JPH034197B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、高分子炭水化物の分解酵素、単離さ
れた高分子炭水化物、このような酵素を産生する
微生物の選択方法及びこのような酵素の産生方法
に関する。 ベルギー特許第882769号明細書には、蛋白質の
溶解及び再沈殿を行なうことなく残分を酵素によ
り除去することによつて精製植物性蛋白質製品
(pvp)を製造する方法が記載されている。この
公知方法によつて得られるpvpの純度は満足なも
のではなく、従つて改良の余地を残している。実
施例では、約85%のpvpの純度が証明された。公
知方法により純度約90%のpvpを得ることができ
るとしても、これはある種の前処理した出発原
料、例えば、大豆蛋白質濃縮物を用いて初めて得
られる。極めて広範囲の出発原料、特に外皮を除
去しそして脱脂した大豆粉を用いて約90%または
それ以上の純度のpvpを得られることが望ましい
であろう。 本発明は、前記のような酵素処理の間に生ずる
ような、残留分解生成物のある一部、即ち、水溶
性高分子炭水化物が、以下に詳述するように植物
性蛋白質の一部に結合しているという意外な発見
に基づく。もちろん、炭水化物が結合すると、蛋
白質の純度は低くなる。また、この高分子量炭水
化物が動物性蛋白質に結合する能力を有すること
も判明した。 本発明の目的は、純度の改善されたpvpを製造
する可能性を開く、前記高分子炭水化物の分解酵
素及びこのような酵素の製造方法を提供すること
である。 以下に、本発明の基礎を第1図を参照して説明
するが、第1図には不溶性固形分として存在する
物質だけを示し、上澄液をすべて省略する。大豆
粉の装入物を2つの等しい部分、部及び部に
分けた(第1図のa欄)。部をアルカラーゼ
(ALCALASE)〔バチルス・リケニフオルミス
(B.licheniformis)によつて産生され、デンマー
ク国バクスバード2880のノボ・インダストリ社
(NOVOINDUSTRI A/S)によつて市販され
ている蛋白分解酵素〕を用いて約8のPH値で蛋白
分解処理し、次に約PH8で洗浄して蛋白質を全量
除去し、残分を上澄液から分離し、そして洗浄し
た(第1図の部、a及びb欄参照)。この方法
で、純粋な残分(残分と示す)が単離された
(第1図のb欄)。大豆粉の部は処理しなかつ
た;略して、、部の残分を残分と示す(第1
図のb欄)。残分及び部を市販のペクチナー
ゼ、例えばペクチネツクス(PECTINEX)〔ス
イス国バーゼルのシユバイツアリツシエ・フエル
メント社(Schweizerische Ferment A/G)
によつて製造されたペクチン分解酵素〕により分
解する(第1図のb欄及びc欄参照)。第1図か
ら、意外にも、残分の不溶分が窒素及び乾燥固
形分収支に基づいて残分の不溶分より著しく少
ないことが判る。第1図において、c欄における
ハツチングをした部分は前記段階の不溶性非蛋白
質に相当する。更に、ペクチナーゼで処理した残
分からの上澄液を大豆蛋白質懸濁液と一緒にPH
4.5にすると、上澄液中の多糖類は大豆蛋白質に
結合する。残分から上澄液中のこの多糖類は、
残分分解生成物の一部であり、大豆蛋白質の不存
在で水に澄明に溶解するが、大豆蛋白質が存在す
る場合には、大豆蛋白質の等電点またはその付近
で大豆蛋白質に結合するものであり、これをSPS
(可溶性多糖類)と示す(第1図参照)。SPSは5
×106〜0.9×104の分子量分布を有する。単離さ
れたSPSの製造法を第2図に示す。第2図は第1
図に示した処理工程も若干含んでいる。この場
合、問題は、SPS分解生成物が大豆蛋白質を結合
していないか、またはSPSが結合している大豆蛋
白質より著しく少ししか大豆蛋白質を結合しない
ようにSPSを分解しうる酵素を見い出すことであ
る。 特に大豆蛋白質について説明するが、本発明は
大豆蛋白質に限定するものではなく、すべての種
類の植物性蛋白質を包含する(例えば、ベルギー
国特許第882769号明細書1頁に列挙されている蛋
白質参照)。 本発明によれば、SPS分解能についてスクリー
ニングすることによつて、SPSを有効に分解する
酵素活性を示す化合物(略して以下SPS−アーゼ
と記す)を産生しうる微生物を選択しうることが
判つた。 本発明は第一に、SPSを適切な条件下で分解し
て、水性媒体中で蛋白質に、SPSが分解前に相応
する条件下で同じ蛋白質に結合していたであろう
より少ない程度に結合している分解生成物を生成
することができる、使用可能な形のカルボヒドラ
ーゼであるSPS−アーゼに関する。 前述の「使用可能な形」という表現は、例え
ば、毒性物質を含むSPS−アーゼ含有製剤、また
は実際に重要なSPSを分解するために、50℃で当
該SPS−アーゼの最適PHで24時間反応を実施する
際に基質中のSPSの重量に対して10%より多くの
SPS−アーゼ含有製剤の使用を必要とする程低い
SPS−アーゼ活性を示すSPS−アーゼ含有製剤を
本発明から除外することを意味する。 最終植物性蛋白質からSPSを全部または一部分
除去することにより、最終植物性蛋白質の純度
は、ベルギー特許第882769号明細書から公知の方
法により得られる最終植物性蛋白質の純度に比べ
て改良されている。それというのはこの公知の植
物性蛋白質製品はSPSで汚染されていたからであ
る。 下記の特定のSPS−アーゼがその酵素活性を単
一の酵素から生ずるのか、または少なくとも2種
の酵素から成る酵素複合体から生ずるのかは、現
在判つていない。若干の研究は、少なくとも2種
の酵素がSPS−アーゼ分解作用に応答し、これら
の酵素のうち1種はSPSを少しだけ分解でき、そ
の後1種以上の酵素がSPSの一層広範な分解を行
ないうることを示しているようである。しかし、
本出願人はこのような仮説または同様の仮説に限
定したくない。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼがSPSを水性媒体中で分解して、水
性媒体中で植物蛋白質に、SPSが分解前に水性媒
体中で同じ植物蛋白質に結合していたであろうよ
り少ない程度に結合している分解生成物を生成す
ることができるという事実を特徴とする。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼが大豆SPSを、4.5から1.5より大き
くは偏位しないPH値を有する水性媒体中で分解し
て、その水性媒体中で大豆蛋白質に、大豆SPSが
分解前に水性媒体中で大豆蛋白質に結合していた
であろうより少ない程度に結合している分解生成
物を生成しうることを特徴とする。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
分解完了後のSPSの分解生成物が、分解前のSPS
が水性媒体中で植物蛋白質に結合していたであろ
うより50%より少ない、特に20%より少ない程度
で植物蛋白質に結合していることを特徴とする。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼが本明細書に記載した定性的及び定
量的SPS−アーゼ測定法により試験したときに、
陽性SPS−アーゼ試験を示すことを特徴とする。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼがアスペルギルス(Aspergillus)
属、好ましくは黒色アスペルギルス
(Aspergillus niger)に属する微生物によつて産
生されたものであることを特徴とする。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼがアスペルギルス・アクレアトウス
(Asp.aculeatus)DSM2344(すなわち、
CBS101.43)により産生しうる酵素に由来するこ
とを特徴とする。同じくSPS−アーゼを、アスペ
ルギルス・ヤポニクス(Asp.japonics)
DSM2346(すなわち、IF04408)により産生させ
ることもできる。アスペルギルス・アクレアトウ
スDSM2344は極めて強力なレマナーゼ、セルラ
ーゼ、ペクチナーゼ及びヘミセルラーゼも産生す
ることが判つた。更に、アスペルギルス・アクレ
アトウスまたはアスペルギルス・ヤポニクス種に
属するすべての菌株が本発明に必要なSPS−アー
ゼを発生するわけではないことが判つた。本明細
書に後記(5節)のように、菌株アスペルギル
ス・ヤポニクスDSM2345(すなわち、
ATCC20236)は本明細書に記載したSPS−アー
ゼの酵素測定法によつて検出しうるような量の
SPS−アーゼを産生しないことが証明された。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼがアスペルギルス・アクレアトウス
DSM2344によつて産生されるSPS−アーゼと免
疫電気泳動で同一であり、免疫電気泳動重層法に
より同定しうることを特徴とする(6及び7節参
照)。 SPS−アーゼを微生物により産生させる場合に
は、SPS−アーゼは若干の同伴物質、特に他の酵
素と混合して形成される。必要に応じ、問題の
SPS−アーゼを例えば、後記(8節)ようなクロ
マトグラフイー分離法により精製することができ
る。 Agr.Biol.Chem.40(1)、87〜92頁(1976年)に
は、アスペルギルス・ヤポニクスATCC20236
(DSM2345)の菌株が、しようゆ中の酸性多糖類
(APSと言う)の部分的分解を行ないうる酵素複
合体を産生することが記載されており、その酸性
多糖類の部分的分解のフラクシヨンはAPS−
と示されている。この酸性多糖類はSPSと同一で
はない。このことは本明細書に下記3節に詳述す
る。SPS及びAPSのHPLCゲル濾過クロマトグラ
ムは明らかに異なり、更に、市販のペクチナー
ゼ、ペクトリアーゼ(Pectolyase)により分解し
たAPSのゲル濾過クロマトグラムと市販のペク
チナーゼ、ペクトリアーゼで処理したSPSのゲル
濾過クロマトグラムとは明らかに異なる。更に、
酸性多糖類が大豆蛋白質に結合すること、ならび
に分解した酸性多糖類は大豆蛋白質に結合しない
か、または未分解酸性多糖類より著しく少ない程
度で大豆蛋白質に結合することは文献には記載さ
れていない。また、この菌株が本明細書に記載し
たSPS−アーゼの酵素測定法によつて検出できる
ような量でSPS−アーゼを産生しないことが証明
された。このことは、SPS−アーゼの産生菌であ
るアスペルギルス・ヤポニクスの菌株に対する偏
見を生ずるものであるが、意外にも本発明によれ
ばアスペルギルス・ヤポニクスの若干の菌株が
SPS−アーゼの産生菌であることが判明した。 本発明は更に、出発原料として植物性粗蛋白質
を基質として製造した、単離されたSPSに関す
る。 本発明による単離されたSPSの好ましい態様
は、植物性粗蛋白質が脱脂大豆粉であることを特
徴とする。この単離されたSPSの製造法は第2図
に関連して前述した。 本発明はまた、試験すべき微生物を、主炭素源
がSPSである発酵培地上で増殖させ、その後発酵
培地の試料をSPS−アーゼについて分析し、SPS
−アーゼの分析結果が陽性になつたら、問題の微
生物をSPS−アーゼ産生微生物として選択するこ
とにより、本発明によるSPS−アーゼ産生用の
SPS−アーゼ産生微生物を選択する方法に関す
る。 本発明は、更に、SPS−アーゼ産生微生物の前
記選択方法により選択しうる菌株を栄養培地中で
培養することによりSPS−アーゼを産生する方法
に関する。培養を深部発酵または表面発酵として
実施することができる。 本発明方法の好ましい態様は、アスペルギル
ス・アクレアトウスDSM2344(CBS101.43)また
はアスペルギルス・ヤポニクスDSM2346
(IF04408)の菌株を栄養倍地中で培養すること
を特徴とする。 本発明方法の好ましい態様は、培養を深部培養
として3〜7、好ましくは4〜6のPH範囲で、20
〜40℃、好ましくは25〜35℃の温度範囲で実施
し、栄養培地が炭素源、窒素源及び無機塩を含む
ことを特徴とする。 本発明による方法の好ましい態様は、栄養培地
が焼いた大豆粉を含むことを特徴とする。 本発明方法の好ましい態様は、大豆粉を基質の
成分として使用する前に蛋白分解酵素、好ましく
はバチルス・リケニホルミスにより微生物学的に
産生した蛋白分解酵素で処理することを特徴とす
る。 本発明方法の好ましい態様は、ペクチンの溶液
を培養中の発酵液に無菌的に加えることを特徴と
する。 アスペルギルス・アクレアトウスDSM2344は
SPS−アーゼの他に極めて強力な残分可溶化酵
素、セルラーゼ、ペクチナーゼ及びヘミセルラー
ゼを産生すること、ならびにアスペルギルス・ア
クレアトウスDSM2344によつて産生された酵素
複合体が植物性物質の細胞壁の破壊に使用する試
薬として好適であることが判明した。アスペルギ
ルス・アクレアトウスDSM2344から産生しうる
酵素複合体は、果実及び植物性マツシユの処理の
ため、及びジユース及びワインの加工において清
澄化及び粘度低下のため、食品加工工業に使用し
て優れた結果を得ることができる。これらの酵素
複合体を更に植物の加工において脱水剤(即ち、
多糖類の分解剤、従つて多糖類の重合体構造内に
結合されていた水を遊離させる試薬)として使用
することができる。 本発明の要旨を明瞭にするため、下記の1〜10
節に基づいて本発明を詳述する; 1 SPSの製造 2 SPSの特性、特にその分子量分布、 3 SPS及びAPSが異なる化合物であることに
関する証明、 4 SPS−アーゼ産生微生物のスクリーニング 5 SPS−アーゼ産生微生物の特性 6 免疫電気泳動法と関連した重層法の一般的説
明 7 多特異性抗体を用いるSPS−アーゼの免疫電
気泳動特性及び重層 8 SPS−アーゼ製剤の精製、 9 SPS−アーゼのPH活性依存性、温度活性依存
性及び安定性、 10 酵素活性測定法 <1節> SPSの製造 前記のように、SPSの製造用出発原料は大豆残
分であつてよい。従つて、まず大豆残分の製造法
を説明する。 大豆残分は、脱脂し、外皮を除いた大豆粉中の
蛋白質を含まない炭水化物フラクシヨン(実際に
は微量のリグニン及び鉱物を含んでいてよい)で
あり、その炭水化物フラクシヨンはPH4.5の水性
媒体に不溶であり、下記の方法で製造することが
できる(第17図参照)。 脱脂大豆分〔アールース・オリーフアブリク社
(Aarhus Oliefabrik A/S)からのソヤメル
(Sojamel)13〕を、PH−スタツト及び温度制御
装置を付けたタンク中で50℃の脱イオン水中に大
豆粉:水=1:5の重量比で懸濁する。4N
NaOH()を用いてPHを8.0に調節する。アルカ
ラーゼ0.6L〔バチルス・リケニフオルミスに基づ
く、0.6アンソン単位/gの活性を蛋白分解酵
素:その活性はノボ・エンザイム・インフオメイ
シヨン(NOVO ENZYME INFORMATION)
IBNo.058e−GBに記載されているようなアンソン
法により測定する〕を用いてPH−スタツト加水分
解をする。その際酵素/基質の比は大豆粉中の蛋
白質の量の4%にする()。1時間加水分解し
た後、スラツジを遠心分離()及び洗浄()
によつて分離し、この操作を2回実施する(、
、)。こうして処理したスラツジを再度アル
カラーゼ0.6Lで1時間前記と同様に加水分解する
(、)。次に、スラツジを遠心分離(X)によ
り分離し、2回洗浄し(X、X、X、X
)、最後の洗浄したスラツジ(6)を噴霧乾燥する。
(X)。こうして製造し、噴霧乾燥した粉末が
SPSの製造原料として役立つ大豆残分である。 SPSは、前記の大豆残分をペクチナーゼで常法
で処理することによつて形成される水溶性多糖類
フラクシヨンである。SPSは下記の方法で下記の
14反応工程によつて製造される(第18図2参
照)。 1 前記の大豆残分中の乾燥固形分を測定し、大
豆残分を乾燥固形分2%に水で希釈し、温度制
御装置を付けたタンク中で50℃において懸濁す
る。 2 6N NaOHを用いてPH値を4.50に調節する。 3 ペクチネツクス・スーパー・コンク・L
(Pectinex Super conc.L)を乾燥物質1Kg当
り200gの量で添加し〔スイス連邦、バーゼル
のシユバイツアリツシエ・フエルメント社から
市販のペクチナーゼ、同社の1981年6月12日付
小冊子「デイターミネイシヨン・オブ・ザ・ペ
