JPH0347091A - 新規な腫瘍関連抗原、その抗体、その組成物およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原、特に腫瘍関連抗原の特性化に関する。

さらに、本発明は、このような抗原と特異的に反応する
抗体に関する。さらにまた、本発明は、このような抗体
の生産方法ならびにこれらの診断および治療上の用途に
関する。

癌を診断し、処置する上において、モノクローナル抗体
の潜在的役割が、近年の研究および考察の的となってい
る。特に関心を集めているのは、癌の経過、例えば治療
器の癌の経過を検査し、モニターするための免疫検定法
にモノクローナル抗体が使用できる可能性である。モノ
クローナル抗体はまた、生体内（インビボ）において腫
瘍関連抗原と結合できる能力によって腫瘍の画像化（イ
メージング）および治療に適用できる可能性を有してい
ることも特に関心を集めている。

さらに、モノクローナル抗体技術の発達により、ヒト腫
瘍における複雑な抗原性の研究が可能となっている。具
体的に言えば、モノクローナル抗体の正確な免疫反応性
によって、ヒト腫瘍から発現される独特の抗原を同定し
、分類することができる。

したがって、このような独特の腫瘍関連抗原を特性化す
ることは、癌を診断および治療するためのモノクローナ
ル抗体を生産し、使用することをより完全に活用できる
手段をもたらすものである。

ある種の抗原は、ヒト腫瘍細胞および正常細胞の両細胞
から発現される。したがって、このような抗原は、「腫
瘍に特異的な抗原Ｊと呼ばれずに、「腫瘍関連抗原Ｊと
呼ばれる。これらの腫瘍関連抗原が診断および治療にお
いて重要であることは、腫瘍細胞から発現される抗原が
正常細胞からのものと比較して相対的に過剰量であるこ
と、および生体内において正常細胞よりも腫瘍細胞によ
って発現される抗原に対して抗体が選択的であるごとに
由来する。生体内に投与された抗体が腫瘍細胞から発現
される抗原に対して比較的選択的であることの原因とし
ては、（１）悪性増殖の、異常で急速な代謝により癌細
胞からの抗原の発現性が増大すること、および（２）腫
瘍細胞膜のバリヤーとしての性質が破壊することにより
、腫瘍組織から発現される抗原が抗体に接近しやすくな
ること、が考えられる。

現在までのところ、限られた数の腫瘍関連抗原しか十分
に特性化されていない。たとえば、１９８４年９月１１
日発行のコブロースキー（Ｋｏｐｒｏｖｓｋ　ｉ）らの
米国特許筒４．４７１．０５７号（標題「結腸直腸癌腫
の検出」）には、ハイブリドーマセルラインＡＴＣＣ番
号１−ＩＢＯ８５９から発現されるモノクローナル抗体
（以下、本明細書ではＺＣＥＯ６３、センタコア（Ｃｅ
ｎｔａｃｏｒ）　１９　、９または１９．９と称する）
と反応する結腸直腸癌腫モノシアロガングリオシド（ｍ
ｏｎｏｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）抗原が記載
されている。

コブロースキーらによれば、その抗原は、内胚葉起源の
糖脂質である。別に、結腸癌腫の８０％以上に見いださ
れる腫瘍関連抗原（ＴΔＧ−７２）が、ジジンソン（Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ）らのＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
４６，８５０−８５７（１９８６）に記載されている。

ＴΔＧ−７２は、モノクローナル抗体８７２．３と反応
する高分子量の多量にグリコジル化された糖タンパク質
であると報告されている［以下、本明細書ではＺＢＣ０
６２と称する］。

さらに、診断あるいは予後のマーカーとして有用な腫瘍
関連抗原の中には、すべての患者、または疾病のすべて
の段階および症状にわたり存在し得ないものがある。し
たがって、同一の腫瘍組織により発現される１つ以上の
腫瘍関連抗原を同定し、特性化すれば、診断上の識別性
と治療効果が増大される。また、癌の診断および治療を
行うには、特定のタイプのヒト腫瘍に関連するーＢＹ（
ｓｅｔ）の、−あるいは一連（ｐａｎｅｌ）の個別の抗
原を利用するのが望ましい。このような事情から、独特
の腫瘍関連抗原をさらに同定し、特性化することが要求
されている。

本発明は、ヒト組織、およびヒト癌腫セルラインに存在
する新規な抗原を発見し、特性化したことに基づく。し
たがって、本発明は、約６００Ｋｄから１，０００Ｋｄ
の分子量を有し、かつ約４．３から約４．５および約４
．８から約５．０の等電点を示す独特な腫瘍関連糖タン
パク質抗原を目的とするものである。

本発明はさらに、本明細書で規定される抗原に特異的な
抗体、およびこのような抗体を生産する方法を提供する
。また、本発明は、免疫組織化学的方法および免疫検定
法によって癌をインピトロ検出し、診断するための、な
らびに以下に記載するように、ヒト癌を生体内で診断し
、処置するという本発明抗体における用途をも提供する
ものである。

第１図は、一連のモノクローナル抗体について試験した
本発明の抗原を含有する結腸癌腫のサイドシル（細胞質
ゾル）の等電点電気泳動パターンを示すグラフである。

第２図は、Ｔ１８３腫瘍を担うヌードマウスにおける注
射後４８時間のＩｌｌ　ｌ　ｎ標識化ＣＣＲ０８６の生
体分布を示すグラフである。

既述のように、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ｌ（８８７
８６（寄託臼１９８５年４月１９日）のハイブリドーマ
セルラインから産生されるモノクローナル抗体ＣＣＫＯ
６，１と反応する腫瘍関連抗原、およびＡＴＣＣ寄託番
号ＨＢ　　１００５１（寄託臼１９８９年３月９日）か
ら産生されるモノクローナル抗体ＣＣＲ０８６を提供す
るものである。

本発明の抗原の物理化学的および免疫学的性質、具体的
にはモノクローナル抗体ＣＧＫＯ６１およびＣＣＲ０８
６との反応性により、特性化、およびヒト腫瘍組織など
の癌性のヒトセルラインおよびヒト組織に存在する他の
抗原との識別が可能となる。本明細書で使用している「
セルライン」なる用ｉ１Ｅは、インピトロ、たとえば組
織培養物中で、またはヌードマウスなどの適当な動物宿
主における異種移植片として増殖可能な繁殖し得る細胞
を意味する。樹立セルライン由来の細胞は無制限に入手
できるので、それは、入手性が限定されている正常およ
び癌の組織由来の細胞と区別される。

「組織標本」なる用語は「組織」なる用語と互換性をも
って使用され、手術、バイオプシー（生検）またはオー
ドブシー（剖検）によって得られる固形試料、またはそ
れと同様の機能を営む細胞の他の凝集体を意味する。

このように、本発明に係る抗原の同定可能な特徴および
性質を以下に記載する： ａ）本抗原は、ヒト結腸癌腫セルラインに存在する。モ
ノクローナル抗体ＣＣＫＯ６１を使用した標準的な酵素
結合免疫吸着結合性検定（ＥｌｌＳΔ）法により、この
抗原は結腸癌腫セルラインに存在することは示されたが
、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、肺腺癌および黒色腫セルラ
インなどの他のセルラインには存在しない。

ｂ）本抗原は、正常結腸および結腸癌腫組織のサイドシ
ル中に産生される。ヒト結腸癌腫および組織から精製さ
れた原形質膜とのＣＣＫＯ６１の反応性は、通常のＥＬ
　Ｉ　ＳＡ法によって証明される。比較すれば、抗体Ｃ
ＣＫＯ６１は、乳癌、前立腺癌、肺腺癌および黒色腫セ
ルラインなどの他の正常または腫瘍組織から精製された
膜とは反応性を示さない。

Ｃ）免疫ベルオキシダーゼ染色法による抗体ＣＣＫＯ６
１およびＣＣＲ０８６との強い反応性によって示される
ように、正常結腸、結腸癌、食道癌および胃癌中に本抗
原が存在することが、１Ｍ’ｌｔ＝的な免疫組織学的方
法により証明される。比較すれば、乳癌、肺腺癌、腎臓
癌、小郡細胞癌および黒色腫では、これらの抗体との反
応性は弱いか、または全く無いことが示されている。

ｄ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３
−ＰＡＧＥ）およびウェスターン免疫プロット分析（Ｗ
ｅｓｔｅｒｎ　ｉｍＩ！１ｕｎｏｂｌｏＬ　ａｎａｌｙ
ｓｉｓ）によって、本抗原の分子量は約６００　Ｋｄか
ら約１．０００Ｋｄであることが分かっている。

ｅ）標準的な方法に基づく目Ｃ−グルコサミンによる結
腸癌細胞の代謝標識法（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｌａｂｅ
ｌｉｎｇ）およびＣＣＫＯ６１との本抗原の免疫沈降法
により、本抗原は糖タンパク質であることが示されてい
る。

ｒ）溶液中の抗原の等電点電気泳動法により、等電点は
、約４．３から約４．５および約４．８から約５．０の
範囲内にあり、約４．４および約４゜９がピークである
こ七が分かっている。

ｇ）種々のムチン調製物を用いた研究により、モノクロ
ーナル抗体ＣＣＲ０８６およびＣＣＫＱ６１は、本明細
書で特性化した抗原の種々のエピトープに対する特異性
を有していることが判明している。

上記事項を要約すれば、本発明の腫瘍関連抗原は、分子
量的６００，０００ダルトン（６００Ｋｄ）から約ｔ、
ｏｏｏ、ｏｏｏダルトン（ｌｏｏＯＫｄ）を有し、かっ
等電点的４．３から約４，５および約４．８から約５．
０を示す実質的に純粋な糖タンパク質であると特性化さ
れる。より詳細には、本発明の抗原は、等電点的４．４
および約４．９を示すものと特性化される。さらに、こ
の腫瘍関連糖タンパク質は、正常結腸および結腸癌組繊
細胞から発現され、そしてヒト結腸癌セルラインに存在
している。

本発明の抗原を他の腫瘍関連抗原などの他の抗原と識別
する上で特に重要なことは、本明細書で特性化した抗原
に対するモノクローナル抗体ＣＣＫＯ６１およびＣＣＲ
０８６との特異性である。

さらに、本発明”によって規定される抗原に対するＣＣ
ＫＯ６１およびＣＣＲ０８６の特異性は、ヒトを起源と
する他の材料からこの抗原を単離精製する手段、最終的
には抗原決定基を特性化する手段を提供するものである
。このような精製された抗原およびその決定基は、当業
界周知の方法を使用して診断および治療に適用できるモ
ノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を生産する
のに有用である。例えば、精製抗原は、本抗原に特異的
なモノクローナル抗体を発現するネズミハイブリドーマ
（ネズミ雑種細胞）を得るために動物を免疫するのに使
用することができる。さらに、本抗原は、たとえばゴー
ス（Ｇｈｏｓｅ）らのＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、　９３巻、　３２６−３２７（１９８３
）に記載されているようにしてウサギ、ヤギまたは池の
動物の免疫応答を刺激し、それから血清ポリクローナル
抗体を得るために使用することができる。また、本抗原
は、目的とする抗体、たとえばモノクローナル抗体また
はヒト組織または体液中に存在する抗体の特性化を行う
ために使用することができる。本発明の説明に当たって
は、「特異性」なる用語は、「特異的反応性」および「
免疫反応性」なる用語と互換性をもって使用する。

