JPH0420576B2 - - Google Patents

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JPH0420576B2
JPH0420576B2 JP57021020A JP2102082A JPH0420576B2 JP H0420576 B2 JPH0420576 B2 JP H0420576B2 JP 57021020 A JP57021020 A JP 57021020A JP 2102082 A JP2102082 A JP 2102082A JP H0420576 B2 JPH0420576 B2 JP H0420576B2
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soybean
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Roorentsu Adoraa Nitsusen Iensu
Gurutoeru Henritsuku
Uiruherumu Iensen Jorugu
Aaje Seiru Orusen Hansu
Risugarudo Suteiin
Shurain Maachin
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Novo Nordisk AS
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、植物残分の分解剤、特に大豆残分の
分解剤及び精製植物性蛋白質製品の製造方法に関
する。 ベルギー特許第882769号明細書には、蛋白質の
溶解及び再沈殿を行なうことなく残分を酵素によ
り除去することによつて精製植物性蛋白質製品
（pvp）を製造する方法が記載されている。また、
この特許には、蛋白質分解活性をできるだけ低く
保持すべきであるという点についての重要性が述
べられている。この公知方法によつて得られる
pvpの純度は満足なものではなく、従つて改良の
余地を残している。実施例では、約85％のpvpの
純度が証明された。公知方法により純度約90％の
pvpを得ることができるとしても、これはある種
の前処理した出発原料、例えば、大豆蛋白質濃縮
物を用いて初めて得られる。極めて広範囲の出発
原料、特に外皮を除去しそして脱脂した大豆粉を
用いて90％以上の純度のpvpを得られることが望
ましいであろう。 本発明は、前記のような酵素処理の間に生ずる
ような、残留分解生成物のある一部、即ち、水溶
性高分子炭水化物が、以下に詳述するように蛋白
質の一部に結合しているという意外な発見に基づ
く。もちろん、炭水化物が結合すると、蛋白質の
純度は低くなる。 本発明の目的は、純度の改良されたpvpを生成
する、植物性蛋白質の存在下において植物残分
（特に、大豆残分）を分解するための薬剤、及び
pvpの製造方法を提供することにある。 以下に、本発明の基礎を第１図を参照して説明
するが、第１図には不溶性固形分として存在する
物質だけを示し、上澄液をすべて省略する。大豆
粉の装入物を２つの等しい部分、部及び部に
分けた（第１図のａ欄）。部をアルカラーゼ
（ALCALASE）〔バチルス・リケニフオルミス
（B.licheniformis）によつて産生され、デンマー
ク国バクスバード2880のノボ・インダストリ社
（NOVO INDUSTRI Ａ／Ｓ）によつて市販さ
れている蛋白分解酵素〕を用いて約８のPH値で蛋
白分解処理し、次に約PH８で洗浄して蛋白質を全
量除去し、残分を上澄液から分離し、そして洗浄
した（第１図の部、ａ及びｂ欄参照）。この方
法で、純粋な残分（残分と示す）が単離された
（第１図のｂ欄）。大豆粉の部は処理しなかつ
た；略して、部の残分を残分と示す（第１図
のｂ欄）。残分及び部を市販のペクチナーゼ、
例えばペクチネツクス（PECTINEX）〔スイス
