JPH0359079B2 - - Google Patents
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- JPH0359079B2 JPH0359079B2 JP63098801A JP9880188A JPH0359079B2 JP H0359079 B2 JPH0359079 B2 JP H0359079B2 JP 63098801 A JP63098801 A JP 63098801A JP 9880188 A JP9880188 A JP 9880188A JP H0359079 B2 JPH0359079 B2 JP H0359079B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- huti
- cyanogen bromide
- trypsin
- reaction
- trypsin inhibitor
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は新規な人尿性トリプシンインヒビター
誘導体及びその製造方法に関するものであり、更
に詳しくは人尿性トリプシンインヒビター（以下
HUTIと略記する）分子中のメチオニル結合を臭
化シアンで切断したことを特徴とする人尿性トリ
プシンインヒビター誘導体（以下Ｍ−HUTIと略
記）に関する。 生体内における細胞組織の病態変化の１つであ
る炎症にプロテアーゼが関与することから〔コー
ルマン、ダブリユ．クリニカル フアルマコロジ
ーアンド セラピユーテイツクス（Colman、W.
Clinical Pharmacology and Therapeutics６、
598、1965年）〕、従来より多くのプロテアーゼイ
ンヒビターが抗炎症治療剤として用いられてい
る。ところがこれらプロテアーゼインヒビターの
殆んどは動物や植物に由来する異種蛋白であるた
め、抗原性を有し、頻回投与によつては、しばし
ば、発熱やアレルギー反応を起すことに問題があ
る。このことから、発明者らは、人由来のプロテ
アーゼインヒビターの医薬品化のため、永年種々
の検討を行つてきた。その結果、古くから知られ
ている人尿中のトリプシンインヒビター〔ジエ
イ．バーナー等、メデイチイニツシエ クリニク
（J.Baner et al、Medizinische Klinik46、1909、
1744年）〕が有用と考え、このものを工業的規模
で分離精製し、人由来で抗原性の心配のない、抗
炎症治療剤として開発した（特開昭51−123810）。 このHUTIの阻害活性はトリプシンやキモトリ
プシンに対し極めて特異的に効果を発揮するが、
プラスミン、カリクレイン及びヒアルロニダーゼ
等に対しては若干弱いことがわかつた。そのた
め、症例によつては良好な投与効果を得るのに、
大量投与あるいは長期間の反復投与を行なわねば
ならないこともありうる。 このことから、発明者らはHUTIのプラスミ
ン、カリクレイン及びヒアルロニダーゼ等に対す
る阻害活性を強くし、かつまた阻害スペクトルを
拡大させる研究を行ない、種々検討を重ねてきた
結果、HUTI分子中のメチオニル結合の臭化シア
ンで切断した修飾人尿性トリプシンインヒビター
（以下Ｍ−HUTIと言う）がもとのHUTIに比べ、
種々のプロテアーゼに対しより強い阻害能を有す
ること、そしてより効果的な抗炎症作用を示すこ
とを見い出し、これら新知見に基づいて本発明を
完成するに至つた。 本発明はHUTI分子中のメチオニル結合を臭化
シアンで切断させた分子量が62000±5000、糖含
量が約10％（グルコース換算）、等電点がPH2.5〜
4.5の化学修飾HUTI及びその製造方法からなる。
このものは、もとのHUTIに比べ強い酵素阻害能
を有し、その製法はメチオニル結合を臭化シアン
で切断することを特徴とするものである。 尚、分子量、糖含量及び等電点は以下の方法に
よつた。 分子量の測定法：セフアデツクス G75［フアル
マシア社製高分子（デキストリン系）ゲル物
質］の溶出位置により、ヒト血清アルブミン、
オボアルブミン、トリプシンインヒビター及び
大豆を分子量標準品として、求める。 糖含量の測定法：グルコースを標準品として、糖
のフエノール硫酸反応による比色法によつて定
量を行う。 等電点の測定法：等電点電気泳動法を行い、標準
