JPH0367580A - ストレプトミセスｓｐ．Ｙ―１８３及びヒダントイナーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は新菌株であるストレプトミセスｓｐ。

Ｙ−１８３及びこれを利用するヒダントイナーゼ（ｌｌ
ｙｄａｎｔｏｉｎａｓｅ）の製造方法に関するものであ
る。

本発明により提供されるヒダントイナーゼはヒダントイ
ン誘導体を立体特異的に加水分解させ、Ｄ−Ｎ−カルバ
逅ルアミノ酸を作る酵素である。

ヒダントイナーゼによって製造されたＤ−Ｎ−カルバミ
ルアミノ酸は化学的な方法あるいはカバミラーゼの酵素
作用により望むＤ−アミノ酸に導くことができる。一方
、このようなアミノ酸等はβラクタム系抗生物質である
アモキシシリン（ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ）、アンピシ
リン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、セファレキシン（ｃｅ
ｐｈａｌｌｅｘｉｎ）等を製造するのに必要な中間物質
であるＤ−Ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンとＤ−フェ
ニルグリシン等の製造に使用される。

ヒダントイナーゼはジヒドロピリミジナーゼ（Ｄｉｈｙ
ｄｒｏｐｒｉｍｉｄｉｎａａｅ、　ＥＣ３，５，２，２
）に命名されることもあり、動物、植物、微生物等に広
く存在する。

〔従来技術〕

従来に知られているヒダントイナーゼ酵素の生産菌株と
してはストレプトミセス　ミタ力エンシス（ＡＴＣＣ１
５２９５）やシェードモナス　ストリアタ（ＩＦ０１２
９９６）等があり、これらの微生物を使用してＤ−Ｎ−
カルバミルアミノ酸を製造する方法（米国特許第４　、
２３７　、２２７号明細書〉も紹介されているが、工業
的な面でその生産性が不良であり、より優れた酵素活性
を有するヒダントイナーゼを生産する新菌株の確保が急
を要した。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明はこのような従来の問題点を解決し、高い酵素活
性を有する優れた菌株を確保するためのものであり、各
種の土壌から引き続き菌株スクリーニングを試み、従来
に知られている菌株に比べて酵素活性がはるかに高い高
収率のヒダントイナーゼを分離同定し、これを利用して
Ｄ−Ｎ−カルバミルアミノ酸を工業的な規模で安価に生
産することができることを見出して完成されたものであ
〔課題を解決するための手段〕 本発明による新菌株であるストレプト主セスＳｐ、Ｙ　
−１Ｂ　３　（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ｓｐ、Ｙ−１
８３）は韓国の京酸道平沢郡で採種した土壌から分離し
たものであって、１９８９年３月２４日付にて韓国科学
技術院遺伝工学センターの遺伝子銀行に寄託（寄託番号
：　ＫＣＴＣ８４５０Ｐ）され、また米国のＡＴＣＣに
も１９８９年９月７日付にて寄託された（寄託番号？Ａ
ＴＣＣ５３９４１）。

本発明者等が土壌から分離した菌株であるストレプトξ
セスｓｐ、Ｙ−１８３と公知のヒダントイナーゼ生産菌
株であるストレプト果セス　くタカエンシス（寄託番号
：ＡＴＣＣ１５２９５）に対してこれらの菌学的特性を
比較した結果、次のような差異点があった。

〔以下余白〕

以上で対比してみた通り、未発明によるストレプトミセ
スｓｐ、Ｙ−１８３は従来知られているヒダントイナー
ゼ生産菌株であるストレプトミセス　ミタ力エンシス（
ＡＴＣＣ１５２９５）と比較してみる場合、その菌学的
特性が互いに大きく異なるものであり、本発明者等はこ
れらを新菌株に分離同定した。