クチナーゼ・ユニツツ・オン・アツプル・ジユ
ース(Detemination of the Pectinase units
on Apple Juice)(MOU)」により測定して
750000MOUのペクチナーゼ活性を有する〕、
そしてセルクラスト(Celluclast)200Lを乾燥
物質1Kg当り20gの量で添加する〔デンマーク
国、バグスバード2880、ノボ・アレのノボ・イ
ンダストリ社から入手しうる小冊子「ノボ・エ
ンザイムス、インフオメイシヨンシート
(NOVO enzymes、information sheet)
B153e−GB1000(1981年7月)に記載されてい
る市販セルラーゼ〕。 4 タンクの内容物を撹拌しながら24時間50℃に
保持する。 5 4N NaOHを用いてPH値を9.0に上げること
により酵素を不活性化する。反応混合物を30分
間放置し、次に6N HClを用いてPH値を4.5に
再調整する。 6 反応混合物を遠心分離し、遠心分離液及びス
ラツジを集める。 7 工程6からの遠心分離液をフイルタープレス
上でチエツク濾過する(チエツク濾過前にフイ
ルターを洗浄する)。 8 チエツク濾液を限外濾過し、透析し、再び
3000のカツトオフ値を有する膜〔デ・ダンス
ケ・ズツカーフアブリカー(De Danske
Sukkerfabrikker)製DDS GR 60−P〕上で
限外濾過する。その際、下記のパラメータを使
用する: 1 6の容積濃度に相当する限外濾過 2 透過液中の乾燥物質のパーセンテージが0
(〜0゜ブリツクス)になるまで透析。 3 濃縮液中の乾燥物質約15%に限外濾過。温
度は50℃、PHは4.5、平均圧力は3バールで
ある。 9 限外濾過した濃縮液を5℃に冷却し、96%エ
タノールを等容量加える。 10 沈殿物を遠心分離機により集める。 11 工程10からの遠心分離液の容量に相当する
H2O中の50%V/Vエタノールを用いて沈殿
物を2回洗浄する。即ち、遠心分離を2回行な
う。 12 洗浄した沈殿を、工程9からの限外濾過し
た。濃縮液の容量に等しい容量の水に再溶解す
る。 13 工程12からの液体をガラス濾過器上でチエツ
ク濾過する。 14 純粋なSPSを含む透明な濾液を凍結乾燥す
る。 <2節> SPSの特性、特にその分子量分布 HPLC装置〔ウオータース(Waters)・ポンプ
モデル6000、ウオータース・データ・モジユール
730及びウオータース屈析計R401)でのゲルクロ
マトグラフイーにより、本明細書に示したように
して製造したSPSの分子量分布を測定する(第4
図)。SPS−アーゼによるSPSの分解生成物の分
子量分布を同じ方法により測定した(第5図)。
更に、大豆蛋白質とSPSとの結合作用(第6図)
及び本発明による試薬により分解したSPSと大豆
蛋白質との間に結合作用のないこと(第7図)を
同じ方法により証明した。 スウエーデン国ウプサラ(Uppsala)、S−
75104、私書箱175のフアルマシア・フアイン・ケ
ミカルス社(Pharmacia Fine Chemicals AB)
製の分子量既知の数種の標準デキストラン(T4,
T10,T40,T70,T110,T500)によつて検量
線を作つた(分子量の対数をRfに対してプロツ
トし、その際グルコースに関するRf値を任意に
1とし、特定のデキストランのRf値を、グルコ
ースの保持時間でこのデキストランの保持時間を
割つた数値と定義する)。各デキストランピーク
の最大値のRf値を実測し、対応する分子量を√
Mw・Mo(式中、wは分子量の重量平均値であ
り、oは分子量の数平均値である)として計算
した。このクロマトグラフイー操作の溶離剤とし
ては、0.1M NaNO3を使用した。クロマトグラ
フイー操作に使用したカラムは日本の東洋ソーダ
社の60cmのPW5000と60cmのPW3000である。こ
の方法で、前記デキストランの分子量とRf値と
の関係を測定し、第3図に示す。 第4図に基づいて、SPSが約5.4×105のwの
数値及び約4.2×104のoの数値を生ずる分子量
分布を有することを計算することができる。ま
た、この図から、クロマトグラムは約5×106の
分子量に相当する保持時間34.5分(6%)及び約
4.9×104の分子量に相当する保持時間47.12分(67
%)に2つの明瞭なピークを示すことが判る。ま
た、この曲線から、これらの2つのピークの間に
2.8×105の分子量に相当する保持時間41.25分(27
%)のところに肩が存在することが判る。 SPSをSPS−アーゼで分解した後、加水分解混
合物を膜濾過し、濾液をクロマトグラフ処理し
た。SPSの約55%が単糖類、二糖類及び三糖類に
分解し、残りの45%が5×104、104及び4.4×103
の分子量を有する3個のピークを有するポリマー
に分解することが判つた(第5図参照)。 大豆蛋白質とSPSとの間の結合作用及び大豆蛋
白質とSPS−アーゼで分解したSPSとの間の結合
作用の著しい減少を証明するため、下記の実験を
行なつた。 PH4.5の0.1M酢酸塩緩衝液中の3%SPSを大豆
単離物〔プリーナ(Purina)E500〕のスラリー
に加えて、10:1の単離物/SPS比を有する懸濁
液を作る。この懸濁液を50℃の振盪浴上で18時間
インキユベートする。インキユベーシヨン後、懸
濁液を遠心分離し、透明な上澄液を前記のように
HPLCで分析する。第4図と比べて第6図から、
SPSが大豆単離物に完全に吸着することが判る。 前の段落に示したのと同じ操作を、DSM2344
により産生されたSPS−アーゼを用いて加水分解
した3%SPS溶液について行なう(第7図)。第
7図と第5図とを比較すると、加水分解したSPS
中に約104より低い分子量の化合物は大豆単離物
に吸着していないことが判る。加水分解すると、
定量的結合は大豆蛋白質へのSPSの結合に対して
約10〜15%に減少する。 本明細書に示したようにして製造したSPSの
NMR分析によれば、SPSの概略の組成は下記の
とおりである。 (1) 約45%の量のα−ガラクトウロン酸:α−ガ
ラクトウロン酸の全量の約40%がメチルエステ
ルとして存在する。 (2) 約20%の量のラムノピラノース、 (3) 約15%の量のガラクトピラノース、及び (4) 約20%の量のβ−キシロピラノース。 成分は、ラムノガラクトウロン骨格並びにキシ
ロース及びガラクトースの側鎖から成る構造中に
存在すると思われる。 SPSを酸で完全に加水分解し(1N H2SO4中で
8時間)、その後TLC分析すると、加水分解した
SPS中に微細の単糖類フコース及びアラビノース
が存在したことが判つた。 DSM2344によつて産生されたSPS−アーゼ酵
素複合体によつて分解したSPSのHPLC分析は、
分子量の著しい低下を示す。この結果と一致し
て、前記のように分解したSPSのNMR−スペク
トルは、エステル基の大部分が消え、高分子量物
質中のキシロース及びガラクトースの含有率が減
少したことを示す。SPS分解生成物のうち、SPS
分解生成物1容量にエタノール1容量を添加する
ことによつて沈殿する部分のNMR−スペクトル
は、SPSのNMR−スペクトルと同様であり、エ
ステル基並びにキシロースとガラクトースの含有
率に関して前記の変化を示す。 <3節> SPS及びAPSが異なる化合物であることに関す
る証明 Agr.Biol.Chem.、第36巻、第4号、544〜550
頁(1972)に記載されているようにしてAPSを
製造した。 この多糖類及びSPSを種々の酵素で加水分解
し、その後、2節「SPSの特性、特にその分子量
分布」に記載したように、HPLC装置で分解混合
物をゲルクロマトグラフイーに付した。 詳述すれば、PH4.5の0.1M酢酸塩緩衝液中の2
%APSまたは2%SPSの溶液25mlを10mgの
KRF68または30mgのペクトリアーゼで処理する
ことによつて加水分解を実施した。KRF68は
SPS−アーゼ製剤であり、その製造方法は例1に
記載した。結果を下記の表に示す。
れた高分子炭水化物、このような酵素を産生する
微生物の選択方法及びこのような酵素の産生方法
に関する。 ベルギー特許第882769号明細書には、蛋白質の
溶解及び再沈殿を行なうことなく残分を酵素によ
り除去することによつて精製植物性蛋白質製品
(pvp)を製造する方法が記載されている。この
公知方法によつて得られるpvpの純度は満足なも
のではなく、従つて改良の余地を残している。実
施例では、約85%のpvpの純度が証明された。公
知方法により純度約90%のpvpを得ることができ
るとしても、これはある種の前処理した出発原
料、例えば、大豆蛋白質濃縮物を用いて初めて得
られる。極めて広範囲の出発原料、特に外皮を除
去しそして脱脂した大豆粉を用いて約90%または
それ以上の純度のpvpを得られることが望ましい
であろう。 本発明は、前記のような酵素処理の間に生ずる
ような、残留分解生成物のある一部、即ち、水溶
性高分子炭水化物が、以下に詳述するように植物
性蛋白質の一部に結合しているという意外な発見
に基づく。もちろん、炭水化物が結合すると、蛋
白質の純度は低くなる。また、この高分子量炭水
化物が動物性蛋白質に結合する能力を有すること
も判明した。 本発明の目的は、純度の改善されたpvpを製造
する可能性を開く、前記高分子炭水化物の分解酵
素及びこのような酵素の製造方法を提供すること
である。 以下に、本発明の基礎を第1図を参照して説明
するが、第1図には不溶性固形分として存在する
物質だけを示し、上澄液をすべて省略する。大豆
粉の装入物を2つの等しい部分、部及び部に
分けた(第1図のa欄)。部をアルカラーゼ
(ALCALASE)〔バチルス・リケニフオルミス
(B.licheniformis)によつて産生され、デンマー
ク国バクスバード2880のノボ・インダストリ社
(NOVOINDUSTRI A/S)によつて市販され
ている蛋白分解酵素〕を用いて約8のPH値で蛋白
分解処理し、次に約PH8で洗浄して蛋白質を全量
除去し、残分を上澄液から分離し、そして洗浄し
た(第1図の部、a及びb欄参照)。この方法
で、純粋な残分(残分と示す)が単離された
(第1図のb欄)。大豆粉の部は処理しなかつ
た;略して、、部の残分を残分と示す(第1
図のb欄)。残分及び部を市販のペクチナー
ゼ、例えばペクチネツクス(PECTINEX)〔ス
イス国バーゼルのシユバイツアリツシエ・フエル
メント社(Schweizerische Ferment A/G)
によつて製造されたペクチン分解酵素〕により分
解する(第1図のb欄及びc欄参照)。第1図か
ら、意外にも、残分の不溶分が窒素及び乾燥固
形分収支に基づいて残分の不溶分より著しく少
ないことが判る。第1図において、c欄における
ハツチングをした部分は前記段階の不溶性非蛋白
質に相当する。更に、ペクチナーゼで処理した残
分からの上澄液を大豆蛋白質懸濁液と一緒にPH
4.5にすると、上澄液中の多糖類は大豆蛋白質に
結合する。残分から上澄液中のこの多糖類は、
残分分解生成物の一部であり、大豆蛋白質の不存
在で水に澄明に溶解するが、大豆蛋白質が存在す
る場合には、大豆蛋白質の等電点またはその付近
で大豆蛋白質に結合するものであり、これをSPS
(可溶性多糖類)と示す(第1図参照)。SPSは5
×106〜0.9×104の分子量分布を有する。単離さ
れたSPSの製造法を第2図に示す。第2図は第1
図に示した処理工程も若干含んでいる。この場
合、問題は、SPS分解生成物が大豆蛋白質を結合
していないか、またはSPSが結合している大豆蛋
白質より著しく少ししか大豆蛋白質を結合しない
ようにSPSを分解しうる酵素を見い出すことであ
る。 特に大豆蛋白質について説明するが、本発明は
大豆蛋白質に限定するものではなく、すべての種
類の植物性蛋白質を包含する(例えば、ベルギー
国特許第882769号明細書1頁に列挙されている蛋
白質参照)。 本発明によれば、SPS分解能についてスクリー
ニングすることによつて、SPSを有効に分解する
酵素活性を示す化合物(略して以下SPS−アーゼ
と記す)を産生しうる微生物を選択しうることが
判つた。 本発明は第一に、SPSを適切な条件下で分解し
て、水性媒体中で蛋白質に、SPSが分解前に相応
する条件下で同じ蛋白質に結合していたであろう
より少ない程度に結合している分解生成物を生成
することができる、使用可能な形のカルボヒドラ
ーゼであるSPS−アーゼに関する。 前述の「使用可能な形」という表現は、例え
ば、毒性物質を含むSPS−アーゼ含有製剤、また
は実際に重要なSPSを分解するために、50℃で当
該SPS−アーゼの最適PHで24時間反応を実施する
際に基質中のSPSの重量に対して10%より多くの
SPS−アーゼ含有製剤の使用を必要とする程低い
SPS−アーゼ活性を示すSPS−アーゼ含有製剤を
本発明から除外することを意味する。 最終植物性蛋白質からSPSを全部または一部分
除去することにより、最終植物性蛋白質の純度
は、ベルギー特許第882769号明細書から公知の方
法により得られる最終植物性蛋白質の純度に比べ
て改良されている。それというのはこの公知の植
物性蛋白質製品はSPSで汚染されていたからであ
る。 下記の特定のSPS−アーゼがその酵素活性を単
一の酵素から生ずるのか、または少なくとも2種
の酵素から成る酵素複合体から生ずるのかは、現
在判つていない。若干の研究は、少なくとも2種
の酵素がSPS−アーゼ分解作用に応答し、これら
の酵素のうち1種はSPSを少しだけ分解でき、そ
の後1種以上の酵素がSPSの一層広範な分解を行
ないうることを示しているようである。しかし、
本出願人はこのような仮説または同様の仮説に限
定したくない。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼがSPSを水性媒体中で分解して、水
性媒体中で植物蛋白質に、SPSが分解前に水性媒
体中で同じ植物蛋白質に結合していたであろうよ
り少ない程度に結合している分解生成物を生成す
ることができるという事実を特徴とする。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼが大豆SPSを、4.5から1.5より大き
くは偏位しないPH値を有する水性媒体中で分解し
て、その水性媒体中で大豆蛋白質に、大豆SPSが
分解前に水性媒体中で大豆蛋白質に結合していた
であろうより少ない程度に結合している分解生成
物を生成しうることを特徴とする。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
分解完了後のSPSの分解生成物が、分解前のSPS
が水性媒体中で植物蛋白質に結合していたであろ
うより50%より少ない、特に20%より少ない程度
で植物蛋白質に結合していることを特徴とする。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼが本明細書に記載した定性的及び定
量的SPS−アーゼ測定法により試験したときに、
陽性SPS−アーゼ試験を示すことを特徴とする。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼがアスペルギルス(Aspergillus)
属、好ましくは黒色アスペルギルス
(Aspergillus niger)に属する微生物によつて産
生されたものであることを特徴とする。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼがアスペルギルス・アクレアトウス
(Asp.aculeatus)DSM2344(すなわち、
CBS101.43)により産生しうる酵素に由来するこ
とを特徴とする。同じくSPS−アーゼを、アスペ
ルギルス・ヤポニクス(Asp.japonics)
DSM2346(すなわち、IF04408)により産生させ
ることもできる。アスペルギルス・アクレアトウ
スDSM2344は極めて強力なレマナーゼ、セルラ
ーゼ、ペクチナーゼ及びヘミセルラーゼも産生す
ることが判つた。更に、アスペルギルス・アクレ
アトウスまたはアスペルギルス・ヤポニクス種に
属するすべての菌株が本発明に必要なSPS−アー
ゼを発生するわけではないことが判つた。本明細
書に後記(5節)のように、菌株アスペルギル
ス・ヤポニクスDSM2345(すなわち、
ATCC20236)は本明細書に記載したSPS−アー
