JPH03500651A - トコフェロールを基体とした薬剤系 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 トコフェロールを基体とした・　Ｊ系 関連している共係属米国出　データ この出願は１９８７年１０月１９日に出願された共係属米国特許出願第１１０， ２６１号の一部継続出願である。

見肌立ｉ匙 本発明は、安定なリボンーム組成物に関する。特に、この発明は薬剤組成物とし て用いられる安定化剤を含有するアルファトコフェロールニ分子層（ｂｉｌａｙ ｅｒ）の有機酸誘導体の物理的安定化に関する。

トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）−トコフェロールヘミサク シネート（ｔ−ＴＢＳ）のようなアルファトコフェロールの有機酸誘導体の塩形 態は、高い取り込み効果を有し、生理的なｐＨ値での高い捕獲容積を有する閉鎖 されたマルチラメラ小胞体を形成することが知られている〔ジャノフら、１９８ ９年９月２４日出願米国特許出願第９１１，１３８号、発明の名称［アルファト コフェロールを基体とした小胞体」ここに参考に引用されている；およびレイら 、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ膓１ｓｔｒｙＬ　２４：］、］６４６−１ ６６１１９８５）］。ＴＨ３は又、ｐＨもしくは二価のカチオンの存在に依存し たポリモルフイック（例えばヘキサゴナル■への二分子層）相の行動を示してい る。例えば−ＴＢＳの水性懸濁液は生理的ｐＨおよびそれ以上（約ｐ　Ｈ６，０ −９，０）では二分子膜相（ｂｉｌａｙｅｒ　ｐｈａｓｅ）にあるが、このＰＨ を約６．０より下げるか、Ｍｇ＋＋もしくはＣａ＋＋のような二価のカチオンに 導入すると、小胞体の凝集および融解を生せしめ、ヘキサゴナル相（ｈ　ｅ　ｘ 　ＩＩ）　形成を誘導する。

トコフェロール酸サクシネート（ヘミサクシネート）もＴＢＳのトリス塩形態も 酸性のｐＨではリポソームを形成しないし、またリポソームのままでもいない。

これは低いＰＨではｈｅｘＩＩ構造が形成されるからである。アルファーＴＨ５ は、ヘキサゴナル相ポリモルフイズムへの二分子層を示すことが知られている他 の脂質とは構造的に全く異なっている分枝単一鎖脂質であり、このような脂質と しては、例えばホスファチジルエタノールアミン、カルシオリピンおよび七ノー ジアシルグリセライド類である。

リポソーム薬剤搬送システムにおいてアルファートコフェロールヘミサクシネー ト（ＴＢＳ）を使用したこれまでの研究では。

取り込まれるかＴＢＳと会合している生物活性剤は生理学的ＰＨ値において安定 であった。このような薬剤搬送システムにおいて、ＴＢＳの二分子膜状態に対す る生理学的ｐＨに対する必要性はこの薬剤のための同様のＰＨ必要性と一致した 。しかしながらある種の薬、例えばピロカルピンは生理学的ＰＨにおいてこのよ うなプロント化されていない形態において触媒的に活性であり、したがってより 酸性のｐＨの搬送システムが必要とされる。これまでのこのようなシステムは、 二分子層の状態でのＴＢＳのＰＨ必要性の故に、搬送システムとしてＴＢＳと適 合できなかった。というのはこのような条件がＴＢＳを加水分解に対し非常に敏 感にさせ、その結果ＴＨ５を崩壊させるのであった。その上ピロカルピン自体が 高いｌ）Ｈにおいて不安定であり、そこでは塩基で触媒されて加水分解されるの である。低いＰＨではピロカルピンはプロント化されより安定である〔チュンら 、ジャーナルオブファーマシューティカルサイエンス（Ｊ、Ｐｈａｒｍ、Ｓｃｉ 、）、５９（９）：１３００−１３０５゜（１９７０））、他の薬の中でもピロ カルピンはこのように要求をするので、より低い（酸性の）ｐＨにおいて二分子 １システムと会合しているのが好ましい。

すなわち、ＴＢＳおよびピロカルピンのような薬を使用する脂質を基体とした搬 送システムにおいては、この薬の酸性条件の要求が、ＴＢＳのための二分子層形 態（中性から塩基性条件）への要求と摺入れないように見える。ＴＢＳ分子のポ リモルフイック相行動、これは酸性のＰＨにおいて溶液中に上記のｋａｘＩｒ相 および沈殿を形成するのだが、および薬の酸性ｐＨに対する要求の故に、酸性お よびアルカリ性の両ｐＨにおいてＴＢＳの二分子層形態を維持する安定化剤を使 用する新しいシステムを本発明者等は発展させたものである。安定化剤が存在す るこのこのような条件下では、ＴＢＳは、酸性ｐＨＷ液中安定化されている。こ のシステムは、より低いｐＨ条件を容認もしくは要求する生物活性剤、例えばイ ミダゾール基を有する薬で、層剤の最終ＰＨは酸性であるが、それと会合もしく はそれを取り込むＴＨＳリポソームを使用する。

