JPH03503479A - 接合転写／翻訳の無細胞系における遺伝子の予備発現法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 接合転写／翻訳の無細胞系における遺伝子の予備発現法 技術分野 本発明は分子生物学およびバイオテクノロジーに関し、すなわち接合転写／翻訳 の無細胞系における遺伝子の予備発現の方法に関する。

周知のように、遺伝子の発現の産物はペプチドまたはタン白質である。これらの 物質は生物学的工程のバイオレギュレーター並びに製剤、診断系としての薬剤に 広く用いられている。例えば、ペプチド−免疫系の活性化因子、ペプチド−塩代 謝の刺激物質、血中の糖含量を調節するタン白質等が知られている。また、成長 ホルモンのような生物刺激物質として農業においてポリペプチドが用いられるこ とも知られている。

背景技術 生細胞中への外来ＤＮＡの侵入に基づく遺伝子工学の方法による細胞遺伝物質の 予備発現の方法でありで、前記の外来ＤＮＡの遺伝物質を宿主細胞の装置によっ て発現させる方法が、当該技術分野に知られている。この方法は、タン白質の商 業的生産に広く用いられている。しかし、それは応用が限られている。これは、 遺伝子の発現の産物の単離の複雑さ、宿主細胞に対するある種の所望な産物の致 死率、外来遺伝子の発現の産物のタンパク分解性の分解または凝集と関連してい る。後者の環境によって、１５〜７０個のアミノ酸残基の長さを有するポリペプ チドの単離または人為的に変化させたアミノ酸配列を有するタン白質の産生が特 に困難になる。

したがって、この遺伝子工学の方法では如何なる遺伝子の予備発現を行うことも できないことになる。

接合転写／翻訳の無細胞系の使用に基づく遺伝子の発現のもう一つの方法が知ら れている。

この方法は細胞抽出物を用いることを含み、ＤＮＡ分子を用いることを特徴とす るものである。かがる系では、ＤＮＡ分子からｍ　ＲＮ　Ａ’が増殖され、続い てその翻訳が起こる。

接合転写／翻訳の無細胞系は細胞によって課される制限がなく、必要な方法で設 計されるＤＮＡ分子の形態において実質的にどんな遺伝子の発現をも行うことが できる。

しかしながら、かかる方法の効率は極めて低いものでしかない。かかる系の機能 の時間は２０〜８０分であるが、合成されるポリペプチドの量はインキニベーシ ジン混合物１ｍｌ当たり３〜１０ピコモルを上回ることはない。

このように、接合転写／翻訳の無細胞系における遺伝子の発現の方法が、当該技 術分野において知られている（Ｇｅｎｅ、第６巻、１９７９年、２９〜４２頁） 。

この方法では、接合転写／翻訳の無細胞系の１００μｌは、トリス−アセテート ７７ｍＭ、ｐＨ８，２、酢酸カルシウム１３１Ｎ、酢酸マグネシウム１３−Ｘ、 酢酸カリウムｌＯｈＭ、酢酸アンモニウム５０５Ｍ、　ＤＤＴ２．４ｓＭから成 る緩衝液中で抽出物８３０を２５μｍ、ＤＮＡ分子を５μｌ、総ｔＲＮＡを１９ ■、ＡＴＰを１．７■Ｍ　、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰをそれぞれ１ｍＮ　、 ＣＡＭＰを８８μＭ１葉酸を０．５　Ｋ、ホスホエノールピルベートを３７１Ｍ 、ポリエチレ８８μＭ１残りの１９のアミノ酸のそれぞれ４８０ｕＭを含んでい る。

遺伝子の発現は３７℃の温度で行う。合成の際に、遺伝子の発現産物は系中に蓄 積されるのであり、これらの産物はＡＭＰ、ＡＤＰ％ＧＤＰ、ＣＤＰ、ＵＤＰ、 ピロホスフェート、無機リン酸塩、および遺伝子の発現の系の阻害物質であるそ の他のものを含んでいる。阻害の結果として、系は３０〜６０分以内にその機能 を停止する。かかる系１００μｍ中の合成されたポリペプチドの量は、０，５〜 １ピコモルを超過しない。