ゼの酵素測定法によつて検出しうるような量の
SPS−アーゼを産生しないことが証明された。 本発明によるSPS−アーゼの好ましい態様は、
SPS−アーゼがアスペルギルス・アクレアトウス
DSM2344によつて産生されるSPS−アーゼと免
疫電気泳動で同一であり、免疫電気泳動重層法に
より同定しうることを特徴とする(6及び7節参
照)。 SPS−アーゼを微生物により産生させる場合に
は、SPS−アーゼは若干の同伴物質、特に他の酵
素と混合して形成される。必要に応じ、問題の
SPS−アーゼを例えば、後記(8節)ようなクロ
マトグラフイー分離法により精製することができ
る。 Agr.Biol.Chem.40(1)、87〜92頁(1976年)に
は、アスペルギルス・ヤポニクスATCC20236
(DSM2345)の菌株が、しようゆ中の酸性多糖類
(APSと言う)の部分的分解を行ないうる酵素複
合体を産生することが記載されており、その酸性
多糖類の部分的分解のフラクシヨンはAPS−
と示されている。この酸性多糖類はSPSと同一で
はない。このことは本明細書に下記3節に詳述す
る。SPS及びAPSのHPLCゲル濾過クロマトグラ
ムは明らかに異なり、更に、市販のペクチナー
ゼ、ペクトリアーゼ(Pectolyase)により分解し
たAPSのゲル濾過クロマトグラムと市販のペク
チナーゼ、ペクトリアーゼで処理したSPSのゲル
濾過クロマトグラムとは明らかに異なる。更に、
酸性多糖類が大豆蛋白質に結合すること、ならび
に分解した酸性多糖類は大豆蛋白質に結合しない
か、または未分解酸性多糖類より著しく少ない程
度で大豆蛋白質に結合することは文献には記載さ
れていない。また、この菌株が本明細書に記載し
たSPS−アーゼの酵素測定法によつて検出できる
ような量でSPS−アーゼを産生しないことが証明
された。このことは、SPS−アーゼの産生菌であ
るアスペルギルス・ヤポニクスの菌株に対する偏
見を生ずるものであるが、意外にも本発明によれ
ばアスペルギルス・ヤポニクスの若干の菌株が
SPS−アーゼの産生菌であることが判明した。 本発明は更に、出発原料として植物性粗蛋白質
を基質として製造した、単離されたSPSに関す
る。 本発明による単離されたSPSの好ましい態様
は、植物性粗蛋白質が脱脂大豆粉であることを特
徴とする。この単離されたSPSの製造法は第2図
に関連して前述した。 本発明はまた、試験すべき微生物を、主炭素源
がSPSである発酵培地上で増殖させ、その後発酵
培地の試料をSPS−アーゼについて分析し、SPS
−アーゼの分析結果が陽性になつたら、問題の微
生物をSPS−アーゼ産生微生物として選択するこ
とにより、本発明によるSPS−アーゼ産生用の
SPS−アーゼ産生微生物を選択する方法に関す
る。 本発明は、更に、SPS−アーゼ産生微生物の前
記選択方法により選択しうる菌株を栄養培地中で
培養することによりSPS−アーゼを産生する方法
に関する。培養を深部発酵または表面発酵として
実施することができる。 本発明方法の好ましい態様は、アスペルギル
ス・アクレアトウスDSM2344(CBS101.43)また
はアスペルギルス・ヤポニクスDSM2346
(IF04408)の菌株を栄養倍地中で培養すること
を特徴とする。 本発明方法の好ましい態様は、培養を深部培養
として3〜7、好ましくは4〜6のPH範囲で、20
〜40℃、好ましくは25〜35℃の温度範囲で実施
し、栄養培地が炭素源、窒素源及び無機塩を含む
ことを特徴とする。 本発明による方法の好ましい態様は、栄養培地
が焼いた大豆粉を含むことを特徴とする。 本発明方法の好ましい態様は、大豆粉を基質の
成分として使用する前に蛋白分解酵素、好ましく
はバチルス・リケニホルミスにより微生物学的に
産生した蛋白分解酵素で処理することを特徴とす
る。 本発明方法の好ましい態様は、ペクチンの溶液
を培養中の発酵液に無菌的に加えることを特徴と
する。 アスペルギルス・アクレアトウスDSM2344は
SPS−アーゼの他に極めて強力な残分可溶化酵
素、セルラーゼ、ペクチナーゼ及びヘミセルラー
ゼを産生すること、ならびにアスペルギルス・ア
クレアトウスDSM2344によつて産生された酵素
複合体が植物性物質の細胞壁の破壊に使用する試
薬として好適であることが判明した。アスペルギ
ルス・アクレアトウスDSM2344から産生しうる
酵素複合体は、果実及び植物性マツシユの処理の
ため、及びジユース及びワインの加工において清
澄化及び粘度低下のため、食品加工工業に使用し
て優れた結果を得ることができる。これらの酵素
複合体を更に植物の加工において脱水剤(即ち、
多糖類の分解剤、従つて多糖類の重合体構造内に
結合されていた水を遊離させる試薬)として使用
することができる。 本発明の要旨を明瞭にするため、下記の1〜10
節に基づいて本発明を詳述する; 1 SPSの製造 2 SPSの特性、特にその分子量分布、 3 SPS及びAPSが異なる化合物であることに
関する証明、 4 SPS−アーゼ産生微生物のスクリーニング 5 SPS−アーゼ産生微生物の特性 6 免疫電気泳動法と関連した重層法の一般的説
明 7 多特異性抗体を用いるSPS−アーゼの免疫電
気泳動特性及び重層 8 SPS−アーゼ製剤の精製、 9 SPS−アーゼのPH活性依存性、温度活性依存
性及び安定性、 10 酵素活性測定法 <1節> SPSの製造 前記のように、SPSの製造用出発原料は大豆残
分であつてよい。従つて、まず大豆残分の製造法
を説明する。 大豆残分は、脱脂し、外皮を除いた大豆粉中の
蛋白質を含まない炭水化物フラクシヨン(実際に
は微量のリグニン及び鉱物を含んでいてよい)で
あり、その炭水化物フラクシヨンはPH4.5の水性
媒体に不溶であり、下記の方法で製造することが
できる(第17図参照)。 脱脂大豆分〔アールース・オリーフアブリク社
(Aarhus Oliefabrik A/S)からのソヤメル
(Sojamel)13〕を、PH−スタツト及び温度制御
装置を付けたタンク中で50℃の脱イオン水中に大
豆粉:水=1:5の重量比で懸濁する。4N
NaOH()を用いてPHを8.0に調節する。アルカ
ラーゼ0.6L〔バチルス・リケニフオルミスに基づ
く、0.6アンソン単位/gの活性を蛋白分解酵
素:その活性はノボ・エンザイム・インフオメイ
シヨン(NOVO ENZYME INFORMATION)
IBNo.058e−GBに記載されているようなアンソン
法により測定する〕を用いてPH−スタツト加水分
解をする。その際酵素/基質の比は大豆粉中の蛋
白質の量の4%にする()。1時間加水分解し
た後、スラツジを遠心分離()及び洗浄()
によつて分離し、この操作を2回実施する(、
、)。こうして処理したスラツジを再度アル
カラーゼ0.6Lで1時間前記と同様に加水分解する
(、)。次に、スラツジを遠心分離(X)によ
り分離し、2回洗浄し(X、X、X、X
)、最後の洗浄したスラツジ(6)を噴霧乾燥する。
(X)。こうして製造し、噴霧乾燥した粉末が
SPSの製造原料として役立つ大豆残分である。 SPSは、前記の大豆残分をペクチナーゼで常法
で処理することによつて形成される水溶性多糖類
フラクシヨンである。SPSは下記の方法で下記の
14反応工程によつて製造される(第18図2参
照)。 1 前記の大豆残分中の乾燥固形分を測定し、大
豆残分を乾燥固形分2%に水で希釈し、温度制
御装置を付けたタンク中で50℃において懸濁す
る。 2 6N NaOHを用いてPH値を4.50に調節する。 3 ペクチネツクス・スーパー・コンク・L
(Pectinex Super conc.L)を乾燥物質1Kg当
り200gの量で添加し〔スイス連邦、バーゼル
のシユバイツアリツシエ・フエルメント社から
市販のペクチナーゼ、同社の1981年6月12日付
小冊子「デイターミネイシヨン・オブ・ザ・ペ
クチナーゼ・ユニツツ・オン・アツプル・ジユ
ース(Detemination of the Pectinase units
on Apple Juice)(MOU)」により測定して
750000MOUのペクチナーゼ活性を有する〕、
そしてセルクラスト(Celluclast)200Lを乾燥
物質1Kg当り20gの量で添加する〔デンマーク
国、バグスバード2880、ノボ・アレのノボ・イ
ンダストリ社から入手しうる小冊子「ノボ・エ
ンザイムス、インフオメイシヨンシート
(NOVO enzymes、information sheet)
B153e−GB1000(1981年7月)に記載されてい
る市販セルラーゼ〕。 4 タンクの内容物を撹拌しながら24時間50℃に
保持する。 5 4N NaOHを用いてPH値を9.0に上げること
により酵素を不活性化する。反応混合物を30分
間放置し、次に6N HClを用いてPH値を4.5に
再調整する。 6 反応混合物を遠心分離し、遠心分離液及びス
ラツジを集める。 7 工程6からの遠心分離液をフイルタープレス
上でチエツク濾過する(チエツク濾過前にフイ
ルターを洗浄する)。 8 チエツク濾液を限外濾過し、透析し、再び
3000のカツトオフ値を有する膜〔デ・ダンス
ケ・ズツカーフアブリカー(De Danske
Sukkerfabrikker)製DDS GR 60−P〕上で
限外濾過する。その際、下記のパラメータを使
用する: 1 6の容積濃度に相当する限外濾過 2 透過液中の乾燥物質のパーセンテージが0
(〜0゜ブリツクス)になるまで透析。 3 濃縮液中の乾燥物質約15%に限外濾過。温
度は50℃、PHは4.5、平均圧力は3バールで
ある。 9 限外濾過した濃縮液を5℃に冷却し、96%エ
タノールを等容量加える。 10 沈殿物を遠心分離機により集める。 11 工程10からの遠心分離液の容量に相当する
H2O中の50%V/Vエタノールを用いて沈殿
物を2回洗浄する。即ち、遠心分離を2回行な
う。 12 洗浄した沈殿を、工程9からの限外濾過し
た。濃縮液の容量に等しい容量の水に再溶解す
る。 13 工程12からの液体をガラス濾過器上でチエツ
ク濾過する。 14 純粋なSPSを含む透明な濾液を凍結乾燥す
る。 <2節> SPSの特性、特にその分子量分布 HPLC装置〔ウオータース(Waters)・ポンプ
モデル6000、ウオータース・データ・モジユール
730及びウオータース屈析計R401)でのゲルクロ
マトグラフイーにより、本明細書に示したように
して製造したSPSの分子量分布を測定する(第4
図)。SPS−アーゼによるSPSの分解生成物の分
子量分布を同じ方法により測定した(第5図)。
更に、大豆蛋白質とSPSとの結合作用(第6図)
及び本発明による試薬により分解したSPSと大豆
蛋白質との間に結合作用のないこと(第7図)を
同じ方法により証明した。 スウエーデン国ウプサラ(Uppsala)、S−
75104、私書箱175のフアルマシア・フアイン・ケ
ミカルス社(Pharmacia Fine Chemicals AB)
製の分子量既知の数種の標準デキストラン(T4,
T10,T40,T70,T110,T500)によつて検量
線を作つた(分子量の対数をRfに対してプロツ
トし、その際グルコースに関するRf値を任意に
1とし、特定のデキストランのRf値を、グルコ
ースの保持時間でこのデキストランの保持時間を
割つた数値と定義する)。各デキストランピーク
の最大値のRf値を実測し、対応する分子量を√
Mw・Mo(式中、wは分子量の重量平均値であ
り、oは分子量の数平均値である)として計算
した。このクロマトグラフイー操作の溶離剤とし
ては、0.1M NaNO3を使用した。クロマトグラ
フイー操作に使用したカラムは日本の東洋ソーダ
社の60cmのPW5000と60cmのPW3000である。こ
の方法で、前記デキストランの分子量とRf値と
の関係を測定し、第3図に示す。 第4図に基づいて、SPSが約5.4×105のwの
数値及び約4.2×104のoの数値を生ずる分子量
分布を有することを計算することができる。ま
た、この図から、クロマトグラムは約5×106の
分子量に相当する保持時間34.5分(6%)及び約
4.9×104の分子量に相当する保持時間47.12分(67
%)に2つの明瞭なピークを示すことが判る。ま
た、この曲線から、これらの2つのピークの間に
2.8×105の分子量に相当する保持時間41.25分(27
%)のところに肩が存在することが判る。 SPSをSPS−アーゼで分解した後、加水分解混
合物を膜濾過し、濾液をクロマトグラフ処理し
た。SPSの約55%が単糖類、二糖類及び三糖類に
分解し、残りの45%が5×104、104及び4.4×103
の分子量を有する3個のピークを有するポリマー
に分解することが判つた(第5図参照)。 大豆蛋白質とSPSとの間の結合作用及び大豆蛋
白質とSPS−アーゼで分解したSPSとの間の結合
作用の著しい減少を証明するため、下記の実験を
行なつた。 PH4.5の0.1M酢酸塩緩衝液中の3%SPSを大豆
単離物〔プリーナ(Purina)E500〕のスラリー
に加えて、10:1の単離物/SPS比を有する懸濁
液を作る。この懸濁液を50℃の振盪浴上で18時間
インキユベートする。インキユベーシヨン後、懸
濁液を遠心分離し、透明な上澄液を前記のように
HPLCで分析する。第4図と比べて第6図から、
SPSが大豆単離物に完全に吸着することが判る。 前の段落に示したのと同じ操作を、DSM2344
により産生されたSPS−アーゼを用いて加水分解
した3%SPS溶液について行なう(第7図)。第
7図と第5図とを比較すると、加水分解したSPS
中に約104より低い分子量の化合物は大豆単離物
に吸着していないことが判る。加水分解すると、
定量的結合は大豆蛋白質へのSPSの結合に対して
約10〜15%に減少する。 本明細書に示したようにして製造したSPSの
NMR分析によれば、SPSの概略の組成は下記の
とおりである。 (1) 約45%の量のα−ガラクトウロン酸:α−ガ
ラクトウロン酸の全量の約40%がメチルエステ
ルとして存在する。 (2) 約20%の量のラムノピラノース、 (3) 約15%の量のガラクトピラノース、及び (4) 約20%の量のβ−キシロピラノース。 成分は、ラムノガラクトウロン骨格並びにキシ
ロース及びガラクトースの側鎖から成る構造中に
存在すると思われる。 SPSを酸で完全に加水分解し(1N H2SO4中で
8時間)、その後TLC分析すると、加水分解した
SPS中に微細の単糖類フコース及びアラビノース
が存在したことが判つた。 DSM2344によつて産生されたSPS−アーゼ酵
素複合体によつて分解したSPSのHPLC分析は、
分子量の著しい低下を示す。この結果と一致し
て、前記のように分解したSPSのNMR−スペク
トルは、エステル基の大部分が消え、高分子量物
質中のキシロース及びガラクトースの含有率が減
少したことを示す。SPS分解生成物のうち、SPS
分解生成物1容量にエタノール1容量を添加する
ことによつて沈殿する部分のNMR−スペクトル
は、SPSのNMR−スペクトルと同様であり、エ
ステル基並びにキシロースとガラクトースの含有
率に関して前記の変化を示す。 <3節> SPS及びAPSが異なる化合物であることに関す
る証明 Agr.Biol.Chem.、第36巻、第4号、544〜550
頁(1972)に記載されているようにしてAPSを
製造した。 この多糖類及びSPSを種々の酵素で加水分解
し、その後、2節「SPSの特性、特にその分子量
分布」に記載したように、HPLC装置で分解混合
物をゲルクロマトグラフイーに付した。 詳述すれば、PH4.5の0.1M酢酸塩緩衝液中の2
%APSまたは2%SPSの溶液25mlを10mgの
KRF68または30mgのペクトリアーゼで処理する
ことによつて加水分解を実施した。KRF68は
SPS−アーゼ製剤であり、その製造方法は例1に
記載した。結果を下記の表に示す。
【表】
尚、前記の表中および後記の全ての表中におけ
る×印は、表中の当該事項に該当することを意味
する。 <4節> SPS−アーゼ産生微生物のスクリーニング 試験すべき微生物を、その微生物を増殖させう
る組成物を含む斜面寒天培地上で培養する。斜面
寒天培地上で初めに増殖させた後、微生物を、主
炭素源がSPS(前記のように製造)であり、窒素
源がNO3 -、NH4 +、尿素、遊離アミノ酸、蛋白
質または別の窒素含有化合物であり、更に好まし
くは酵母エキスの形で、必要な塩類及びビタミン
の混合物を含む液体主培地に移す。主培地の組成
は微生物の属に左右され、主な要件は、主培地が