安定化剤は、酸性ｐＨ環境中でリポソームを基体としたｄ−アルファートコフェ ロール酸サクシネートの二分子１状態の形成及び／または維持を可能にする化合 物として定義される。この機能を行えることが見出きれた物質は一般に、界面活 性剤および洗浄剤として普通知られているクラスの化合物に属する。本発明にお いては、薬剤的に許容し得るｅｘｉｅｐｉｅｎｔｓポリオキシアルキルエーテル 〔ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２３−ラ ウリルエーテルおよびそれらの組合せ、そしてまた各々ラウレス（Ｌａｕｒｅｔ ｈ）　−４＋ワウレス−２３およびラウレス〜１２．ＩＣＩ　アメリカズ、イン コーホレーテッド（Ａ１１ｅｒｉｃａｓ、Ｉｎｃ、）の名前によって知られてお り；付記さ汎た数はポリオキシエチレングリコール部分におけるエチレンオキシ ド単位の平均数を表わす〕のような安定剤（洗浄剤）は酸性ＰＨにおいてＴＢＳ を二分子相へと安定化することが見出された。

本発明者等は驚くべきことに、酸性ＰＨに調整し得るＴＢＳ−安定剤二分子膜相 を使用するシステムを見出したものであり、これによって低いｐＨ条件を必要と する薬を適応させるものである。

このシステムにおいては、ＴＩ（Ｓ−安定化剤二分子膜相は低いＰＨ１例えば酸 性のｐＨ−例えば約２．０と６．５の間のＰＨで、より好ましくはｐＨ約４．０ −５．０で、最も好ましくはＰＨ約４．５で形成される。次いでこのような低い ＰＨ条件を要求する薬をこの製剤に加える力暑さもなけ九ばこの薬はｐＨの調整 の前に添加することができる。本発明者らは更に、この製剤が中性ｐＨ（例えば 生理学ｐＨ）に調整されたとき、このシステムの二分子膜相は維持さ九、この溶 液の粘度は増加することを見出した。このようなＰＨ調整はこの溶液を体液に添 加したとき、例えば眼用ピロカルピンおよび涙の膜の場合に、効率よく行うこと ができる。例えば酸性リポソームＴＨＳピロカルピン溶液の眼への添加は粘度の 増大をもたらし、これはピロカルピンと眼の組織との接触時間を増加させること ができる。接触時間の増加は眼の組織による薬の摂取の強化に直接つながること が知られている（Ｃｈｒａｉら、ジャーナルオブファーマシューテイカルサイエ ンス（Ｊ、Ｐｈａｒ＋ｍ、Ｓｃｉ、）、６３：１２１８（１９７４）、リーら、 ジャーナルオブファーマシューテイカルサイエンス（Ｊ、Ｐｈａｒｍ、Ｓｃｉ、 ）、６３ニア２１　（１９７４））。

本発明の生物活性剤の輸送の形態は好ましくは薬と脂質（例えばＴＢＳ）の会合 、リポソーム中への取り込み、リポソームの外部との結合もしくは脂質二分子層 の内側との会合によるものである。

リポソームは取り込まれた水性容量を有する完全に閉鎖された二分子膜層である 。リポソームはユニラメラ小胞体（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓ） （単−膜二分子層を有す）もしくはマルチラメラ小胞体（多数の膜二分子層によ って特徴づけられる玉葱様構造をもち、各層は水性層によって次の層と分けられ ている）であることもできる。この二分子層は疎水性“尾部″領域と親水性“頭 部″領域を有する２つの脂質モルイヤー（一分子層）から成っている。

膜二分子層の構造は、単分子膜の疎水性（無極性）の脂質モルイヤの″尾部”が 二分子層の中心に向かっており、一方親水性（極性）の２頭部”が水性層に向か うといったものとなっている。

パンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）等の、初期のリポソーム製造〔ジャーナルオブモレ キュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、１２，２３８−２５２．１ ９６５〕は有機溶媒中にリン脂質をＳ濁させ、次いでこの溶媒を蒸発乾燥させ２ 反応容器上にリン脂質の膜を残留させるものである。

続いて適当量の水性相を添加し、この混合物を″膨ｍ　（ｓｗｅｌｌ）”させ、 そして得られたマルチラメラ（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）小胞体（１’１Ｌ ＶＳ）からなるリポソームを機械的手段で分散させる。この技術が、バパハジョ ボウロス（Ｐａｐａｈａｄｊｉｏｐｏｕｌｏｓ）らによって記載された〔バイオ ヒミカエトバオオフイジカウントアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）１３５，６２４−６３８，１９６８）音波処理さ れた小さなユニラメラおよび大きなユニラメラ小胞体の開発のための基礎を提供 している。

各種ステロール及びそれらの水溶性誘導体を、リポソーム形成のために用いるこ とができる。特に、ジャノフ（Ｊａｎｏｆｆ）ら、ＰＣＴ公開番号８５１０４． ５７８号、１９８５年１０月２４日公開、名称″ステロイド性すポソーム″参照 。メイヒュー（Ｍａｙｈｅｉｉ）ら、Ｐ　ＣＴ　公開番号Ｗ０８５１００９６８ ．１９８５年３月１４日公開には、アルファートコフェロールある種のその誘導 体を含むリポソームで薬剤をカプセル化することによって、薬の毒性を低減させ る方法が記載されている。リポソーム−薬搬送系において、薬のような生物活性 剤をリポソーム中に取り込み或いはリポソームと会合させ、次いで治療すべき患 者に投与する０例えば５ラーマン（Ｒａｈｍａｎ）ら、米国特許第３，９９３， ７５４号；シアーズ（Ｓｅａｒｓ）　。

米国特許第４，１４５，４１０号；パパハジョポラス（Ｐａｐｈａｄｊｏｐｏｕ ｌｏｓ）ら、米国特許第４，２３５，８７１号；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄ ｅｒ）　、米国特許第４，１１４，１７９号；レンダ（Ｌａｎｋ）ら、米国特許 第４，５２２，８０３号：及びファウンテイン（Ｆｏｕｎｔａｉｎ　）ら、米国 特許第４，５８８，５７８号参照。