一方、本発明による新菌株であるストレプト逅セスｓｐ
、Ｙ−１８３から分離される酵素であるヒダントイナー
ゼは基質特性が特に高く、中性の天然型アミノ酸のヒダ
ントインには勿論、非天然型フェニルヒダントイン類に
も作用し、全てＤ型の基質のみが加水分解されて対応す
るＤ−Ｎ−カルバミルアミノ酸が生成される。

本発明によるヒダントイナーゼは次のような工程により
Ｄ−アミノ酸を製造することになる。即ち、アルデヒド
からブヒャラー（Ｂｕｃｈｅｒｅｒ）の方法によって５
位に置換基を有するヒダントイン誘導体を誘導し、ここ
にヒダントイナーゼを作用させ、Ｄ−Ｎ−カルバミルア
ミノ酸に加水分解させる。

この際、反応ｐｉを８〜９に維持すれば基質であるヒダ
ントインの化学的ラセミ化反応が共に進行するから、Ｄ
Ｌ−ヒダントインから定量的にＤ−Ｎ−カルバミルアミ
ノ酸の転換が可能である。これを酸性条件下で、亜硝酸
で処理すれば、定量的にＤ−アミノ酸が生成される。

以下、本発明による新菌株であるストレプトごセスｓｐ
、Ｙ−１８３を用いてヒダントイナーゼ。

を生産する方法を記述する。先ずグリセリンアスパラギ
ン寒天培地にストレプトミセスｓｐ、Ｙ−１８３を斜面
培地で成長させた後、種培養培地に１白金ル一プ接種さ
せて、３０°Ｃで２４時間の間、振盪培養してこれを０
．５〜ＩＶＶＭの通気量、４００〜６００ｒｐｍの撹拌
速度下で５％の割合で接種して、３０°Ｃ〜３５°Ｃ，
ｐＨ７，０で６０時間培養させる。

このように培養された溶液を遠心分離して菌体を回収し
、これを磨砕、超音波、自動分解等で処理して細胞抽出
液をつくる。

このようにして製造された粗酵素液に、３％プロタミン
サルフエイトを処理して核酸を除去させ、アンモニウム
サルフェイト分画を実施して酵素活性が高い４０〜６５
％分百を取って緩衝液に溶解させた後、４８時間の間透
析させる。

次いで、この酵素溶液をイオン交換樹脂に吸着させた後
、塩化ナトリウムで溶出させ、酵素活性が最も高い部分
のヒダントイナーゼを得る。

本発明においてヒダントイン誘導体等の加水分解程度を
調べるためにジヒドロウラシルと比較測定した結果、次
の表４と同様にＤＬ−５〜（ｐ　−ヒドロキシフェニル
）ヒダントインとＤＬ−５−フェニルヒダントイン等の
基質で高い活性を表した。

〔以下余白〕

表４　ストレプトミセスｓｐ。

Ｙ−１８３の基質特異性 且つ、精製されたヒダントイナーゼの活性に対する最適
ｐＨとｐＨ安定性の範囲を調査した結果、添付の第１図
及び第２図で見るように、最適ｐＨは８．８で、最も高
い酵素活性を表したし、ＰＨ７〜１０の範囲で安定性を
表した。この際、最適ｐｉとｐＨ安定性の範囲を測定す
る方法は各々公知の方法により実施した。

そして、第３図及び第４図で見るように、本発明による
ヒダントイナーゼは最適温度は４５℃付近で最も高い酵
素活性を表したし、温度安定性の範囲は４５℃までは安
定であったけれども５０″Ｃ以上で酵素活性を失い始め
た。最適温度及び温度安定性の範囲の測定は、各々公知
の方法により実施した。

一方、本発明においてヒダントイナーゼの酵素作用を阻
害する物質としては、金属キレート化合物である８−ヒ
ドロキシキノリン、１．１０−フェナントロリン等があ
るし、ＳＨ試薬であるｐクロロ水銀安息香酸（ｐ−ｃｈ
ｌｏｒｏ　ｍｅｒｃｕｒｙ　ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）
も酵素活性を胆害するものとして表れた。