マーカーの泳動距離との比較から求める。 本発明に用いるHUTIは、新鮮尿あるいは尿中
から精製されたHUTIであり、又医療上有用な成
分、例えばウロキナーゼ、ウロクレイン等を抽出
した後の尿より精製されたものでもよい。この
HUTIの分子量はセフアデツクスＧ−75によるゲ
ル濾過分析の結果、約66000±5000と推定され、
糖含量は硫酸フエノール法によつて調べた結果、
グルコース換算で10％あり、デンプンゲル電気泳
動法（Starch gel electrophoresis）（トリス−ホ
ウ酸緩衝液、PH8.6）ではプレ・アルブミンに位
置する単一成分である。そして等電点はPH2.5〜
4.5である。 本発明の化学修飾は臭化シアンが酸性PH中で蛋
白質分子中のメチオニル結合と極めて特異的に、
ほぼ定量的に反応し、切断する（Cross、E.、
and B.Witkop.、：J.Biol.chem.、237．1856
1962年）と言う公知の事実に基づく。 このメチオニル結合と臭化シアンとの反応及び
その切断機構は次の式に示す通りである。 この反応は、完結段階まで迅速に進行し、反応
が終了した反応液中には上記式のメチオニンシア
ノスルホニウム誘導体やホモセリンのイミノ−γ
−ラクトン誘導体の中間体は全く認められず、メ
チオニル結合切断によつて新しくホモセリンある
いはホモセリンラクトンをＣ未満とするタンパク
あるいはペプタイドと新たにＮ未満をもつタンパ
クあるいはペプタイド、それに揮発性メチルチオ
シアナートと臭化水素とが生成する。 本発明のHUTI分子中のメチオニル結合切断法
及びＭ−HUTIの精製方法の概略は下記のとおり
である。乾燥HUTIを70％ギ酸、0.1N塩酸ある
いは70％トリフルオロ酢酸で0.1〜10％（ｗ／ｖ）
となるように溶解する。そして臭化シアンを乾燥
HUTI1mgに対し0.1〜20mgの割合で添加し10〜50
℃にて密栓状態で１〜60時間反応させる。反応終
了後トリプシン阻害活性を有しないペプチド、メ
チルチオシアナート及び過剰の臭化シアンを分離
して目的とするＭ−HUTIを回収する。回収には
公知のゲル濾過法、分子篩別法、あるいはトリプ
シン−セフアロースのアフイニテイクロマトグラ
フ法（特開昭51−123810）による方法がある。ゲ
ル濾過法で分画した場合はＭ−HUTIと、トリプ
シン阻害活性を有しないペプチド、メチルチオシ
アナート及び過剰の臭化シアンとがきわめて明瞭
な差異を持つて挙動することから、目的とする結
合物の回収を容易に行いうる。図面はセフアデツ
クスＧ−75によるゲル濾過における各成分の挙動
を示す。 回収したＭ−HUTIは、除菌濾過及びHBsAg
不活性のための加熱処理等を行なつたのち分注
し、凍結乾燥してＭ−HUTIの注射用乾燥製剤を
得る。 このようにして得たＭ−HUTIの糖含量は硫
酸・フエノール法でもとのHUTI同様グルコース
換算で10％で、デンプンゲル電気泳動によつても
もとのHUTI同様にプレアルブミンの位置に単一
な成分として泳動された。一方Ｍ−HUTIの等電
点はPH2.5〜4.5で、分子量はセフアデツクスＧ−
75によるゲル濾過分析の結果、もとのHUTIのそ
れに比べわずかに低く、62000±5000と推定され
た。またＭ−HUTIに比活性は2300〜2800μｇト
リプシン阻害単位／mg蛋白でもとのHUTIの比活
性（1900〜2300μｇトリプシン阻害単位／mg蛋
白）に比べ約1.2倍高くなつていた。 本発明のＭ−HUTIについてトリプシンの他キ
モトリプシン、プラスミン、カリクレイン、ヒア
ルロニダーゼ、トロンビン、プロトロンビン及び
エラスターゼに対する阻害作用をもとのHUTIの
それと比較した。その結果は表１に示す如くであ
る。本発明のＭ−HUTIはもとのHUTIに比べプ
ラスミン、カリクレイン、ヒアルロニダーゼ及び
プロトロンビンの酵素に対し強い阻害作用を有し
さらに、トロンビンをも阻害した。
誘導体及びその製造方法に関するものであり、更
に詳しくは人尿性トリプシンインヒビター（以下
HUTIと略記する）分子中のメチオニル結合を臭
化シアンで切断したことを特徴とする人尿性トリ
プシンインヒビター誘導体（以下Ｍ−HUTIと略
記）に関する。 生体内における細胞組織の病態変化の１つであ
る炎症にプロテアーゼが関与することから〔コー
ルマン、ダブリユ．クリニカル フアルマコロジ
ーアンド セラピユーテイツクス（Colman、W.