国バーゼルのシユバイツアリツシエ・フエルメン
ト社（Schweizerische Forment Ａ／Ｇ）によ
つて製造されたペクチン分解酵素〕により分解す
る（第１図のｂ欄及びｃ欄参照）。第１図から、
意外にも、残分の不溶分が窒素及び乾燥固形分
収支に基づいて残分の不溶分より著しく少ない
ことが判る。第１図において、ｃ欄におけるハツ
チングをした部分は前記段階の不溶性非蛋白物質
に相当する。更に、ペクチナーゼで処理した残分
からの上澄液を大豆蛋白質懸濁液と一緒にPH
4.5にすると、上澄液中の多糖類は大豆蛋白質に
結合する。残分から上澄液中のこの多糖類は、
残分分解生成物の一部であり、大豆蛋白質の不存
在で水に澄明に溶解するが、大豆蛋白質が存在す
る場合には、大豆蛋白質の等電点またはその付近
で大豆蛋白質に結合するものであり、これをSPS
（可溶性多糖類）と示す（第１図参照）。SPSは５
×106〜4.9×104の分子量分布を有する。単離さ
れたSPSの製造法を第２図に示す。第２図は第１
図に示した処理工程も若干含んでいる。この場
合、問題は、SPS分解生成物が大豆蛋白質を結合
していないか、またはSPSが結合している大豆蛋
白質より著しく少ししか大豆蛋白質を結合しない
ようにSPSを分解しうる薬剤を見い出すことであ
る。 特に大豆蛋白質について説明するが、本発明は
大豆蛋白質に限定するものではなく、すべての種
類の植物性蛋白質を包含する（例えば、ベルギー
国特許第882769号明細書１頁に列挙されている蛋
白質参照）。 本発明によれば、SPS分解能についてスクリー
ニングすることによつて、SPSを有効に分解する
酵素活性を示す化合物（略して以下SPS−アーゼ
と記す）を産生しうる微生物を選択しうることが
判つた。 本発明によれば、SPS−アーゼとは、SPSを適
切な条件下で分解して、水性媒体中で植物性蛋白
質に、SPSが分解前に相応する条件下で同じ植物
性蛋白質に結合していたであろうより少ない程度
に結合している分解生成物を生成することができ
るカルボヒドラーゼであるということができる。 本発明は第一に、出発原料として脱脂植物性蛋
白質を用いて蛋白質純度約90％のpvpを製造する
のに適した、植物性蛋白質（特に、大豆蛋白質）
の存在下において植物残分（特に、大豆残分）を
分解するための、残分可溶化活性を有する酵素を
含んでなる植物残分分解剤であつて、SPSを分解
し得る酵素（SPS−アーゼ）を含んでなり且つ蛋
白質分解活性をほとんど有さないものに関する。
この植物残分分解剤の蛋白質分解活性が窒素及び
乾燥固形分重量収支に基づき、残分約65％が可溶
化された場合には、30％以下、好ましくは15％以
下、より好ましくは10％以下の完成pvpの全蛋白
質減量を付随する蛋白質分解活性に等しいかまた
はこれより低いならば、該植物残分分解剤はほと
んど蛋白質分解活性を有さない。 最終植物性蛋白質からSPSを全部または一部分
除去することにより、完成植物性蛋白質の純度
は、ベルギー特許第882769号明細書から公知の方
法により得られる完成植物性蛋白質の純度に比べ
て改良されている。それというのはこの公知の植
物性蛋白質製品はSPSで汚染されていたからであ
る。 下記の特定のSPS−アーゼがその酵素活性を単
一の酵素から生ずるのか、または少なくとも２種
の酵素から成る酵素複合体から生ずるのかは、現
在判つていない。若干の研究は、少なくとも２種
の酵素がSPS−アーゼ分解作用に応答し、これら
の酵素のうち１種はSPSを少しだけ分解でき、そ
の後１種以上の酵素がSPSの一層広範な分解を行
ないうることを示しているようである。しかし、
本出願人はこのような仮説または同様の仮説に限
定したくない。 本発明に係る植物残分分解剤の好ましい態様
は、SPS−アーゼがアスペルギルス
（Aspergillus）属に属する微生物によつて産生さ
れたものであることを特徴とする。 本発明に係る植物残分分解剤の好ましい態様