〔以下余白〕

表５　酵素活性を阻害する物質及びその阻害率酵素の活
性を測定するためにはＤＬ−５−（２−メチルチオエチ
ル）ヒダントインを基質に使用して、ＰＨ８，０，３０
℃で２０分間反応させた後、パラジメチルアミノベンズ
アルデヒドで発色させて測定する。

この際、酵素ｌユニットは分当たり１マイクロモルのＮ
−カルバξルーＤ−メチオニンを生威する酵素の量で定
めた。

反応基質に使用するヒダントイン誘導体等の基質濃度は
０．１〜３０％の間で選ばれ、反応ｐＨは７〜１０であ
り、ＤＨが７以下である場合には反応率が非常に低くな
るが、これは反応ＰＨが低いと基質であるＤＬ−ヒダン
トイン誘導体のラセミ化反応が起こらないので、Ｎ−カ
ルバミル−Ｄ−アミノ酸の生成率が低くなるからである
。

従って、反応が進行するに応じて、反応液のｐＨが落ち
るので、適当な時間に反応液をアルカリ条件で維持させ
るためにアンモニア、炭酸ナトリウム等を加えるのが良
い。

反応温度は微生物の酵素種類により異なるが、２０℃〜
６０℃の温度で、振盪または撹拌条件下で遂行すること
が望ましい。

反応時間もまた、用いる微生物の種類により異なるが普
通５〜１００時間が適当である。

反応液で精製されたＤ−Ｎ−カルバミルアミノ酸を分離
する際は、アミノ酸の等電点を利用するが、イオン交換
樹脂を用いて分離する。

即ち、生成物がＮ−カルバξルーＤ−メチオニン、Ｎ−
カルバ壽ルーＤ−フェニルアラニンと同じく疎水性であ
るアミノ酸である場合には、反応液をまずＰＨ５に調節
した後、遠心分離して未反応基質や蛋白質のような不溶
性物質を除去させて、余液を更にｐＨ２〜４に補正させ
れば、望むＤ−Ｎ−カルバξルアミノ酸が沈澱する。

しかしながら、Ｎ−カルバξルーＤ−セリン、Ｎ−カル
バ逅ルーＤ−アラニンのような親水性であるアミノ酸を
分離しようとする時にはイオン交換樹脂を用いるのが良
い。

次いで、不溶性物質を除去した反応液を陰イオン交換樹
脂に通過させ、所望の物質を吸着させた後、希塩酸で溶
出させ、この溶出液を中性につくった後、減圧下で濃縮
させると、所望のアミノ酸が結晶化する。

〔実施例〕

以下実施例を挙げて、本発明をもっと詳細に説明すれば
次の通りである。

実施例１ 次のような培地組成にて出来上がった種培養培地を１０
０ｄずつ各々５分画に分け、ここに成長したストレプト
壽セスｓｐ、Ｙ−１８３の１白金ループを接種させた後
、３０℃で３０時間の間振盪培養する。

次いで、１４．５ｆｆｉｌｌ酵槽の醗酵培地ｌＯｌに接
種させ、ｐＨ７，０及び３０℃で０，５ＶＶＭ１７）通
気量と４０Ｏｒｐｍ撹拌速度下で６０時間培養する。

培養中、ｐＨは塩酸とアンモニアで維持する。

ｃ種培地の！ｌ１ｔｃ） 酵母エキス２．５　ｇ　、ソイトン（Ｓｏｙｔｏｎ）　
１５　ｇ−肉汁１ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、ジヒドロ
ウラシル３ｇ、塩化カリウム６ｇ、燐酸第２カリウム０
．２ｇ、塩化マンガン０．２　ｇ　、グリセロール１〇
−１蒸留水１ｊ！、ｐＨ７，０ （醗酵培地の組成） 酵母エキス１０ｇ、ジヒドロウラシル３ｇ１塩化カリウ
ム６ｇ、燐酸第２カリウム０．２ｇ、塩化マンガン０．
２ｇ、グリセロール１（ｌｄ、魚肉汁５ｇ、蒸留水１１
．ｐＨ７，０ この際、培養時間による酵素活性度は次の表６で分かる
ように４８時間培養した時最大酵素活性度を表した。