本発明は酸性要求もしくは酸性耐性薬の酸性ｐＨでの輸送の問題をＴＢＳで解決 するものである。酸性ｐＨにおいてＴＢＳを安定化剤と結合させることによりＴ ＢＳの二分子層条件が維持される。更に、ものｐＨを中性に調整することに続い て、このシステムは粘度を増加し薬と体の組織との間の接触時間を増加させる。

このシステムは酸要求性もしくは酸耐性薬剤、例えばピロカルピンのような薬を 包含するものである。

本発明においては、ＴＢＳ、生物活性剤および安定剤を包含するリポソームが酸 性ｐＨに調整され対象者に投与される。

光１し鉱夫１一 本発明は低ＰＨ条件を要求もしくは耐容性である薬剤の作用を持続させる方法を 開示するものであり、ここではアルファートコフェロールの有機酸誘導体を酸性 ＰＨにおいて安定化剤と混合する。得られた混合物は追加的に生物活性剤含有す ることができる。

この方法は生物活性剤が塩基性触媒的に加水分解を受け、したがって低ｐＨ条件 を要求もしくは耐性である場合に使用される。このような薬剤は、例えば、ピロ カルピンのようなイミダゾール基を有する薬剤である。

本発明の好ましい態様においては、安定化剤はポリオキシエチレンアルキルエス テルもしくはエーテル、例えばラウレスー】２、ラスレス−２３、もしくはトコ フェロールポリオキシエチレングリコールサクシネート（ＴＰＧＳ）のような洗 浄剤である。この安定化剤はもしそれが親脂質性である場合には、メチレンクロ ライドのような有機溶媒中、アルファートコフェロールの有機＠誘導体と一緒に することができる。生物活性剤を含有する水性懸濁液および緩衝剤は有機溶液と 混合し、有機溶媒を除去することができる。得られた懸濁液のＰＨはそれから約 ３．０〜５，５、より好ましくは約４．５に調整される。この製剤は更にＰ−ヒ ドロキシ安息香酸エステル、ベンジルアルコール、ペンジルコニウムクロライド もしくはソルビン酸のような防腐剤を含有する。

すなわち、この発明は上記の条件下、低ＰＲにおいてアルファトコフェロールの 有機酸誘導体と安定化剤を含有する持続作用のあるリポソーム組成物に関する。

この組成物は生物活性剤、例えば眼病治療有効量のピロカルピンを含有する薬剤 組成物であることができ、このものはこのような処置が必要な対象者の眼の組織 に該生成物を適用することにより投与することができる。

本発明の低いｐＨＴＨ５安定化リポソームの形成にいくつかの方法が適用できる ０本発明組成物形成のための１つの方法は、低ＰＨを必要とする薬と生理学的ｐ Ｈを必要とする両親媒性化合物（ＴＢＳ）を含有するリポソームとを会合させる ものであり、これはこの薬を低ＰＨの水溶液中に溶解し、安定化剤を含有する有 機溶媒中にＴＨＳを懸濁させ、第一の溶液と上記の懸濁液とを一緒にし、有機溶 媒を除去、そしてＰＨを調整することを包含するものである。用いられる有機溶 媒はメチレンクロライドが好ましい。

本発明のいずれの方法を用いてもトコフェロールヘミサクシネートおよび安定化 剤を含有する薬剤搬送システムはつくられ、このシステムのｐＨは酸性である。

このリポソームは眼に局所的に投与することができる。

ｇ置版３一 本発明はアルファトコフェロールの有機酸誘導体を基体としたシステムをつくる ための組成物および方法に関し、この方法は生理学的ＰＨでは不安定で、安定の ために低ｐＨ（酸性の）環境を必要とするか、それに耐えられる生物活性剤の搬 送に特に好適である。また特にこの発明はアルファトコフェロールの有機酸誘導 体と酸要求生物活性剤（特に例えばピロカルピンのようなイミダゾール基を有す る薬）を二分子膜中で共安定化させる方法に関する。この安定化には表面活性剤 および／または洗浄剤、より好ましくはポリオキシエチレンアルキルエーテルも しくはエステルのような洗浄剤のような安定化剤を必要とする。このようなトコ フェロールニ分子層形成化合物の有機酸誘導体としてはトコフェロールヘミサク シネート（ＴＢＳ）がある。

ＴＢＳのｐＨに依存した多形性という性質はＴＢＳを含有する薬剤搬送システム をデザインする際に重要である。ＴＢＳ相の行動に対するｐＨの影響を調べるた めにＴＨ８二分子層（リポソーム）に対して行われた凍結粉砕電子顕微鏡Ｌ；よ れ１ｆ−ＰＨ，７，。、はＴＢＳはマルチラメラおよびユニラメラ小胞体の異質 集合体を形成することが証明された。また一方、ＰＨ７，０でピロカルピン−Ｔ ＢＳでつくられたリポソームは凝集されたマルチラメラリポソームであり、サイ ズおよび形の両者に関して異質のものである。

ピロカルピンおよびＴＢＳは７．０あたりのｐＨでの混合物では化学的に不安定 である。

ＴＨ３Ｈ３製剤びピロカルピン−ＴＨ８製剤の間でみられる顕微鎖的な相違は、 ピルカルピンとＴＢＳの間の会合を示唆している０両製剤のＰＲを低くしていく と、ｈｅｘｌｌ相脂質に似ている沈澱が形成される。酸性化により同様に沈澱が 生じるという事実は、より低いＰＨでのＴＢＳのピロカルピン会合の損失を示し ている。低いｐＨでのＴＢＳのこのような多形性（二分子膜からｈｅｘＩＩ）相 行動は、その安定性プロフィールが低ｐＨを要求する（もしくは耐容性がある） 薬の共投与を難かしく、あるいは不成功にさせる。