は、活性成分がアスペルギルス・アクレアトウス
（Asp.aculeatus）DSM2344（すなわち、
CBS101.43）により産生しうる酵素に由来するこ
とを特徴とする。同じSPS−アーゼを、アスペル
ギルス・ヤポニクス（Asp.japonics）DSM2346
（すなわち、IFO4408）により産生させることも
できる。アスペルギルス・アクレアトラス
DSM2344も極めて強力な残分可溶化酵素、セル
ラーゼ、ペクチナーゼ及びヘミセルラーゼを産生
することが判つた。更に、アスペルギルス・アク
レアトウスまたはアスペルギルス・ヤポニクス種
に属するすべての菌株が本発明に必要なSPS−ア
ーゼを発生するわけではないことが判つた。本明
細書に後記のように、菌株アスペルギルス・ヤポ
ニクスDSM2345（すなわち、ATCC20236）は本
明細書に記載したSPS−アーゼの酵素測定法によ
つて検出しうるような量のSPS−アーゼを産生し
ないことが証明された。 本発明に係る植物残分分解剤の好ましい態様
は、SPS−アーゼがアスペルギルス・アクレアト
ウスDSM2344（CBS101.43）によつて産生される
SPS−アーゼと免疫電気泳動で同一であり、免疫
電気泳動重層法により同定しうることを特徴とす
る（６及び７節参照）。 本発明に係る植物残分分解剤の好ましい態様
は、HUT−単位の蛋白質分解活性とSRUM−
120−単位の残分可溶化活性との比が約２：１未
満、好ましくは１：１未満、より好ましくは
0.25：１未満であることを特徴とする。PH3.2（プ
ロテアーゼの活性最適PH）における、HUT単位
（後述する）で表わしたプロテアーゼ活性と蛋白
質減量との間には明白な相関が存在することが判
明した。この相関はアスペルギルス・アクレアト
ウスDSM2344（CBS101.43）によつて産生し得る
SPS−アーゼ製剤に特異的である。DSM2344に
よつて産生し得るSPS−アーゼとは異なるSPS−
アーゼを形成する別のSPS−アーゼ産生微生物に
関してはこの相関は存在しないかもしれないが、
当業者ならば、本明細書の特許請求の範囲の欄で
特許請求の範囲第１項中に述べた蛋白質減量に関
する要件を満足させる同様な相関を見い出し得る
ことを理解されたい。SRUM−120活性（後記に
おいて定義）は常用の残分可溶化、セルラーゼ、
ペクチナーゼ及びヘミセルラーゼ活性及び他の活
性の尺度である。 SRUM−120単位はPH4.5で測定する。このPHが
選ばれたのは残分の分解を大豆蛋白質の等電点ま
たはその付近において実施するためであること、
ならびに残分の分解を別のPH値で実施する場合に
は異なる酵素活性法を用いなければならないこと
を理解されたい。 本発明に係る植物残分分解剤の好ましい態様
は、植物残分分解剤がセルラーゼ活性を含み且つ
そのセルラーゼ活性の一部分または全部がトリコ
デルマ・レゼエイ（Trichoderma reseei）に由
来するものであることを特徴とする。このセルラ
ーゼは結晶セルロースを溶解することができるの
で、この植物残分分解剤は高純度のpvpを作成す
る。 本発明に係る植物残分分解剤の好ましい態様
は、植物残分分解剤がセルラーゼ活性（Cx）、ペ
クチナーゼ活性（PU、PGE、UPTE、PEE）及
びヘミセルラーゼ活性（VHCU）を含んでなる
ことを特徴とする。 Agr.Biol.Chem.40(1)、87〜92頁（1976年）に
は、アスペルギルス・ヤポニクスATCC20236
（DSM2345）の菌株が、しようゆ中の酸性多糖類
（APSと言う）の部分的分解を行ないうる酵素複
合体を産生することが記載されており、その酸性
多糖類の部分的分解のフラクシヨンはAPS−
と示されている。この酸性多糖類はSPSと同一で
はない。このことは本明細書に下記３節に詳述す
る。SPS及びAPSのHPLCゲル過クロマトグラ
ムは明らかに異なり、更に、市販のペクチナー