表６　培養時間による酵素活性度 実施例２ 使用菌株及び培養培地は、上記実施例１の種培養培地で
ジヒドロウラシルを加えない培地を使用すること以外は
実施例１と同一な方法にして、１０〇−三角フラスコに
２０ｍ培地を分株した後、ヒダントイン誘導体等を各々
６０■ずつ加えてｐＨ７，０で調節した後、１２１℃で
１５分間加圧滅菌する。

ここにグリセリンアスパラギン寒天培地で生育したスト
レプトミセスｓｐ、Ｙ−１８３の１白金ループを接種し
、３０℃で４８時間振盪培養した後、菌体を回収して酵
素活性度を測定した結果、表７のとおりジヒドロウラシ
ルを加えた培地でもっと高い酵素活性度を表した。これ
はジヒドロウラシルがヒダントイナーゼ酵素を生成する
のに必要な誘導物質であることを確認したし、醗酵培地
にも添加して、酵素活性を増加させた。

表７　酵素生成に及ぼす誘導体等の影響実施例３ 上記実施例１と同一な種培養培地を使用して、１００１
ｄ三角フラスコに２０ｄずつ培地を９株した後、ＰＨ７
，０にｍｊＩｆｆｔ、て１２１℃で１５分間加圧滅菌す
る。

次いでグリセリンアスパラギン寒天培地で生育したスト
レプト藁セスｓｐ、Ｙ−１８３の１白金ループを接種し
、３０℃で４８時間振盪培養する過程で燐酸第２カリウ
ムを各々１■、２■、４■ずつ２４時間、３６時間、４
８時間毎に加えて、ストレプトくセスＳＰ、Ｙ−１８３
の菌体増殖量を測定した結果、表８に示したように、２
■を１２時間毎に加える場合、もっと多くの菌体を得た
し、この際の酵素活性度もまた高かった。

表８　燐酸第２カリウム濃度に及ぼす菌体増殖の影響 実施例４ ストレプト逅セスｓｐ、Ｙ−１８３と公知菌株の酵素活
性を比較するために、ストレプトミセス属ｓｐ、Ｙ−１
８３とストレプトミセス　ξタカエンシスＡＴＣＣ１５
２９５は実施例１と同一な種培養培地を使用し、シェー
ドモナス　ストリアタＩＦ０１２９９６に対しては肉汁
２０ｇ、グリセロール６ｇ、ヒダントイン１ｇ１燐酸第
２力リウム２ｇ、硫酸マグネシウム１ｇ、塩化カルシウ
ム４０■、硫酸鉄２０■、硫酸マンガン２０■、硫酸銅
２０■、蒸留水ＩＩｌ、ｐＨ５，５である培地を使用し
て、１００ｄ三角フラスコに上記の培地を２０−９株し
た後、ｐＨを調節し１２１℃で１５分間加圧滅菌した後
、生育した各々の種菌を１白金ループで接種した。

また、シュードモナス　ストリアタＩＦ０１２９９６で
ある場合は３０℃で２４時間振盪培養した後、菌体を回
収して酵素活性を測定し、ストレプトミセスｓｐ、Ｙ−
１８３とストレブトミセスミタカエンシスＡＴＣＣ１５
２９５を３０℃で４８時間振盪培養した後、菌体を回収
して酵素活性を測定した結果、表９のとおり本発明の菌
株が最も高い酵素活性を表した。