接合転写／翻訳の無細胞系の作用時間が短いことのおもな理由は次のような点に ある： １、この系は限られた基質の量、すなわち系の阻害を生じる基質の増加した量を 含んでいる。

２、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、ＵＤＰ、ピロホスフェートおよびホスフ ェートのような系の機能時に形成される分解生成物は系の阻害物質である。

３、所望な産物も接合転写／翻訳の無細胞系を阻害することがある。

発明の概要 本発明の目的は、接合転写／翻訳の無細胞系における遺伝子の発現の方法であっ て、系の機能時間を延長することによる予＃ｉ量のポリペプチドを得ることがで きるようにする方法を提供することである。

この目的は、ＤＮＡ分子として遺伝子を用い、基質としてアミノ酸、ＡＴＰＳＧ ＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰを含み、無細胞系中にポリペプチド、ＡＭＰ、ＡＤＰ 。

ＧＤＰＳＣＤＰ、ＵＤＰ、ピロホスフェート、無機リン酸塩を含む遺伝子の発現 の産物を形成する接合転写／翻訳の無細胞系における遺伝子の予備発現法であっ て、本発明によれば、接合転写／翻訳の無細胞系の作用時に基質が消費されて生 成物が形成されるので、ポリペプチド、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＣＤＰ、ＣＤＰおよび υＤＰ、ピロホスフェートおよび無機リン酸塩を含む遺伝子の発現の産物を系か ら取り出すと同時に、アミノ酸、ＡＴＰ。

ＧＴＰ、ＣＴＰＳＵＴＰのような基質を系に導入してそれらの初期の水準の濃度 を保持する方法によって達成される。

本発明による方法における遺伝子の発現の系としては、接合転写／翻訳の原核お よび真核性の両方の無細胞系を用いることができる。本発明の方法では、選択さ れる系に最適な反応混合物中の成分の比率、合成のイオンおよび温度条件が用い られる。これらの条件の範囲は広く、無細胞系を作成した生物体の特性によって 画定される。

本発明による遺伝子の予備発現の方法は遺伝子工学の方法には限定されず、どん なペプチドまたはタン白質の遺伝子の発現にも用いることができる。この特性は 、人為的に変化されたアミノ酸配列を有する生物的に活性なペプチドおよびタン 白質の産生に特に重要である。

本発明による方法では、５０時間以上の時間不変の高率で接合転写／翻訳の無細 胞系において遺伝子を発現させることができる。この場合の所望な産生量は系を ５０〜１００時間作用の間反応混合物１ｍｌ当たり２００〜４００μｇであるの で、遺伝子の発現の産物を商業的に製造することができる。

図面の簡単な説明 本発明を、合成されるポリペプチドの量と合成の時間との関係のグラフを示す添 付図面に関して、発明の態様の例によって更に説明する。

発明を行うための最良の態様 本発明による接合転写／翻訳の無細胞系における遺伝子の予備発現の方法は、下 記方法で行う。

翻訳の装置および転写の装置の総ての構成要素を含むが内因性ｍＲＮＡおよびＤ ＮＡを含まない抽出物は原核または真核細胞から作成される。この抽出物に、転 写および翻訳の低分子成分（アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ。

ＵＴＰ、ＣＴＰ）およびＤＮＡ分子の形態の遺伝子を加える。

反応混合物を容器に移し、組み合わせた転写／翻訳の工程を行う。この工程の停 止を防止するため、転写生成物（無機リン酸塩、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、ＵＤ Ｐ）および翻訳生成物（合成ポリペプチド、ＡＭＰ、ＧＤＰ、無機リン酸塩およ びピロホスフェート）を半透性膜を介して容器から連続的に取り出す。同時に、 アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ％ＣＴＰ、ＵＴＰを容器に入れて、それらの初期濃度 を保持する。合成されたポリペプチドを吸着剤を詰めたカラムに集め、転写およ び翻訳の生成物は特別な貯蔵器に集めて次の再生に使用する。