微生物の増殖及び代謝を支持しうることである。
適当な期間、即ち問題の微生物の増殖速度に応じ
て1〜7日の程度の期間に増殖が起つたら、本明
細書に記載した酵素SPS−アーゼ測定法、または
大豆残分の分解剤の成分としての用途以外のSPS
−アーゼの特殊な用途に調整された他の任意の
SPS−アーゼ測定法により、発酵液の試料をSPS
−アーゼについて分布する。 酵素活性を測定するため一層感度の高い方法を
達成するため、温度を40℃に低下し、培養時間を
SPS−アーゼ活性の測定中20時間に上昇すること
ができ、その際感染を避けるため培地に抗生物質
を添加すべきである。 この試験方法により、アスペルギルス属及び他
の属に属する他のSPS−アーゼ産生微生物を観察
することができる。 <5節> 若干のSPS−アーゼ産生微生物の特性 SPS−アーゼ産生微生物に関する。本明細書中
に記載したスクリーニング法により、下記の表の
上部に挙げた微生物がSPS−アーゼ産生菌である
ことが判つた。この表には、SPS−アーゼ産生菌
でないアスペルギルス・ヤポニクスに属する菌株
も記載した。
る×印は、表中の当該事項に該当することを意味
する。 <4節> SPS−アーゼ産生微生物のスクリーニング 試験すべき微生物を、その微生物を増殖させう
る組成物を含む斜面寒天培地上で培養する。斜面
寒天培地上で初めに増殖させた後、微生物を、主
炭素源がSPS(前記のように製造)であり、窒素
源がNO3 -、NH4 +、尿素、遊離アミノ酸、蛋白
質または別の窒素含有化合物であり、更に好まし
くは酵母エキスの形で、必要な塩類及びビタミン
の混合物を含む液体主培地に移す。主培地の組成
は微生物の属に左右され、主な要件は、主培地が
微生物の増殖及び代謝を支持しうることである。
適当な期間、即ち問題の微生物の増殖速度に応じ
て1〜7日の程度の期間に増殖が起つたら、本明
細書に記載した酵素SPS−アーゼ測定法、または
大豆残分の分解剤の成分としての用途以外のSPS
−アーゼの特殊な用途に調整された他の任意の
SPS−アーゼ測定法により、発酵液の試料をSPS
−アーゼについて分布する。 酵素活性を測定するため一層感度の高い方法を
達成するため、温度を40℃に低下し、培養時間を
SPS−アーゼ活性の測定中20時間に上昇すること
ができ、その際感染を避けるため培地に抗生物質
を添加すべきである。 この試験方法により、アスペルギルス属及び他
の属に属する他のSPS−アーゼ産生微生物を観察
することができる。 <5節> 若干のSPS−アーゼ産生微生物の特性 SPS−アーゼ産生微生物に関する。本明細書中
に記載したスクリーニング法により、下記の表の
上部に挙げた微生物がSPS−アーゼ産生菌である
ことが判つた。この表には、SPS−アーゼ産生菌
でないアスペルギルス・ヤポニクスに属する菌株
も記載した。
【表】
前記の菌株の簡潔な同定は下記の培養カタログ
に見ることができる。 オランダ国、バールン(Baarn)のセントラル
ビユロー・フオン・シンメルカルチヤース
(Centraalbureau voor Schimmelcultures)の
リスト・オブ・カルチヤース(List of
Cultures)1978。 日本国、大阪府大阪市淀川区十三本町2−17−
85(電話番号06−302−7281)の財団法人醗酵研究
所の培養リスト(List of Cultures)(1972年)
第5版。 メリーランド20852、ロツクビル・パークロウ
ン・ドライブ12301のアメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨン・カタログ・オブ・ストレ
インズ(American Type Culture Collection
Catalogue of Strains )、第14版(1980)。 前記の表中の菌株はすべて、ザ・ジイーナス・
アスペルギルス・オブ・レイパー・アンド・フエ
ンネル(The genus Aspergillus of Raper and
Fennel)、1965年(特に327〜330頁参照)に見ら
れる種アスペルギルス・ヤポニクス及びアスペル
ギルス・アクレアトウスの分類の記載に密接に相
当する。 前記3菌株は、1982年4月14日に本願出願人で
あるノボ・インダストリ・アクテイーゼルスカブ
によつてドイチエ・ザンムルンク・フオン・ミク
ロオルガニスメン(Deutsche Sammlung von
Microorganismen)に再寄託された。 <6節> 免疫電気泳動法と関連した重層法の一般的説明 上層寒天重層法と記載する方法は、酵素複合体
中のすべての酵素成分に対する多特異性抗体との
交差免疫電気泳動により酵素複合体の個々の成分
を同定するため、本出願人によつて開発されたも
のである。この方法は、酵素が特異的酵素−抗体
結合後にもなお活性であること、または換言すれ
ば活性酵素部位が酵素−抗体結合の部位と同一で
ないことに基づく。酵素−抗体複合物は、電気泳
動の間にゲル中に明瞭な円弧として沈殿する。ゲ
ル板を上層寒天中の可溶性SPSで被覆する。相対
湿度100%の雰囲気中で45℃に20時間加熱した後、
SPS−アーゼ活性を有する円弧は、エタノール及
びアセトンの等容量部の混合物で沈殿した後の
SPS被覆中に、黒色背景に対して見たときに透明
化帯域として見えるであろう。SPS−アーゼ活性
を有しない円弧は見えないままである。 <7節> 多特異性抗体を用いSPS−アーゼの免疫電気泳動
特性及び重層 例1に示したように(KRF68)、アスペルギル
ス・アクレアトウスDSM2344(CBS101.43)の発
酵により得られたSPS−アーゼ含有酵素複合体で
家兎を免疫し、多特異性抗体をそれ自体公知の方
法で回収した。この多特異性抗体を用いて、例1
に示したように(KRF68)、アスペルギルス・ア
クレアトウスDSM2344の発酵によつて得られた
酵素複合体の交差免疫電気泳動を、アクセルセン
(N.H.Axelsen)ら著、「ア・マユニアル・オ
ブ・クアンテイタテイブ・イムノエレクトロフオ
レシス(A Manual of Quantitative
Immunoelectrophoresis)」、6′(1977年印刷)に
記載されているようにして行なつた。第11図に
は、その微生物によつて産生された種々の蛋白質
に相当する円弧を示す。前記の上層寒天重層法に
より、ハツチングをした部分がSPS−アーゼに相
当することが判る。 SPS−アーゼが少なくとも2種の酵素から成る
という仮定を含む前記の仮説が正しいとすれば、
ハツチングをした部分は、SPS−アーゼ活性に応
答する酵素がすべて存在する部分である。本発明
の他の実施態様におけるこれらの酵素を、共通の
領域を被覆しないように免疫電気泳動によつて分
離すべき場合には、SPS−アーゼ活性の一部を
SPS及び市販のペクチナーゼで重層する免疫電気
泳動によつて同定することもできる。 <8節> SPS−アーゼ製剤の精製 SPS−アーゼ製剤KRF92(例1参照)の精製を
イオン交換によつて行なつた。緩衝液はHClでPH
7.0に調節した50mMトリス(トリス−ヒドロキ
シメチルアミノメタン)である。カラムはスウエ
ーデンのフアルマシア社製のK5/30である。イ
オン交換物質はスウエーデン、ブロンマ
(Bromma)のLKB製のDEAE−トリスアクリル
である。流速は100/時間である。 15gのSPS−アーゼ製剤KRF92を6℃の水450
mlに溶かし、下記の操作をすべて6〜10℃で実施
した。1MトリスでPHを7.0に調節した。カラムを
緩衝剤で平衡させ、次にSPS−アーゼ試料をカラ
ムに導入した。OD280及び導電率を溶出液につい
て測定し、第12図に示す。フラクシヨン1はイ
オン交換物質に結合していない溶出液である。次
に、カラムを緩衝液2000mlで洗浄し、フラクシヨ
ン2を生じる。次に0〜500mMのNaCl勾配を作
り、フラクシヨン3〜9を生じる。9個のフラク
シヨンをすべて200mlに濃縮し、透析法〔アメリ
カ合衆国マサチユセツツ州のアミコン
(Amicon)社製のホロー・フアイバー(Hollow
Fiber)DP2〕により2mSiの導電率になるまで水
に対して透析した。次に、9個のフラクシヨンを
凍結乾燥した。フラクシヨン1及び2だけがSPS
−アーゼ活性を示した。 フラクシヨン1を更にゲル濾過により精製し
た。1.5gのフラクシヨン1をPH4.5の50mM酢酸
ナトリウム(500mM KCl)10mlに溶かした。カ
ラムはLKB製の2.5×100cmのものである。ゲル
濾過充填物質はスウエーデンのフアルマシア社の
セフアクリルS−200である。流速は30ml/時間
である。球状蛋白質で検量して分子量70000〜
100000の物質を含むフラクシヨンは、定性寒天試
験により試験したときにSPSを分解することもで
きないフアクターGと言われる酵素複合体を含ん
でいた。しかしながら、フアクターGをペクチナ
ーゼと混合すると、定性寒天試験によりSPSを分
解する。フアクターGがSPSからガラクトース、
フコース及び若干のガラクトウロン酸を脱離する
ことができ、HPLC分析による主分解生成物はな
お、SPSに極めて良く似た高分子生成物であるこ
とが判つた。 <9節> SPS−アーゼのPH活性依存性、温度活性依存性及
び安定性 第13図はSPS−アーゼ製剤KRF68の活性の
PH依性を示す。PH2.7〜PH3.5ではギ酸緩衝剤系を
使用し、PH3.7〜5.5では酢酸塩緩衝剤系を使用し
た。 第14図は、SPS−アーゼ製剤KRF68の活性
の温度依存性を示す。 第15図は、SPS−アーゼ製剤KRF68の温度
安定性を示す。 尚、SPS−アーゼの作用至適温度範囲は約46〜
56℃である。 <10節> 酵素活性の測定 下記の表は、本発明による種々の酵素活性測定
の結果を示す。
に見ることができる。 オランダ国、バールン(Baarn)のセントラル
ビユロー・フオン・シンメルカルチヤース
(Centraalbureau voor Schimmelcultures)の
リスト・オブ・カルチヤース(List of
Cultures)1978。 日本国、大阪府大阪市淀川区十三本町2−17−
85(電話番号06−302−7281)の財団法人醗酵研究
所の培養リスト(List of Cultures)(1972年)
第5版。 メリーランド20852、ロツクビル・パークロウ
ン・ドライブ12301のアメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨン・カタログ・オブ・ストレ
インズ(American Type Culture Collection
Catalogue of Strains )、第14版(1980)。 前記の表中の菌株はすべて、ザ・ジイーナス・
アスペルギルス・オブ・レイパー・アンド・フエ
ンネル(The genus Aspergillus of Raper and
Fennel)、1965年(特に327〜330頁参照)に見ら
れる種アスペルギルス・ヤポニクス及びアスペル
ギルス・アクレアトウスの分類の記載に密接に相
当する。 前記3菌株は、1982年4月14日に本願出願人で
あるノボ・インダストリ・アクテイーゼルスカブ
によつてドイチエ・ザンムルンク・フオン・ミク
ロオルガニスメン(Deutsche Sammlung von
Microorganismen)に再寄託された。 <6節> 免疫電気泳動法と関連した重層法の一般的説明 上層寒天重層法と記載する方法は、酵素複合体
中のすべての酵素成分に対する多特異性抗体との
交差免疫電気泳動により酵素複合体の個々の成分
を同定するため、本出願人によつて開発されたも
のである。この方法は、酵素が特異的酵素−抗体
結合後にもなお活性であること、または換言すれ
ば活性酵素部位が酵素−抗体結合の部位と同一で
ないことに基づく。酵素−抗体複合物は、電気泳
動の間にゲル中に明瞭な円弧として沈殿する。ゲ
ル板を上層寒天中の可溶性SPSで被覆する。相対
湿度100%の雰囲気中で45℃に20時間加熱した後、
SPS−アーゼ活性を有する円弧は、エタノール及
びアセトンの等容量部の混合物で沈殿した後の
SPS被覆中に、黒色背景に対して見たときに透明
化帯域として見えるであろう。SPS−アーゼ活性
を有しない円弧は見えないままである。 <7節> 多特異性抗体を用いSPS−アーゼの免疫電気泳動
特性及び重層 例1に示したように(KRF68)、アスペルギル
ス・アクレアトウスDSM2344(CBS101.43)の発
酵により得られたSPS−アーゼ含有酵素複合体で
家兎を免疫し、多特異性抗体をそれ自体公知の方
法で回収した。この多特異性抗体を用いて、例1
に示したように(KRF68)、アスペルギルス・ア
クレアトウスDSM2344の発酵によつて得られた
酵素複合体の交差免疫電気泳動を、アクセルセン
(N.H.Axelsen)ら著、「ア・マユニアル・オ
ブ・クアンテイタテイブ・イムノエレクトロフオ
レシス(A Manual of Quantitative
Immunoelectrophoresis)」、6′(1977年印刷)に
記載されているようにして行なつた。第11図に
は、その微生物によつて産生された種々の蛋白質
に相当する円弧を示す。前記の上層寒天重層法に
より、ハツチングをした部分がSPS−アーゼに相
当することが判る。 SPS−アーゼが少なくとも2種の酵素から成る
という仮定を含む前記の仮説が正しいとすれば、
ハツチングをした部分は、SPS−アーゼ活性に応
答する酵素がすべて存在する部分である。本発明
の他の実施態様におけるこれらの酵素を、共通の
領域を被覆しないように免疫電気泳動によつて分
離すべき場合には、SPS−アーゼ活性の一部を
SPS及び市販のペクチナーゼで重層する免疫電気
泳動によつて同定することもできる。 <8節> SPS−アーゼ製剤の精製 SPS−アーゼ製剤KRF92(例1参照)の精製を
イオン交換によつて行なつた。緩衝液はHClでPH
7.0に調節した50mMトリス(トリス−ヒドロキ
シメチルアミノメタン)である。カラムはスウエ
ーデンのフアルマシア社製のK5/30である。イ
オン交換物質はスウエーデン、ブロンマ
(Bromma)のLKB製のDEAE−トリスアクリル
である。流速は100/時間である。 15gのSPS−アーゼ製剤KRF92を6℃の水450
mlに溶かし、下記の操作をすべて6〜10℃で実施
した。1MトリスでPHを7.0に調節した。カラムを
緩衝剤で平衡させ、次にSPS−アーゼ試料をカラ
ムに導入した。OD280及び導電率を溶出液につい
て測定し、第12図に示す。フラクシヨン1はイ
オン交換物質に結合していない溶出液である。次
に、カラムを緩衝液2000mlで洗浄し、フラクシヨ
ン2を生じる。次に0〜500mMのNaCl勾配を作
り、フラクシヨン3〜9を生じる。9個のフラク
シヨンをすべて200mlに濃縮し、透析法〔アメリ
カ合衆国マサチユセツツ州のアミコン
(Amicon)社製のホロー・フアイバー(Hollow
Fiber)DP2〕により2mSiの導電率になるまで水
に対して透析した。次に、9個のフラクシヨンを
凍結乾燥した。フラクシヨン1及び2だけがSPS
−アーゼ活性を示した。 フラクシヨン1を更にゲル濾過により精製し
た。1.5gのフラクシヨン1をPH4.5の50mM酢酸
ナトリウム(500mM KCl)10mlに溶かした。カ
ラムはLKB製の2.5×100cmのものである。ゲル
濾過充填物質はスウエーデンのフアルマシア社の
セフアクリルS−200である。流速は30ml/時間
である。球状蛋白質で検量して分子量70000〜
100000の物質を含むフラクシヨンは、定性寒天試
験により試験したときにSPSを分解することもで
きないフアクターGと言われる酵素複合体を含ん
でいた。しかしながら、フアクターGをペクチナ
ーゼと混合すると、定性寒天試験によりSPSを分
解する。フアクターGがSPSからガラクトース、
フコース及び若干のガラクトウロン酸を脱離する
ことができ、HPLC分析による主分解生成物はな
お、SPSに極めて良く似た高分子生成物であるこ
とが判つた。 <9節> SPS−アーゼのPH活性依存性、温度活性依存性及
び安定性 第13図はSPS−アーゼ製剤KRF68の活性の
PH依性を示す。PH2.7〜PH3.5ではギ酸緩衝剤系を
使用し、PH3.7〜5.5では酢酸塩緩衝剤系を使用し
た。 第14図は、SPS−アーゼ製剤KRF68の活性