本発明者らはリポソーム製剤において洗浄剤のようなある種の安定他剤分子の導 入が、ｈｅｘｎ構造の形成を妨げ、そしてこの製剤を安定化することを見出した 。該薬に対する酸性ｐＨ環境の必要性は、ＴＨ８製剤への安定化剤の包括により 可能となり、酸性求薬剤はこのシステムを経由して搬送することができる。

本発明の方法は、この酸性要求薬剤をＴＨＳリポソームと共にこのように安定化 して投与することを可能にする。安定剤（表面活性剤もしくは洗浄剤ンと結合し たＴＨＥは、このような薬の新しい搬送システムを構成する。薬と該搬送システ ムとの会合は、この薬が最も安定な条件を示しつつ薬の持続した作用を可能にす る。更に、生体内投与の際にこのＰＨを中性の値に調整するとシステムの粘度が 増大し、それによってこのシステムと組織との接触時間を増大することができる 。

本発明の製剤は有機および水性相を混合することによってｍ製することができる ；有機相はＴＢＳおよび安定化剤（使用される安定化剤が親脂質性であるならば 、有機溶媒に溶解性である）をメチレンクロライドのような有機溶媒中に含有す る。この方法は始めに二分子層構造の形成を促進し、これがｐＨ調整後に二分子 層を維持する傾向をもたらす。この溶液は物理的に安定なご分子膜相にあり、薬 は後から添加することができる。

この水性相はソルビン酸のような防腐性抗菌剤およびＥＤＴＡのような抗菌剤強 化剤が含有することができ、これらは滅菌水もしくは緩衝剤中で混合され、加熱 して溶解する。使用される防腐剤に応じ、この加熱工程は省くことができる。冷 却後、薬（ピロカルピン）は水性防腐溶液に添加される。この水溶液は最終製剤 が有機相と混合された後−ｐＨ４，５あるいはその周辺となるよう緩衝塩もしく は等量の酸あるいは塩基を含有するべきである。溶媒の除去後に、水酸化ナトリ ウム（ＮａＯＨ）のような塩基で得られた製剤のＰＨにほんの少し調整を行い、 約ｐ　Ｈ４，５とすべきである。

ＴＢＳ　（有機相）は続いて生物活性剤（水性相）と混合することができ、そし てｌ！ｌ濁液は手で撹拌される。続いて該有機溶媒は例えば真空下の蒸発により 除去される。この後、得られた溶液は滅菌蒸留水もしくは緩衝剤で望ましい容量 に調整され、またクエン酸ナトリウムもしくはクエン酸のような塩、希塩基、希 酸を用いてｐＨを約４．５に調整される。

使用される安定化剤が親水性であるならば、有機相よりむしろ水性相で混合する ことができる。

得られるピロカルピン−ＴＨＳリポソームは、１９８７年４月１６日に出願され た普通に譲渡された（ａｓｓｉｇｎｅｄ）共係属米国特許出願第０３６，９８０ 号に記載され、参考のためにここに引用されている連続的サイズ減少方法を用い てサイズを小さく、もしくは均質化することができる。この技術においては、リ ポソーム溶液を、５００ｎｍの公称孔サイズを有するステンレススチールフィル ターを多数回圧力下、通す。さもなければこのリポソームはＬＵＶＥＴ法により 均一孔サイズフィルターを通して押し比すことができ、このＬＵＶＥＴ法はグリ スらの「ユニラメラ小胞体を製造する押し出し技術」という名称の、１９８６年 １月１６日付ＰＣＴ公開第８７／　００２３８号（参考のためここに引用してい る）に記載されている。この技術によってつくられる小胞体はＬ　Ｕ　Ｖ　Ｅ　 Ｔ　ｓと呼ばれるが、膜フィルターを通して圧力下、押出される。小胞体はまた ２００ｎｍのフィルターを通す押出し技術によってもつくることができる；この ような小胞体はＶＥＴ、。。Ｓとして知られている。またさもなければＭａｎｔ ｏｒ＋−Ｇａｕｌｉｎホモゲナイザーのような装置を使用してリポソームを均質 化することもできる。

本発明において使用されているように、生物活性剤という語は生物学的活性を有 するいずれの化合物をも包含すると理解され；例えばペプチド、ホルモン、毒素 、酵素、神経伝達物質、リポプロティン、グリコプロティン、免疫調節剤、イム ノグロブリン。

ポリサッカライド、細胞受容体結合分子、核酸、ポリヌクレオチド、等のような 薬および他の治療薬が、染料、放射性造影剤および蛍光剤のような生物学的追跡 剤と同様に挙げられる。特に、本発明は例えばピロカルピンのような眼の治療剤 である薬に関する。

本発明において、安定剤は存在する脂質の量および安定化剤の生物許容性に応じ た量で包含される。好ましくは、この組成物は約２〜２０％の安定剤を含有する 。製剤中に沈殿、結晶構造、ゲル、かたまりもしくは非均一性の物質が存在する 場合には、洗浄剤もしくは表面活性剤ではこの製剤の安定化がうまくできない。