Clinical Pharmacology and Therapeutics６、
598、1965年）〕、従来より多くのプロテアーゼイ
ンヒビターが抗炎症治療剤として用いられてい
る。ところがこれらプロテアーゼインヒビターの
殆んどは動物や植物に由来する異種蛋白であるた
め、抗原性を有し、頻回投与によつては、しばし
ば、発熱やアレルギー反応を起すことに問題があ
る。このことから、発明者らは、人由来のプロテ
アーゼインヒビターの医薬品化のため、永年種々
の検討を行つてきた。その結果、古くから知られ
ている人尿中のトリプシンインヒビター〔ジエ
イ．バーナー等、メデイチイニツシエ クリニク
（J.Baner et al、Medizinische Klinik46、1909、
1744年）〕が有用と考え、このものを工業的規模
で分離精製し、人由来で抗原性の心配のない、抗
炎症治療剤として開発した（特開昭51−123810）。 このHUTIの阻害活性はトリプシンやキモトリ
プシンに対し極めて特異的に効果を発揮するが、
プラスミン、カリクレイン及びヒアルロニダーゼ
等に対しては若干弱いことがわかつた。そのた
め、症例によつては良好な投与効果を得るのに、
大量投与あるいは長期間の反復投与を行なわねば
ならないこともありうる。 このことから、発明者らはHUTIのプラスミ
ン、カリクレイン及びヒアルロニダーゼ等に対す
る阻害活性を強くし、かつまた阻害スペクトルを
拡大させる研究を行ない、種々検討を重ねてきた
結果、HUTI分子中のメチオニル結合の臭化シア
ンで切断した修飾人尿性トリプシンインヒビター
（以下Ｍ−HUTIと言う）がもとのHUTIに比べ、
種々のプロテアーゼに対しより強い阻害能を有す
ること、そしてより効果的な抗炎症作用を示すこ
とを見い出し、これら新知見に基づいて本発明を
完成するに至つた。 本発明はHUTI分子中のメチオニル結合を臭化
シアンで切断させた分子量が62000±5000、糖含
量が約10％（グルコース換算）、等電点がPH2.5〜
4.5の化学修飾HUTI及びその製造方法からなる。
このものは、もとのHUTIに比べ強い酵素阻害能
を有し、その製法はメチオニル結合を臭化シアン
で切断することを特徴とするものである。 尚、分子量、糖含量及び等電点は以下の方法に
よつた。 分子量の測定法：セフアデツクス G75［フアル
マシア社製高分子（デキストリン系）ゲル物
質］の溶出位置により、ヒト血清アルブミン、
オボアルブミン、トリプシンインヒビター及び
大豆を分子量標準品として、求める。 糖含量の測定法：グルコースを標準品として、糖
のフエノール硫酸反応による比色法によつて定
量を行う。 等電点の測定法：等電点電気泳動法を行い、標準
マーカーの泳動距離との比較から求める。 本発明に用いるHUTIは、新鮮尿あるいは尿中
から精製されたHUTIであり、又医療上有用な成
分、例えばウロキナーゼ、ウロクレイン等を抽出
した後の尿より精製されたものでもよい。この
HUTIの分子量はセフアデツクスＧ−75によるゲ
ル濾過分析の結果、約66000±5000と推定され、
糖含量は硫酸フエノール法によつて調べた結果、
グルコース換算で10％あり、デンプンゲル電気泳
動法（Starch gel electrophoresis）（トリス−ホ
ウ酸緩衝液、PH8.6）ではプレ・アルブミンに位
置する単一成分である。そして等電点はPH2.5〜
4.5である。 本発明の化学修飾は臭化シアンが酸性PH中で蛋
白質分子中のメチオニル結合と極めて特異的に、
ほぼ定量的に反応し、切断する（Cross、E.、
and B.Witkop.、：J.Biol.chem.、237．1856
1962年）と言う公知の事実に基づく。 このメチオニル結合と臭化シアンとの反応及び
その切断機構は次の式に示す通りである。 この反応は、完結段階まで迅速に進行し、反応
が終了した反応液中には上記式のメチオニンシア
ノスルホニウム誘導体やホモセリンのイミノ−γ
−ラクトン誘導体の中間体は全く認められず、メ
