JPH0361479A - 微生物の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物の培養方法に関し、さらに詳しくは、構
造遺伝子の上流にトリプトファンプロモーターを含むプ
ラスミドを保有するエシェリヒア・コＩＪ　Ｋ　−１２
系株を効率よく培養するための新規な方法に関する。

トリプト７アンプロモーターを含むプラスミドで形質転
換されｌ：大腸菌を培養するに際し、培地にインドール
アクリル酸を添加することにより、トリプトファンプロ
モーターの下流に導入された構造遺伝子の発現抑制が解
除されることは知られている（特開昭６０−８７７８４
号公報）。しかしながら、インドールアクリル酸は微生
物菌体の増殖を阻害するため、トリプトファンプロモー
ターを含むグラスミド′で形質転換された大腸菌を高発
現（目的とする酵素を著量産生させること。以下同じ）
状態に保ちつつ高密度で培養することは困難であった。

本発明者らは、この困難を克服すべく鋭意検討を重ねた
結果、今回、構造遺伝子の上流側にトリプトファンプロ
モーターを含むプラスミドを保有するエシェリヒア・コ
リに一１２系株を培養するに際し、培養の対数増殖中期
ないし後期に培地にインドールアクリル酸を添加した後
、培養温度を２８〜３４℃の範囲内に保持することを特
徴とする培養方法を見い出すに至った。　かかる本発明
の方法によれば、構造遺伝子の高発現状態を保持しつつ
上記微生物菌株を高密度で培養することが可能となり、
該構造遺伝子に対応する酵素を著量産生せしめることが
できる。

以下、本発明の方法をさらに詳しく説明する。

本発明の方法を適用しうる微生物は、工業的に有用な酵
素およびホルモン等をコードする構造遺伝子の上流側に
トリプトファンプロモーターを含むプラスミドを保有す
るニジエリピア・コリ（Ｅｓｅｈ＋ｅｌｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ）Ｋ　−１２系株であり、具体的には例えば、ト
リプトファンプロモーターの下流側に構造遺伝子として
ｔｒｐＡ　ｔｒｐＢ（ｌ−リブトファンシンターゼ遺伝
子）を含むプラスミドを保有するエシェリヒア・コリに
−１２ＹＫ−２００９（ＦＥＲＭ　　ｐ−７９５７）及
び同ＹＫ２０１４（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８３２８）などが
挙げられる。

これら微生物を培養するための培地としては、大腸菌の
培養に通常用いられる培地の中から、個々の微生物に適
した組成の培地を適宜選択して使用することができる。

かくして、炭素源としては、例えばグルコース、グリセ
ロール、７ラクトース、／ユクロース、糖蜜等の炭水化
物が挙げられ、また、窒素源としては、例えば塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の
アンモニラ１．塩：硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝
酸アンモニウム等の硝酸塩：アンモニア等が好適に用い
られ、さらに無機物としては、例えばリン酸カリウｌ４
、硫酸マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等を使用する
ことができる。さらに必要に応じて、ビタミン、アミノ
酸等の栄養源を添加することもできる。

培養中の培地のｐＨとしては一般に６へ・９、好ましく
は７〜８の範囲内が適しており、培地のｐＨの調節は培
地７こ酸性又はアルカリ性物質を添加することにより行
なうことができる。用いうる酸性物質としては、例えば
硫酸、塩酸、酢酸等の水溶液が挙げられまたアルカリ性
物質としては、例えばアンモニア氷や水酸化ナトリウム
、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の水溶液を用い
ることができる。

培養は通常、通気撹拌条件下に好気的に行なうことがで
きる。

本発明の方法においては、培地にインドールアクリル酸
が添加される。その添加時期は、培養の対数増殖中期か
ら後期までの間（大体培養開始から３〜８時間の間）で
あり、その間の任意の時点にインドールアクリル酸を添
加することができるが、一般には、４〜６時間の時点に
添加するのが好都合である。その添加量は一般には１０
〜３００−ｙ９／　！２、好ましくは２５−２００ｍｌ
／Ｑの範囲内とすることができる。