２０％の安定剤では、製剤中にｈｅｘＵ　相脂質は見ら九ずに、リポソームのみ が存在しており、この二分子層は完全に安定化されている。

本発明において使用することのできる安定剤は洗浄剤もしくは表面活性剤のよう なものであり、例えばステアリン酸ポリオキシル、オクトキシノール（Ｔｒｉｔ ｏｎ　７２０）、もしくはラウレス−１２および２３、ラウレス−４および２３ の組合せ、そしてＴＰＧＳのようなポリオキシエチレンアルキルエーテルがある 。しかしながら、次のような洗浄剤は該製剤を安定化せず、したがって使用を薦 めることはできない：ポリオキシェチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレ ンソルビタン、ポリンルベート８０（丁ｗｅｅｎ　８０）、ソルビタンモノパル ミテートもしくはソルビタンモノラウレート、グリセロールモノステアレート、 テロキサポール、およびボロキサマーズ（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−１２７および Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８）である。

本発明で用いることのできる抗菌性防腐溶液としてはソルビン酸、Ｐ−ヒドロキ シ安息香酸メチル、エチル、ブチルもしくはプロピルエステル、ベンジルアルコ ール、クロルブタノール、ペンジルコニウムクロライド、フェネチルアルコール 、および水銀性防腐剤である。ソルビン酸は最終製剤中に約０．０１〜０．１％ （Ｗ／Ｖ）で存在するのが好ましく、最も好ましいのは０．０５％であり、水銀 製剤の場合は約０．００１〜０．００４％（Ｗ／Ｖ）　、クロロブタノールおよ びフェネチルアルコールの場合は約０．５％（Ｗ／Ｖ）　、（−してペンジルコ ニウムクロライドもしくは他の第４Ｒアミン防腐剤の場合は約０．０１もしくは それ以下（Ｗ／Ｖ）である。必要とされる防腐剤の量は抗菌効果試験（ＡＭＥ） および製剤中の他の成分との構造的および化学的適合性によって決めることがで きる。

この防腐溶液ははたエチレンジアミンテトラ酢＠　（ＥＤＴＡ）のような強化物 質を約０．０１〜０．１％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０５％で存在させること もできる。このような物質は防腐剤の抗菌活性を強めるものである。好ましくは 本発明ではソルビンｊｌ：ＥＤＴＡ　（０，０５％：　０．０５％）が用いられ る。

本発明の安定剤−二分子層ＴＨ５製剤において用いられる水溶液は蒸留水、０． １％（Ｗ／Ｖ）までのソルビン酸水溶液、もしくは０．１％までのジソジウムＥ ＤＴＡ二水和物水溶液を包含するが、これらの限定されるものではない。好まし くは滅菌水が用いられる。この水性相は生物活性剤、安定剤、防腐剤および緩衝 塩を、酸および塩基と同様に含有することもできる。

本発明の両親媒性物質二分子層形成物質（脂質）は１〜コフエロールの有機酸誘 導体の塩形態、もしくは構造的に関連した他の化合物を包含し、これによって水 溶液中での完全に閉鎖された二分子屡の形成が可能となるのである。特別のトコ フェロールの有機酸誘導体の塩形態の安定性は、この化合物が外部環境と接触し ないように水溶性化合物を隔離する能力に依存している。例えばアルファトコフ ェロールヘミサクシネート（ＴＢＳ）のようなトコフェロールの有機酸誘導体は いずれも本発明の実施に当って使用することができる。

このトコフェロール（例えばアルファトコフェロール）の誘導体をつくるために 使用できる有機酸はカルボン酸、ジカルボン酸、ポリカルボン酸、オキシ酸、ア ミノ酸およびポリアミノ酸を包含するがこれに限定されることはない。誘導体と してはエステル、ヘミエステルもしくはエーテルが挙げられる。塩形態は有機酸 の水溶性を増大させるので、どのような有機酸もアルファトコフェロールの誘導 体を形成するために用いることができるが、有機酸自体が水溶性であれば有利で ある。このような水溶性の有機酸としては酢酸、プロピオン酸、ブチル酸、吉草 散等のような水溶性カルボン＠（注：炭素数４までのカルボン酸は水と混合性で ある；炭素数５個の遊離カルボン酸は部分的に溶解性であり、より長い鎖の遊離 酸はほとんど不溶性である。）；マロン酸、コハク酸、ゲルタール酸、アジピン 酸、ピメリン■、マレイン酸等のような水溶性脂肪族ジカルボンＷ／！（注：鎖 が短い捏水溶性で好ましい；水への溶解性の境界線はＣ，からＣ１である）；そ してヘミメリチン酸、トリメシン酸、サクシンイミド等の水溶性芳香族ジカルボ ン酸；ポリカルボン酸；グリコール酸、乳酸、マンデル酸、グリセリン酸、りん ご酸、酒石醸、クエン酸等のような水溶性オキシ酸（注：カルボニル基のアルフ ァ炭素に付いている分枝鎖を含有するアルファヒドロキシ酸は加水分解を受けに くいので、本発明の実施に当っては有利である）；そしてアミノ酸もしくはポリ アミノ酸のいずれもが挙げられる。

誘導体とされたアルファトコフェロールの塩形態はアルファトコフェロールの有 機酸誘導体と原塩の対向イオン（例えば原塩の遊離塩基）の両者を適当な蒸発性 溶媒中で溶解し、該溶媒を蒸発もしくはアルファトコフェロールの有機酸誘導体 の塩形態からなる残渣を残す同様の技術により除去することによって製造するこ とができる。使用できる対向イオンは相当する塩を形成するためにトリス、２− アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノエタノール、ビス −トリスプロパン、トリエタノールアミン等を包含するが、これらに限定される ことはない。本発明において、ＴＢＳの遊離酸形態が好ましく用いられる。