チオニル結合切断によつて新しくホモセリンある
いはホモセリンラクトンをＣ未満とするタンパク
あるいはペプタイドと新たにＮ未満をもつタンパ
クあるいはペプタイド、それに揮発性メチルチオ
シアナートと臭化水素とが生成する。 本発明のHUTI分子中のメチオニル結合切断法
及びＭ−HUTIの精製方法の概略は下記のとおり
である。乾燥HUTIを70％ギ酸、0.1N塩酸ある
いは70％トリフルオロ酢酸で0.1〜10％（ｗ／ｖ）
となるように溶解する。そして臭化シアンを乾燥
HUTI1mgに対し0.1〜20mgの割合で添加し10〜50
℃にて密栓状態で１〜60時間反応させる。反応終
了後トリプシン阻害活性を有しないペプチド、メ
チルチオシアナート及び過剰の臭化シアンを分離
して目的とするＭ−HUTIを回収する。回収には
公知のゲル濾過法、分子篩別法、あるいはトリプ
シン−セフアロースのアフイニテイクロマトグラ
フ法（特開昭51−123810）による方法がある。ゲ
ル濾過法で分画した場合はＭ−HUTIと、トリプ
シン阻害活性を有しないペプチド、メチルチオシ
アナート及び過剰の臭化シアンとがきわめて明瞭
な差異を持つて挙動することから、目的とする結
合物の回収を容易に行いうる。図面はセフアデツ
クスＧ−75によるゲル濾過における各成分の挙動
を示す。 回収したＭ−HUTIは、除菌濾過及びHBsAg
不活性のための加熱処理等を行なつたのち分注
し、凍結乾燥してＭ−HUTIの注射用乾燥製剤を
得る。 このようにして得たＭ−HUTIの糖含量は硫
酸・フエノール法でもとのHUTI同様グルコース
換算で10％で、デンプンゲル電気泳動によつても
もとのHUTI同様にプレアルブミンの位置に単一
な成分として泳動された。一方Ｍ−HUTIの等電
点はPH2.5〜4.5で、分子量はセフアデツクスＧ−
75によるゲル濾過分析の結果、もとのHUTIのそ
れに比べわずかに低く、62000±5000と推定され
た。またＭ−HUTIに比活性は2300〜2800μｇト
リプシン阻害単位／mg蛋白でもとのHUTIの比活
性（1900〜2300μｇトリプシン阻害単位／mg蛋
白）に比べ約1.2倍高くなつていた。 本発明のＭ−HUTIについてトリプシンの他キ
モトリプシン、プラスミン、カリクレイン、ヒア
ルロニダーゼ、トロンビン、プロトロンビン及び
エラスターゼに対する阻害作用をもとのHUTIの
それと比較した。その結果は表１に示す如くであ
る。本発明のＭ−HUTIはもとのHUTIに比べプ
ラスミン、カリクレイン、ヒアルロニダーゼ及び
プロトロンビンの酵素に対し強い阻害作用を有し
さらに、トロンビンをも阻害した。
【表】
【表】
阻害効果：
：極めて効果大 ：効果大 ＋：相当効
果あり ±：効果あり −：効果なし
このようなことから本発明のＭ−HUTIは人体
内のプロテアーゼ類が関係する生体内の種々の炎
症反応をもとのHUTIに比べ強く阻害し、そして
前記反応によつて起る各種疾患に対してもより優
れた治療効果を示唆するものであつた。 次にエチオニンで実験的に膵炎を起させた犬及
びホルマリンで実験的に炎症を起させたウイスタ
ー系ラツトをそれぞれ用い、本発明のＭ−HUTI
の抗膵炎作用と抗炎症作用をもとのHUTIのそれ
と比較した。その結果表２、表３に見られるよう
にＭ−HUTIはもとのHUTIに比べ少量投与で膵
炎及び肉芽腫形成の抑制効果を示した。このこと
からＭ−HUTIが抗炎症治療剤としてもとの
HUTIのそれに比べ優れた効果を発現することが
期待できる。 本発明によつて得たＭ−HUTIの急性毒性試験
をウイスター系ラツトの尾静脈内投与により調べ
るため、体重１Kgにつき80000μｇトリプシン阻
害単位を静注し投与後７日にわたつて一般症状の
観察と体重測定を行つたところ、体重は順調に増
加して全く異常所見は認められなかつたし、剖検
ならびに組織学的検査の結果も全く異常は認めら
れなかつた。 本発明に係るＭ−HUTIの臨床使用における投
与量および投与方法は、犬の実験的膵炎およびラ