培養温度は、インドールアクリル酸を添加するまでは３
５〜３７℃の範囲内が好適であり、添加後はそれより若
干低目、すなわち２８〜３４℃、好ましくは３０〜３３
°Ｃの範囲内の温度に保持しつつ培養を行なうのが望ま
しい。

以上に述べた本発明の方法によれば、構造遺伝子の上流
側にトリプトファンプロモーターを含むプラスミドを保
有するエシェリヒア・コリに一１２系株を上記構造遺伝
子の高発現状態を保ちなから高密度で培養することがで
き、該構造遺伝子こ対応する酵素を高収量で産生ずるこ
とが可能となり、工業的に極めて有利である。

次に実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ 下記第１表に示す組成の培地５０ｎ＋４を５００ｍ／′
用三角フラスコに分注し、ｉ　２０　’ｃで１５分間滅
菌処理したものに、エシェリヒア・コリに一１２ＹＫ−
２００９（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７９５７）を−白金耳型植
菌し、さらに１２０℃で１０分間滅菌した５０％グルコ
ース溶液２−を添加した。次いで３７℃にて１日間振盪
培１１（前項１り後、１２０　’Ｃで１５分間滅菌処理
した同培地１００１００Ｏを含む２Ｑ容通気撹拌槽に滅
菌済５０％グルコース溶液２０ｍＱを添加し、前培養物
２０ｍｆｆを植菌し、３７°Ｃ，ｐＨ７，２（２５％ア
ンモニア水で調整）で培養を開始した。なお、グルコー
スは、培養中培養液中の濃度が０．１〜２　（ｗｔ／　
ｖｏｌ）％どなるように逐次添加した。撹拌回転数はｔ
ｏｏ。

ｒｐｍとし、通気量は始発ＩＶＶＭに調整した。培養開
始後、６時間後にインドールアクリル酸を１００ｍ７／
Ｑの濃度で添加した後、培養温度を実験区の温度に低下
させ、引き続き１４時間培養を行った。培養終了後、培
養液５００ｍＱから遠心分離（８０００ｒｐｍ、　２０
分間、４°Ｃ）により回収された湿菌体の重量およびト
リプト７アンシンターゼ比活性を測定した。結果は対照
として培養温度３７°Ｃで培養した場合をｌＯＯとする
相対値で示した。結果を下記第２表に示す。

第１表 （ＮＨ４）２ＳＯ４３ｉ ＫＨ，Ｐｏ、　　　　　　　　　　　　　　５　　＃Ｋ
ｚＨＰＯ４５Ｊ／ Ｍ２ＳＯ４４ＨｚＯＱ、４ｎ ＦａＳＯ，−７Ｈ２０Ｑ、ｌｎ 酵母エキス　　　　　　　　ｌ　〃 ペプトン　　　　　　　　　ｌ　〃 蒸留水　　　　　　　　　１０００　　ｍＱ（ｐＨ７，
２） なお、トリプトファンシンターゼ比活性は、一定時間培
養後の菌体を遠心分離して集菌し、１００ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，８）にて−度洗浄後、湿菌体２００
ｍｊを秤量し、同緩衝液１ｌＴＩＩｌを添加後、菌体破
砕装置（ブランソン２００）にて菌体を破砕したのち、
遠心分離（１２０００ｒｐｍ。

４０分間、４°Ｃ）により得た上澄液を常法通りＹａｎ
ｏｆｓｋｙらの方法［Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ。

５．７９４　（１９６’２）参照１に従い測定した。

第２表 実施例２ 菌株をエシェリヒア・コリに−１２ＹＫ−２０１４（Ｆ
ＥＲＭ　　Ｐ−８３２’８）を使用する以外は実施例１
と同様の実験を行った。結果は第３表に示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 構造遺伝子の上流にトリプトファンプロモーターを含む
   プラスミドを保有するエシエリヒア・コリＫ−１２系株
   を培地で培養するに際し、培養の対数増殖中期ないし後
   期に培地にインドールアクリル酸を添加した後、培養温
   度を２８〜３４℃の範囲内に保持することを特徴とする
   培養方法。