本発明において、ＴＢＳは好ましくは最終製剤の１０．２％（ｗ／Ｖ）で使用さ れる。この製剤はまた、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジル エタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリンｃｐｓ）−ホスファチジルグ リセロール（ＰＧ）、ホスファチジン＠　（ＰＡ）　、ホスファチジルイノシト ール（ＰＩ）−スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）等のような他の脂質を包含するこ とができる。このリン脂質は合成品でもよいし、卵や大豆のような天然資源に由 来するものでもよい。例えば、このＴＨＳは卵ＰＣと７０：３０のモル比で使用 することもできる。更に、このリポソームはコレステロールヘミサクシネート（ ＣＨ３）とＴＢＳを９５：５ないし８０　：　２０（ＴＢＳ：ＣＢＳ）の比で含 有することもできる。

ポリビニルアルコールもしくはヒドロキシプコビルメチルセルロースのような親 水性ポリマー粘度増強剤化合物はリポソームの組織上への保持をも強化するもの であるが、これらを使用することもできる。これらの化合物は最終製剤の約０． ０５〜１．５％（Ｗ／Ｖ）濃度で使用される。これらの化合物が使用されるとき 、これらは最初の水性相製剤（ピロカルピン−水溶液）に添加される。

このピロカルピン−ＴＨ８製剤において、いくつかの溶液がこのリポソーム溶液 のｐＨを調整（滴定）するために使用でき；このような滴定剤としては例えば水 酸化ナトリウムもしくはクエン酸ナトリウムが包含さ九る。この最終製剤のＰＨ は約２．０〜６．５であり、より好ましくは約ｐ　Ｈ４，０〜５．０、最も好ま しくは約ｐＨ４゜５である。

本発明で用いることのできる酸要求性もしくは酸耐容性生物活性剤（薬）は、約 ｐＨ１，６〜６．０で安定なものはいずれも用いることができる。特に、この発 明はイミダゾール基を含有する薬、特にピロカルピンとリポソームとの会合に関 し、この場合、この方法に用いられるＰＨは好ましくは約４．５である０本発明 のリポソーム中の薬の量は使用される脂質（ＴＢＳ）の量に応じて変化すること ができる１例えば、総脂質に対する薬の重量比は約１：１から約１：３の範囲で 変化できるが、好ましくは約ｌ：２である。

４１製剤中に存在するピロカルピンの量（塩基当量）は約４％（ｗ／ｖ）である 。

脂質対安定化剤の比は使用される安定化剤に応じて約１０：１から１：１０の範 囲で変化することができる。

本リポソームの製造の間、該脂質を懸濁するために有機溶媒が使用できる。有機 溶媒としては、種々の極性および誘導性を有し、脂質を溶解するものが好ましく 、クロロホルム、メタノール、エタノールおよびメチレンクロライドを包含する が、これらに限定されることはない。この結果、脂質を含有する溶液（脂質およ び他の成分が全体に均一に分散している混合物）が形成される。溶媒は一般にそ の生物学的許容性、低毒性、および溶解化能力を基に選択される。本発明におい ては、メチレンクロライドが好ましい有機溶媒である。

本発明の方法によって得られるリポソーム製剤は標準的な方法により凍結乾燥も しくは脱水され、使用時まで貯蔵され、その後それらは水溶液で再水和すること ができるであろう、このよウナ方法は、再水和後リポソームの完全性を保つ乾燥 工程に先立って乾燥保護剤の添加を必要とする。このような保護剤は、例えばシ ュークローズ、デキストロース、マルトースもしくはマンニトールのようなサツ カライドであることができ、約２〜２０％の濃度で使用することができる。例え ば、約２．０．３．０．５．０および１０．０％（Ｗ　／　Ｖ　）のマンニトー ルが使用できる。

本発明の方法から得られるＴＢＳ組成物はその生物活性形態で会合している薬の 持続し、た作用を必要とする病気もしくは状態の治療において、哺乳動物（人間 を含めて）に対して治療的に用いることができる。この賦形剤はそれと会合して いるかその中に取り込まれている生物活性剤を有するリポソームの形態であるの が好ましい。本発明においては、アドレナリン性の薬であるピロカルピンが好ま しく使用される１本発明のリポソームによって処置することのできる状態として は、例えば緑内障のようなどロカルピンで処置できる病状が挙げられるが、これ に限定されることはない。

製剤の投与形態が、この化合物が搬送される生物における部位および細胞を決定 することができる。本発明のリポソームは単独で投与することができるが、一般 には投与の意図した経路および標準的な薬剤的慣習にしたがって選ばれた薬剤担 体もしくは希釈剤と混合して投与されるであろう。本発明の製剤は例えば筋肉内 、経口もしくは局部的なものであることができる。リポソームと一緒になったピ ロカルピンの投与においては、この製剤は局部的に、例えば目に投与される。

経口投与形態としては、本発明のリポソームは錠剤、カプセル、甘味入り錠剤、 トローチ、粉末剤、シロップ、エリキシル、水溶液および懸濁液等の形で用いら れる。錠剤の場合には、使用できる担体はラクトース、クエン酸ナトリウムおよ びリン酸塩が挙げられる。でん粉のような種々の崩壊剤、ステアリン酸マグネシ ウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような滑沢剤が、錠剤に通常用い られる。カプセル形での経口投与には、有用な希釈剤はラクトースおよび高分子 量のポリエチレングリコールである。