ツトの抗炎症作用の薬理実験の成績から50〜
500μｇトリプシン阻害単位／Kg／日で静脈内注
射により行う。これにより、十分に治療効果を上
げるものと考えられる。 本発明に係るＭ−HUTIは、もとのHUTIに比
べ比活性は高く、又、抗プラスミン、抗カリクレ
イン及びヒアルロニダーゼ作用が強くその上抗ト
ロンビン作用を持つ、トリプシンインヒビターで
ある。このものは、低濃度で抗炎症作用を示し、
毒性をほとんど示さない優れた特性を有し、従来
にない極めて有用性の高い医薬品である。 以下に製剤の調整例について例を挙げて説明す
る。尚、いずれの例についても活性回収率は80％
以上であつた。 製造例 １ 乾燥HUTI5ｇを70％ギ酸0.5に溶解し、臭化
シアン５ｇを加え室温で15時間、密栓状態で反応
させる。反応終了後、反応混合液をセフアデツク
スＧ−75のカラムにかけてゲル濾過し、Ｍ−
HUTIと、過剰の臭化シアン、その他の反応生成
物とを分別する。 このようにして分離したＭ−HUTI画分を集
め、ミリポア ・フイルター（ミリポア社製限外
濾過用フイルター）による除菌濾過を行い、トリ
プシン阻害単位を測定して、分注量を決めたの
ち、所定量を小分け分注し、凍結乾燥を行い、Ｍ
−HUTI製剤を得る。この製剤は前述したＭ−
HUTIの種々の特性を保有していた。 製造例 ２ 乾燥HUTI2ｇを70％ギ酸１に溶解し、臭化
シアン２ｇを加え、室温で20時間、密栓状態で反
応させる。反応終了後、反応混合液に10倍量の蒸
留水を加え、凍結乾燥を行い、過剰の臭化シアン
と揮発性の反応生成物とを除去し、次にトリプシ
ン−セフアロース（セフアロース ［（フアルマ
シア社製アガロースゲル）を用いて自己調製にＭ
−HUTIを吸着させて、阻害活性を示さないペプ
チドを除去する。吸着したＭ−HUTIを溶出し回
収する。その後製造例１と同様にＭ−HUTIを除
菌濾過し分注・凍結乾燥し、製剤とする。 この製剤は前述した、Ｍ−HUTIの種々の特性
を保有していた。 製造例 ３ 乾燥HUTI5ｇを0.1N HCl0.5に溶解し、臭
化シアン５ｇを加え18℃で15時間、密栓状態で反
応させる。その後製造例１と同様に過剰の臭化シ
アンと、他の反応生成物とを分子篩別して除去
し、Ｍ−HUTIを除菌濾過し、分注・凍結乾燥し
て製剤とする。 この製剤は前述した、Ｍ−HUTIの種々の特性
を保有していた。 製造例 ４ 乾燥HUTI5ｇを70％トリフルオロ酢酸0.5に
溶解し、臭化シアン５ｇを加え、18℃で15時間、
密栓状態で反応させる。その後、反応液を製造例
１と同様にしてＭ−HUTIを得て、除菌・分注凍
結乾燥し製剤とする。 この製剤は前述した、Ｍ−HUTIの種々の特性
を保有していた。 実験例 １ 製造例１によつて得たＭ−HUTIの実験的膵炎
に対する効果をもとのHUTIのそれと比較した。
体重８〜10Kgの犬（雑種）にエチオニン
（ethionine）1000mg／Kgを代謝拮抗阻害剤として
腹腔内投与した後、その２、６及び12時間後にＭ
−HUTIあるいはHUTI50、100、500、1000又は
10000μｇトリプシン阻害単位／Kgをそれぞれ静
脈内投与した。エチオニン投与後、４時間目、８
時間目、12時間目、24時間目そして72時間目に屠
殺して膵臓のトリプシン活性を膵炎のマーカーと
して測定し、同時に病理組織学的検策を行つた。
その効果は表２に示す通りである。HUTI50μｇ
トリプシン阻害単位／Kgを投与した時はほとんど
抗膵炎作用を示さなかつた。同じ単位のＭ−
HUTIを投与した時12時間目でトリプシン活性の
かなりの阻害がみられ、又組織学的検索によつて
も、炎症の低下の兆候が見られた。他の４種の濃
度投与においてもＭ−HUTIはもとのHUTIに比
べ、より効果的な抗炎症作用を認めた。
：極めて効果大 ：効果大 ＋：相当効
果あり ±：効果あり −：効果なし
このようなことから本発明のＭ−HUTIは人体
内のプロテアーゼ類が関係する生体内の種々の炎
症反応をもとのHUTIに比べ強く阻害し、そして