本発明は、本発明によって特性化される抗原に特異的で
あるモノクローナル抗体、およびその生産方法を提供す
るものである。このような抗体としては、好ましいモノ
クローナル抗体ＣＣＫ、Ｑ（３１およびＣＣＲ０８６と
実質的に同様な、本発明の腫瘍関連糖タンパク質との免
疫反応性を有するモノクローナル抗体がであることが好
ましい。あるいは、本発明のこの目的における抗体では
、起源がポリクローナルであってもよい。本発明のモノ
クローナル抗体は、ヒトにおける癌、特に結腸直腸癌を
検出し、診断し、治療するのに有用であり得る。さらに
このような抗体は、本発明によって提供される抗原を単
離精製するため、および正確な決定基を特性化するため
に利用することができる。

既述のモノクローナル抗体は、ケネット（Ｋｅｒ＋ｎｅ
Ｕ）ら編のガーハード（Ｇｅｒｈａｒｄ）、Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　３７０−３７１
（ブレナン・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ１９８
０））に基づき改変したケーラーとミルスタイン［Ｋｏ
ｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、ネイチャー（に
ａｔｕｒｅ）２５６、４９５−４９７（＋９７５）］の
方法にしたがい生産することができる。本発明にしたが
えば、本発明の精製抗原または結腸癌から得たヒト腫瘍
組織の可溶性分画で、マウスまたは当業界周知の他の適
当な宿主を免疫する。免疫後、免疫したマウスの肺臓細
胞を適当なマウス骨髄腫細胞と融合させ、雑種細胞セル
ラインの混合物を得る。得られたセルラインを雑種細胞
セルラインの選択用培地で培養する。

次いで、本明細書で特性化される抗原と特異的であるモ
ノクローナル抗体、好ましくはＣＧＫＯ６１またはＣＣ
Ｒ０８６を産生ずる生存雑種細胞をクローンし、その結
果産生されたモノクローナル抗体を回収する。

本発明は、ヒト癌、特に結腸直腸癌をインピトロで検出
するための方法を包含している。既述の本発明にかかる
独特な腫瘍関連糖タンパク質を特性化することによって
、患者の検体中におけるその検出が可能となる。インピ
トロ検出の１つノ方法は、免疫組織化学法によるもので
ある。患者検体中の抗原を免疫ｆ（ｌ織化学的に検出す
る方法は、当業界周知であり、それにはティラー（Ｔａ
ｙ　ｆｏｒ）の＾ｒｃｈ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｌａｂ、
　Ｍａｄ、　１１１２．１１３（１９７ｇ）によって教
示された方法がある。本明細書において手垢に示せば、
癌の疑いのある患者（疑似癌患者）から得た組織検体を
本発明の腫瘍関連抗原に特異的な抗体、好ましくはモノ
クローナル抗体、より好ましくはＣＣＫＯ６１およびＣ
ＣＲ０８６と接触させる。

次いで、標準的な免疫組織化学法によって組織検体を選
択的に染色することにより、抗体が抗原と結合した部位
を検出する。本明細書で使用している組織とは、細胞の
固形４Ａ合体、または同様の機能を営む細胞の他の凝集
体を意味する。免疫組織化学法または免疫検定法によっ
て患者検体中の本発明の腫瘍関連抗原を定量的に、また
は定性的に測定することは診断学的に有用であり、また
、それは疾患状態の経過の指標、またはそれに相関する
ものとなり得るものである。

同様に、免疫検定法により患者の体液試料中の抗原性物
質をインピトロにて検出する方法は、当業界周知である
。体液試料には、血清、血漿、尿、唾液、汗、腹水、胸
膜液、および他の体液が包含される。本発明においては
、患者の体液試料を本発明の腫瘍関連抗原と特異的であ
る少なくとも１つの抗体、好ましくはモノクローナル抗
体と接触させ、本明細書に記載の方法または当業界周知
の方法によって体液試料の抗原成分と抗体との結合性を
測定する。拮抗的または非拮抗的な免疫検定法によって
、本発明によって規定される抗原を定量的または定性的
に検定することができる。モノクローナル抗体、好まし
くはＣＣＫＯ６１およびＣＣＲ０８６は、この本発明の
目的に使用することができ、またそれが好ましい。ある
いは、本発明によって提供される抗原に対して特異的で
あるポリクローナル抗体を使用することもできる。さら
に、使用するのに好ましい免疫検定法は、標的抗原の互
いに妨害し合うことのないそれぞれの決定基と結合する
よう選択されたモノクローナル抗体を使用する２点免疫
測定法（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ　ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ
　ａｓｓａｙｓ）である。この２点免疫測定法は、デイ
ピッド（Ｄａｖｉｄ）らに対して１９８３年３月８日に
発行された米国特許第４．３７６、１１０号に記載され
ている。

番中飾 第２図では、腫瘍保持マウスの結腸直腸癌に本発明の抗
体が有意に局在化することが示されており、このことは
本発明がインビボ適用において有用であることを示唆す
るものである。たとえば、本発明の１つの目的は、ヒト
における癌、具体的には結腸直腸癌の生体内診断および
治療である。

本発明によれば、本発明のＩＮ！ＴＩ瘍関連抗原と特異
的に反応する抗体を、前もって決定しておいた有効量で
疑似癌患者に投与し、次いでその抗体の局在部位を検出
することによって、腫瘍の位置決め、および検出を行う
ことができる。標準的なイメージング法、好ましくは二
次元イメージング法および／または単一光子放出電算断
層撮影法（ＳＰＥＣＴ）により、局在化の部位を決定す
る。イメージング適用における、標識した、および標識
していない抗体の前もって決定しておく有効量は、約２
から約２００ｍｇ、好ましくは約５から約８０＋ｇ、さ
らに好ましくは約２０から約４０ｍｇである。本発明の
抗体、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくは
ＣＣＫＯ６１またはＣＣＲ０８６は、製薬的に許容され
得る担体に入れ、インピトロ検出を可能にするようマー
カーで標識して患者に投与する。イメージングに当たっ
ては、抗体を、ガンマ線エミッター、ポジトロンエミッ
ター、およびＸ線エミッターなどの放射性同位元素、た
とえばインジウム−１１１，テクネシウム−９９ｍ、ヨ
ウ素−１２５、ガリウム−６７、およびガリウム−６８
で標識するのが好ましい。ＣＧＫＯ６１およびＣＣＲ０
８６などの抗体は、インジウム−１１１などのガンマ線
を放出する標識物で標識するのが好ましい。イメージン
グおよび治療の用途としての製薬的に許容され得る担体
は当業界で周知であり、それには重炭酸緩衝液、リン酸
緩衝液、リンゲル溶液、および生理食塩水があり、要す
ればそれらに５％デキストロースまたはヒト血清アルブ
ミンを加える。本発明のさらなる利点として、本発明抗
体のある種のものは、常法では検出されない結腸直腸癌
の部位を検出できることを発見した。このような場合、
従来他の方法では検出されなかった腫瘍部位を位置決め
する際の処置方法が劇的に変化し得る。

癌の治療において本発明の方法にしたがえば、本発明の
腫瘍関連抗原と特異的に反応する抗体、好ましくはモノ
クローナル抗体の前もって決定した存効ｍを、肢検癌患
者に投与する。治療適用に際した抗体の前もって決定し
た有効量は、約１から約１００ｍｇ、好ましくは約２か
ら約４０ｚｇ、より好ましくは約２．５ｍｇから約１０
ｍｇである。

モノクローナル抗体、好ましくはＣＣＫＱ５１およびＣ
ＣＲ０８６抗体は、既述のように１２Ｍ的に許容され得
る担体に入れ、腫瘍部位に供給させるために選択した適
当な治療物質とコンジュゲートさせて癌患者に投与する
。治療物質としては、放射性同位元素、薬物、毒物およ
び生物学的タンパク質がある。放射性同位元素には、イ
メージング法に有用なもの、ならびにα線およびβ線粒
子のエミッター、たとえばイツトリウム−９０，スカン
ジウム−４７およびヨウ素−１３１がある。薬物として
は、一般に、アルキル化剤、抗増殖剤、チューブリン結
合剤、細胞毒性物質などを挙げることができる。好まし
い化合物は、ナイトロジェンマスタード剤、ビンカアル
カロイド、ダウノマイシン族、マイトマイシン、プレオ
マイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジン族の薬物
、およびスルホニル尿素類［欧州特許公開第２２２．４
７５号、１９８７年５月２０日公開コである。これら化
合物の中で特に有用なものは、ドキソルビシン、ダウノ
ルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプ
テリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンＣ
１ポルフイロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メ
ルカプトプリン、シトシン・アラビノシト、エトポサイ
ド、メルフアラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、
ラウロシジンなどである。治療物質として適当である毒
性物質は、ボドフィオフィロトキシン、リジン、トリコ
テセン、コルヒチン、および／ニードモナスのエンドト
キシンである。治療価値を有している生物学的タンパク
質には、ホルモン、インターフェロン（α、βおよびγ
）、インターロイキン類がある。癌治療に当たってこの
ような治療物質を抗体に結合させる方法は、当業界周知
である。たとえば、抗体に治療物質を結合させる方法は
、ブレイア−（Ｂｌａｉｒ）らのＪ、　１ｍｎ＋ｕｎｏ
１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５９．１２９（１９８３）、ゴ
ース（Ｇｈｏｓｅ）らのＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｎｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　９３，２８０（１９８３）、およびア
ルパーツ（Ａｌｖａｒｅｚ）らの１９８８年５月３日発
行の米国特許第４．７４１．９００号に記載されている
。もう１つの目的は、本発明抗体を治療物質に結合させ
ることである。本発明の治療用組成物の投与方法には、
静脈内、腹腔内、リンパ内、くも膜下内、動脈内注入ま
たは注射がある。

本発明の他の目的は、本明細書で特性化した抗原に特異
的な反応性を有する抗体、および既述のＰｌソ薬的に許
容され得る担体からなる医薬組成物を提供することにあ
る。この本発明の医薬組成物の製造に当たって使用され
る抗体は、モノクローナル抗体が好ましく、またモノク
ローナル抗体ＣＣＫＯ６１およびＣＣＲ０８６がさらに
好ましい。