水性懸濁液が経口用に必要とされるときには、活性成分は乳化および懸濁剤と一 緒にされる。望ましい場合には、成る種の甘味剤および／または香り何割を加え ることができる。

局部的適用に当っては、本発明のリポソームはゲル、油剤、乳化剤等の投与形態 中に導入することができる。このような製剤は、クリーム、ペースト、軟こう、 ゲル、ローション等の形で、直接投与することができる０本発明の組成物はまた 化粧製剤の形で使用することもできる。このような製剤においては、これらの製 剤はクリーム（例えば湿潤化剤）、ローション、ゲル等の形であることができる 。

本発明の組成物は緑内障のような眼病の処置における眼用投与として使用するこ とができる。このような投与においては、この組成物は例えば軟こうもしくは滴 下し得る液体であり、塗り薬あるいは点眼剤のようなこの分野でよく知られてい る眼薬搬送システムによって投与することができる。この組成物は更にヒアルロ ン酸、コンドロイチン硫置塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはポ リビニルアルコールのような粘液擬態剤（ｍｕｃｏｍｉ＋ｏｅｔｉｃｓ）　；そ してソルビンＩＩＥＤＴＡもしくはペンジルコニウムにような防腐剤および通常 の量の希釈剤および／または担体物質に含有することができる ピロカルピン治療に応答するような病状の治療における人間への投与については 、投与される人間に対して適当な投与量を処方医が最終的に決めるであろう。そ してこれは年齢、体重、病人の病気の性質および重さと同様、個人の反応により 、変わることが予測される。リポソームの形態における薬の投与量は一般的に、 大体遊離の薬に対して採用されるものであろう。しかしながら、ある場合にはこ れらの限度の範囲外の投与量を投与することが必要となるかもしれず、そのよう な場合には処置を行なっている医者がその投与量は決めることになるであろう。

次の実施例は説明のために与えられるものであり、本発明の範囲を限定するため のものではない。

失胤叢よ 注射用滅菌水１４０ｍＲにＥＤＴＡｏ、１１ｇｍ及びソルビン酸０．１ｇｍを加 えた。この溶液は完全に溶解するため簡単に加熱され、ついで冷却された。つい でピロカルピンＨＣＱ　（９，４２ｇｍ）をこの水性溶液に加え、混合し、その ｐＨをＮａＯＨ′７：ｐＨ４，５に調節した。他の容器中で、Ｔ　ＨＳ　２０． ４　ｇ　ｍをポリオキシエチレンアルキルエーテル（ラウレス（Ｌａｕｒｅｔｈ ）　−２３）　２４．０　ｇ　ｍに加え、この溶液を混合した。ついで、このピ ロカルピンを含有する水性溶液を有機溶媒中のＴＨ８溶液に加え、そしてこの混 合物を数分間渦巻き状に激しく混合した。ついでこの溶液を４０℃にセットした 水浴中の回転蒸発器上に置き、その溶媒を一時間で蒸発した。回転蒸発後、この 溶液を、滅菌水を加えて２００ｍ　ｆｌ容量にし、その溶液のＰＨをＮａＯＨで 約４．５に調節し、そして得られたリポソーム混合物を５．０ｍ　Ｈの一定量に 分割し、ガラスびん中に密閉し、４℃で貯蔵した。この最終製剤はＴ　ＨＳ　１ ０．０％、ピロカルピン４％、安定剤１２％、そしてＥＤＴＡ及びソルビン酸各 ０．０５％（Ｗ／Ｖ）を含有した。

１１銖え 安定剤としてポリオキシエチレンアルキルエーテル（ラウレス＝１２）を用いて 実施例１の操作及び物質が使用され、くり返された。この最終濃度は次のとおり であった・ラウＬ／Ｘ−１２１２％・ピロカルピン４％、ＴＨＳ１２％、そして ソルビン酸及びＥＤＴＡの各Ｏ，ＯＳ％。

１産且ｙ 実施例１のＴＨ５小胞体（ｖｅｓｉｃｌｅ）を次のようにして、凍結−粉砕電子 顕微鏡で試験をした。

１ｏ％ＴＨ８小胞体標本の一定量（０，１−０，３μΩ）を一対のバルゼルス（ Ｂａｌｚｅｒｓ）　（ナシュア、ＮＨ）銅支持板の間にはさみ、液体プロパン中 に２３℃から急速に沈めた。試料を粉砕し、２Ｘ１０−′ｍ　ｂａｒ又はそれ以 上の真空下、−１１５℃でバルゼルス凍結−粉砕ユニット中の二重反復装置上で 反復実施した。レプリカを３ＮＨＮ○、中に浮遊させ、ついでクロロソクス（Ｃ ｈｌｏｒｏｘ）溶液の標準系（ｇｒａｄｅｄ　５ｅｒｉｅｓ）で洗浄した。最後 に、これらを蒸留水で洗浄し、３００Ｈｅスメツシユ銅ｌｌ４（ポリサイエンス 、ＦＡ）上に取り上げた。レプリカを倍率２２，０００倍のフィリップス３００ を子顕微鏡で観察した。