の温度依存性を示す。 第15図は、SPS−アーゼ製剤KRF68の温度
安定性を示す。 尚、SPS−アーゼの作用至適温度範囲は約46〜
56℃である。 <10節> 酵素活性の測定 下記の表は、本発明による種々の酵素活性測定
の結果を示す。
【表】
前記の表の最終欄に示した文献を下記の表に詳
述する。
述する。
【表】
【表】
セルラーゼ活性測定に関して、分析をAF149/
6−GBに記載したように実施し、測定の原理は
アナリテイカル・バイオケミストリイに説明され
ている。 <10a節> SPS−アーゼの酵素測定法 SPS−アーゼの酵素測定は2工程で、即ち定性
的寒天平板試験及び全遊離糖の量の測定に基づく
定量的SPS−アーゼ活性の測定で実施する。定性
的寒天平板試験が陰性である場合、SPS−アーゼ
活性は、定量的SPS−アーゼ活性測定からの数値
にかかわらず、ゼロである。定性的寒天平板試験
が陽性である場合には、SPS−アーゼ活性は定量
的SPS−アーゼ活性測定から得られる数値に等し
い。 定性的寒天平板試験 SPS−寒天平板を下記の方法で製造した。
0.3M酢酸を1N NaOHにより4.5のPH値に調節
することによつて緩衝液(B)を製造する。SPS1
gをB20mlに溶かす。アガロース(HSB
Litex)1gをB80mlと混合し、撹拌しながら
沸点に加熱する。アガロースが溶解したら、
SPS溶液を徐々に添加する。生ずる1%SPS−
アガロース溶液を60℃の水浴中に置く。1%
SPS−アガロース溶液15mlを寸法10cm×10cmの
水平ガラス板上に注ぐことにより平板を注型す
る。次いで、SPS−アガロースの固化層に2.5
cmの距離の9個の穴をあける。各穴に、SPS−
アーゼ活性について試験すべき酵素タンパク質
の1%溶液10μを導入する。平板を50℃、相
対湿度100%で18時間インキユベートする。未
分解SPSをエタノール及びアセトンの等容量部
の溶液によつて沈殿させる。特定の穴に置いた
試料に関するSPS−アーゼ寒天平板試験は、こ
の穴の周りに透明な環状帯域が現われる場合
に、陽性である。 定量的SPS−アーゼ活性測定試験 この試験の目的は、分解生成物が大豆蛋白質
に対する吸着または結合親和性を著しく減少し
ているかまたは全く示さない程度にSPSを分解
しうる酵素活性を測定することである。SPS分
解生成物のうち、水及びエタノールの等容量の
混合物によつては沈殿しない部分は、大豆蛋白
質に対する吸着または結合親和性を有しないこ
とが実験により判つた。 SPS−アーゼ測定は、標準条件下でのSPSの
加水分解とそれに続くSPSの、エタノールで加
水分解されない部分の沈殿に基づく。沈殿後、
沈殿しない炭水化物の含有量を全糖に関する定
量分析(バグスバード2880のノボ・インダスト
リ社から入手しうるAF169/1による)により
測定する。 標準条件は下記のとおりである: 温 度 :50℃ PH :4.5 反応時間:対照:基質だけで210分、次に酵
素を添加して2分:主として212
分。 装置は下記の部品を含む: 50℃に恒温保持された振盪水浴、ホイーリ
ミキサー(Whirlimixer)撹拌機、遠心分離
機、及び氷水浴。 試薬は下記のものを含む: 緩衝液:(a)脱イオン水中の0.6M酢酸、 (b)1.0M NaOH 基 質:a50mlのPH値をbで4.5に調節し、次
にSPS4.0gを加え、SPSを溶解し
た後、PHを4.5に再調節し、容量を
脱イオン水で100mlに調節する。 停止試薬:無水エタノール 1SPS−アーゼ活性単位は、前記の標準条件下
で毎分、1μmolのガラクトースに等しい50%エタ
ノールに溶ける炭水化物の量を放出するSPS−ア
ーゼ活性と定義する。 酵素標準曲線の最初の部分が直線である場合で
さえ、(0、0)点を通らないことに注意しなけ
ればならない。 <10b節> SRUM120と表わす残分可溶化活性の酵素測定 原 理 加水分解活性の測定方法において、脱脂し、蛋
白質を除去し、外皮を除いた大豆粉を標準条件下
で加水分解する。酵素反応を停止試薬で停止し、
不溶分を濾去する。溶解した多糖類の量を、バグ
スバード2880のノボ・インダストリイ社から入手
しうるAF169/1により酸性加水分解をした後、
分光光度計により測定する。 エンド−活性及びエキソ−活性を有するカルボ
ヒドラーゼをこの方法により測定する。 この酵素測定に適合する基質はSRU法のため
記載した残分基質と同一である。基質を下記のク
エン酸塩緩衝液中の3%溶液として溶解する: 0.1Nクエン酸塩−燐酸塩緩衝液(PH4.5) クエン酸−水和物〔メルク・アルト
(Merck Art)244〕 5.24g 燐酸水素二ナトリウム・二水和物(メルク・
アルト6580) 8.12g 脱イオン水を加えて 全量1 PH4.5±0.05 14日間安定 停止試薬は下記の組成を有する: 0.5N NaOH 100ml 96%エタノール 200ml 使用するまで冷蔵庫に保持する。 標準条件 温度 50℃ PH 4.5 反応時間、試料 120分 反応時間、ブランク 5分 単位の定義 1大豆残分可溶化単位(SRUM)120(Mはマ
ニユアルに関する)は所定の反応条件下で、毎
分、ガラクトースの1マイクロモルに等しい可溶
化多糖類を遊離する酵素の量である。 <10c節> 蛋白分解活性の酵素測定 蛋白分解活性を、情報小冊子アナリテイカル・
メソツドAF92/2−GB(請求すれば、デンマー
ク国、バグスバード2880、ノボ・アレのノボ・イ
ンダストリイ社から入手しうる)に記載されてい
るHUT法により測定するが、下記の変更または
修正を行なう: 1 小冊子に渦動ミキサー(Whirlmixer)と記
載されている場合には、渦動ミキサーをホイー
リミキサー(Whirlimixer)に修正すべきであ
る。 2 「試薬」の見出しの下の第1段落に示した
0.5M酢酸塩緩衝液に基づいて、脱イオン水で
適切に希釈することにより0.2M及び0.1M酢酸
塩緩衝液を製造する。 3 「試薬」の見出しの下の段落の試薬2及び3
を削除する。 4 「ヘモグロビン基質」の見出しの下の段落の
1行の4.0gを5.0gに変える。同じ行に、「ヘ
モグロビンは1%チオマーサレート
(Thiomersalate)で防腐し、凍凍乾燥したウ
シヘモグロビン粉である。」という文章を加入
する。 5 「ヘモグロビン基質」の見出しの下の段落の
6行の「0.5M酢酸ナトリウムを用いて」を
「1N NaOHを用いて」に変える。 6 「ヘモグロビン基質」の見出しの下の段落の
8行の「脱イオン水」を「0.2M酢酸塩緩衝液」
に変える。 7 「酵素試料」の見出しの下の段落の4行を全
部削除し、「すべての試料を0.1M酢酸塩緩衝液
に溶かす。」に代える。 8 「試料」の見出しの下の段落の1行を「基質
を室温に保持する」に代える。 9 「ブランク」の見出しの下の段落の1行、3
行、4行及び6行を削除する。 10 「ブランク」の見出しの下の段落の5行の
「3〜4秒」を「1秒」に変える。 11 「ブランク」の見出しの下の段落の7行を
「正確に5分後、トリクロロ酢酸5mlを加える。
ホイーリミキサー中で3〜4秒振盪し、管を室
温に置く」に代える。 12 「測定」の見出しの下の段落の1行の「30〜
60」を「40」に変える。 13 PH値4.7をすべての場合に3.2に代える。従つ
て、緩衝液の組成を変える。 KRF68中のプロテアーゼの安定性のPH依存性
の研究をPH値2.0〜8.0でHUT分析により実施し
たところ、PH8以上でプロテアーゼの安定性が極
めて小さいことが判つた(第16図参照)。 次に、例1〜例8に基づいて本発明を詳述する
が、例1はSPS−アーゼの製造例、例2〜8は
SPS−アーゼの応用例である。 実施例に記載するアスペルギルス・アクレアト
ウス及びアスペルギルス・ヤポニクスの菌株を用
いる若干の発酵は、実験室規模で実施した。これ
により本明細書中に記載したSPS−アーゼ試験に
よりSPS−アーゼを含む製剤が得られた。しか
し、応用試験を行なうには、むしろ多量のSPS−
アーゼを必要とするので、同様の発酵をパイロツ
トプラント規模で行なつた(例1参照)。 例 1 パイロツトプラント規模でのSPS−アーゼの製
造 アスペルギルス・アクレアトウスDSM2344
(CBS101.43)の深部発酵によりSPS−アーゼを
製造した。 フエルンバツハ(Fernbach)フラスコ中で下
記組成の寒天培地を調製した: ペプトン〔デイフコ社(Difco)製〕 6g アミノリン・オルタナ(Aminolin Ortana)
4g グルコース 1g 酵母エキス(デイフコ) 3g 肉エキス(デイフコ) 1.5g KH2PO4(メルク) 20g 麦芽エキス〔エパース(Evers)〕 20g イオン交換水を加えて 全量1000ml PHを5.30〜5.35に調節した。次に寒天(デイフ
コ)40gを加え、混合物を120℃で20分間オート
クレーブ滅菌した(この培地をE−寒天と言う)。 菌株DSM2344を斜面E−寒天上で培養した
(37℃)。斜面からの胞子を滅菌スキム−ミルク中
に懸濁し、懸濁液をバイアル中で凍結乾燥した。
凍結乾燥したバイアル1個の内容物をフエルンバ
ツハフラスコに移した。次に、フラスコを13日間
30℃でインキユベートした。 500の種発酵槽中で下記組成の培地を調製し
た: CaCO3 1.2Kg グルコース 7.2Kg ロフエツク(Rofec)(コーンステイープリカ
ー乾燥物質) 3.6Kg 大豆油 1.2Kg 水道水を加えて全量約240にした。CaCO3を
添加する前に、PHを約5.5に調製した。種発酵槽
中でこの培地を121℃で1時間滅菌した。接種前
の最終容量は約300であつた。 フエルバツハフラスコの胞子懸濁液を種発酵槽
に移した。種発酵条件は下記のとおりであつた: 発酵槽の型:約2.3の高さ/直径比を有する常
用の、通気及び撹拌式発酵槽、 撹 拌:300rpm(2個のタービン撹拌機) 通 気:空気300N/分 温 度:30〜31℃ 圧 力:0.5ato 時 間:約28時間 接種の約28時間後に、種発酵槽から150を主
発酵槽に移した。 2500の主発酵槽中で下記組成の培地を製造し
た: 焼いた大豆粉 90Kg KH2PO4 20Kg プルロニツク(Pluronic) 150ml 水道水を加えて全量約900にした。焼いた大
豆粉を水中に懸濁した。NaOHでPHを8.0に調節
し、温度を50℃に上げた。その後、約925アンソ
ン単位のアルカラーゼ(ALCALASE )0.6Lを
懸濁液に加えた。混合物を通気せずに、ゼロato
において、100rpmで撹拌しながら4時間50℃、
PH=8.0(Na2CO3添加)に保持した。その後、残
りの培地成分を加え、燐酸を用いてPHを約6.0に
調節した。主発酵槽中で培地を123℃で1 1/2時
間滅菌した。接種前の最終容量は約1080であつ
た。 次に種培養物150を加えた。 発酵条件は下記のとおりであつた: 発酵槽の型:約2.7の高さ/直径比を有する常
用の通気及び撹拌式発酵槽 撹 拌:250rpm(2個のタービン撹拌機) 通 気:空気1200N/分 温 度:30℃ 圧 力:0.5ato 時 間:約151時間 24時間〜約116時間の発酵時間の間、主発酵槽
に約8/分の一定速度で無菌的にペクチン溶液
を加えた。下記の組成物を有するペクチン溶液を
500の配合タンク中で調製した: ペクチン・ゲヌ(Pectin genu)〔コペンハー
ゲン・ペクチン・フアクトリイ社
(Copenhagen pectin factory Ltd.)の柑橘型
NF〕 22Kg 濃燐酸 6Kg プルロニツク (Pluronic ) 50ml 水道水を加えて全量約325にした。培地を配
合タンク中で121℃で1時間滅菌した。配合開始
前の最終容量は約360であつた。この部分が終
了したら、別の部分を作つた。1回の発酵に対す
るペクチン溶液の合計量は約725であつた。 約151時間発酵後、発酵工程を停止した。培養
液約1850を約5℃に冷却し、下記の方法で酵素
を回収した。 ハイフロ−スーパ−セル(Hy−flo−super−
cel)珪藻土(濾過助剤)で予め被覆した真空ド
ラム濾過器〔ドル・オリバー(Dorr Oliver)〕
で培養液を濾過した。濾液を蒸発により培養液の
容量の約15%に濃縮した。濾過助剤として0.25%
のハイフロ−スーパ−セルを用いてザイツ
(Seitz)濾過シート〔スープラ(supra)100型〕
上で濃縮液を濾過した(下記の表に濾過と記
す)。濾液を(NH4)2SO4561g/を用いてPH5.5
で沈殿させ、濾過助剤としてハイフロ−スーパ−
セル珪藻土を加える。沈殿物及び濾過助剤をフレ
ーム濾過器で濾過により分離する。濾滓を水に溶
かし、不溶分をフレーム濾過器で濾過により分離
する。濾液を濾過助剤として0.25%ハイフロ−ス
ーパ−セルを用いてザイツ濾過シート(スープラ
100型)でチエツク濾過する(下記の表に濾過
と記す)。濾液を限外濾過装置で透析する。透析
した後、液体を12.7%の乾燥固形分に濃縮する
(下記の表に濃縮液中の乾燥固形分と記す)。 プロテアーゼ活性を部分的に除去するため、場
合により塩基処理をこの段階で実施することがで
きる。塩基処理を使用する場合、これをPH9.2で
1時間実施し、その後PH値を5.0に調節する。 次に、液体をチエツク濾過し、菌減少のため濾
過し、濾液をストークス(Stokes)社の凍結乾
燥装置で凍結乾燥する。 下記の方法で4回発酵を行なつたが、その際発
酵に使用した菌株、任意の塩基処理の使用及びそ
の他のパラメータを下記の表に示したように変え
た。
6−GBに記載したように実施し、測定の原理は
アナリテイカル・バイオケミストリイに説明され
ている。 <10a節> SPS−アーゼの酵素測定法 SPS−アーゼの酵素測定は2工程で、即ち定性
的寒天平板試験及び全遊離糖の量の測定に基づく
定量的SPS−アーゼ活性の測定で実施する。定性
的寒天平板試験が陰性である場合、SPS−アーゼ
活性は、定量的SPS−アーゼ活性測定からの数値
にかかわらず、ゼロである。定性的寒天平板試験
が陽性である場合には、SPS−アーゼ活性は定量
的SPS−アーゼ活性測定から得られる数値に等し
い。 定性的寒天平板試験 SPS−寒天平板を下記の方法で製造した。
0.3M酢酸を1N NaOHにより4.5のPH値に調節
することによつて緩衝液(B)を製造する。SPS1
gをB20mlに溶かす。アガロース(HSB
Litex)1gをB80mlと混合し、撹拌しながら
沸点に加熱する。アガロースが溶解したら、
SPS溶液を徐々に添加する。生ずる1%SPS−
アガロース溶液を60℃の水浴中に置く。1%
SPS−アガロース溶液15mlを寸法10cm×10cmの
水平ガラス板上に注ぐことにより平板を注型す
る。次いで、SPS−アガロースの固化層に2.5
cmの距離の9個の穴をあける。各穴に、SPS−
アーゼ活性について試験すべき酵素タンパク質
の1%溶液10μを導入する。平板を50℃、相
対湿度100%で18時間インキユベートする。未
分解SPSをエタノール及びアセトンの等容量部
の溶液によつて沈殿させる。特定の穴に置いた
試料に関するSPS−アーゼ寒天平板試験は、こ
の穴の周りに透明な環状帯域が現われる場合
に、陽性である。 定量的SPS−アーゼ活性測定試験 この試験の目的は、分解生成物が大豆蛋白質
に対する吸着または結合親和性を著しく減少し
ているかまたは全く示さない程度にSPSを分解
しうる酵素活性を測定することである。SPS分
解生成物のうち、水及びエタノールの等容量の
混合物によつては沈殿しない部分は、大豆蛋白
質に対する吸着または結合親和性を有しないこ
とが実験により判つた。 SPS−アーゼ測定は、標準条件下でのSPSの
加水分解とそれに続くSPSの、エタノールで加
水分解されない部分の沈殿に基づく。沈殿後、
沈殿しない炭水化物の含有量を全糖に関する定
量分析(バグスバード2880のノボ・インダスト
リ社から入手しうるAF169/1による)により
測定する。 標準条件は下記のとおりである: 温 度 :50℃ PH :4.5 反応時間:対照:基質だけで210分、次に酵
素を添加して2分:主として212
分。 装置は下記の部品を含む: 50℃に恒温保持された振盪水浴、ホイーリ
ミキサー(Whirlimixer)撹拌機、遠心分離
機、及び氷水浴。 試薬は下記のものを含む: 緩衝液:(a)脱イオン水中の0.6M酢酸、 (b)1.0M NaOH 基 質:a50mlのPH値をbで4.5に調節し、次