これらの抗体も、既述の治療物質で標識することができ
る。

さらに、生体内における癌の診断および治療に関連して
当業者ならば理解できるであろうが、本発明の既述の腫
瘍関連抗原に対して特異的に反応する抗体または抗体断
片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の混合体からなる抗体調製物は
、特定の場合には、腫瘍の検出、位置決め、および治療
を効果的に行うのに使用することができる。

本発明においてはさらに、本発明の抗原の少なくとも１
つの決定基は、意外にも遺伝病である膵嚢胞性僚維症に
関連するムチン抗原から発現されることが発見された。

さらに詳細に言えば、本発明者らは、モノクローナル抗
体ＣＣＫＯ６１は、膵嚢胞性線維症の指標であるムチン
抗原の高い血清レベルを検出するのに有用であろうこと
を見いだした。ＣＣＫＯ６１はルイスの血液型システム
とは無関係なムチン抗原のタンパク質エピトープと反応
するので、ＣＣＫＯ６１は、膵嚢胞線維症に関連ケるシ
アロシル化ルイス抗原を検出可能な量で遺伝学的に産生
ずることのできない患者における、その疾患の発見に特
に有用である。したがって、本発明は、血清試料をモノ
クローナル抗体ＣＣＫＯ６１と接触させ、免疫検定によ
りＣＣＫＯ６１の試料成分との結合性を測定することに
よって、膵嚢胞線維症を検出する方法を教示するもので
ある。好ましくは、免疫検定には膵嚢胞線維症に関連す
るムチン抗原と結合することのできる第２の抗体を使用
する。膵嚢胞線維症を検出するのに特に好ましいことは
、ＣＣＫＯ６１および第２の抗体が膵嚢胞線維症に関連
する血清ムチン抗原の互いに妨害し合うことのないそれ
ぞれの決定基と結合するように選択したモノクローナル
抗体である第２の抗体を使用する２点免疫測定法の免疫
検定に、ＣＣＫＯ６１を使用することである。

本発明をさらに詳細に説明するため、以下に実施例を挙
げるが、これらは本発明の限定を意図するものでない。

実施例１ モノクローナル抗体ＣＣＫＯ６１の生産モノクローナル
抗体ＣＣＫＯ６１を産生するＡＴＣＣ寄託番号！−ＩＢ
８７８６の雑種セルラインを調製するため、雌性Ｂａ１
ｂ／ｃマウスしカールス・リバー・ブレ、ディング・ラ
ボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅ
ｄｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウイルミント
ン２ＭＡコに、ヒト結腸癌（以下、５Ｃ８３−４２１と
称する）のオードブシー検体から得たルｎ瘍サイドシル
２００μｇを１４日間隔で５同腹腔内投与し、免疫した
。

５回目の免疫後３日経過して、マウスから肝臓を無菌的
に取り出し、ＡＰ−ＭＥＭ培地［フロー・ラボラトリー
ズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、イングル
ウッド、カリフォルニアコ中に入れた。Ｉｌ！ＩＩ臓を
注意して粉砕し、肺臓細胞を培地に遊離させた後、細胞
塊をピペッティングにより分裂させ、遠心管に移した。

５分間放置した後、細胞懸濁液を沈降物質から分離させ
、それを１，０Ｏ０９で５分間遠心した。洗浄し、２回
口の遠心を行った後、得られた肺臓細胞ペレットをＡＰ
−ＭＥＭ培地に再懸濁した。

ガーハードのモノクローナル抗体、　Ｒ，Ｋｅｎｎｅｔ
ｔらの３７０−３７１（プレノン・プレス１９８０）に
基づき改変したケーラーとミルスタインのＮａｔｕｒｅ
　２５６．４９５−４９７（１９７５）の操作法にした
がって、細胞融合を行った。簡単に説明すれば、肺臓細
胞ｌＸｌ０’個を、ＡＰ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地中の３５％
ポリエチレングリコール（Ｐ　ＥＧ　１５００）１．０
ｘ（ｌの中で、マウス骨髄腫セルラインであるＰ３−Ｘ
６３−Ａｇ８．６５３（Ａ　Ｔ　ＣＣ番号ＣＲＬ　　１
５８０）２．５ＸＩＯ’個と融合させた。融合後、得ら
れた細胞を、３７°Ｃ１５％ｃｏ、のインキュベーター
中、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チ
ミジン）において培養した。。

得られたハイブリドーマから産生された抗体を、固相酵
素免疫測定法（ＥＬ［ＳＡ）によって免疫用結腸癌のサ
イドシル調製物についてスクリーニングした。正常肺と
比較して５倍またはそれ以上の腫瘍サイドシルとの反応
性を示す抗体を選択した。

この選択方法の結果として、モノクローナル抗体ＣＣＫ
Ｏ６１をさらに特性化し、選択し、本発明によって提供
される抗原の特性化に使用した。

実施例２ モノクローナル抗体ＣＣＫＯ６１をＥｌ、ｉｓ八によっ
て一連のヒト癌セルラインに対してスクリーニングし、
本抗体と反応する抗原の存在について決定した。モノク
ローナル抗体ＣＣＫＯ６１の反応性をスクリーニングす
るために使用したセルラインを以下の第１表に記載する
。

（以下余白） セルライン ５Ｗ４０３結腸癌 Ｔ８４　結＋１［、！Ｊ（ ＳｋＭｅｌ−２８黒Ｉ！！Ｊｌ：［１ Ｃａｌｕ−３肺腺癌 Ｔ４７Ｄ乳癌 ＭＩ４黒色腫 ＋１９０７膀胱癌 ＰＣ−３前立腺癌 ３１６２０結腸癌 第１表 饅眞 アメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクシコン、ロックビル、 メリーランド（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２３０）＋＋、マスイ
博士、カリフォルニア大学（カリフォルニア、サン・デ
イエゴ、 サン・ディエゴ・キャンサー・ センター） アメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクション、ロックビル、 メリーランド（八τＣＣ１ｌＩＴＢ７２）アメリカン・
タイプ・カルチャー・ コレクション、ロックビル、 メリーランド（人ＴＣＣ＃１ｌＴ１３−５５）レナトー
・ダルベツコ博士、 ソータ・インスティテユート、 う・ジコラ、カリフォルニア ラルフーレイズフェルド博士、 スクリップス・クリニック・アンド・ Ｊサーチ・ファウンデーシコン、 う・ジコラ、カリフォルニア ＫＥ、ヘルストロン博士、フレッド・ ハノチンソン・キャンサー・ リサーチ・センター、ワシントン マーク・ゲラフン−博士、カリフォ ルニア大学（サン・ディエゴ、゛ う・ジョラ、カリフォルニア） アメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクシコン、ロックビル、 メリーランド（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２２７）この第１表に
記載のセルラインから得た細胞が約９０％全面成長する
まで組織培養フラスコ中で維持させた。細胞および培地
を含有するフラスコを一２０°Ｃで冷凍し、使用に備え
た。その後、このフラスコを室温に戻し、細胞を取り出
して計数した。細胞濃度を４Ｘ１０°細胞／ｌりに調節
し、クレーブランド（Ｃ１ａｖｃｌａｎｄ）ガラス繊維
フィルター平板上（Ｖｌ’　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上
のウェル当たり２×１０５個でプレートアウトし、乾燥
した。次いで、細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ：　
ｏ、ｏ　）Ｍ　リン酸ナトリウム十〇、１４Ｍ　ＮａＣ
ｇ）中、０．３％ゼラチン、１％ウシ而面アルブミン（
Ｂ　Ｓ　Ａ）で３回洗浄した。各ウェルにモノクローナ
ル抗体ＣＣＫ０６１（Ｉ　Ｏμｇ／ｘＩ２）５０μ＆を
適用し、室温で１時間インキュベートした。０．３％ゼ
ラチン／ＰＢＳで５回洗浄した後、１：４０００に希釈
したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス［ｇＧおよびＥ
　ｇＭ　（Ｔａｇｏ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌｓ、バーリン
ガム、Ｃ＾）５０μｑを加え、１時間インキュベートし
た。６回洗浄した後、０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液中
、ｌｘｇ／ｘＱｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、０
．０３％過酸化水素２００μＱ（以下、ＯＰＤ発色溶液
と称する）を加え、発色させる。この平板を暗所で３０
分間インキュベートした後、ウェル毎に４Ｎ硫酸５０μ
ｇを加えた。４９０ｎｍにおける光学密度（０，Ｄ、）
を測定した。

以下の第２表に示されているように、ＣＣＫＯ６１は結
腸癌セルライン５Ｗ４０３およびＴ８４と反応性を有し
ており、このことはヒト結腸癌セルラインＩこ本明細書
で特性化した抗原が存在することを示している。比較す
れば、ＣＣＫＯ６１は、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、肺の
腺癌、および黒色腫セルラインなどのセルラインとは認
め得る程の反応性は示さなかった。

く以下余白） 第２表 ヒトセルラインとのモノクローナル抗体ＣＣＫＯ６Ｉの
反応性 セルライン ５Ｗ４０３結腸癌 ’Ｉ”　４７　Ｄ乳癌 ＰＣ−３前立腺癌 Ｈ９０７膀胱癌 Ｃａ１ｕ−３肺腺癌 ＳｋＭｅｌ黒色腫 Ｍ１４　黒色腫 ５Ｗ６２０結腸癌 Ｔ８４　結腸癌 Ｂ、膜ＥＬＩＳＡ 正常ヒト組織およびヒト腫瘍組織の精製膜分画中のおけ
る、モノクローナル抗体ＣＣＫＯ６１と反応する抗原の
存在を、４９０ｒ＋ｆｆｌの吸光度を測定するＥＬｒＳ
Ａによって決定した。

死後１０時間以内に採取して一８０°Ｃで保存しておい
たヒト組織の外科的およびオードブシー検ＯＤ、、。

０．４９ ０．０３ ０．０８ ０．０Ｉ Ｏ５０３ ０，０３ ０５ ０，０Ｉ Ｏ６４０ 体から、膜／サイドシルの分画を調製した。ダウンスホ
モジナイ・ザー（Ｄｏｕｎｃｅ　ｈｏｍｏｇ＋４＋１ｚ
ｅｒ）を用い、組織検体を４容量の１０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃ１１ｌｒ＋Ｈ７，５，２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ
フェニルメチルスルホネート（ホモジナイズｔＪｔ？Ｊ
ｉ液）中にて４℃でホモジナイズした。一連の工程はす
べて４°Ｃで行った。得られたホモジネートを遠心分離
（１０００Ｘｇ、５分間）にかけ、細胞核と無傷の細胞
を取り除いた。上清を取り出し、１００，０００Ｘ９で
１時間遠心した。この高速遠心によって得られた上清を
取り出し、これをサイドシル分画と命名した。膜を含有
するペレットを１容量のホモジナイズ緩衝液に再懸濁し
、１０ｍＭ　　トリス−ＨＣ１２ｐＨ７，２中の４０％
／２０％不連続型シヨ糖グラジェントに電層した。グラ
ジェントを遠心分離（１００，０００ｘｇ、１７時間）
にかけた。４０％／２０％中間期の物質をピペットを用
いて取り出し、ホモジナイズ緩衝液を用いて５倍に希釈
し、１００．０００　Ｘｇで６０分間遠心した。得られ
たベレットをホモジナイズ緩衝液に再懸濁し、標本化し
て一８０°Ｃで保存した。