ゼ、ペクトリアーゼ（Pectolyase）により分解し
たAPSのゲル過クロマトグラムと市販のペク
チナーゼ、ペクトリアーゼで処理したSPSのゲル
過クロマトグラムとは明らかに異なる。更に、
酸性多糖類が大豆蛋白質に結合すること、ならび
に分解した酸性多糖類は大豆蛋白質に結合しない
か、また未分解酸性多糖類より著しく少ない程度
で大豆蛋白質に結合することは文献には記載され
ていない。また、この菌株が本明細書に記載した
SPS−アーゼの酵素測定法によつて検出できるよ
うな量でSPS−アーゼを産生しないことが証明さ
れた。このことは、SPS−アーゼの産生菌である
アスペルギルス・ヤポニクスの菌株に対する偏見
を生ずるものであるが、意外にも本発明によれば
アスペルギルス・ヤポニクスの若干の菌株がSPS
−アーゼの産生菌であることが判明した。 本発明は第二に、出発原料としての植物性粗蛋
白質から残分を除去することによる精製植物性蛋
白質製品の製造方法であつて、窒素及び乾燥固形
分質量収支に基づき少なくとも約60％、好ましく
は少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも
約80％の残分が可溶化されるまで、該出発原料の
蛋白質部分の主要部の等電点から1.5PH単位より
多くは異ならないPH値で約20乃至約70℃の温度に
おいて水性媒体中で該出発原料を本発明に係る薬
剤で処理し、次いで精製植物性蛋白質製品を含む
固相を上澄液から分離することを含んでなる製造
方法に関する。 本発明に係る製造方法の好ましい態様は、室温
乃至上澄液の凝固点の温度において分離を実施す
ることを特徴とする。これによれば、蛋白質が高
収率で得られる。 本発明に係る製造方法の好ましい態様は、出発
原料が脱脂されたかまたは脱脂されそしてさらに
部分的に精製された植物性蛋白質であることを特
徴とする。この出発原料は容易に入手し得る。 本発明に係る製造方法の好ましい態様は、出発
原料が大豆粉であることを特徴とする。この出発
原料は安価で且つ容易に入手し得る。 本発明に係る製造方法の好ましい態様は、出発
原料が熱処理した大豆粉、好ましくはジエツト蒸
煮した大豆粉であることを特徴とする。これによ
れば、より低い酵素投与量を使用でき、さらに高
収率が達成できる。 本発明に係る製造方法の好ましい態様は、出発
原料が約2.5mmのメツシユ寸法を有する篩を通過
し得ることを特徴とする。このことはかなり短か
い反応期間を保証する。 本発明は第三に、本発明に係る製造方法によつ
て製造される、精製植物性蛋白質製品に関する。 大豆粉の処理におけるSPS−アーゼ活性の投与
量率（SAE単位）のみを示すことができる：ジ
エツト蒸煮大豆粉100ｇあたり少なくとも約
35SAE単位及び未蒸煮大豆粉100ｇあたり
350SAE単位。実際問題として、SPSを分解する
のに必要な酵素活性の正確が相互関係は知られて
いないので、ペクチナーゼ、セルラーゼ及びヘミ
セルラーゼの最小投与量及び比率は示すことがで
きない。しかしながら、大豆粉の処理中における
SRUM単位での複合活性を示すことができる：
すなわち、蒸熱大豆粉100ｇあたり少なくとも
60SRUM−120単位、未加熱大豆粉あたり
600SRUM−120単位。後述において例示した数
値は最小投与量より大きいと考えられる。pvpに
変換すべき大豆基質に関する最大操作比率及び反
応時間を決定するためには、手探り試験を使用で
きる。 本発明の要旨を明瞭にするため、下記の１〜10
節に基づいて本発明を詳述する： １ SPSの製造 ２ SPSの特性、特にその分子量分布 ３ SPS及びAPSが異なる化合物であることに
関する証明 ４ SPS−アーゼ産性微生物のスクリーニング ５ SPS−アーゼ産性微生物の特性 ６ 免疫電気泳動法と関連した重層法の一般的説
明 ７ 多特異性坑体を用いるSPS−アーゼの免疫電