本発明を一層良好に理解するために、下記の具体例を説明する。

無細胞系におけるプラスミドｐＵＤ１８の遺伝子の予備発現。

標準の無細胞系を作成して、組み合わせ転写／翻訳を行う。プラスミドｐＵＤ１ ８は、β−ラクタマーゼとジヒドロフオレートレダクターゼの遺伝子を含む。

溶液（Ａ）はトリス−アセテート、ｐＨ８，２を５５ｍＭ、Ｍ　ｇ　Ａ　ｃを１ １５Ｍ、Ｃａ　Ｃ１２を９．５ｓＭ　、Ｋ　Ａ　ｃを７８５Ｍ、ＤＤＴを１．５ ■Ｈ，ポリエチレングリコール６０００をり、８％、ホスホエノールピルベート を５ａＭ、ＡＴＰを１．２ｍＭ、ＧＴＰＳＣＴＰおよびＵＴＰをそれぞれ０．８ 讃河、葉酸を５■１１、比放射能が２３０　ｍｃｉ／ミリモルである［３Ｈ］　 −ロイシンを１００μＭ１および残りのアミノ酸をそれぞれ１００μＭ含んでい る。緩衝液（Ａ）を用いて作成される反応混合物１ｍｌは、抽出物Ｓ３０を４３ ０μ１１プラスミドｐＵＤ１８を１５０ぼ、総ｔＲＮＡを２００■含む。

組み合わせた転写／翻訳の標準系で、３７℃の温度でインキュベージジンを４０ 分間行ってインキュページジン混合物１ｍｌ当たりβ−ラクタマーゼとジヒドロ フオレートレダクターゼをそれぞれ６ピコモル合成する。

連続的作用単位における平行実験では、溶液（Ａ）を反応混合物１ｍｌに３ｍ１ ／時または２ｍｌ／時の速度で連続的に添加し、反応生成物をオランダの会社で ある「アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）Ｊから発売されている限外濾過膜ＸＭ−１００ を通して同じ速度で抜き取る。このような系におけるβ−ラクタマーゼとジヒド ロフオレートレダクターゼの遺伝子の発現の動態は、合成時間ｔを横座標軸にプ ロットし、マイクログラムで表わした形成される生成物の量（ｍ）が縦座標軸に 示される添付の図面のグラフによって表わされる。動態曲線の領域１では、溶液 （Ａ）を３ｍｌ／時の速度で供給し、動態曲線の領域２では、溶液（Ａ）を２ｍ ｌ／時の速度で供給する。グラフから判るように、ポリペプチドの合成の速度は 溶液（Ａ）の供給速度によって変化するが、系の機能時間によっては変化しない 。

反応混合物１ｍｌ中でかかる系を５０時間作用させることにより、β−ラクタマ ーゼおよびジヒドロフオレートレダクターゼのタン白質２１２■に相当するβ− ラクタマーゼおよびジヒドロフオレートレダクターゼがそれぞれ４．１ナノモル 合成される。

それ故、本発明の方法は、接合転写／翻訳の標準的無細胞系より５００倍を上回 る量の生成物を合成することによって無細胞系で遺伝子の予備発現を行うことが できる。

産業上の応用性 接合転写／翻訳の無細胞系における遺伝子の予備発現の方法は、ポリペプチドを 産生ずるためのバイオテクノロジーに応用を見出すことができる。

国際調査報告 特表平３−５０３４７９　（４）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＤＮＡ分子として遺伝子を用い、基質としてアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ およびＵＴＰを含み、無細胞系中にポリペプチド、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、Ｃ ＤＰ、ＵＤＰ、ピロホスフェート、無機リン酸塩を含む遺伝子の発現の産物を形 成する接合転写／翻訳の無細胞系における遺伝子の予備発現法であって、接合転 写／翻訳の無細胞系の機能時に基質が消費されて生成物が形成されるので、ポリ ペプチド、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、ＵＤＰ、ピロホスフェートおよび 無機リン酸塩を含む遺伝子の発現の産物を系から取り出すと同時に、アミノ酸、 ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰのような基質を系に加えてそれらの初期の水準 の濃度を保持することを特徴とする方法。