Ｅ　１．、　ｌ　ＳΔを行うために、ウェル当たり１ｕ
ｇの膜分画を、９６ウエルの平底ポリビニル−マイクロ
タイター平板（ダイナチック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）、ア
レ半サンドリア、ＶＡ）上で乾燥させた。この平板を蒸
留水で４回洗浄した後、ＰＢＳ中２０％ウマ血清と共に
室温で３０分間インキュベートした。

緩衝液を除去し、ＣＣＫＯ６１抗体（１０μｇ／＋Ｑ）
５０μｇを１時間かけて適用した。ｌ：１０００に希釈
したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩ
ｇＭを５０μｇ／ウェルで加える前に、平板を水道水で
６回洗浄した。次いで、得られた平板を１時間インキュ
ベートした後、蒸留水で５回δＬ浄した。ＯＰＤ発色溶
液１００μｇを添加して発色させた。その平板を暗所で
３０分間インキュベートした後、ｌウェル当たり４Ｎ硫
酸５０μｇを加え、反応をクエンチした。４９０ｒｖに
おける反応性を測定した。

第３表に示されるように、モノクローナル抗体ＣＣＫＯ
６１は正常結腸および結腸癌の膜分画と反応したが、他
の正常な組織ならびに乳癌、肺の腺癌、黒色腫および前
立腺癌などの癌の膜とは反応しなかった。したがって、
モノクローナル抗体ＣＣＫＯ６１によって特性化される
抗原は、結腸癌および正常結腸の膜にのみ存在している
ことが証明された。

第３表 ヒト組織の膜調製物とのモノク ＫＯ６１の反応性 腫瘍膜　　　ＯＤ、、。

結腸癌　　　　２．０５ 結腸癌　　　０．７８ 乳癌　　　　　０．００ 乳癌　　　　　０．０３ 肺腺癌　　　０．０３ 肺腺癌　　　０．０１ 鱗状肺癌　　０．０１ 小細胞肺癌　０．００ 小細胞肺癌　０．００ 黒色腫　　　０．Ｏｌ 前立腺癌　　０．０１ 前立腺癌　　０．００ 結腸 肝臓 肺 膵臓 肝臓 乳房 ＩＶ胱 脳 正常膜 ローナル抗体ＣＣ ＯＤ　、、。

２．８１ ＯｌＯｌ Ｏ９００ ０，００ ０，００ ０，００ ０，００ ０，００ Ｃ，ＣＣＫＯ６１の免疫組織化学的決定正常および腫瘍
組織中に存在するＣＣＫＯ６１と反応する抗原の存在を
ヒト組織の免疫ペルオキシダーゼ染色によって測定した
。

ティラーのＡｒｃｈ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｌａｂ、　Ｍ
ｅｄ、　１０２．１１３（１９７８）に実質的に記載さ
れている間接免疫ペルオキシダーゼ検定法により、得ら
れた切片を染色した。死後１０時間以内に採取して一８
０°Ｃで保存しておいた外科的およびオードブシーの検
体から得た凍結組織の塊を、ミクロトーム（切片作成器
）／クリオスタット（低温槽）上で４−６マイクロンの
切片にスライスし、ゼラチン肢覆したスライドガラス上
に載せた。得られた切片を手垢に風乾し、アセトンに浸
し、次いでＩｊ　Ｂ　Ｓ中で５分間インキュベートする
ことによって再水和した。ＣＣＫＯ６１抗体をｌＯμｇ
／ｘ（ｌで含有する上清を重層した後、その切片を保湿
型中で１時間インキュベートした。次いで、その切片を
ＰＢＳで洗浄し、結合していない抗体を除去し、ＰＢＳ
中に５分間浸漬した。切片に１＝５０希釈のペルオキシ
ダーゼ結合ヤギ−マウスＩｇＧおよびＩｇＭ抗体［りが
・ケミカル、バーリンガム、Ｃ＾コで重層した後、過湿
容器中で３０分間インキュベートし、次いでＩ）　Ｂ　
Ｓで洗浄し、結合していない第２の抗体を除去した。

Ｉｘｇ／ｘ（ｌジアミノベンジジンおよび０．０３％過
酸化水素を加えることによって発色させ、ヘマトキシリ
ン・エオシンで反対染色した。

以下に示す第４表に記載の結果は、モノクローナル抗体
ＣＣＫＱ６１が正常の結腸粘膜との強い反応性を有して
いることを示しており、それはその組織の染色度の強度
から測定された。比較すれば、ＣＣＫＯ６１抗体は、他
の正常組織との反応性は弱く、または殆ど有していなか
った。

（以下余白） 第４表 正常組織に対するＣＣＫＱ５１の免疫組織学的反応性 組　織　　　　　　　陽性の数／全試験数位い反応性 結腸（粘膜のみ）４／４ 弱い反応性 乳房 肺 頚（可変ｌ） 食道（可変１） 前立腺 卵巣（可変Ｉ） 甲状腺 膵臓 反応なし 肝臓 胃 腎臓 膀胱 子宮 小腸 精巣 １／４ １５ ２／２ ２／２ １／４ １／２ １／２ １／２ ０／２ ０／２ ０／２ ０、／１ ０／１ ０／２ ０／２ 以下の第５表では、モノクローナル抗体ＣＣＫ０６１が
結腸癌・、食道癌および胃癌とは強く反応するが、他の
癌腫とは殆どまたはまったく反応しないことが示されて
いる。具体的には、乳癌および肺腺癌などの癌腫との反
応性は弱いことが証明された。

（以下余白） 電可変：均一な染色性でない。

征−互一考 腫瘍組織に対するＣＣＫＯ６１の免疫組織学的反応性 組　織　　　　　　　　陽性の数／全試験数位い反応性 結腸癌　　　　　　　　　　　１５／１８食道癌　　　
　　　　　　　　　２／２胃癌　　　　　　　　　　　
　　２／２弱い反応性 乳癌（管腔ダクト）３／７ 肺腺癌　　　　　　　　　　　１／４ 鱗状癌（Ｓｑｕａｍｏｕｓ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）　　
２　／　４膵臓癌　　　　　　　　　　　２ｘ４ 反応なし 小細胞肺　　　　　　　　　　０／４ 前立腺癌　　　　　　　　　　０／４ 肝癌　　　　　　　　　　　　０／２ 黒色腫　　　　　　　　　　　０／１ 脳癌腫　　　　　　　　　　　０／２ 腎臓癌　　　　　　　　　　　　０／２Ｄ、ＣＣＫＯ６
１のアイソタイプの決定ヤギ抗？’７ス１ｇＧ、、Ｉ　
ｇＧ　ｔＡ、Ｉ　ｇＧ　ｔｏ、ｒｇＧ、およびＩｇＭ（
丁ａｇｏ、バーリンガム、カリフォルニア）を１１１ｇ
／ＲＩ２タンパク質の保存濃縮物由来のｌＯａ＋Ｍ　　
リン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７゜２）にまず希釈（
１：　３０００）した。９６−ウェルのポリビニルマイ
クロタイター平板の試験ウェルをまず最初にｌウェル毎
に５０μＱの希釈化ヤギ抗マウスＩｇで被覆し、３７℃
で一夜インキコベートした。次いで、その平板をＰＩ３
５−０，１％Ｔ　ｖｅｅｎで洗浄した後、蒸留水で洗浄
した。各試験ウェルに阻害溶液２００μＱを加え、１１
１られた被覆平板を４℃で保存した。阻害溶液は、ＢＳ
Δ（ング？）　２Ｑ　ｇ　、　Ｔｗｅｅｎ−２０（シグ
マ）２ｘ（１、および１０％アジ化ナトリウム２０ｘ（
ｌをＰＩ３５２Ｃに連続撹拌下にゆっくりと加えること
により調製した。

５日以内でその平板をＰＢＳ−０，１％Ｔ　Ｗｅｅｎで
洗浄し、次いで蒸留水で室温にて洗浄した。次いで、抗
体上清４０μＬＩｇＧおよびＩｇＭのポジティブ対照、
およびＨＡＴ培地（ネガティブ対照として使用）を各試
験ウェルに加え、包み、３７°Ｃで１時間インキュベー
トした。ＰＩ３５−０．１％′ｒ’　ｗｅｅｎで３回洗
浄した後、蒸留水で１回洗浄し、調製したばかりのＯＰ
Ｄ発色溶液１００μｅを各ウェルに加えた。得られた平
板を素早くホイルで包み、撹拌下に室温で１５分間イン
キコベートした。反応を停止させるため、４Ｎ硫酸５０
μＱを各ウェルに加え、ＥＬＩＳΔ解読器で４９０ｎｓ
において判読した。

既述した操作を行うことにより、モノクローナル抗体Ｃ
ＣＫＯ６１のアイソタイプをネズミｒｇＭクラスと決定
した。

実施例３ モノクローナル抗体ＣＣＲ０８６の生産モノクローナル
抗体ＣＣＲ０８６は、実施例１に記載した方法によって
調製されるハイブリドーマから回収することができる。

また、ハイブリドーマセルラインＡＴＣＣ番号ＨＢＩ０
０５ｆから産生されるモノクローナル抗体ＣＣＲ０８６
は、ガーハードのモノクローナル抗体、　Ｒ，Ｋｅｎｎ
ｅｔｔらの３７０−３７１（プレノン・プレス＋９８０
）に基づき改変し、またさらに正常組織中に見いだされ
ているヒト結ｍｆ５抗原に特異的なモノクローナル抗体
ＣＣ０Ｉ３５およびＣＣＰ１３７でＢａ１ｂ／ｃ？ウス
をコープライミングすることにより改変したケーラーと
ミルスタインのＮａｔｕｒｅ　２５６，４９５−４９７
（１９７５）の操作法にしたがって生産された。免疫プ
ロトコールの１および４週目に、Ｂａ１ｂ／ｃマウスに
、５ｘｇ／ｘＱＣＣＯ１３５腹水１００μｇおよび５肩
ｇ／村ＣＣＰ１３７（１００μｇ）を腹水として静脈内
注射した。モノクローナル抗体ＣＣ０Ｉ３５およびＣＣ
Ｐ１３７を産生するハイブリドーマは、本発明の譲受人
であるハイブリチック・インコーホレイテッドで調製し
た。３および７週目に、同じＢａｔｂ／ｃマウスに、死
後１０時間以内で採取して一８０°Ｃで保存しておいた
オードブシーとして得たヒト結腸癌検体（ＳＣ８３−４
２１）から調製した膜５０μｇを腹腔的注射した。