気泳動特性及び重層 ８ SPS−アーゼ製剤の精製 ９ SPS−アーゼのPH活性依存性、温度活性依存
性及び安定性 10 酵素活性測定法 ＜１節＞ SPSの製造 前記のように、SPSの製造用出発原料は大豆残
分であつてよい。従つて、まず大豆残分の製造法
を説明する。 大豆残分は、脱脂し、外皮を除いた大豆粉中の
蛋白質を含まない炭水化物フラクシヨン（実際に
は微量のリグニン及び鉱物を含んでいてよい）で
あり、その炭水化物フラクシヨンはPH4.5の水性
媒体に不溶であり、下記の方法で製造することが
できる（第１７図参照）。 脱脂大豆粉〔アールース・オリーフアブリク社
（Aarhus Oliefabrik Ａ／Ｓ）からのソヤメル
（Sojamel）13〕を、PH−スタツト及び温度制御
装置を付けたタンク中で50℃の脱イオン水中に大
豆粉：水＝１：５の重量比で懸濁する。4N
NaOH（）を用いてPHを8.0に調節する。アルカ
ラーゼ0.6L〔バチルス・リケニフオルミスに基づ
く、0.6アンソン単位／ｇの活性を蛋白分解酵
素：その活性はノボ・エンザイム・インフオメイ
シヨン（NOVO ENZYME INFORMATION）
IBNo.058e−GBに記載されているようなアンソン
法により測定する〕を用いてPH−スタツト加水分
解をする。その際酵素／基質の比は大豆粉中の蛋
白質の量の４％にする（）。１時間加水分解し
た後、スラツジを遠心分離（）及び洗浄（）
によつて分離し、この操作を２回実施する（、
、）。こうして処理したスラツジを再度アル
カラーゼ0.6Lで１時間前記と同様に加水分解する
（、）。次に、スラツジを遠心分離（）によ
り分離し、２回洗浄し（XI、XII、、）、
最後の洗浄したスラツジ(6)を噴霧乾燥する（
）。こうして製造し、噴霧乾燥した粉末がSPS
の製造原料として役立つ大豆残分である。 SPSは、前記の大豆残分をペクチナーゼで常法
で処理することによつて形成される水溶性多糖類
フラクシヨンである。SPSは下記の方法で下記の
14反応工程によつて製造される（第１８図２参
照）。 １ 前記の大豆残分中の乾燥固形分を測定し、大
豆残分を乾燥固形分２％に水で希釈し、温度制
御装置を付けたタンク中で50℃において懸濁す
る。 ２ 6N NaOHを用いてPH値を4.50に調節する。 ３ ペクチネツクス・スーパー・コンク・Ｌ
（Pectinex Super conc.L）を乾燥物質１Kg当
り200ｇの量で添加し〔スイス連邦、バーゼル
のシユバイツアリツシエ・フエルメント社から
市販のペクチナーゼ、同社の1981年６月12日付
小冊子「デイターミネイシヨン・オブ・ザ・ペ
クチナーゼ・ユニツト・オン・アツプル・ジユ
ース（Determination of the Pectinase units
on Apple Juice）（MOU）」により測定して
750000MOUのペクチナーゼ活性を有する〕、
そしてセルクラスト（Celluclast）200Lを乾燥
物質１Kg当り20ｇの量で添加する〔デンマーク
国、バグスバード2880、ノボ・アレのノボ・イ
ンダストリ社から入手しうる小冊子「ノボ・エ
ンザイムス、インフオメイシヨンシート
（NOVO enzymes、information sheet）
B153e−GB1000（1981年７月）に記載されてい
る市販セルラーゼ〕。 ４ タンクの内容物を撹拌しながら24時間50℃に
保持する。 ５ 4N NaOHを用いてPH値を9.0に上げること
により酵素を不活性化する。反応混合物を30分
間放置し、次に6N HClを用いてPH値を4.5に
再調整する。 ６ 反応混合物を遠心分離し、遠心分離液及びス
ラツジを集める。 ７ 工程６からの遠心分離液をフイルタープレス
上でチエツク過する（チエツク過前にフイ
ルターを洗浄する）。 ８ チエツク液を限外過し、透析し、再び
30000のカツトオフ値を有する膜〔デ・ダンス
ケ・ズツカーフアブリカー（De Danske