災庭態主 以下のようにして、水性相及び有機相を調製した２５％（Ｗ／Ｖ）塩基性当量ピ ロカルピン−’ＨＣＩＩ水性溶液を注射用に滅菌水で調製した。１０．２％（ｗ ／ｖ）ｄ−アルファトコフェロール酸サクシネート及び１２％（Ｗ／Ｖ）ワウレ ス−１２フｓ液をメチルクロライドで調製した。有機相１００ｍ　Ｑを５００ｍ 　ｎ丸底フラスコに移し、水性相８０ｍＱを加えた。ｐＨ指示紙で測定しながら 十分な水酸化ナトリウム（約０．５〜１．０ｍ　Ｑ　）を加えて、得られた溶液 のｐＩ（をＰＨ４，５にｙＡ′！ＩＢシた。ＮａＯＨ又はＨＣｌ２を用いてその ｐＨを約４．５に調節するため定期的に止めながら、この溶媒を真空蒸発（３５ ℃にセットされた水浴中での回転蒸発）により除去した。その溶媒の除去に続い て、その容量を滅菌水で１００ｍ　ｎに調ｉした。これは最終ピルカルピンＨＣ Ω濃度４％であった。

寒五匠旦 実施例４の方法により作られたポリオキシエチレンアルキルエーテル（ラウレス −１２）を有する低ｐＨピロカルピンリポソームを目の病理（毒性）の立証のた めに雌のニューシーラント白うビット３匹の眼に入れて試験した。各ラビットは その賜に局部的に適用される２５μ２投与量で４時間毎に投与され、７２時閣、 毒性が観察された。この古典的ドレイズ（Ｄｒａｉｚｅ）スコアリングシステム が用いられた；それらのラビットは膨潤、角膜又は結膜損傷。

充血及び一般的苦痛について観察された。このラウレス−１２を含有するリポソ ーム調剤は十分に耐容性のあるものであった。

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．トコフェロールの有機酸誘導体を含有する有機相と低ｐＨを有する水性相と を安定剤の存在下混合する工程を包含する低ｐＨトコフェロール組成物の製造方 法。
2. ２．水性相が更に追加的に生物活性剤を含有する請求の範囲１記載の方法。
3. ３．安定剤が有機相に存在する請求の範囲１記載の方法。
4. ４．ｐＨが約４．０〜５．０である請求の範囲１記載の方法。
5. ５．ｐＨが約４．５である請求の範囲４記載の方法。
6. ６．トコフェロールの有機酸誘導体及び安定剤を低ｐＨで含有するリポソーム組 成物。
7. ７．請求の範囲６記載の組成物の眼病処置有効量をそのような処置の必要な患者 に投与することを包含する眼病の処置方法。
8. ８．トコフェロールがアルファトコフェロールヘミサクシネートである請求の範 囲６記載の組成物。
9. ９．組成物が更に追加的に生物活性剤を含有する請求の範囲８記載の組成物。
10. １０．生物活性剤が低ｐＨ条件を必要とするかもしくは許容するものである請求 の範囲９記載の組成物。
11. １１．低ｐＨ条件を必要とする生物活性剤がイミダゾール基を有する請求の範囲 １０記載の組成物。
12. １２．生物活性剤がピロカルピンである請求の範囲１１記載の組成物。
13. １３．安定剤が洗浄剤を含有する請求の範囲６記載の組成物。
14. １４．洗浄剤がポソオキシエチレンアルキルエーテル又はエステル、ポソオキシ ステアレート、オクトキシノール又はＴＰＧＳである請求の範囲１３記載の組成 物。
15. １５．ポソオキシエチレンアルキルエーテルが平均約１２エチレンオキサイド単 位を有する請求の範囲１４記載の組成物。
16. １６．ｐＨが約３．０〜５．０である請求の範囲１５記載の組成物。
17. １７．ｐＨが約４．５である請求の範囲１６記載の組成物。
18. １８．組成物が更に追加的に防腐剤を含有する請求の範囲１７記載の組成物。
19. １９．防腐剤がｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、ベンシルアルコール、ベンザ ルコニウムクロライド又はソルビン酸である請求の範囲１８記載の組成物。
20. ２０．防腐剤がソルビン酸である請求の範囲１９記載の組成物。
21. ２１．請求の範囲２０記載の組成物の眼病処置有効量をそのような処置の必要な 患者に投与することを包含する眼病の処置方法。
22. ２２．請求の範囲２０記載の組成物および製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤 を含有する製薬学的組成物。
23. ２３．ピロカルピンの眼病処置量を包含し、その際安定剤が平均約１２エチレン オキサイド単位を有するポソオキシエチレンアルキルエーテルである請求の範囲 ６記載の組成物。
24. ２４．安定剤の存在下、生物活性剤を含有する低ｐＨでの水性溶液と有機溶媒中 にトコフェロールを含有する有機溶媒溶液とを混合する工程を包含する低ｐＨを 必要とするかもしくはそれを許容する生物活性剤と生理学的ｐＨを必要とするト コフェロールの有機酸誘導体を含有するリポソームを結合する方法。
25. ２５．ｐＨが約３．０〜５．０である請求の範囲２４記載の方法。
26. ２６．ｐＨが約４．５である請求の範囲２５記載の方法。
27. ２７．有機溶媒を除去する追加工程を包含する請求の範囲２６記載の方法。
28. ２８．所望する値に得られた溶液のｐＨを調節する追加工程を包含する請求の範 囲２７記載の方法。
29. ２９．有機溶媒がメチレンクロライドである請求の範囲２４記載の方法。
30. ３０．水性媒体が水又は緩衝液である請求の範囲２４記載の方法。
31. ３１．ピロカルピンＨＣｌを含有する低ｐＨの水性溶液とメチレンクロライド中 にアルファトコフェロールヘミサクシネート及び安定剤を含有する有機溶媒とを 混合する工程及びメチレンクロライドを除去することを包含する低ｐＨを必要と するかもしくは許容する生物活性剤と生理学的ｐＨを必要とするトコフェロール の有機酸誘導体を結合する方法。