참조). 이와 같이 제조된 pCT1 플라스미드에서 Tac전사 활성화 서열과 이.콜라이 베타갈락토시다제 효소의 아미노 말단 650개 아미노산을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열(lacZ')을 포함하고 있으며, 그 뒷부분에는 SstI, KpnI, SmaI, BamHI, SalI 등의 제한효소 부위를 포함하고 있다.

플라스미드 pCT10은 pCT1 플라스미드와 같은 방법으로 제한되었는데 단지 pPLCT(S) 플라스미드에서 유래한 베타갈락토시다제 유전자(lacZ")를 사용하였으며(제5도 참조). 효소의 아미노 말단 354개 아미노산을 코우드할 수 있다는 점이 다르다.

[실시예 4]

베타갈락토시다제 효소의 아미노 말단의 길이를 보다 짧게 줄여서 융합 단백질을 생산할수 있는 발현벡터를 제조하기 위해서 제6도의 방법을 사용하였다. 실시예 3에서 제조된 pCT10 플라스미드 DNA 10ug을 완충용액II의 조건하에서 BamHI 제한효소로 부분분해한 후 두개의 BamHI 제한효소 자리중에서 한 자리만 분해된 DNA를 0.8% 아가로즈 젤 전기영동법에 의해 분리하였다. 분리된 DNA를 완충용액IV (50mM Tris-Cl, pH7.2 ; 10mM MgSO₂; 0.1mM DDT ; 50ug/ml bovine serum albumin ; 2nM dATP, dCTP, dGTP, TTP)의 조건에서 클리나우 효소로 20℃ 에서 30분동안 처리한후 페놀과 클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하였다. 회수된 DNA를 완충용액II의 조건하에서 SalI으로 분해하고 0.8% 아가로즈 젤 전기영동법에 의해 베타갈락토시다제 서열을 포함하는 약 7kbp DNA 단편을 분리하였다(제6도 참조). 또한 PINⅢ-AI 플라스미드 DNA 5ug을 완충용액I의 조건하에 EcoRI 제한효소로 분해하고 클리나우 효소로 반응시킨 후 SalI 제한효소로 분해하여 해독 정지화 서열을 포함하는 1.1kbp DNA 단편을 분리하였다(제6도 참조). 이 DNA 200ng과 위에서 회수한 pCT10 DNA 800ng을 완충용액III의 조건하에 T4 DNA 리가아제로 10℃에서 12시간 처리하여 pCT15 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드 pCT15 DNA를 완충용액 I의 조건하에 HindIII 와 ClaI 제한효소로 분해하고 완충용액 IV의 조건하에 클리나우 효소로 20℃에서 30분간 처리한 후 페놀, 클로로포름의 추출 및 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하였다. 회수된 DNA를 완충용액 II의 조건하에 T4 DNA 리가아제로 20℃에서 12시간 동안 처리하여 pCT20 플라스미드를 제조하였다(제6도 참조). 이와같은 방법으로 제조된 pCT20 플라스미드에는 Tac 전사 활성화 서열, 베타갈락토시다제 효소의 아미노 말단 280개 아미노산을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열(lacZ'"), 해독 정지화 서열, 및 락토오즈 오페론 억제단백질 유전자 서열(lacI) 이 순서대로 전사, 해독 및 발현 과정에 적합하도록 연결되어 있다(제3도 및 제6도 참조)

[실시예 5]

융합 단백질에서 베타갈락토시다제 효소 부위가 아미노 말단 200개 아미노산만을 포함하도록 하기 위해서 발현벡터 pCT30 을 제6도에서와 같이 제조하였다.

실시예 3에서 제조된 pCT10 플라스미드 DNA 5ug을 완충용액II의 조건하에서 BamHI 제한효소로 분해한 후 1% 아가로즈 젤 전기영동법으로 분리하여 베타갈락토시다제 서열을 포함하는 1.1kbp DNA 단편을 얻었다.