最後の免疫後３日経過して、肺臓を無菌的に取り出し、
肺臓細胞を分けて細胞懸濁１１ｖ、を調製した。

次いで、上記実施例１に記載した融合法によって、得ら
れた肝臓細胞を骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ。

８．６５３と融合させた。

得られたハイブリドーマから産生された抗体を、固相酵
素免疫測定法（ＥＬＩＳΔ）によって５０８３−／１２
１ヒト結腸癌検体０サイドシル調製物についてスクリー
ニングした。抗体ＣＣＲ０８６は、正常肝のサイドシル
と比較してより高い腫瘍サイドシルとの反応性を示した
。最後に、本発明によって提供される抗原の特性化に使
用するため、ＯＣＲ０８６を選択し、さらに特性化を行
った。これらの結果に基づき、インビボ試験によってＣ
ＣＲ０８６をさらに選別し、ヒト結１ｍｌ腸瘍を検出し
、処置する上における本発明の抗体の使用効能を試験し
た。

実施測子 実施例２Ｄに記載の操作法によって、モノクローナル抗
体ＣＣＲ０８６のアイソタイプをネズミＩ　ｇＧ　、ク
ラスと決定した。

Ｂ、免疫組織化学的決定 一連の正常および腫瘍組織との反応性によって、ＣＣＲ
０８６抗体の免疫組織化学的特性を決定した。死後１０
時間以内で採取して一８０℃で保存しておいた外科的お
よびオードブシーから組織検体を得た。凍結検体を４−
６マイクロンの切片にスライスし、ゼラチン被覆化スラ
イドガラス上に載せた。次いで、得られた切片を風乾し
、アセトン中で５分間固定し、５％正常ヤギ血清で処置
した。一連の正常および腫瘍組織とのＣＣＲ０８６抗体
の反応性を実施例２Ｃに記載の間接免疫ペルオキシダー
ゼ検定法によって評価した。以下の第６表にはヒト腫瘍
組織についての評価結果を示し、第７表にはヒト正常組
織についての結果を示す。

第６表および第７表に示されているように、モノクロー
ナル抗体ＣＣＲ０８６は正常結腸および前立腺組織のサ
ブセントと、およびそれらの腫瘍と反応した。比較すれ
ば、モノクローナル抗体０ＣＲ０８６における試験した
他のすべての正常および腫瘍組織との反応性は何等認め
られなかった。

第６表 ｔニド腫瘍組織とのモノクローナル抗体ＣＣＲ０８６の
反応性 組織 を古１ルＬ肩餐枯１１Ｑ） 結腸癌（非枯膜） 前立腺癌 乳癌 胃癌 肺腺癌 肺気管支肺胞癌 肺類表皮癌 肺大細胞癌 肺小細胞癌 Ｊンパ腫 黒色腫 膵臓癌 直腸癌 腎臓癌 肉腫 精巣癌 甲状腺癌 陽性の数／全試験数 Ｉ＋／１６ ５／９ ２／７ ０／８ ０／４ ０／８ ０／２ ０／２ ０／２ ０／２ ０／２ ０／４ ０／３ ０／２ ０／４ ０／２ ０／４ ０／２ 第７表 ヒト正常組織どのモノクローナル抗体ＣＣＲ０８６の反
応性 組織 結腸 前立腺 副腎 膀胱 乳房 胸部 頚部 横隔膜 十二指腸 食道 心臓 回腸 空腸 腎臓 肝臓 肺 リンパ節 卵巣 膵臓 末梢神経 陽性の数／全試験数 ８／１１ ３／８ ０／２ ０／２ ０／２ ０／８ ０／２ ０／１ ０／３ ０／２ ０／２ ０／１ ０／３ ０／６ ０／６ ０／１０ ０／２ ０／２ ０／２ ０／１１ 胎盤 唾液腺 皮膚 １１９！臓 γＹ１頷 胃 精巣 胸腺 甲状腺 扁桃腺 尿道 子宮 膣 ０／２ ０／１ ０／１ ０／２ ０／１ ０／２ ０／２ ０／１ ０／１ ０／２ ０／１ ０／２ ０／１ ヒトテナい霊長類動物カニクイザルの組織を用いた免疫
ペルオキシダーゼ検定において、同様の染色パターンが
認められた。以下の第８表は、対応する正常ヒトおよび
カニクイザル組織におけるモノクローナル抗体０ＣＲ０
８６との反応性を比較したものである。

第８表 ヒト／霊長類動物の正常組織におけるモノクローナル抗
体ｃｃＲ０８６との反応性の比較組　織（良性）　　　
　ヒト１　　カニクイザル結腸　　　　　　　２／２　
　　　２．／２十二支腸　　　　　０／２　　　　０／
２空腸　　　　　　　０／２　　　　０／２腎臓　　　
　　　　０／２　　　　０／２肝臓　　　　　　　０／
２　　　　０／２肺　　　　　　　　　　０／２　　　
　　０／２卵巣　　　　　　　０／１　　　　０／１膵
臓　　　　　　　０／２　　　　０／２胛臓　　　　　
　　０／２　　　　０／２精巣　　　　　　　０／１　
　　　０／１マカク属のｒａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カ
ニクイザル）サル由来の組織を使用した霊長類の前臨床
毒性試験では、モノクローナル抗体０ＣＲ０８６は、ヒ
トのイメージング用量に調節した最大ｆＪｈ１２０ｚｇ
／　７０眩の１１．５倍までの投与量で、臨床的に検出
され得る毒性を示さなかった。

Ｃ，サイドシルＥＬＩＳＡ モノクローナル抗体ＣＣＲ０８６、ＣＣＫＯ６１および
ｚｎｃＯ６２について、Ｔ８４セルラインから抽出した
ウシ顎下腺のムチン（Ｂ　Ｓ　Ｍ）、癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＭ）、および組織検体（ＳＣ８３−４２１）由来の結
腸癌サイドシルに対する試験を行った。５μｇ／ウェル
のＢＳＭおよびＣＥＡ。

ならびにｌμｇ／ウェルの結腸サイドシルをまず最初に
試験ウェル上で乾燥した。実施例２Ａに記載のＥＬ　Ｉ
　ＳＡ法にだいたいしたがった。得られた乾燥試験ウェ
ルをＩＯｕｇ／ｌ（ｌ　ＣＣＲ０８６、ＣＣＫＯ６］ま
たはＺＢＣＯ６２と共にインキュベートした。ｌ／１０
００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ビオチン（ザイム
ド（Ｚｙｍｅｄ））を第２の抗体として使用した。ＥＬ
ＩＳＡの結果を以下の第９表に示す。これは、０ＣＲ０
８６が結腸癌をターゲツティングするための非ＣＥＡ腫
瘍マーカーとして有用であり得ることを示している。

ＣＣＲ０８６がＣＥＡと反応できない他の試験であるウ
ェスターン・プロット分析によって、得られた知見をさ
らに確認した。このウェスターン・プロット分析の詳細
は、以下の実施例８で説明す第９表 ＢＳＭ、結腸癌サイドシルおよびＣＥＡとの反応性ＢＳ
Ｍ　　　　　５Ｃ８３−４２１ＣＥ＾ＣＲ０８６ ＣＫＯ６１ ＺＢＣＯ６２十 十−陽性反応 一陰性反応 ＋ ＋ ＋ （以下余白） 実施例５ モノクローナル抗体ＣＣＲ０８６の精製モノクローナル
抗体ＣＣＲ０８６を、ｌＸｌ０７ＣＣＲ０８６ハイブリ
ドーマ細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＢＩＯ０５１）を腹控内投与
し、プリスタンでプライムしたＢａ１ｂ／ｃマウスから
得た腹水のプール２０４　農Ｑから精製した。腹水標本
と取得法はＧａ１ｒｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、、　Ｖｏ
ｌ、　７３Ｂ、　４３−４５．　Ｌａｎｇｏｎｅ　＆　
Ｖａｎ　Ｖｕｎａｋｉｓ。

ｅｄｓ、　（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８１
）に記載されている。

プールした腹水を４℃で２０分間、１５，０００Ｘｇで
遠心した。上清画分に２５％硫酸ナトリウム溶液４７ｓ
ｘａを室温でゆっくり撹拌しながら加えることにより抗
体を沈澱させた。得られた混合物を室温で１．５時間放
置し、室温で約２０分間、ｌ　５．　ＯＯＯＯＸ９で遠
心した。上清画分を除いて捨てた後、沈澱した物質に１
８％硫酸ナトリウム１２０ｘＱを加えてホモジニアスな
溶液を得、室温にて１５，０００ｘｙで２０分間遠心し
た。

沈澱を５０１１ＩＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８，２）６
２ｘＱに溶解し、１６時間後に緩衝液を１回取り替えて
５０１１ＩＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，２）に
対し、４°Ｃで２４時間透析した。次いで、透析した抗
体溶液を滅菌水で希釈し、総容量３２４ｘ（１とし、４
°Ｃにて１５．０００Ｘりで２０分間遠心した。０ＣＲ
０８６抗体を含む上清画分を更に精製するため、注意深
く除去した。

０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８，２、伝導率１．
８）で平衡化したＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　　Ｓ　ｅｐｈａｃｅ
ｌ　（ＰｈａｒＩＩａｃｉａ）カラムを使って、沈澱し
た抗体を精製した。

ＤＥＡＥカラムに０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８
，２、伝導率１．８）と共に抗体溶液を入れた後、カラ
ムをまず０．０２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝Ｍ（ｐＨ８
，２、伝導率３．６）で洗浄し、次いで、０．０５Ｍリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ８，２、伝導率６．４）で溶出し
た。２８　Ｏｒ＋ａ＋で１，０以上の吸光度を示す両分
を集め、プールし、４°Ｃで保存した。

実施例６ ＩＩＩ　ｌ　ｎ−標識ＣＣＲ０８６の調製０ＣＲ０８６
のインジウム−１１１による放射性標識は、キレート剤
ジエチレントリアミン−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）によっ
て行った。まず、１０ｍＭ　ＤＴＰＡ（ｐＨ９，５）３
．６３１１２を、２０．４５Ｂｇ／ｒＱに精製したＣＣ
Ｒ０８６抗体８８村に加えた。抗体＝ＤＴＰＡ溶液のｐ
Ｈを、１．ＯＭＮ　ａ　、Ｃ０＝（ｐＨ１２）を使って
約９．５に調節した。