前記反応によつて起る各種疾患に対してもより優
れた治療効果を示唆するものであつた。 次にエチオニンで実験的に膵炎を起させた犬及
びホルマリンで実験的に炎症を起させたウイスタ
ー系ラツトをそれぞれ用い、本発明のＭ−HUTI
の抗膵炎作用と抗炎症作用をもとのHUTIのそれ
と比較した。その結果表２、表３に見られるよう
にＭ−HUTIはもとのHUTIに比べ少量投与で膵
炎及び肉芽腫形成の抑制効果を示した。このこと
からＭ−HUTIが抗炎症治療剤としてもとの
HUTIのそれに比べ優れた効果を発現することが
期待できる。 本発明によつて得たＭ−HUTIの急性毒性試験
をウイスター系ラツトの尾静脈内投与により調べ
るため、体重１Kgにつき80000μｇトリプシン阻
害単位を静注し投与後７日にわたつて一般症状の
観察と体重測定を行つたところ、体重は順調に増
加して全く異常所見は認められなかつたし、剖検
ならびに組織学的検査の結果も全く異常は認めら
れなかつた。 本発明に係るＭ−HUTIの臨床使用における投
与量および投与方法は、犬の実験的膵炎およびラ
ツトの抗炎症作用の薬理実験の成績から50〜
500μｇトリプシン阻害単位／Kg／日で静脈内注
射により行う。これにより、十分に治療効果を上
げるものと考えられる。 本発明に係るＭ−HUTIは、もとのHUTIに比
べ比活性は高く、又、抗プラスミン、抗カリクレ
イン及びヒアルロニダーゼ作用が強くその上抗ト
ロンビン作用を持つ、トリプシンインヒビターで
ある。このものは、低濃度で抗炎症作用を示し、
毒性をほとんど示さない優れた特性を有し、従来
にない極めて有用性の高い医薬品である。 以下に製剤の調整例について例を挙げて説明す
る。尚、いずれの例についても活性回収率は80％
以上であつた。 製造例 １ 乾燥HUTI5ｇを70％ギ酸0.5に溶解し、臭化
シアン５ｇを加え室温で15時間、密栓状態で反応
させる。反応終了後、反応混合液をセフアデツク
スＧ−75のカラムにかけてゲル濾過し、Ｍ−
HUTIと、過剰の臭化シアン、その他の反応生成
物とを分別する。 このようにして分離したＭ−HUTI画分を集
め、ミリポア ・フイルター（ミリポア社製限外
濾過用フイルター）による除菌濾過を行い、トリ
プシン阻害単位を測定して、分注量を決めたの
ち、所定量を小分け分注し、凍結乾燥を行い、Ｍ
−HUTI製剤を得る。この製剤は前述したＭ−
HUTIの種々の特性を保有していた。 製造例 ２ 乾燥HUTI2ｇを70％ギ酸１に溶解し、臭化
シアン２ｇを加え、室温で20時間、密栓状態で反
応させる。反応終了後、反応混合液に10倍量の蒸
留水を加え、凍結乾燥を行い、過剰の臭化シアン
と揮発性の反応生成物とを除去し、次にトリプシ
ン−セフアロース（セフアロース ［（フアルマ
シア社製アガロースゲル）を用いて自己調製にＭ
−HUTIを吸着させて、阻害活性を示さないペプ
チドを除去する。吸着したＭ−HUTIを溶出し回
収する。その後製造例１と同様にＭ−HUTIを除
菌濾過し分注・凍結乾燥し、製剤とする。 この製剤は前述した、Ｍ−HUTIの種々の特性
を保有していた。 製造例 ３ 乾燥HUTI5ｇを0.1N HCl0.5に溶解し、臭
化シアン５ｇを加え18℃で15時間、密栓状態で反
応させる。その後製造例１と同様に過剰の臭化シ
アンと、他の反応生成物とを分子篩別して除去
し、Ｍ−HUTIを除菌濾過し、分注・凍結乾燥し
て製剤とする。 この製剤は前述した、Ｍ−HUTIの種々の特性
を保有していた。 製造例 ４ 乾燥HUTI5ｇを70％トリフルオロ酢酸0.5に
溶解し、臭化シアン５ｇを加え、18℃で15時間、
密栓状態で反応させる。その後、反応液を製造例
１と同様にしてＭ−HUTIを得て、除菌・分注凍
結乾燥し製剤とする。 この製剤は前述した、Ｍ−HUTIの種々の特性
を保有していた。 実験例 １ 製造例１によつて得たＭ−HUTIの実験的膵炎
に対する効果をもとのHUTIのそれと比較した。
体重８〜10Kgの犬（雑種）にエチオニン