이 DNA 를 Sau3A 제한효소로 부분분해하고 1.2%아가로즈 젤 전기영동법으로 분리하여 600bp DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편은 베타갈락토시다제 효소의 아미노 말단 200개 아미노산을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이다(제3도참조). 이 DNA 단편을, BamHI 제한효소로 분해하고 포스포타제(BAP)를 처리한 pUC18 플라스미드 DNA와 함께 완충용액III의 조건하에서 T4 DNA 리가아제로 10℃에 12시간 반응시켜 pUCCT30 플라스미드(KCTC 8324P)를 제조하였다. pUCCT30 플라스미드 DNA를 완충용액II의 조건에서 BamHI 과 SalI 제한효소로 분해하고 1.2%아가로즈 젤 전기영동법으로 약 600bp DNA 단편을 분리하였다. 분리된 DNA 단편을 BamHI 과 SalI 제한효소로 분해한 pT-6IN 플라스미드 DNA와 함께 완충용액III의 조건에서 T4 DNA 리가아제로 연결시켜 pCT30 플라스미드를 제조하였다.(제3도 및 제7도 참조)

이와같이 제조된 pCT30 플라스미드에는 Tac 전사 활성화 서열, 베타갈락토시다제의 아미노 말단 300개 아미노산을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열(lacZ'") 및 락토오즈 오페론 억제단백질 유전자(lacI)가 순서대로 전사, 해독, 및 발현과정에 적합하도록 연결되어 있다(제3도 및 제7도 참조)

[실시예 6]

실시예 3,4,5에서 제조된 pCTL, pCT10, pCT20, pCT30 플라스미드 DNA를 이.콜라이 MC1061 균주(Casadaban 등, Methods in Enzymology, 제100권, 293페이지, 1983년)에 형질전환하기 위해서 칼슘클로리드(CaCl₂) 방법을 사용하였다.(Mandel 과 Higa, J. Mol. Biol., 제53권, 154페이지, 1970년). 형질전환된 균주를 X-gal(2% v/v)과 앰피실린(50mg/ml)이 포함된 배지에서 37℃로 16시간 동안 배양하여 푸른색의 콜로니를 일차선별한 후 이차적으로 플라스미드 DNA를 분리하여 제한효소 분해에 의한 분석방법에 의해 상기의 플라스미드를 갖는 이.콜라이 MC1061 균주를 선별하였다. 이 균주로부터 이.콜라이 베타갈락토시다제 폴리펩티드의 생성을 유도하기 위하여 다음의 방법을 실시하였다. 각 벡터를 포함하는 이.콜라이 MC1061 균주를 LB배지(1 1에 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g ; pH7.5)에서 37℃로 16시간 동안 배양한 후 이 배양액 1ml을 LB 배지 100ml에 접종하여 500ml 플라스크에서 배양하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 이소-프로필-베타-갈락토사이드(iso-propyl-B-D-galactoside, IPTG)를 최종 2mM이 되도록 넣어 폴리펩티드의 생성을 유도하였다. 유도후 6시간 동안 배양하여 8% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophore sis)방법에 의해 생성된 폴리펩티드를 확인하였다(제8도). 생성된 베타 갈락토시다제 아미노 말단 펩티드들은 SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 기대했던 분자량의 위치에 나타났으며 각각의 수율을 측정하기 위해 덴시토메트리스캔(densitometry scan)으로 측정한 결과 pCT1에 의해 생산된 베타갈락토시다제 펩티드는 총 세포 단백질의 25%, 그리고 pCT10과 pCT20에 의해서는 각각 총 단백질의 45%및 60%가 되도록 생산되었다(제9도 참조). pCT30의 경우는 벡터에 의해 코우드되는 베타갈락토시다제 펩티드가 이.콜라이 세포내에서 안정하게 발현되지 않지만 이 벡터에 발현을 원하는 대상 펩티드의 유전자를 연결시켜서 융합 단백질로 생산할 경우에는 펩티드의 길이가 길어지면서 융합 단백질 산물이 안정화하는 효과가 있다.

pCT30에 간염 바이러스의 프리-S2를 코우드화 하는 뉴클레오티드 서열을 연결시켜서 발현시켰을 경우 제8도의 11번 시료에서와 같이(pCTHB20 플라스미드 KCTC 8317p의 경우)융합 단백질 산물이 총 세포 단백질의 약 50% 정도로 늘어나게 된다.