次いで、抗体濃度を、室温で１５分分間中かに撹拌しな
がら、９５ｍＭ　ＮａＨＣＯ，を２３．６ｍ（加えるこ
とにより、５ｍｇ／ｘ（ｌに調節した。抗体溶液を撹拌
しながら”’　Ｉｎ（ＩＩＩ）のイソチオシアネート溶
液（Ｔ　ＴＣ溶液）を、０．６＋ｎＭリン酸ナトリウム
０．５８ｘＱ　（ｐＨ８，２）を３７　ｍＭ”’　Ｉ　
ｎ（ＩＩＩ）インチオシアネート０．５８＋ｇに加える
ことにより調製した。ＩＴＣ溶液を調製したら直ちにこ
の溶液１．１６１１２を抗体−ＤＴＰＡ溶液に加え、次
いで、室温で２．５時間連続撹拌した。反応を、０℃に
冷却することにより終結させた。

標識した抗体コンジュゲート混合物をＰ−６ＤＧセフア
デツクスカラムに入れ、７０＋Ｎ／時間ノ流速で０，１
３クエン酸アンモニウム（ｐＨ６，０）でカラムを溶出
した。Ｕｖモニターを使って０１１以上の吸光度（Ａ、
６゜）を持った溶出液の画分を全て集め、Ｉｌｌ　ｌ　
ｎの導入について調べた。最大の導入を示す画分をプー
ルすると、全量３３．２ｘ１２となった。これに２５％
正常血清アルブミン０６３村を加えた。得られた抗体溶
液に０．１３クエン酸アンモニウム（ｐＨ６，０）ｌ　
０９ｘ（ｌを加えて最終濃度１ｘｇ／ｘ（ｌとし、濾過
滅菌し、４℃で保存した。

コンジュゲートしていない、およびコンジュゲートした
０ＣＲ０８６抗体の反応性比較試験を、抗体の反応性に
及ぼすコンシュゲージジンの影響を調べるために行った
。精製し、コンデうゲートしたＣＣＲ０８６抗体を、実
施例２Ｂに記載した方法に従って調製した結腸癌組織標
本（Ｓ　Ｃ８３−４２１）から抽出したｌμｇ／ウェル
のシトソール（サイドシル）に対してＥＬ　Ｉ　ＳＡに
より試験した。結果を第１０表に示す。コンジュゲート
していないものと比較すると、コンジュゲートしたＣＣ
Ｒ０８６は有意な反応性の損失を示していな（１゜第１
０表 精製およびコンジュゲートしたＣＣＲ０８６抗体の反応
性 ０ＣＲ０８６の希釈（μｇ／ウェル） 試料　１０　２．５　０．６２５　０．１５６　０．０
３９　０．００９ｇ精製　　４．５１　５．３２　４．
３０　　１．８５　　０．５４コンジスゲー）４．２４
　　　４゜８６　　　４．２４　　　　１．９０　　　
　０．６３　　　　０．１８実施例７ 抗原の特性化：捕獲ＲＴＡ モノクローナル抗体ＣＣＫＯ６１およびＣＣＲ０８６が
同一抗原を認識するか否かを調べるために、捕獲放射線
免疫検定法（ＲＩ　Ａ）を使用して抗体を試験した。第
１段階として、第１の抗体（非標識ＣＣＲ０８６、ＣＣ
ＫＯ６１、ＺＢＣＯ６２およびＧＤＪ３５２）１μｇを
９６−ウェルポリビニル微量滴定プレートの各試験ウェ
ル中の固形支持体上にプレートし、４℃で１時間インキ
ュベートした。脱イオン水で洗浄後、結腸癌組織標本（
ＳＣ８３−４２１）から抽出した結腸癌シトソー０．１
５ ル（細胞質ゾル）またはＴ８４抽出物から調製したＣＥ
Ａを試験ウェルに１または５μｇ／ウェルの割合で加え
、回転させながら室温で３時間インキュベートした。Ｉ
ｌｌ　ｉ　ｎ＝標識ＣＣＲ０８６またはＧＤＪ３５２を
５００．０００ｃｐｍ／ウェルの割合で加えた後、プレ
ートを覆い、室温で一夜インキユベートした。ガンマ−
カウンターで数えるためにウェルをカットする前に、プ
レートを数回水洗した。下記第１１表に要約した様に、
捕獲ＲＩＡ試験の結果は、モノクローナル抗体ＣＣＫＯ
６１よびＣＣＲ０８６が同一抗原を認識することを示し
ている。ＣＣＫＯ６１およびＣＣＲ０８６が同一抗原に
結合し得ることは、これらのモノクローナル抗体は、同
一抗原上の異なったエピトープに特異的であることを示
している。

第１１表 Ｉｎ−標識ＣＣＲ０８６による捕獲ＲＩＡＣＣＫＯ６１
１８，３１１２７，４１６９４７３ＣＣＲ０８６４０，
３２１６０，６９２２７３２９３ＺＢＣＯ６２４２ｇ　
　　　８３１　　　６９　　　９０ＧＤＪ３５２　　　
　　２１６　　　４０７　　　７８　　　７３本明細書
記載のこの試験およびその他の試験では、本出願人（Ｈ
ｙｂｒｉｔｅｃｈ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）におい
て製造された抗−ガードネレラノ＼イブリドーマである
モノクローナル抗体ＧＤＪ３５２を負の対照として使用
したが、非哺乳動物性抗原に対して生じた抗体、例えば
ＡＴＣＣ＃９７２３およびＡＴＣＣ＃１２７９２の様な
抗−クラミジアまたは抗バクテリアモノクローナル抗体
を使用してもよい。

寒塵珂旦 抗原の特性化二分子量の決定 本発明の新規な抗原の分子量を、ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）およびウェスタン免疫プロット検定を使用し、モノ
クローナル抗体ＣＣＫＯ６１およびＣＣ，Ｒ０８６との
その反応性によって決定シた。結腸癌セルラインＴ１８
３ヌードマウスキセノグラフ（ｘｅｎｏｇｒａｐｈｓ）
から調製したシトソールを、標的抗原の供給源とした。

Ｔ１８３セルラインは、サン・ジエゴ大学のネイサン・
カブラン博士（Ｎａｔｈａｎ　Ｋａｐｌａｎ）から入手
したものであり、Ｚｉｒｖｉ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　４２．３７９３−３７９７（１９ｇ２）に記
載されている。比較のために、手術、または死亡後１０
時間以内の剖検から得た、２種類のヒト結腸癌組織標本
からのシトソール（ＳＣ８３−４３１およびＡＯＯ３４
３−０１’と呼ぶ）、およびウシ下顎のムチン（シグマ
社）も、抗体、具体的にはＣＣＲ０８６、ＣＣＫＯ６１
、ＧＤＪ３５２、ＺＢＣＯ６２およびＺＣＥＯ６３のパ
ネルに対して試験した。

抗原を還元するため、シトソールおよびムチン標本（５
μｇ／試料）をゲル試料緩衝液（６２，５ｍＭ　　ト’
）７．−ＨＣＱ　５ｐＨ６，８，３％ＳＤＳ、１０％グ
リセロール、０．００１％プロモフェノールブルー、５
％メルカプトエタノール）に溶解し、５分間沸騰させ、
ラエムリ等による記載（Ｖ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０（１９
７０）に従い、３％スタッキングゲルを含む３−１０％
直線グラジェントゲルで、不連続的５ＤＳ−ＰＡＧＥに
よって分離した。分離したタンパクを、トウビン等の方
法（Ｈ，Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　７
６、４３５０（１９７９乃に従い、電気泳動的に（２５
０ミリアンペア、６時間）ニトロセルロースシート（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）に移し
た。このニトロセルロースレプリカをまずＰＢＳ中３％
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と−緒に３０分間インキ
ュベートし、次いで、ｌＯμｇ／ｘ１２の抗体と一緒に
一夜インキユベートシタ。ニトロセルロース細片を、Ｐ
ＢＳ−０，１％ツウィーンで、緩衝液を５回取り替えな
がら３０分間洗浄し、次いで、５００．０００ｃｐｍ／
ｘ１２の１１５１−標識ヒツジ抗−マウス免疫グロブリ
ン［タボ］と一緒に３時間インキエベートした。ＰＢＳ
ｏ、１％ツウィーンで洗浄後、ニトロセルロース細片を
風乾し、増強スクリーンと一緒にＸ−線フィルム（コダ
ックＸＡＲ５）に　７０°Ｃで４７２時間暴露した。

Ｔ１８３シトソールのウェスタンプロット検定は、抗原
が約６００Ｋｄ〜約１，０００Ｋｄの範囲の、高分子量
の複数種として存在していることを示している。Ｔ１８
３シトソールに反応するモノクローナル抗体ＣＣＫＯ６
１およびＣＣＲ０８６についてのウェスタンプロットパ
ターンは同一であり、従って、抗体が同一抗原を認識す
るということを更に支持する。主要なバンドは約６５０
８００　Ｋｄの範囲に現れ、主要なバンドの上に、より
高分子量のバンドが伸びている。別のウェスタンプロッ
ト検定では、精製したＣＥＡに反応するＣＣＫＯ６１と
ＣＣＲ０８６についてのパターンは異なっていた。具体
的には、ＣＣＫＯ６１は１８０Ｋｄに移動する精製ＣＥ
Ａと反応したが、ＣＣＲ０８６はＣＥＡと反応しなかっ
た。この測定法で使用した分子量マーカー（ホスホリラ
ーゼｂを伴ったポリマー）は、シグマ社（セントルイス
、メリーランド）から入手し、９７．４〜５８４．４Ｋ
ｄの範囲である。

この新規抗原の分子量を決定する以外に、ウェスタン免
疫プロットは、ＺＣＥＯ６３もＴ１８３シトソールと反
応し、モノクローナル抗体ｃｃＲ０８６およびＣＣＫＯ
６１と類似したバンドパターンを呈することを示す。し
かしながら、ＺＣＥ０６３は５Ｃ８３−４２１組織シト
ソールと反応しなかった。比較すると、ＣＣＲ０８６お
よびＣＣＫＯ６１は５Ｃ８３−４２１組織標本と反応し
たが、ＡＯＯ３４３−０１またはウシムチンとは反応し
なかった。最後に、ＺＢＣＯ６２はウシムチンと反応し
たが、いずれのシトソール標本とも反応しなかった。こ
れらの結果を第１２表に示す。

第１２表 結腸直腸癌抗体のウェスタンブロッティングＴ１８３　
　５Ｃ８３−４２１＾００３４３−０１　　　　ウシの
五チンＣＣＫＯ３１＋ ＣＣＲ０８６＋ ＺＣＥＯ６３＋ ＢＣＯ６２ ＤＪ３５２ ＋ 十 ＋ ＋：反応あり ：反応なし 実施例９ 抗原の特性化：糖タンパクの決定 本明細書で特性化した抗原は、１４ｃｍグルコサミン標
識５Ｗ４０３結腸癌細胞の免疫沈澱によって、糖タンパ
クであると決定された。

５Ｗ４０３細胞を、８％ウマ面清および２％ウシ胎児血
清を補足した培地中、７５ｃｓ”組織培養フラスコに全
面生長させた。培地に５０μＣｉ／ｚ（ｌの１４ｃｍグ
ルコサミン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ
。

Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）を加えた後、細胞を、加湿した
５％ＣＯ，インキュベーター中、３７℃で１８時間イン
キユベートした。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、
フラスコから採取し、１０ＪＩ＋２のＰＢＳに加えた。

細胞ペレットを洗浄し、更にＰＢＳを加えて３回遠心し
、その後、溶解緩衝液（０，０２Ｍトリス−ＨＣＱ、ｐ
Ｈ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０゜５％ＮＰｉＯ１０，
５％デオキシコーレート、０．５ｍＭフェニルメチルス
ルホネート）１．ｏｘ（２に再懸濁した。回転器にて４
°Ｃで１．５時間インキュベートした後、リゼートをマ
イクロヒュージにて１分間遠心しく１６，０ＯＯｘ９）
、上清をＴＢＳ（０，０２Ｍ　トリス−ＨＣｆ２、ｐＨ
８，０，０，１５ＭＮａＣＱ、０．１％アジ化ナトリウ
ム）に対して透析した。′◆Ｃ−標識リゼーすをＣＣＫ
Ｏ６１抗体と一緒に回転器にて４°Ｃで一夜インキコベ
ートした。

この混合物にセファロース結合したヒツジ抗マウス免疫
グロブリンを加え、室温で３時間インキュベートし、そ
の後、０．０５Ｍ　トリス、Ｏ，１５ＭＮａＣＱ、　０
．５％ＮＰ−４０，０，０５％デオキシコーレート、０
．１％ＮａＮ、、１　ｘ９７ｘＱ　Ｂ　Ｓ　Ａ。

ｐＨ８川で４回、ＢＳＡを除いた同一緩衝液で更に４回
洗浄した。５ＤＳ−ＰＡＧＥによって試料を分離した結
果、ＣＧＫＯ６１は、約８００Ｋｄの位置に移動する１
４Ｃ−標識バンドを沈澱させることがわかった。

実施例１１ 等電点電気泳動 下記の様な等電点電気泳動カラムを使用し、ＣＣＫＯ６
１およびＣＣＲ０８６によって特性化された抗原の等電
点電気泳動を調べた。

実施例２Ｂの記載の様にして調製したＴ１８３結腸癌シ
トソール２０ｏを、水で被覆した１１０１等電点電気泳
動カラム中、ｐＨ範囲３．５−１０の両性電解質を含有
している０−４７％ンユクロースグラジエントを使用し
て電気泳動させた。各試料をグラジェントの中に注入す
る前に、カラムを６００ボルト、４°Ｃで１２時間予め
電気泳動し、次いで、４℃で更に３０時間電気泳動させ
た。カラムから１１（ｌずつの画分を集め、直ちにｐＨ
を測定した。集めた画分を、１０ｍＭリン酸ナトリウム
、ｐＨ７，０に対して一夜透析した。その一部分を、Ｃ
ＣＫＯ６１およびＣＣＲ０８６抗体との反応性について
、Ｔ１８３結腸癌細胞のシトソール標本に対してＥＬＩ
ＳＡ検定で調べた。

この方法によって抗原を等電点電気泳動した結果、等電
点は約４．３〜約４．５および約４，８〜約５．０の範
囲であり、ピークは約４．４および約４．９であること
がわかった。この腫瘍中の抗原の主要な免疫反応性形態
は、約４，３〜約４．５の範囲に等電点を有している。

ｐＨ３，７におけるＧＤＪ３５２を包含する、全ての抗
体の活性のピークは多分、カラムの酸性領域で抗原が変
性することを示している。

実施例１２ 抗原の特性化：エピトープの検定 Ａ、ムチンの試験 ３種類の供給源のムチン、即ちヒト唾液ムチン、ルイス
ａ（Ｌｅつムチン、およびウシムチン（シグマ）を、Ｅ
ＬＩＳＡフォーマットを使用し、抗結腸瘍抗体のパネル
との反応性について調べた。抗体パネルは、ＣＣＲ０８
６、ＣＣＫＯ６１、ＺＢＣ０６２およびＺＣＥＯ６３で
あった。ヒト唾液ムチンおよびＬ　ｅ　ａムチンは、Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　１ｎｓｔｉｔｕｔｅの
Ｇｉｎｓｂｅｒｇ博士から入手したものであり、Ｗｏｏ
ｄｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　２＋、　６９４−７０１（１９８２）に記載の方法を
包含する、当業者周知の方法によって調製することがで
きる。

抗体パネルに対するムチンの反応性を試験するために、
各ムチン標本をまず、９６ウ工ル微量滴定プレートにｌ
μｇ／ウェルでプレートし、３７°Ｃで一夜乾燥させた
。蒸留水で４回洗浄した後、ウェルをＰＢＳ−２０％ウ
マ血清と共に室温で３０分間インキュベートし、次いで
約１μ９／ウエルの抗体を加えて更に１時間インキュベ
ートした。

プレートを６回洗浄し、その後、ベルオキシダーゼーコ
ンジコゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩ　ｇＭ（
Ｚｙｍｅｄ　１　：　１０００希釈）を５０μＱ／ウエ
ルで加えた。実施例２Ａの記載と同様にしてＯＰＤ発色
溶液を添加することによって発色させ、振とうしながら
暗所にて３０分間インキュベートした。５０μＱ／ウエ
ルの４Ｎ　Ｈ，Ｓｏ、を加えて反応を停止させ、４９０
ｎｍでＯ，Ｄ、を測定した。

このムチンの試験結果を以下の第１３表に記載する。

第１３表 ムチンの試験 ＣＲ０８６ ＣＣＫＯ６１＋＋＋　　　　＋＋＋ ＺＣＥＯ６３−＋ ＺＢＣＯ６２ＮＤ　　　　　　ＮＤ　　　　　＋＋＋＋
＋＋：強い反応性 ＋１弱い反応性 一：反応せず ＮＤ：測定せず 第１３表かられかるように、モノクローナル抗体ＣＣＫ
Ｏ６１は２種類のヒトムチンと強く反応するが、０ＣＲ
０８６はいずれのムチン標本にも反応性を示さなかった
。この試験の結果は、モノクローナル抗体ＣＣＫＯ６１
およびＣＣＲ０８６は別個のエピトープを認識するとい
う別の証拠を提供する。

Ｂ、破壊処理試験 モノクローナル抗体ＣＣＫＯ６１によって認識されるエ
ピトープの特性を調べるために、実施例２Ｂの記載の様
にしてヒト腫瘍標本５Ｃ８３−４２１から調製したシト
ソール画分２０μ９を、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェス
タン免疫プロット検定の前に、以下の処理に付した： ａ）過ヨウ素酸ナトリウム：５０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリ
ウム中、４°Ｃで１時間インキュベートした。

ｂ）ノイラミニダーゼ：酢酸でｐＨ５−６に調節し、Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｒｒｉｎｇｅｎｓノイラ
ミニダーゼ１０ｍＵと一緒に３７°Ｃで１時間インキュ
ベートした。

Ｃ）プロテイナーゼＫ　：　２．　Ｏｕ９／ｘ（１（Ｄ
ブロテイナーゼに中、３７°Ｃで１時間インキュベート
した。

ｄ）穏やかなアルカリ処理：　Ｑ、ＩＮ　ＮａＯＨ中で
一夜インキユベートし、次いで、Ｏ，１ＮＨＣＱで中和
した。

実施例８の記載と同様に、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェ
スタン免疫プロット検定の前に、ゲル試料緩衝液を加え
ることによって全ての反応を停止させた。

処理（ａ）および（ｂ）は炭水化物部位を破壊するよう
にデザインされているが、処理（ｃ）および（ｄ）はタ
ンパクのコンフォーメーションを破壊するようにデザイ
ンされている。抗原とＣＣＫＯ６１の反応性はプロテイ
ナーゼに処理によって破壊され得ることが示され、従っ
てＣＣＫＯ６１によって認識されるエピトープはタンパ
クであることが証明された。上記のその他の方法による
処理では、反応性は失われなかった。

別の試験においては、モノクローナル抗体ＣＣＫ０６１
およびＣＣＲ０８６によって認識されるエピトープの特
性を調べるために、実施例２Ｂの記載に従って調製した
５Ｃ８３−４２１からのシトソール画分２０μ９を以下
の破壊処理に付し、ＥＬＴＳＡフォーマットで試験した
： ａ）メタノール：９５％メタノール中、４°Ｃで１時間
インキュベートした。

ｂ）ノイラミニダーゼ：　１００単位／酎のＣ，ｐｅｒ
ｆｒｉｎｇｅｎｓノイラミニダーゼと一緒に３７°Ｃで
１時間インキュベートした。

Ｃ）過ヨウ素酸塩：ｌｎＭ過ヨウ素酸ナトリウム中、室
温で３０分間インキュベートし、１０ｍＭホウ水素化ナ
トリウムで還元した。

ｄ）熱；シトソールを］、　ＯＯｏＣで２０分間処理し
た。

ｅ）還元／アルキル化：６Ｍグアニジン−Ｈ（Ｊ）。

１０ｍＭＤＴＴ中、４５℃で４時間インキュベートし、
次いで、１０ｍＭヨウ化酢酸中、２３°Ｃで３０分間イ
ンキュベートした。

ｆ）尿素＝８Ｍ尿素中、４５°Ｃで１８８時間インキュ
ベートた。

ＣＣＫＯ６１およびＣＣＲ０８６についての破壊処理試
験の結果を、以下の第１４表に示す。実施例２Ａの記載
に従い、ＥＬＩＳＡフォーマットで試験するために、処
理した抗原を、１μｇ／ウェルでプレートし、３７°Ｃ
で一夜乾燥させた。０ＣＲ０８６については、炭水化物
エピトープを確認するためにデザインされた処理（メイ
ラミニダーゼおよび過ヨウ素酸塩）は、有意な効果を示
さなかった。脂質エピトープを確認するために使用され
たメタノール処理も、有意な効果を示さなかった。グア
ニジンおよび尿素処理も、０ＣＲ０８６と抗原の反応性
を変更することができず、これらの変性条件が３次元構
造の破壊に有効ではないなう、エピトープはフンフォー
メーションタン１＜クエピトーブではないということを
示唆した。エピトープに対する熱の影響は確定的ではな
かった。