（ethionine）1000mg／Kgを代謝拮抗阻害剤として
腹腔内投与した後、その２、６及び12時間後にＭ
−HUTIあるいはHUTI50、100、500、1000又は
10000μｇトリプシン阻害単位／Kgをそれぞれ静
脈内投与した。エチオニン投与後、４時間目、８
時間目、12時間目、24時間目そして72時間目に屠
殺して膵臓のトリプシン活性を膵炎のマーカーと
して測定し、同時に病理組織学的検策を行つた。
その効果は表２に示す通りである。HUTI50μｇ
トリプシン阻害単位／Kgを投与した時はほとんど
抗膵炎作用を示さなかつた。同じ単位のＭ−
HUTIを投与した時12時間目でトリプシン活性の
かなりの阻害がみられ、又組織学的検索によつて
も、炎症の低下の兆候が見られた。他の４種の濃
度投与においてもＭ−HUTIはもとのHUTIに比
べ、より効果的な抗炎症作用を認めた。
【表】
【表】
：極めて抑制効果大 ：抑制効果
大 ＋：抑制効果あり ±：わ
ずかに抑制効果あり −：抑制効果なし
実験例 ２ 製造例１によつて得たＭ−HUTIのホルマリン
による炎症に対する効果をもとのHUTIのそれと
比較した。 体重200〜250ｇのウイスター系ラツトに７％ホ
ルマリン液をしみ込ませた直径10mmの濾紙をラツ
トの背部皮下に包埋させて、実験的炎症を起させ
た。術後24時間目から毎日１回、Ｍ−HUTIある
いはもとのHUTIを50〜10000μｇトリプシン阻害
単位／Kgを静脈投与した。術後、７日目に包埋瀘
紙片の周りに形成された肉芽腫を摘出し、その湿
重量を秤量し、生理食塩水投与群の肉芽腫重をコ
ントロールとして、Ｍ−HUTI投与群ともとの
HUTI投与群の肉芽腫量を比較検討した。その結
果は表３に示す通り、HUTI投与群は50μｇトリ
プシン阻害単位／Kgの投与では肉芽腫形成の抑制
効果はわずかしかみられなかつたが、Ｍ−HUTI
投与群では50μｇトリプシン阻害単位／Kgの投与
で著明な肉芽腫形成の抑制効果が認められた。他
の濃度においても同様にＭ−HUTIの投与群は
HUTIに比べ優れた、肉芽種の形成を抑制してい
た。
大 ＋：抑制効果あり ±：わ
ずかに抑制効果あり −：抑制効果なし
実験例 ２ 製造例１によつて得たＭ−HUTIのホルマリン
による炎症に対する効果をもとのHUTIのそれと
比較した。 体重200〜250ｇのウイスター系ラツトに７％ホ
ルマリン液をしみ込ませた直径10mmの濾紙をラツ
トの背部皮下に包埋させて、実験的炎症を起させ
た。術後24時間目から毎日１回、Ｍ−HUTIある
いはもとのHUTIを50〜10000μｇトリプシン阻害
単位／Kgを静脈投与した。術後、７日目に包埋瀘
紙片の周りに形成された肉芽腫を摘出し、その湿
重量を秤量し、生理食塩水投与群の肉芽腫重をコ
ントロールとして、Ｍ−HUTI投与群ともとの
HUTI投与群の肉芽腫量を比較検討した。その結
果は表３に示す通り、HUTI投与群は50μｇトリ
プシン阻害単位／Kgの投与では肉芽腫形成の抑制
効果はわずかしかみられなかつたが、Ｍ−HUTI
投与群では50μｇトリプシン阻害単位／Kgの投与
で著明な肉芽腫形成の抑制効果が認められた。他
の濃度においても同様にＭ−HUTIの投与群は
HUTIに比べ優れた、肉芽種の形成を抑制してい
た。
図面は本発明によるＭ−HUTI製造法における
反応液のセフアデツクスG75によるゲル濾過にお
ける液中成分の挙動を示す。 図面において、１……Ｍ−HUTI蛋白濃度、２
……抗トリプシン活性、３……活性のないペプタ
イド、４……メチルオシアナート・臭化シアンの
濃度を表わす。
反応液のセフアデツクスG75によるゲル濾過にお
ける液中成分の挙動を示す。 図面において、１……Ｍ−HUTI蛋白濃度、２
……抗トリプシン活性、３……活性のないペプタ
イド、４……メチルオシアナート・臭化シアンの
濃度を表わす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 人尿性トリプシンインヒビターを臭化シアン