にSPS4.0gを加え、SPSを溶解し
た後、PHを4.5に再調節し、容量を
脱イオン水で100mlに調節する。 停止試薬:無水エタノール 1SPS−アーゼ活性単位は、前記の標準条件下
で毎分、1μmolのガラクトースに等しい50%エタ
ノールに溶ける炭水化物の量を放出するSPS−ア
ーゼ活性と定義する。 酵素標準曲線の最初の部分が直線である場合で
さえ、(0、0)点を通らないことに注意しなけ
ればならない。 <10b節> SRUM120と表わす残分可溶化活性の酵素測定 原 理 加水分解活性の測定方法において、脱脂し、蛋
白質を除去し、外皮を除いた大豆粉を標準条件下
で加水分解する。酵素反応を停止試薬で停止し、
不溶分を濾去する。溶解した多糖類の量を、バグ
スバード2880のノボ・インダストリイ社から入手
しうるAF169/1により酸性加水分解をした後、
分光光度計により測定する。 エンド−活性及びエキソ−活性を有するカルボ
ヒドラーゼをこの方法により測定する。 この酵素測定に適合する基質はSRU法のため
記載した残分基質と同一である。基質を下記のク
エン酸塩緩衝液中の3%溶液として溶解する: 0.1Nクエン酸塩−燐酸塩緩衝液(PH4.5) クエン酸−水和物〔メルク・アルト
(Merck Art)244〕 5.24g 燐酸水素二ナトリウム・二水和物(メルク・
アルト6580) 8.12g 脱イオン水を加えて 全量1 PH4.5±0.05 14日間安定 停止試薬は下記の組成を有する: 0.5N NaOH 100ml 96%エタノール 200ml 使用するまで冷蔵庫に保持する。 標準条件 温度 50℃ PH 4.5 反応時間、試料 120分 反応時間、ブランク 5分 単位の定義 1大豆残分可溶化単位(SRUM)120(Mはマ
ニユアルに関する)は所定の反応条件下で、毎
分、ガラクトースの1マイクロモルに等しい可溶
化多糖類を遊離する酵素の量である。 <10c節> 蛋白分解活性の酵素測定 蛋白分解活性を、情報小冊子アナリテイカル・
メソツドAF92/2−GB(請求すれば、デンマー
ク国、バグスバード2880、ノボ・アレのノボ・イ
ンダストリイ社から入手しうる)に記載されてい
るHUT法により測定するが、下記の変更または
修正を行なう: 1 小冊子に渦動ミキサー(Whirlmixer)と記
載されている場合には、渦動ミキサーをホイー
リミキサー(Whirlimixer)に修正すべきであ
る。 2 「試薬」の見出しの下の第1段落に示した
0.5M酢酸塩緩衝液に基づいて、脱イオン水で
適切に希釈することにより0.2M及び0.1M酢酸
塩緩衝液を製造する。 3 「試薬」の見出しの下の段落の試薬2及び3
を削除する。 4 「ヘモグロビン基質」の見出しの下の段落の
1行の4.0gを5.0gに変える。同じ行に、「ヘ
モグロビンは1%チオマーサレート
(Thiomersalate)で防腐し、凍凍乾燥したウ
シヘモグロビン粉である。」という文章を加入
する。 5 「ヘモグロビン基質」の見出しの下の段落の
6行の「0.5M酢酸ナトリウムを用いて」を
「1N NaOHを用いて」に変える。 6 「ヘモグロビン基質」の見出しの下の段落の
8行の「脱イオン水」を「0.2M酢酸塩緩衝液」
に変える。 7 「酵素試料」の見出しの下の段落の4行を全
部削除し、「すべての試料を0.1M酢酸塩緩衝液
に溶かす。」に代える。 8 「試料」の見出しの下の段落の1行を「基質
を室温に保持する」に代える。 9 「ブランク」の見出しの下の段落の1行、3
行、4行及び6行を削除する。 10 「ブランク」の見出しの下の段落の5行の
「3〜4秒」を「1秒」に変える。 11 「ブランク」の見出しの下の段落の7行を
「正確に5分後、トリクロロ酢酸5mlを加える。
ホイーリミキサー中で3〜4秒振盪し、管を室
温に置く」に代える。 12 「測定」の見出しの下の段落の1行の「30〜
60」を「40」に変える。 13 PH値4.7をすべての場合に3.2に代える。従つ
て、緩衝液の組成を変える。 KRF68中のプロテアーゼの安定性のPH依存性
の研究をPH値2.0〜8.0でHUT分析により実施し
たところ、PH8以上でプロテアーゼの安定性が極
めて小さいことが判つた(第16図参照)。 次に、例1〜例8に基づいて本発明を詳述する
が、例1はSPS−アーゼの製造例、例2〜8は
SPS−アーゼの応用例である。 実施例に記載するアスペルギルス・アクレアト
ウス及びアスペルギルス・ヤポニクスの菌株を用
いる若干の発酵は、実験室規模で実施した。これ
により本明細書中に記載したSPS−アーゼ試験に
よりSPS−アーゼを含む製剤が得られた。しか
し、応用試験を行なうには、むしろ多量のSPS−
アーゼを必要とするので、同様の発酵をパイロツ
トプラント規模で行なつた(例1参照)。 例 1 パイロツトプラント規模でのSPS−アーゼの製
造 アスペルギルス・アクレアトウスDSM2344
(CBS101.43)の深部発酵によりSPS−アーゼを
製造した。 フエルンバツハ(Fernbach)フラスコ中で下
記組成の寒天培地を調製した: ペプトン〔デイフコ社(Difco)製〕 6g アミノリン・オルタナ(Aminolin Ortana)
4g グルコース 1g 酵母エキス(デイフコ) 3g 肉エキス(デイフコ) 1.5g KH2PO4(メルク) 20g 麦芽エキス〔エパース(Evers)〕 20g イオン交換水を加えて 全量1000ml PHを5.30〜5.35に調節した。次に寒天(デイフ
コ)40gを加え、混合物を120℃で20分間オート
クレーブ滅菌した(この培地をE−寒天と言う)。 菌株DSM2344を斜面E−寒天上で培養した
(37℃)。斜面からの胞子を滅菌スキム−ミルク中
に懸濁し、懸濁液をバイアル中で凍結乾燥した。
凍結乾燥したバイアル1個の内容物をフエルンバ
ツハフラスコに移した。次に、フラスコを13日間
30℃でインキユベートした。 500の種発酵槽中で下記組成の培地を調製し
た: CaCO3 1.2Kg グルコース 7.2Kg ロフエツク(Rofec)(コーンステイープリカ
ー乾燥物質) 3.6Kg 大豆油 1.2Kg 水道水を加えて全量約240にした。CaCO3を
添加する前に、PHを約5.5に調製した。種発酵槽
中でこの培地を121℃で1時間滅菌した。接種前
の最終容量は約300であつた。 フエルバツハフラスコの胞子懸濁液を種発酵槽
に移した。種発酵条件は下記のとおりであつた: 発酵槽の型:約2.3の高さ/直径比を有する常
用の、通気及び撹拌式発酵槽、 撹 拌:300rpm(2個のタービン撹拌機) 通 気:空気300N/分 温 度:30〜31℃ 圧 力:0.5ato 時 間:約28時間 接種の約28時間後に、種発酵槽から150を主
発酵槽に移した。 2500の主発酵槽中で下記組成の培地を製造し
た: 焼いた大豆粉 90Kg KH2PO4 20Kg プルロニツク(Pluronic) 150ml 水道水を加えて全量約900にした。焼いた大
豆粉を水中に懸濁した。NaOHでPHを8.0に調節
し、温度を50℃に上げた。その後、約925アンソ
ン単位のアルカラーゼ(ALCALASE )0.6Lを
懸濁液に加えた。混合物を通気せずに、ゼロato
において、100rpmで撹拌しながら4時間50℃、
PH=8.0(Na2CO3添加)に保持した。その後、残
りの培地成分を加え、燐酸を用いてPHを約6.0に
調節した。主発酵槽中で培地を123℃で1 1/2時
間滅菌した。接種前の最終容量は約1080であつ
た。 次に種培養物150を加えた。 発酵条件は下記のとおりであつた: 発酵槽の型:約2.7の高さ/直径比を有する常
用の通気及び撹拌式発酵槽 撹 拌:250rpm(2個のタービン撹拌機) 通 気:空気1200N/分 温 度:30℃ 圧 力:0.5ato 時 間:約151時間 24時間〜約116時間の発酵時間の間、主発酵槽
に約8/分の一定速度で無菌的にペクチン溶液
を加えた。下記の組成物を有するペクチン溶液を
500の配合タンク中で調製した: ペクチン・ゲヌ(Pectin genu)〔コペンハー
ゲン・ペクチン・フアクトリイ社
(Copenhagen pectin factory Ltd.)の柑橘型
NF〕 22Kg 濃燐酸 6Kg プルロニツク (Pluronic ) 50ml 水道水を加えて全量約325にした。培地を配
合タンク中で121℃で1時間滅菌した。配合開始
前の最終容量は約360であつた。この部分が終
了したら、別の部分を作つた。1回の発酵に対す
るペクチン溶液の合計量は約725であつた。 約151時間発酵後、発酵工程を停止した。培養
液約1850を約5℃に冷却し、下記の方法で酵素
を回収した。 ハイフロ−スーパ−セル(Hy−flo−super−
cel)珪藻土(濾過助剤)で予め被覆した真空ド
ラム濾過器〔ドル・オリバー(Dorr Oliver)〕
で培養液を濾過した。濾液を蒸発により培養液の
容量の約15%に濃縮した。濾過助剤として0.25%
のハイフロ−スーパ−セルを用いてザイツ
(Seitz)濾過シート〔スープラ(supra)100型〕
上で濃縮液を濾過した(下記の表に濾過と記
す)。濾液を(NH4)2SO4561g/を用いてPH5.5
で沈殿させ、濾過助剤としてハイフロ−スーパ−
セル珪藻土を加える。沈殿物及び濾過助剤をフレ
ーム濾過器で濾過により分離する。濾滓を水に溶
かし、不溶分をフレーム濾過器で濾過により分離
する。濾液を濾過助剤として0.25%ハイフロ−ス
ーパ−セルを用いてザイツ濾過シート(スープラ
100型)でチエツク濾過する(下記の表に濾過
と記す)。濾液を限外濾過装置で透析する。透析
した後、液体を12.7%の乾燥固形分に濃縮する
(下記の表に濃縮液中の乾燥固形分と記す)。 プロテアーゼ活性を部分的に除去するため、場
合により塩基処理をこの段階で実施することがで
きる。塩基処理を使用する場合、これをPH9.2で
1時間実施し、その後PH値を5.0に調節する。 次に、液体をチエツク濾過し、菌減少のため濾
過し、濾液をストークス(Stokes)社の凍結乾
燥装置で凍結乾燥する。 下記の方法で4回発酵を行なつたが、その際発
酵に使用した菌株、任意の塩基処理の使用及びそ
の他のパラメータを下記の表に示したように変え
た。
【表】
【表】
燥し、残りの部分を凍結乾燥した。
更にプロテアーゼ活性を低減するため、前記製
剤の若干のものを下記のように処理したが、その
際3種の変法A、B及びCのうち1種だけを使用
した。 A SPS−アーゼ製剤100gを脱イオン1中に
10℃±2℃で撹拌しながら溶かす。4N NaOH
を用いてPHを9.1に調節する。この塩基処理を
1時間実施する。次に氷酢酸を用いてPH値を
4.5に調節し、氷冷脱イオン水に対して3mSiの
導電率まで透析する。次に、冷凍及び凍結乾燥
を実施する。 B SPS−アーゼ製剤500gを脱イオン水4中
に撹拌しながら10℃±2℃で溶解する。4N
NaOHでPHを9.1に調節する。この塩基処理を
1時間実施する。PH値を氷酢酸を用いて5.0に
調節する。得られた物質を凍結乾燥する。 C SPS−アーゼ製剤50gを10℃±2℃で撹拌し
ながら脱イオン水400mlに溶かす。4N NaOH
を用いてPHを9.1に調節する。この塩基処理を
1時間実施する。氷酢酸を用いてPHを5.7に低
下する。得られた物質を凍結乾燥する。
更にプロテアーゼ活性を低減するため、前記製
剤の若干のものを下記のように処理したが、その
際3種の変法A、B及びCのうち1種だけを使用
した。 A SPS−アーゼ製剤100gを脱イオン1中に
10℃±2℃で撹拌しながら溶かす。4N NaOH
を用いてPHを9.1に調節する。この塩基処理を
1時間実施する。次に氷酢酸を用いてPH値を
4.5に調節し、氷冷脱イオン水に対して3mSiの
導電率まで透析する。次に、冷凍及び凍結乾燥
を実施する。 B SPS−アーゼ製剤500gを脱イオン水4中
に撹拌しながら10℃±2℃で溶解する。4N
NaOHでPHを9.1に調節する。この塩基処理を
1時間実施する。PH値を氷酢酸を用いて5.0に
調節する。得られた物質を凍結乾燥する。 C SPS−アーゼ製剤50gを10℃±2℃で撹拌し
ながら脱イオン水400mlに溶かす。4N NaOH
を用いてPHを9.1に調節する。この塩基処理を
1時間実施する。氷酢酸を用いてPHを5.7に低
下する。得られた物質を凍結乾燥する。
【表】
前記製剤は、下記の表に示すように本発明に関
連する酵素活性を有することを特徴とする。
連する酵素活性を有することを特徴とする。
【表】
例 2(応用例)
本例は、外皮を除いた脱脂大豆粉である「ソジ
ヤメル(Sojamel)13」〔アールース・オリーフ
アブリク社(Aarhus Oliefabrik A/S)から
市販されている〕からの精製植物性蛋白質製品
(以下、p.v.p.という)の製造を説明するものであ
る。この大豆粉の乾燥固形分は94.0%であり、乾
燥固形分に基づく(Nx6.25)の含有率は58.7%
であつた。大豆粉を下記の方法でSPS−アーゼ製
剤KRF68B(例1)で処理した。 大豆粉85.2gを50℃において水664.8g中に懸
濁し、撹拌し続け、6N HCl7.5mlを加えてPHを
4.5に調節した。前記SPS−アーゼ製剤4.00gを含
む溶液50gを加え、次に反応混合物を50℃で240
分間撹拌した。次に、混合物を実験室用遠心分離
後〔ベツクマン(Beckman)J−6B〕中で
3000xgで15分間遠心分離した。上澄液を秤量し、
ケルダールN及び乾燥固形分を分析した。次に固
相を第1回の遠心分離によつて得られた上澄液の
量に等しい量の水で洗浄した。この操作を2回行
なつた。次に、固相を凍結乾燥し、デンマーク
国、8000アールース・シイ・マーセリス・ブーレ
バード169のクビスツ・ラボラトリウム(Qvist’
s Laboratorium)でケルダールN及び乾燥固
形分について分析した。この研究室は飼料及び酪
農製品の分析について国から権限を与えられてい
る。実験で得られた結果を表2.1に示す。
ヤメル(Sojamel)13」〔アールース・オリーフ
アブリク社(Aarhus Oliefabrik A/S)から
市販されている〕からの精製植物性蛋白質製品
(以下、p.v.p.という)の製造を説明するものであ
る。この大豆粉の乾燥固形分は94.0%であり、乾
燥固形分に基づく(Nx6.25)の含有率は58.7%
であつた。大豆粉を下記の方法でSPS−アーゼ製
剤KRF68B(例1)で処理した。 大豆粉85.2gを50℃において水664.8g中に懸
濁し、撹拌し続け、6N HCl7.5mlを加えてPHを
4.5に調節した。前記SPS−アーゼ製剤4.00gを含
む溶液50gを加え、次に反応混合物を50℃で240
分間撹拌した。次に、混合物を実験室用遠心分離
後〔ベツクマン(Beckman)J−6B〕中で
3000xgで15分間遠心分離した。上澄液を秤量し、
ケルダールN及び乾燥固形分を分析した。次に固
相を第1回の遠心分離によつて得られた上澄液の
量に等しい量の水で洗浄した。この操作を2回行
なつた。次に、固相を凍結乾燥し、デンマーク
国、8000アールース・シイ・マーセリス・ブーレ
バード169のクビスツ・ラボラトリウム(Qvist’
s Laboratorium)でケルダールN及び乾燥固
形分について分析した。この研究室は飼料及び酪
農製品の分析について国から権限を与えられてい
る。実験で得られた結果を表2.1に示す。
【表】
p.v.p.は、91.4%の蛋白質純度、即ち乾燥固形
分に基づくNx6.25及び83%の蛋白質総収率で得
られた。 例 3(応用例) 本例は、下記の3種の方法で作つた大豆蛋白質
製品の蛋白質収率、栄養品質及び若干の機能的性
質を比較するため実施した: A:単離大豆蛋白質の製造のため伝統的等電点
沈殿、 B:濃縮大豆蛋白質の製造のため伝統的等電点
洗浄、 C:p.v.p.の製造のため残分可溶化酵素を含む
本発明による等電点洗浄、 本発明方法(C)を従来の大豆蛋白質処理方法(A
及びB)と真に比較するため、すべての場合に同
じ原料を使用した。対応する温度及び処理時間が
3種すべての場合に同じであるように、実験を行
なつた。PH値だけは3種の実験の間の基本的差に
より異なつていた。 A 分離大豆蛋白質の製造のため伝統的等電点沈
殿 大豆粉(アールース・オリーフアブリク社製
ソジヤメル13)425.8gを50℃の水道水3574.2