Sukkerfabrikker）製DDS GR60−Ｐ〕上で限
外過する。その際、下記のパラメータを使用
する： １ ６の容積濃度に相当する限外過 ２ 透過液中の乾燥物質のパーセンテージが０
（〜0°ブリツクス）になるまで透析 ３ 濃縮液中の乾燥物質約15％に限外過温度
は50℃、PHは4.5、平均圧力３バールである。 ９ 限外過した濃縮液を５℃に冷却し、96％エ
タノールを等容量加える。 10 沈殿物を遠心分離機により集める。 11 工程10からの遠心分離液の容量に相当する
H2O中の50％ｖ／ｖエタノールを用いて沈殿
物を２回洗浄する。即ち、遠心分離を２回行な
う。 12 洗浄した沈殿を、工程９からの限外過した
濃縮液の容量に等しい容量の水に再溶解する。 13 工程12からの液体をガラス過器上でチエツ
ク過する。 14 純粋なSPSを含む透明な液を凍結乾燥す
る。 ＜２節＞ SPSの特性、特にその分子量分布 HPLC装置〔ウオータース（Waters）ポンプ
モデル6000、ウオータース・データ・モジユール
730及びウオータース屈折計R401）でのゲルクロ
マトグラフイーにより、本明細書に示したように
して製造したSPSの分子量分布を測定する（第４
図）。SPS−アーゼによるSPSの分解生成物の分
子量分布を同じ方法により測定した（第５図）。
更に、大豆蛋白質とSPSとの結合作用（第６図）
及び本発明による試薬により分解したSPSと大豆
蛋白質との間に結合作用のないこと（第７図）を
同じ方法により証明した。 スウエーデン国ウプサラ（Uppsala）、Ｓ−
75104、私書箱175のフアルマシア・フアイン・ケ
ミカルス社（Pharmacia Fine Chemicals AB）
製の分子量既知の数種の標準デキストラン（T4、
T10、T40、T70、T110、T500）によつて検量
線を作つた（分子量の対数をRfに対してプロツ
トし、その際グルコースに関するRf値を任意に
１とし、特定のデキストランのRf値を、グルコ
ースの保持時間でこのデキストランの保持時間を
割つた数値と定義する）。各デキストランピーク
の最大値のRf値を実測し、対応する分子量を√
Mw・Mo（式中、wは分子量の重量平均値であ
り、oは分子量の数平均値である）として計算
した。このクロマトグラフイー操作の溶離剤とし
ては、0.1M NaNO3を使用した。クロマトグラ
フイー操作に使用したカラムは日本の東洋ソーダ
社の60cmのPW5000と60cmのPW3000である。こ
の方法で、前記デキストランの分子量とRf値と
の関係を測定し、第３図に示す。 第４図に基づいて、SPSが約5.4×105のwの
数値及び約4.2×104のoの数値を生ずる分子量
分布を有することを計算することができる。ま
た、この図から、クロマトグラムは約５×106の
分子量に相当する保持時間34.5分（６％）及び約
4.9×104の分子量に相当する保持時間47.12分（67
％）に２つの明瞭なピークを示すことが判る。ま
た、この曲線から、これらの２つのピークの間に
2.8×105の分子量に相当する保持時間41.25分（27
％）のところに肩が存在することが判る。 SPSをSPS−アーゼで分解した後、加水分解混
合物を膜過し、液をクロマトグラフ処理し
た。SPSの約55％が単糖類、二糖類及び三糖類に
分解し、残りの45％が５×104、104及び4.4×103
の分子量を有する３個のピークを有するポリマー
に分解することが判つた（第５図参照）。 大豆蛋白質とSPSとの間の結合作用及び大豆蛋
白質とSPS−アーゼで分解したSPSとの間の結合
作用の著しい減少を証明するため、下記の実験を
行なつた。 PH4.5の0.1M酢酸塩緩衝液中の３％SPSを大豆
単雑物〔プリーナ（Purina）E500〕のスラリー
に加えて、10：１の単離物／SPS比を有する懸濁
液を作る。この懸濁液を50℃の振盪浴上で18時間
インキユベートする。イキユベーシヨン後、懸濁