で分解し、メチオニル結合を切断させた、分子量
が62000±5000、糖含量が約10％（グルコース換
算）、等電点がPH2.5〜4.5の人尿性トリプシンイ
ンヒビター誘導体。 ２ 人尿性トリプシンインヒビター１mgに対し、
臭化シアン0.1〜20mgの割合で添加し、10〜50℃、
１〜60時間で反応させることを特徴とする分子量
が62000±5000、糖含量が約10％（グルコース換
算）、等電点がPH2.5〜4.5の人尿性トリプシンイ
ンヒビター誘導体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63098801A JPS6445400A (en) | 1988-04-21 | 1988-04-21 | Human urinary trypsin inhibitor derivative and production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63098801A JPS6445400A (en) | 1988-04-21 | 1988-04-21 | Human urinary trypsin inhibitor derivative and production thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6445400A JPS6445400A (en) | 1989-02-17 |
| JPH0359079B2 true JPH0359079B2 (ja) | 1991-09-09 |
Family
ID=14229449
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63098801A Granted JPS6445400A (en) | 1988-04-21 | 1988-04-21 | Human urinary trypsin inhibitor derivative and production thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6445400A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2763944B1 (fr) * | 1997-06-03 | 2000-12-15 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux derives de coumarines, leurs procedes de preparation et leur application comme medicaments en tant qu'inhibiteurs de proteases |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1475262A (en) * | 1975-04-03 | 1977-06-01 | Green Cross Corp | Human urinary trypsin inhibitor and a method of preparing it |
| JPS51118810A (en) * | 1975-04-10 | 1976-10-19 | Fujiwa Kako Kk | A process for preparing proteolytic enzyme inhibitor from human urine |
-
1988
- 1988-04-21 JP JP63098801A patent/JPS6445400A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6445400A (en) | 1989-02-17 |
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