g中で抽出した。4N NaOH20.1gを用いてPH
を8.0に調節した。1時間撹拌した後、実験室
用遠心分離機(ベツクマンJ−6B型)中で4
個の1のビーカーを使用してスラリーを
3000xgで15分間遠心分離した。遠心分離液
及び沈殿を秤量した。沈殿を水で4000gの
総重量に再抽出した。温度を50℃に保持し、
4N NaOHを用いてPHを8に調節し、スラリー
を1時間撹拌した。遠心分離並びに遠心分離液
及び沈殿の秤量を前記のように実施した。
ケルダール・N及び乾燥固形分を測定するため
遠心分離液及び及び沈殿から試料を採取
した。その後、遠心分離液及びを混合し、
50℃に保持した。次に、6N HCl45gを用いて
PH4.5で蛋白質を等電点沈殿させた。50℃で1
時間撹拌した後、3000xgで15分間遠心分離す
ることにより蛋白質を回収した。遠心分離液
を秤量し:ケルダール−N及び乾燥固形分につ
いて分析した。固相を秤量し、遠心分離液
の重量に相当する量で水で洗浄した。50℃で1
時間撹拌することにより洗浄を実施した。洗浄
した蛋白質を3000xgで15分間遠心分離するこ
とにより回収した。遠心分離液及び固相を
秤量した。遠心分離液をケルダール−N及び
乾燥固形分について分析した。固相を50℃の水
1550g中に懸濁し、4N NaOH17gを用いてPH
を6.5に調節した。混合物を1時間撹拌して保
持し、必要に応じPH=6.5に再調節した。最後
に、生成物を凍結乾燥し、秤量し、ケルダール
−N及び乾燥固形分について分析した。物質の
収支計算を表3.1に示す。
分に基づくNx6.25及び83%の蛋白質総収率で得
られた。 例 3(応用例) 本例は、下記の3種の方法で作つた大豆蛋白質
製品の蛋白質収率、栄養品質及び若干の機能的性
質を比較するため実施した: A:単離大豆蛋白質の製造のため伝統的等電点
沈殿、 B:濃縮大豆蛋白質の製造のため伝統的等電点
洗浄、 C:p.v.p.の製造のため残分可溶化酵素を含む
本発明による等電点洗浄、 本発明方法(C)を従来の大豆蛋白質処理方法(A
及びB)と真に比較するため、すべての場合に同
じ原料を使用した。対応する温度及び処理時間が
3種すべての場合に同じであるように、実験を行
なつた。PH値だけは3種の実験の間の基本的差に
より異なつていた。 A 分離大豆蛋白質の製造のため伝統的等電点沈
殿 大豆粉(アールース・オリーフアブリク社製
ソジヤメル13)425.8gを50℃の水道水3574.2
g中で抽出した。4N NaOH20.1gを用いてPH
を8.0に調節した。1時間撹拌した後、実験室
用遠心分離機(ベツクマンJ−6B型)中で4
個の1のビーカーを使用してスラリーを
3000xgで15分間遠心分離した。遠心分離液
及び沈殿を秤量した。沈殿を水で4000gの
総重量に再抽出した。温度を50℃に保持し、
4N NaOHを用いてPHを8に調節し、スラリー
を1時間撹拌した。遠心分離並びに遠心分離液
及び沈殿の秤量を前記のように実施した。
ケルダール・N及び乾燥固形分を測定するため
遠心分離液及び及び沈殿から試料を採取
した。その後、遠心分離液及びを混合し、
50℃に保持した。次に、6N HCl45gを用いて
PH4.5で蛋白質を等電点沈殿させた。50℃で1
時間撹拌した後、3000xgで15分間遠心分離す
ることにより蛋白質を回収した。遠心分離液
を秤量し:ケルダール−N及び乾燥固形分につ
いて分析した。固相を秤量し、遠心分離液
の重量に相当する量で水で洗浄した。50℃で1
時間撹拌することにより洗浄を実施した。洗浄
した蛋白質を3000xgで15分間遠心分離するこ
とにより回収した。遠心分離液及び固相を
秤量した。遠心分離液をケルダール−N及び
乾燥固形分について分析した。固相を50℃の水
1550g中に懸濁し、4N NaOH17gを用いてPH
を6.5に調節した。混合物を1時間撹拌して保
持し、必要に応じPH=6.5に再調節した。最後
に、生成物を凍結乾燥し、秤量し、ケルダール
−N及び乾燥固形分について分析した。物質の
収支計算を表3.1に示す。
【表】
【表】
B 濃縮大豆蛋白質の製造のため等電点洗浄
大豆粉(アールース・オリーフアブリク社製
ソジヤメル13)425.6gを50℃の水357g中で洗
浄した。6N HCl44.8gを用いてPHを4.5に調節
した。洗浄を撹拌により4時間実施した。次
に、スラリーを1のビーカー4個を使用して
実験室用遠心分離機(ベツクマンJ−6B型)
中で3000xgで15分間遠心分離した。遠心分離
液を秤量し、ケルダール−N及び乾燥固形分
について分析した。固相を秤量し、水で4000
gの総重量まで再洗浄した。6N HCl1.7gを
用いてPHを4.5に再調節し、スラリーを50℃で
30分間撹拌し続ける。遠心分離及び遠心分離液
及び固体の秤量を前記のように実施した。
固相を50℃の水1575g中に再懸濁し、4N
NaOH34.5gを用いてPHを6.5に調節した。混
合物を50℃で1時間撹拌し続け、必要に応じPH
=6.5に再調節した。最後に、蛋白質生成物を
凍結乾燥し、秤量し、ケルダール−N及び乾燥
固形分について分析した。物質収支を表3.2に
示す。
ソジヤメル13)425.6gを50℃の水357g中で洗
浄した。6N HCl44.8gを用いてPHを4.5に調節
した。洗浄を撹拌により4時間実施した。次
に、スラリーを1のビーカー4個を使用して
実験室用遠心分離機(ベツクマンJ−6B型)
中で3000xgで15分間遠心分離した。遠心分離
液を秤量し、ケルダール−N及び乾燥固形分
について分析した。固相を秤量し、水で4000
gの総重量まで再洗浄した。6N HCl1.7gを
用いてPHを4.5に再調節し、スラリーを50℃で
30分間撹拌し続ける。遠心分離及び遠心分離液
及び固体の秤量を前記のように実施した。
固相を50℃の水1575g中に再懸濁し、4N
NaOH34.5gを用いてPHを6.5に調節した。混
合物を50℃で1時間撹拌し続け、必要に応じPH
=6.5に再調節した。最後に、蛋白質生成物を
凍結乾燥し、秤量し、ケルダール−N及び乾燥
固形分について分析した。物質収支を表3.2に
示す。
【表】
【表】
C p.v.p.の製造のための残分可溶化酵素を含む
等電点洗浄 大豆粉(アールース・オリーフアブリク社製
ソジヤメル13)425.8gを50℃の水3524.2g中
で洗浄した。6N HCl43.7gを使用してPHを4.5
に調節した。SPS−アーゼ製剤KRF68B(例
1)24gを水26gに溶かし、洗浄混合物に加え
る。次に、洗浄を撹拌によつて4時間実施し
た。その後、精製をBに記載したように実施す
るが、6N CHl、4N NaOH及び再懸濁用の水
の量だけは変動する。表3.3に物質収支を示す。
等電点洗浄 大豆粉(アールース・オリーフアブリク社製
ソジヤメル13)425.8gを50℃の水3524.2g中
で洗浄した。6N HCl43.7gを使用してPHを4.5
に調節した。SPS−アーゼ製剤KRF68B(例
1)24gを水26gに溶かし、洗浄混合物に加え
る。次に、洗浄を撹拌によつて4時間実施し
た。その後、精製をBに記載したように実施す
るが、6N CHl、4N NaOH及び再懸濁用の水
の量だけは変動する。表3.3に物質収支を示す。
【表】
【表】
栄養的性質
3種の蛋白質生成物のアミノ酸組成を測定し、
表3.4に示す。必要アミノ酸の総含有率、化学的
スコア及び必須アミノ酸インデツクス(EAAI)
を、1957年からのFAO基準パターンを使用して
計算する。 3種の生成物のトリプシンインヒビター含有率
をA.O.C.S.予試験法(Tentative Method)Ba12
−75〔A.O.C.S.はアメリカン・オイル・ケミス
ツ・ソサイエテイ(American Oil Chemists’
Society)の省略である〕に記載されている方
法により測定した。その結果並びに3種の生成物
の収率及び蛋白質/乾燥固形分比を表3.5に示す。
表3.4に示す。必要アミノ酸の総含有率、化学的
スコア及び必須アミノ酸インデツクス(EAAI)
を、1957年からのFAO基準パターンを使用して
計算する。 3種の生成物のトリプシンインヒビター含有率
をA.O.C.S.予試験法(Tentative Method)Ba12
−75〔A.O.C.S.はアメリカン・オイル・ケミス
ツ・ソサイエテイ(American Oil Chemists’
Society)の省略である〕に記載されている方
法により測定した。その結果並びに3種の生成物
の収率及び蛋白質/乾燥固形分比を表3.5に示す。
【表】
【表】
【表】
機能的性質
窒素可溶化指数(NSI)をそれぞれ0.2M
NaCl及び蒸留水中のPH7.0の1%蛋白質分散液中
で測定した。磁気撹拌機を用いて45分撹拌した
後、懸濁液を4000xgで30分間遠心分離し、上澄
液を窒素について分析した。窒素の溶解性を(可
溶性N%/総N%)として計算した。3種の生成
物に関する、この評価の結果を表3.6に示す。 乳化力を少し変形したスウイフト(Swift)滴
定により各生成物について3回測定した。生成物
の(Nx6.25)4.0gをソルバル・オムニミキサー
(Sorval Omnimixer)を用いて低速で0.5M
NaCl250ml中で混合する。懸濁液50mlをガラスブ
レンダージヤーに移し、大豆油50mlを加えた。そ
の後、全混合物を秤量した。次に、この油と水と
の混合物を氷浴中でジヤーで10000rpmで均質化
した。付加量の大豆油を、エマルジヨンが崩壊す
るまで、0.3ml/秒の速度で加えた。「終点」前に
添加した油の総量を秤量によつて測定した。 乳化力を蛋白質(Nx6.25)1g当りの油のml
数として計算した。油の密度を0.9g/mlとした。 3種の生成物について乳化力を測定した平均の
結果を表3.6に示す。 高速撹拌膨脹をPH6.5の3%蛋白質溶液中で測
定する。蛋白質試料の水性分散液250mlを、ワイ
アホイツプを付けたホバート(Hobart)ミキサ
ー(N−50型)中で速度で4分間撹拌した。高
速撹拌膨脹を下記の式により記載した: 高速撹拌膨脹=V−250/250×100% 〔式中、Vはml単位の最終撹拌容量である〕。 Vは水でミキサージヤーを再充填することによ
つて測定した。3種の試料それぞれについて2回
実験を行なつた。平均の結果を表3.6に示す。 泡安定性を、30分排水後に残る泡の量と泡のも
との量との比として測定した。前記の方法で作つ
た泡Agをメツシユ寸法1mm×1mmの金網を有す
るプラスチツクシリンダー(直径7cm、高さ9
cm)中に導入した。このシリンダーをガラスシリ
ンダーの頂部のロート上に設置し、ガラスシリン
ダー中に排出された液体の重さ(B)を測定する。泡
安定性FSは下記の式で規定される。 FS=A−B/A×100% 測定結果を表3.6に示す。 ゲル強度は、本明細書においては、ブルツクフ
イールド・ヘリパス(Brookfield Helipath)ス
タンド上のT−スピンドルによつて測定したブル
ツクフイールド粘度である。0.5M NaCl中の12
%蛋白質懸濁液の熱処理によつてゲルを作つた。
熱処理は、80℃及び100℃にそれぞれ保持した水
浴中に置いた直径7.3cm、高さ5cmの密閉カン中
で30分行なつた。カンを開放しそして測定する前
に、カンを冷却し、20℃に恒温保持した。測定結
果を表3.6に示す。
NaCl及び蒸留水中のPH7.0の1%蛋白質分散液中
で測定した。磁気撹拌機を用いて45分撹拌した
後、懸濁液を4000xgで30分間遠心分離し、上澄
液を窒素について分析した。窒素の溶解性を(可
溶性N%/総N%)として計算した。3種の生成
物に関する、この評価の結果を表3.6に示す。 乳化力を少し変形したスウイフト(Swift)滴
定により各生成物について3回測定した。生成物
の(Nx6.25)4.0gをソルバル・オムニミキサー
(Sorval Omnimixer)を用いて低速で0.5M
NaCl250ml中で混合する。懸濁液50mlをガラスブ
レンダージヤーに移し、大豆油50mlを加えた。そ
の後、全混合物を秤量した。次に、この油と水と
の混合物を氷浴中でジヤーで10000rpmで均質化
した。付加量の大豆油を、エマルジヨンが崩壊す
るまで、0.3ml/秒の速度で加えた。「終点」前に
添加した油の総量を秤量によつて測定した。 乳化力を蛋白質(Nx6.25)1g当りの油のml
数として計算した。油の密度を0.9g/mlとした。 3種の生成物について乳化力を測定した平均の
結果を表3.6に示す。 高速撹拌膨脹をPH6.5の3%蛋白質溶液中で測
定する。蛋白質試料の水性分散液250mlを、ワイ
アホイツプを付けたホバート(Hobart)ミキサ
ー(N−50型)中で速度で4分間撹拌した。高
速撹拌膨脹を下記の式により記載した: 高速撹拌膨脹=V−250/250×100% 〔式中、Vはml単位の最終撹拌容量である〕。 Vは水でミキサージヤーを再充填することによ
つて測定した。3種の試料それぞれについて2回
実験を行なつた。平均の結果を表3.6に示す。 泡安定性を、30分排水後に残る泡の量と泡のも
との量との比として測定した。前記の方法で作つ
た泡Agをメツシユ寸法1mm×1mmの金網を有す
るプラスチツクシリンダー(直径7cm、高さ9
cm)中に導入した。このシリンダーをガラスシリ
ンダーの頂部のロート上に設置し、ガラスシリン
ダー中に排出された液体の重さ(B)を測定する。泡
安定性FSは下記の式で規定される。 FS=A−B/A×100% 測定結果を表3.6に示す。 ゲル強度は、本明細書においては、ブルツクフ
イールド・ヘリパス(Brookfield Helipath)ス
タンド上のT−スピンドルによつて測定したブル
ツクフイールド粘度である。0.5M NaCl中の12
%蛋白質懸濁液の熱処理によつてゲルを作つた。
熱処理は、80℃及び100℃にそれぞれ保持した水
浴中に置いた直径7.3cm、高さ5cmの密閉カン中
で30分行なつた。カンを開放しそして測定する前
に、カンを冷却し、20℃に恒温保持した。測定結
果を表3.6に示す。
【表】
例 4(応用例)
セルラーゼ活性を部分的にトリコデルマ・レゼ
ーイ(Trichoderma reseei)から誘導した以外
は、例3Cに記載した方法によりp.v.p.を製造し
た。ノボ・インダストリ社製の市販のセルラーゼ
製剤セルクラスト(CELLUCLAST)を下記の
方法で低温で塩基で処理した。水中の10%セルク
ラスト溶液のPH値をNaOHを用いて9.2に調節し、
こうして生じた溶液を5℃に冷却した。このPH及
びこの温度で1時間放置した後、20%酢酸を用い
てPHを4.7に再調節した。この溶液を5℃に一夜
保持し、次に滅菌濾過した。濾液を凍結乾燥し
た。凍結乾燥した生成物4gをSPS−アーゼ製剤
KRF68B(例1)と一緒に加えた。これらの
2種の酵素を、洗浄混合物に加える前に水172g
中に溶かした。この例の物質収支の測定結果を表
4.1に示す。 この実験は、セルクラストの添加が蛋白質/乾
燥固形分比に影響しないと思われるので、この特
定のSPS−アーゼ製剤が既に有効なセルラーゼを
含むことを証明する。しかしながら、他のSPS−
アーゼ製剤はセルクラストより少ないセルラーゼ
を含む(例えばKRF92、前記の例2の表参照)。
ーイ(Trichoderma reseei)から誘導した以外
は、例3Cに記載した方法によりp.v.p.を製造し
た。ノボ・インダストリ社製の市販のセルラーゼ
製剤セルクラスト(CELLUCLAST)を下記の
方法で低温で塩基で処理した。水中の10%セルク
ラスト溶液のPH値をNaOHを用いて9.2に調節し、
こうして生じた溶液を5℃に冷却した。このPH及
びこの温度で1時間放置した後、20%酢酸を用い
てPHを4.7に再調節した。この溶液を5℃に一夜
保持し、次に滅菌濾過した。濾液を凍結乾燥し
た。凍結乾燥した生成物4gをSPS−アーゼ製剤
KRF68B(例1)と一緒に加えた。これらの
2種の酵素を、洗浄混合物に加える前に水172g
中に溶かした。この例の物質収支の測定結果を表
4.1に示す。 この実験は、セルクラストの添加が蛋白質/乾
燥固形分比に影響しないと思われるので、この特
定のSPS−アーゼ製剤が既に有効なセルラーゼを
含むことを証明する。しかしながら、他のSPS−
アーゼ製剤はセルクラストより少ないセルラーゼ
を含む(例えばKRF92、前記の例2の表参照)。
【表】
【表】
例 5(応用例)