表９　ストレプトミセスｓｐ、Ｙ−１８３と公知菌株の
酵素活性比較 ゛実施例５ 実施例１の種培養培地及び醗酵培地と同一な培地を使用
して１０１の醗酵培地で４８時間培養させたストレプト
ミセスｓｐ、Ｙ−１８３の菌体を３０、０ＯＯｒｐ−で
２０−分間遠心分離して回収し、回収した菌体（４００
ｇ）を２０ｍＭ燐酸ａ燐酸緩衝溶液８．０）で洗浄した
後、更に燐酸緩衝溶液（２ｆｆｉ％ｐＨ８，０）に懸濁
させ、超音波磨砕機を用いて４時間の間菌体を破砕させ
る。

この破砕された菌体液を遠心分離して、菌体箔を除去し
た後、上澄液（２，２７りを粗酵素液に使用して、以下
全操作を４°Ｃで実施する。

この粗酵素液に３％プロタミンサルフエイト溶液を０．
１％加えて、３０分間撹拌させた後、遠心分離して核酸
を除去し、限外濾過器を用いて０．５１に濃縮させた。

濃縮された粗酵素液に、硫酸アンモニウムを加えて４０
〜６５％の分画を取った後、遠心分離して得た沈澱物を
２０ｍＭ燐酸緩衝液に溶かし、同一な緩衝溶液で４８時
間透析させた。

透析した酵素液を、予め２０ｍＭ　　ＴＲｌ５−ＨＣＬ
緩衝溶液（ｐＨ５，０）で平衡させたＤＥＡＥ−３ＥＰ
ＨＡＲＯ５Ｉ！　ＣＬ　−６Ｂカラム（１６φＸ４０Ｃ
１１）に吸着させた後、５０ｍＭ　　ＴＲｌ５−ＨＣＬ
ＩＩ衝液で洗浄し、同緩衝液を含有する１００ｍＭ、′
１ ２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭの塩
化ナトリウム濃度に溶出させた後、酵素活性が高い部分
（４００ｍＭ）を集めて同一な１ｍｍ液液透析させ、精
製された酵素液を得た。

次の表１Ｏは精製結果を表したもので、粗酵素液から約
９倍の酵素活性を増加させた。

〔以下余白〕

表１０ ヒダントイナーゼの精製度 〔作用・効果〕 本発明によるヒダントイナーゼ生産性の新菌株ストレプ
ト暑セスｓｐ、Ｙ−１８３は、従来のヒダントイナーゼ
生産菌株に比べて酵素活性がはるかに優れたヒダントイ
ナーゼを生産することができるので、本発明による新菌
株を利用すればβ−ラクタム系抗生物質の合成中間物質
の原料として使用するＤ−Ｎ−カルバミルアミノ酸を工
業的に安価で生産することが可能となるのである。

【図面の簡単な説明】

第１１！Ｉはヒダントイナーゼの活性に対する最適ｐＨ
を表した図面、第２図はヒダントイナーゼの活性に対す
るｐＨ安定性の範囲を表した図面、第３図はヒダントイ
ナーゼの活性に対する最適温度を表した図面、第４図は
ヒダントイナーゼの活性に対する熱安定性の範囲を表し
た図面である。 第１図 第２図 ０ ０ ０ ０ ０ ０ ００ （ＰＩ−１） 第３図 刃 ４０　　　　５０ （０Ｃ） ０ 宙斗図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒダントイナーゼ生産能を有するストレプトミセ
   スｓｐ．Ｙ−１８３。
2. （２）ヒダントイナーゼはＤＬ−５−フェニルヒダント
   ンとＤＬ−５−（Ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダントイ
   ンに対して特異的に９０％以上の相対活性を表わすこと
   を特徴とする請求項１記載のストレプトミセスｓｐ．Ｙ
   −１８３。
3. （３）ストレプトミセスｓｐ．Ｙ−１８３を培養するこ
   とを特徴とするヒダントイナーゼの製造方法。
4. （４）培養における醗酵培地は０．３％のジヒドロウラ
   シルが含有されていることを特徴とする請求項３記載の
   ヒダントイナーゼの製造方法。