Claims

전사 및 해독 활성화 서열, 폴립펩티드의 아미노말단 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열, 전사 및 해독 정지화 신호가 발현과정에 적합하도록 제조되는 발현벡터에 있어서, 재조합된 발현벡터를 숙주 미생물에 도입하였을때 발현 대상의 유전자 산물이 폴리펩티드의 아미노말단과 융합된 상태로 생산되도록 아미노 말달의 200,280 및 350개의 아미노산 서열들로서 이들 각 서열의 카르복시말단에 발현 대상의 펩티드가 연결하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제1항에 있어서, 전사 활성화 서열이 tac 전사 활성화 서열인 벡터.
제2항에 있어서, 폴리펩티드의 아미노 말단을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 이.콜라이 베타갈락토시다제의 아미노 말단 아미노산을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열인 벡터.
제3항에 있어서, 베타갈락토시다제의 뉴클레오티드 서열 다음부위에 여러개의 제한효소 부위가 존재하여 여러개의 발현대상 펩티드의 유전자를 삽입시킬 수 있는 벡터.
제4항에 있어서, 이.콜라이의 락토오스 오페론 억제 단백질을 코우드화하는 서열이 삽입되어 이.콜라이 숙주의 균주 제한이 없는 벡터.
제1,2,3,4 또는 제5항에 있어서, 폴리펩티드의 아미노말단 서열이 베타갈락토시다제의 아미노말단을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열로서 아미노말단의 아미노산이 각각 354개(HpaI부위), 280개(ClaI 부위) 또는, 200개(Sau3A 부위)인 뉴클레오티드 서열인 벡터.
제6항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 벡터.
효소의 아미노말단 354개 아미노산을 코우드할 수 있는 벡터 PCT10
Tac 전사 활성화 서열, 베타갈락토시다제 효소의 아미말단 280개 아미노산을 코우드화할수 있는 벡터 PCT20.
Tac 전사 활성화 서열, 베타갈락토시다제 아미말단 300개 아미노산을 코우드화할수 있는 벡터 PCT30.
간염 B형 바이러스의 pre-S₂부위를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 삽입된 PCTHB20 벡터.
제1,2,3,4,5,7,8,9,10,11항중 어느 하나의 벡터에 의해 형질 절환된 이.콜라이 균주.
전사 및 해독 활성화 서열, 폴리펩티드의 아미노말단 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열, 전사 및 해독 정지화 신호가 발현과정에 적합하도록 재조된 발현 벡터로서 이 재조합된 발현벡터를 숙주 미생물에 도입하였을때 발현대상의 유전자 산물이 폴리펩티드의 아미노 말단과 융합된 상태로 생산되는 것을 특징으로 하는 발현벡터의 제조방법.
제13항에 있어서, 전사 활성화 서열이 tac 전사 활성화 서열인 벡터의 제조방법.
제14항에 있어서, 폴리펩티드의 아미노말단을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 이.콜라이 베타 갈락토시다제의 아미노말단 아미노산을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열인 벡터의 제조방법.
제 15항에 있어서, 폴리펩티드의 아미노말단 서열이 베타갈락토시다제의 아미노말단을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열로서 아미노말단의 아미노산이 각각 354개(HpaI 부위), 280개(ClaI 부위) 또는 200개(Sau 3A 부위)인 뉴클레오티드 서열인 벡터의 제조방법.