言うまでもなく、これらの結果は、０ＣＲ０８６はタン
パクエピトープと反応することを示唆している。

第１４表 モノクローナル抗体ＣＣＫＯ６１およびＣＣＲ０８６Ｓ
Ｃ８３−４２１シトソールの破壊処理対置ａ ＣＫＯ３１ メタノール　　　１０８　　（＋）０〜２０％（−）７
０〜１００％ ノイラミニダーゼ１０２　　（＋）０〜４０％（−）ｇ
ｇ〜１００％ ００ 非脂質 エピトープ 非シアル酸 エピトープ ６Ｍグアニジン ８Ｍ尿素 ＣＲ０８６ メタノール ３ ０８ ７ ノイラミニダーゼ８９ 過ヨウ素酸塩 １ （−）＞５０％ （＋）＜２０％ （−）＞７０％ （→）〈３０％ （−戸７５％ （＋）０〜２０％ （−）７０〜１００％ （＋）０〜４０％ （−）８８〜１００％ （＋）０〜３０％ （−）＞７５％ タンパクエピトープ 隼７ン７ｔ−メーシ３ン タンパクエピトープ 非コンフォーメーシ（ン タンパクエピトープ 非脂質 エピトープ 非シアル酸 エピトープ 非炭水化物 エピトープ 熱　　　　　　　３１　　（＋）ｏ〜６％　　　非確定
的（−）＞ＳＯ％ ６Ｍ　グアニジン　　　　８５　　　（＋）＜２０％　
　　　　非］ンフオーメーシ１ン（−）＞７０％　　　
　　　タンパクエビトープ実施例１３ ヌードマウスにおけるイン・ビボでの腫瘍位置の確認 １０μＣｉのＩＩＩ　ｌ　ｎ−標識ＣＣＲ０８６をｌμ
ｇの投与量で注射した６匹のＴ１８３腫瘍を有するヌー
ドマウスに対し、４８時間の生体内分布試験を行った。

第２図で確認した器官および体液を摘出または抽出し、
適切な場合には秤量し、放射活性を測定した。この試験
の結果を第２図に示す。

第２図かられかるように、標識ＣＣＲ０８６の約３１％
は腫瘍部位に局在した。

実施例１４ 臨床試験 １つの試験では、結腸腺癌の２３個の既知の病巣を有す
る１４人の患者に、３ｍｇまたは１７ｍｇの非標識ＣＣ
Ｒ０８６抗体と混合した、５ｍＣ１のｌｌｌＸｎ−標識
ＣＣＲ０８６抗体２ｍｇを静脈内注射した。注射後３．
５または６８目に、平面画像化（プラナ−イメージング
）または５ＰＥＣＴを行った。５ｍｇのＣＣＲ０８６総
投与量では、既知の８部位の内、５部位が画像化された
（６３％検出）。

２０ｍｇの抗体縁投与量では、既知の１５部位の内、１
３部位が画像化された（８７％検出）。要約すると、こ
れらの患者に対して行なわれた複数部位画像化プロトコ
ールは既知の病巣の７８％（１８／２３）を検出し、そ
れによって、ＣＣＲ０８６を結腸癌を探索するためのＣ
ＥＡ以外のマーカーとして使用し得るということがわか
った。

標識ＣＣＲ０８６による結腸直腸癌のイン・ビボでの位
置追跡の有効性を、既知の結腸直腸癌を有する８人の患
者を使用する試験において更に確認した。実施例２の記
載の様にして調製した精製ロ’Ｉｎ−ｇ識ＣＣＲ０８６
を、そのままで癌を検出するために使用した。５．５ｍ
Ｃ１の１１＋１ｎ−標識ＣＣＲ０８６を、６人の患者に
は２０ｍｇ投与量で、２人の患者には５ｍｇ投与量で、
各患者に１時間かけて注射した。通常、注射後３および
７−１００日目、平面画像化およびシングルフォトンエ
ミッションコンピューター処理断層写真化（ＳＰＥＣＴ
）を行った。腫瘍部位を、４人の患者においては外科的
に、その他の４人の患者においては介入性の通常の診断
法によって確認した。

この臨床試験の結果を下の第１５表に示した。

これは、＋１１ｉｎ＝標識ＣＣＲ０８６抗体は結腸直腸
癌の位置をそのままで確認するのに約８５％有効である
ことを示している。更にこの方法は全ての患者に許容さ
れ、毒性は観察されなかった。

第１５表 ＩＩＩ　ｌ　ｎ−標識Ｃ，ＣＲ０８６による、腫瘍のイ
ン・ビボでの検出 検出された腫瘍 ／確認された腫瘍 腫瘍部位 ２０ｍｇ投与量： 肝臓転移　　　　　　　　　　５１５ 腸損傷　　　　　　　　　　　２／２ 肺転移　　　　　　　　　　　１／２ リンパ節転移　　　　　　　　２／２ 直腸腫瘍による膀胱侵聾１／２ 合計　　１１／１２ ５ｍｇ投与量： 肝臓損傷　　　　　　　　　　１／２ 合計　　　１／２ 組織学的に検認された転移性結腸癌を有する６人の患者
に関する第３のイン・ビボ試験によって、標識０ＣＲ０
８６抗体は結腸直腸癌の存在または不存在を検出した。

第１６表に示した様に、各患者に、約５ｍＣ１のＩＩＩ
　ｌ　ｎ−標識ＣＣＲ０８６１ｍｇ投与量または非標識
ＣＣＲ０８６抗体４または１９ｎ＋ｇ投与量を、２時間
かけて静脈内注射することによって投与した。９５−１
００％の標識完全性は、当業者に既知の方法によって調
べた。注射前、および注射後ｌおよび３日目に、血液標
本、生化学的標本、免疫学的標本および尿標本を採取し
た。注射後、血液については最初の３日間、尿について
は２日間、薬物動力学データを集積した。

■’Ｉｎ−標識ＣＣＲ０８６を調べた結果、６５時間の
平均有効半減期を有し、８５−９７％の平均全身４８時
間保持を示した。胸、骨盤および腹部領域について、平
面のみ、または平面および５ＰＥＣＴによって、１画像
当たり７５分間、画像化を行った。第１７表は、標識Ｃ
ＣＲ０８６およびイオウコロイド画像によって検出され
た局在部位の比較を示す。

第１６表 モノクローナル抗体ＣＣＲ０８６ 投与量および標識の完全性 患者番号　　ＩＩｇｍｃｉ　　　　　標識％１　　　　
５　　５゜ ２　　　２０　　５ ３　　　２０　　４ ４２０５゜ ５２０５゜ ６２０５゜ ２９　　　１００．０ ３９　　　　９５．９ ９９　　　　９５．０ ００　　　　９９．８ １３　　　　９８．９ ４８　　　　９８．８ 第１７表 モノクローナル抗体ＣＣＲ０８６ 局在部位 イオウコロイド スキャンとの一致 患者番号　部位 摘出した肝臓の画策 ２　　　　摘出した肝臓の多領域。

右上胸部（右鎖骨上、胸鎖領域） ３　　　　肝臓の複数の欠損部 ４　　　　陰性試験−肝臓 肺における腫瘍について陰性 ５　　　　腹部癌腫症 仙骨病巣 両脚転移 ６　　　　肝臓 中腹部の病巣 別の臨床試験では、第３の試験に記載のプロトコールに
従い、検認された結腸直腸癌を有する６人の患者に標識
０ＣＲ０８６を注射した。標識ＣＣＲ０８６によって、
１人の患者における１ｃｍよ一致 陰性試験 一致 一致 一致 陰性試験 り小さい３個の病巣以外の全ての既知病巣が検出された
。更に、２人の患者では、それまで知られていなかった
病巣が標識ＣＣＲ０８６によって検出された。この試験
の結果は、組織学的に確認された。

本発明のこれまでの記載は例示および説明を目的とする
実施例である。当業者には、本発明の精神および範囲を
逸脱することなく、変更および修飾が可能であることが
理解されよう。以下の特許請求の範囲は、この様な変更
および修飾を全て包含して説明することを意図するもの
である。

【図面の簡単な説明】

図面の第１図は本発明抗原を含有する結腸癌腫のサイド
シルの等電点電気泳動パターンを示すグラフであり、第
２図はＴ１８３腫瘍を担うヌードマウスにおけるＩＩＩ
　１　ｎ標識化ＣＣＲ０８６の生体分布を示すグラフで
ある。 ４９０ｎｍ　ｌ；Ｒ”７’）　ＯＤ ＦｘａｕｑＥ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、モノクローナル抗体ＣＣＲ０８６と反応するエピト
   ープ。 ２、約６００Ｋｄから１，０００Ｋｄの分子量を有し、
   かつ約４．３から約４．５および約４．８から約５．０
   の等電点を示す腫瘍関連糖タンパク質抗原上に発現され
   る請求項１に記載のエピトープ。 ３、該抗原の等電点が約４．４および約４．９である請
   求項１または請求項２に記載のエピトープ。 ４、該抗原が結腸直腸癌腫により発現される請求項１か
   ら請求項３までのいずれかに記載のエピトープ。 ５、請求項１から請求項４までのいずれかに記載のエピ
   トープと特異的に反応する抗体。６、モノクローナル抗
   体である請求項５に記載の抗体。 ７、ＩｇＧ＿１抗体である請求項６に記載の抗体。 ８、モノクローナル抗体ＣＣＲ０８６。 ９、治療物質によって標識されている請求項５から請求
   項８までのいずれかに記載の抗体。 １０、モノクローナル抗体ＣＣＲ０８６と反応するエピ
   トープに特異的な抗体を産生するハイブリドーマセルラ
   イン。 １１、該エピトープが、約６００Ｋｄから約１，０００
   Ｋｄの分子量を有し、かつ約４．３から約４． ５および約４．８から約５．０の等電点を示し、かつヒ
   ト結腸直腸癌腫に存在する腫瘍関連糖タンパク質抗原に
   おいて発現されるエピトープである請求項１０に記載の
   ハイブリドーマセルライン。 １２、該ハイブリドーマセルラインがＡＴＣＣ番号ＨＢ
   １００５１である請求項１０または請求項１１に記載の
   ハイブリドーマセルライン。 １３、診断または治療に用いられる請求項５から請求項
   ９までのいずれかに記載の抗体。１４、診断または治療
   に用いられるモノクローナル抗体ＣＣＲ０８６。 １５、患者から得た体液試料を、請求項５から請求項８
   までのいずれかに記載の少なくとも１つの抗体と接触さ
   せる工程、および該体液試料の抗原性成分と該抗体との
   結合性を測定する工程からなることを特徴とする、患者
   の癌のインピトロ検出方法。 １６、該抗体がモノクローナル抗体である請求項１５に
   記載の方法。 １７、該モノクローナル抗体がＣＣＲ０８６である請求
   項１６に記載の方法。 １８、第２の抗体を使用する２点免疫測定法により、該
   体液試料の抗原性成分と該抗体との結合性を測定する方
   法であって、請求項１５に記載の抗体と第２の抗体とが
   該抗原の互いに妨害し合うことのないそれぞれの決定基
   と結合することを特徴とする請求項１７に記載の方法。 １９、請求項５から請求項９までのいずれかに記載の抗
   体を、製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤と
   共に含有してなる医薬製剤。 ２０、該抗体が（モノクローナル抗体である請求項１９
   に記載の製剤。 ２１、モノクローナル抗体がＣＣＲ０８６である請求項
   ２０に記載の製剤。