すべての物質を5培だけ縮少し、反応混合物を
遠心分離前に約5℃に冷却する以外は例3Cに記
載した方法によりp.v.p.を製造した。遠心分離液
に関する分析結果に基づいて、沈殿した蛋白質が
理論的収率で得られ、これを表5.1に示す。
遠心分離前に約5℃に冷却する以外は例3Cに記
載した方法によりp.v.p.を製造した。遠心分離液
に関する分析結果に基づいて、沈殿した蛋白質が
理論的収率で得られ、これを表5.1に示す。
【表】
例 6(応用例)
SPSの蛋白質結合の証明
市販の大豆蛋白質単離物〔ラルストン・プリー
ナ(Ralston Purina)製のプリーナ500E〕から
の(Nx6.25)40gを水680gに溶かした。混合物
を水浴中で50℃に加熱し、6N HClを用いてPHを
4.50に調節した。この混合物90gを5個の250ml
のエルレンマイヤーフラスコに移し、前記のよう
にして製造したSPS0g、0.2g、0.4g、0.8g及
び1.6をそれぞれ含む水溶液10gを加えた。次い
でフラスコを水浴中で磁気撹拌機で撹拌しながら
50℃で240分間保持した。 その後、スラリーを3000xgで15分間遠心分離
し、遠心分離液をケルダール−N及び乾燥固形
分について分析した。固相を室温の水で洗浄し、
再び遠心分離した。この操作を繰返した。次に、
固体を水50ml中に分散し、6N NaOHを滴加する
ことによりPHを6.50に調節した。中和した生成物
を凍結乾燥し、ケルダール−N及び乾燥固形分に
ついて分析した。表6.1に示した分析に基づいて、
蛋白質の回収率及び蛋白質に結合したSPSのパー
センテージを表6.2に関して示した式により計算
する。 本例は、SPSが蛋白質に強固に結合して、SPS
の含有率が増加すると共に蛋白質/乾燥固形分比
が減少することを証明する。蛋白質単離物5gに
加えた水10g中の約0.4gに匹敵するSPS含有率
が、大豆粉中に存在する蛋白質/SPS比である。 SPSの結合率(%)が計算値である。SPSの結
合率(%)は低い蛋白質/SPS比比でSPSに関し
て蛋白質が飽和されるため減少する。
ナ(Ralston Purina)製のプリーナ500E〕から
の(Nx6.25)40gを水680gに溶かした。混合物
を水浴中で50℃に加熱し、6N HClを用いてPHを
4.50に調節した。この混合物90gを5個の250ml
のエルレンマイヤーフラスコに移し、前記のよう
にして製造したSPS0g、0.2g、0.4g、0.8g及
び1.6をそれぞれ含む水溶液10gを加えた。次い
でフラスコを水浴中で磁気撹拌機で撹拌しながら
50℃で240分間保持した。 その後、スラリーを3000xgで15分間遠心分離
し、遠心分離液をケルダール−N及び乾燥固形
分について分析した。固相を室温の水で洗浄し、
再び遠心分離した。この操作を繰返した。次に、
固体を水50ml中に分散し、6N NaOHを滴加する
ことによりPHを6.50に調節した。中和した生成物
を凍結乾燥し、ケルダール−N及び乾燥固形分に
ついて分析した。表6.1に示した分析に基づいて、
蛋白質の回収率及び蛋白質に結合したSPSのパー
センテージを表6.2に関して示した式により計算
する。 本例は、SPSが蛋白質に強固に結合して、SPS
の含有率が増加すると共に蛋白質/乾燥固形分比
が減少することを証明する。蛋白質単離物5gに
加えた水10g中の約0.4gに匹敵するSPS含有率
が、大豆粉中に存在する蛋白質/SPS比である。 SPSの結合率(%)が計算値である。SPSの結
合率(%)は低い蛋白質/SPS比比でSPSに関し
て蛋白質が飽和されるため減少する。
【表】
例 7(応用例)
本例は、乾燥物質5%を配合して、SPS−アー
ゼ製剤KRF92B−を使用してp.v.p.を製造する
例を示す。製造方法は、すべての物質を5のフア
クターだけ縮少する以外は、例3Cと全く同じで
あつた。p.v.p.を例2に記載したように分析した。
実験で得られた結果を表7.1に示す。
ゼ製剤KRF92B−を使用してp.v.p.を製造する
例を示す。製造方法は、すべての物質を5のフア
クターだけ縮少する以外は、例3Cと全く同じで
あつた。p.v.p.を例2に記載したように分析した。
実験で得られた結果を表7.1に示す。
【表】
例 8(応用例)
本例は、p.v.p.の製造前にジエツト蒸熱するこ
とにより大豆を前処理する効果を証明するもので
ある。 前処理 100Kg当り大豆粉(アールース・オリーフアブ
リク社製ソジヤメル13)10Kgから成る水中の大豆
粉のスラリーをスチームエジエクタ〔ヒドロヒー
ター(Hydroheater)B−300型〕により送入し、
管状加圧反応器中で150℃の最終温度が25秒維持
できるような量及び流速で8バールの蒸気と混合
した。その後、フラツシユ室(サイクロン)中で
放圧し、そこからスラリーを板熱交換器を介して
送り、約50℃に冷却した。冷却したスラリーを本
発明によるp.v.p.の製造に直接使用することがで
きたが、この場合にはスラリーを入口温度200℃、
出口温度90℃で噴霧乾燥した。前処理した生成物
は96.5%の乾燥固形分及び56.9%(Nx6.25)の蛋
白質含有率を有することが判つた。 p.v.p.の製造 この製造を下記の方法で実施した。 ジエツト蒸熱し、乾燥した大豆粉の乾燥物質70
gを50℃において水560g中に懸濁し、撹拌し続
け、6N HCl6.5mlを用いてPHを4.50に調節した。
この懸濁液6x90gを250mlのエルレンマイヤーフ
ラスコ6個に移し、磁気撹拌機により50℃の水浴
上で撹拌し続けた。各フラスコにSPS−アーゼ製
剤KRF−68−B−0g、0.025g、0.050g、
0.10g、0.20g及び0.40gをそれぞれ含む溶液10
gを添加した。次に反応混合物を50℃で240分撹
拌した。次に3000xgで15分遠心分離を実施した。 上澄液をケルダール−Nについて分析し、固相
を等容量の水で洗浄し、遠心分離した。この操作
を2回行なつた。次に固相を凍結乾燥し、ケルダ
ール−N及び乾燥固形分について分析した。 出発原料として未処理の大豆粉(アールース・
オリーフアブリク社ソジヤメル13)を用いて同様
に実験を行なつた。この場合、酵素基質比は0、
1%、2%、3%、4%及び8%であつた。 上澄液の蛋白質含有率に基づいて、回収された
蛋白質のパーセンテージを計算することができ
る。蛋白質の収率は、酵素生成物が反応後に100
%溶解しているという仮定に基づいている。2つ
の実験によつて得られた結果を下記の表に示す。
とにより大豆を前処理する効果を証明するもので
ある。 前処理 100Kg当り大豆粉(アールース・オリーフアブ
リク社製ソジヤメル13)10Kgから成る水中の大豆
粉のスラリーをスチームエジエクタ〔ヒドロヒー
ター(Hydroheater)B−300型〕により送入し、
管状加圧反応器中で150℃の最終温度が25秒維持
できるような量及び流速で8バールの蒸気と混合
した。その後、フラツシユ室(サイクロン)中で
放圧し、そこからスラリーを板熱交換器を介して
送り、約50℃に冷却した。冷却したスラリーを本
発明によるp.v.p.の製造に直接使用することがで
きたが、この場合にはスラリーを入口温度200℃、
出口温度90℃で噴霧乾燥した。前処理した生成物
は96.5%の乾燥固形分及び56.9%(Nx6.25)の蛋
白質含有率を有することが判つた。 p.v.p.の製造 この製造を下記の方法で実施した。 ジエツト蒸熱し、乾燥した大豆粉の乾燥物質70
gを50℃において水560g中に懸濁し、撹拌し続
け、6N HCl6.5mlを用いてPHを4.50に調節した。
この懸濁液6x90gを250mlのエルレンマイヤーフ
ラスコ6個に移し、磁気撹拌機により50℃の水浴
上で撹拌し続けた。各フラスコにSPS−アーゼ製
剤KRF−68−B−0g、0.025g、0.050g、
0.10g、0.20g及び0.40gをそれぞれ含む溶液10
gを添加した。次に反応混合物を50℃で240分撹
拌した。次に3000xgで15分遠心分離を実施した。 上澄液をケルダール−Nについて分析し、固相
を等容量の水で洗浄し、遠心分離した。この操作
を2回行なつた。次に固相を凍結乾燥し、ケルダ
ール−N及び乾燥固形分について分析した。 出発原料として未処理の大豆粉(アールース・
オリーフアブリク社ソジヤメル13)を用いて同様
に実験を行なつた。この場合、酵素基質比は0、
1%、2%、3%、4%及び8%であつた。 上澄液の蛋白質含有率に基づいて、回収された
蛋白質のパーセンテージを計算することができ
る。蛋白質の収率は、酵素生成物が反応後に100
%溶解しているという仮定に基づいている。2つ
の実験によつて得られた結果を下記の表に示す。
【表】
【表】
既に参照した図面の概説を、一層良好に理解す
るため、以下に記載する。
るため、以下に記載する。
【表】
第1図は大豆粉の分解方法を示す工程図、第2
図はSPSの単離方法を示す工程図、第3図はデキ
ストランの分子量とRf値との関係を示すグラフ
図、第4図はSPSのHPLCゲル濾過クロマトグラ
ム、第5図はSPS−アーゼによるSPSの分解生成
物のHPLCゲルクロマトグラム、第6図は大豆蛋
白質と共にインキユベートしたSPSからの上澄液
のゲルクロマトグラム、第7図は大豆蛋白質と共
にインキユベートした、分解したSPSからの上澄
液のHPLCゲルクロマトグラム、第8図はペクト
リアーゼによるAPSの分解混合物のHPLCゲル
クロマトグラム、第9図はKRF68によるAPSの
分解混合物のHPLCゲルクロマトグラム、第10
図はペクトリアーゼによるSPSの分解混合物の
HPLCゲルクロマトグラム、第11図はアスペル
ギルス・アクレアトウスの発酵により得られた酵
素複合体の交差免疫電気泳動図、第12図はSPS
−アーゼのイオン交換溶出液のOD280及び導電率
を示すグラフ図、第13図はPHとSPS−アーゼ製
剤の活性との関係を示すグラフ図、第14図は
SPS−アーゼ製剤の温度−活性関係を示すグラフ
図、第15図はSPS−アーゼ製剤の活性の温度安
定性を示すグラフ図、第16図はプロテアーゼの
安定性のPH依存性を示すグラフ図、第17図は大
豆残分の製造方法を示す工程図、第18図はSPS
の製造方法を示す工程図である。
図はSPSの単離方法を示す工程図、第3図はデキ
ストランの分子量とRf値との関係を示すグラフ
図、第4図はSPSのHPLCゲル濾過クロマトグラ
ム、第5図はSPS−アーゼによるSPSの分解生成
物のHPLCゲルクロマトグラム、第6図は大豆蛋
白質と共にインキユベートしたSPSからの上澄液
のゲルクロマトグラム、第7図は大豆蛋白質と共
にインキユベートした、分解したSPSからの上澄
液のHPLCゲルクロマトグラム、第8図はペクト
リアーゼによるAPSの分解混合物のHPLCゲル
クロマトグラム、第9図はKRF68によるAPSの
分解混合物のHPLCゲルクロマトグラム、第10
図はペクトリアーゼによるSPSの分解混合物の
HPLCゲルクロマトグラム、第11図はアスペル
ギルス・アクレアトウスの発酵により得られた酵
素複合体の交差免疫電気泳動図、第12図はSPS
−アーゼのイオン交換溶出液のOD280及び導電率
を示すグラフ図、第13図はPHとSPS−アーゼ製
剤の活性との関係を示すグラフ図、第14図は
SPS−アーゼ製剤の温度−活性関係を示すグラフ
図、第15図はSPS−アーゼ製剤の活性の温度安
定性を示すグラフ図、第16図はプロテアーゼの
安定性のPH依存性を示すグラフ図、第17図は大
豆残分の製造方法を示す工程図、第18図はSPS
の製造方法を示す工程図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 植物性粗蛋白質から単離された新規可溶性多
糖類(SPS)に作用し、少なくとも50%の最適活
性をPH3.2〜4.7に有し、作用PH3〜6を有し、更
に作用至適温度範囲約46〜56℃を有することを特
徴とするSPS−アーゼ。 2 培地中で新規SPS−アーゼを産生し得るアス
ペルギルス属に属する菌株を培養し、次いで培養
ブロスより新規SPS−アーゼを回収することを特
徴とするSPS−アーゼの製造方法。 3 前記アスペルギルス属に属する菌株が、黒色
アスペルギルス(Aspergillus)菌群に属する微
生物である、特許請求の範囲第2項記載の製造方
法。 4 前記アスペルギルス属に属する菌株が、アス
ペルギルス・アクレアトウス(Aspergillus
aculeatus)DSM2344(すなわちCBS101.43)ま
たはアスペルギルス・ヤポニクス(Aspergillus
japonicus)DSM2346(すなわち、IF04408)の菌
株である、特許請求の範囲第3項記載の製造方
法。 5 前記アスペルギルス属に属する菌株が、アス
ペルギルス・アクレアトウスDSM2344によつて
産生されるSPS−アーゼと免疫電気泳動で同一で
あり、免疫電気泳動重層法により同定されるもの
である、請求の範囲第2から第4項までのいずれ
かに記載の方法。 6 アスペルギルス・アクレアトウス
(Aspergillus aculeatus)DSM2344(すなわち、
CBS101.43)またはアスペルギルス・ヤポニクス
(Aspergillus japonicus)DSM2346(すなわち、
IF04408)の菌株を栄養培地中で培養する特許請
求の範囲第2項記載の製造方法。 7 培養を深部培養として、3〜7のPH範囲で20
〜40℃の温度範囲で実施し、栄養培地が炭素源、
窒素源及び無機塩を含む特許請求の範囲第2項か
ら第6項までのいずれかに記載の製造方法。 8 培養を深部培養として、4〜6のPH範囲で25
〜35℃の温度範囲で実施し、栄養培地が炭素源、
窒素源及び無機塩を含む特許請求の範囲第7項記
載の製造方法。 9 栄養培地が大豆粉を含む特許請求の範囲第4
項から第8項までのいずれかに記載の製造方法。 10 大豆粉を基質成分として使用する前に蛋白
分解酵素、好ましくはバチルス・リケニフオルミ
ス(Bacillus licheniformis)により微生物学的
に産生された蛋白分解酵素で処理する特許請求の
範囲第9項記載の製造方法。 11 ペクチンの滅菌溶液を培養中に発酵液に無
菌的に加える特許請求の範囲第4項から第10項
までのいずれかに記載の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK5690/81 | 1981-12-22 | ||
DK569081 | 1981-12-22 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS58111684A JPS58111684A (ja) | 1983-07-02 |
JPH034197B2 true JPH034197B2 (ja) | 1991-01-22 |
Family
ID=8144502
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP57021019A Granted JPS58111684A (ja) | 1981-12-22 | 1982-02-12 | 高分子炭水化物の分解酵素、単離された高分子炭水化物、該分解酵素を産生する微生物の選択方法及び該分解酵素の製造方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS58111684A (ja) |
BE (1) | BE895430A (ja) |
ZA (1) | ZA829363B (ja) |
-
1982
- 1982-02-12 JP JP57021019A patent/JPS58111684A/ja active Granted
- 1982-12-21 ZA ZA829363A patent/ZA829363B/xx unknown
- 1982-12-21 BE BE6/47756A patent/BE895430A/fr not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BE895430A (fr) | 1983-06-21 |
ZA829363B (en) | 1983-10-26 |
JPS58111684A (ja) | 1983-07-02 |
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