液を遠心分離し、澄明な上澄液を前記のように
HPLCで分析する。第４図と比べて第６図から、
SPSが大豆単離物に完全に吸着することが判る。 前の段落に示したのと同じ操作を、DSM2344
（CBS101.43）により産生されたSPS−アーゼを
用いて加水分解した３％SPS溶液について行なう
（第７図）。第７図と第５図とを比較すると、加水
分解したSPS中に約104より低い分子量の化合物
は大豆単離物に吸着していないことが判る。加水
分解すると、定量的結合は大豆蛋白質へのSPSの
結合に対して約10〜15％に減少する。 本明細書に示したようにして製造したSPSの
NMR分析によれば、SPSの概略の組成は下記の
とおりである。 (1) 約45％の量のα−ガラクトウロン酸：α−ガ
ラクトウロン酸の全量の約40％がメチルエステ
ルとして存在する。 (2) 約20％の量のラムノピラノース、 (3) 約15％の量のガラクトピラノース、及び (4) 約20％の量のβ−キシロピラノース。 成分は、ラムノガラクトウロン骨格並びにキシ
ロース及びガラクトースの側鎖から成る構造中に
存在すると思われる。 SPSを酸で完全に加水分解し（1N H2SO4中で
８時間）、その後TLC分析すると、加水分解した
SPS中に微量の単糖類フコース及びアラビノース
が存在したことが判つた。 CBS101.43によつて産生されたSPS−アーゼ酸
素複合体によつて分解したSPSのHPLC分析は、
分子量の著しい低下を示す。この結果と一致し
て、前記のように分解したSPSのNMR−スペク
トルは、エステル基の大部分が消え、高分子量物
質中のキシロース及びガラクトースの含有率が減
少したことを示す。SPS分解生成物のうち、SPS
分解生成物１容量にエタノール１容量を添加する
ことによつて沈殿する部分のNMR−スペクトル
は、SPSのNMR−スペクトルと同様であり、エ
ステル基並びにキシロースとガラクトースの含有
率に関して前記の変化を示す。 ＜３節＞ SPS及びAPSが異なる化合物であることに関す
る証明 Agr.Biol.Chem.、第36巻、第４号、544〜550
頁（1972）に記載されていようにしてAPSを製
造した。 この多糖類及びSPSを種々の酵素で加水分解
し、その後、２節「SPSの特性、特にその分子量
分布」に記載したように、HPLC装置で分解混合
物をゲルクロマトグラフイーに付した。 詳述すれば、PH4.5の0.1M酢酸塩緩衝液中の２
％APSまたは２％SPSの溶液25mlを10mgの
KRF68または30mgのペクトリアーゼで処理する
ことによつて加水分解を実施した。KRF68は
SPS−アーゼ製剤であり、その製造方法は例１に
記載した。結果を下記の表に示す。
【表】 ＜４節＞ SPS−アーゼ産生微生物のスクリーニング 試験すべき微生物を、その微生物を増殖させう
る組成物を含む斜面寒天培地上で培養する。斜面
寒天培地上で初めに増殖させた後、微生物を、主
炭素源がSPS（前記のように製造）であり、窒素
源がNO3 -、NH4 +、尿素、遊離アミノ酸、蛋白
質または別の窒素含有化合物であり、更に好まし
くは酵母エキスの形で、必要な塩類及びビタミン
の混合物を含む液体主培地に移す。主培地の組成
は微生物の属に左右され、主な要件は、主培地が
微生物の増殖及び代謝を支持しうることである。
適当な期間、即ち問題の微生物の増殖速度に応じ
て１〜７日の程度の期間に増殖が起つたら、本明
細書に記載した酵素SPS−アーゼ測定法に従つて
発酵液の試料をSPS−アーゼについて分析する。 酵素活性を測定するため一層感度の高い方法を
達成するため、温度を40℃に低下し、培養時間を
SPS−アーゼ活性の測定中20時間に上昇すること
ができ、その際感染を避けるため培地に坑生物質
を添加すべきである。 この試験方法により、アスペルギルス属及び他
の属に属する他のSPS−アーゼ産生微生物を観察
することができる。 ＜５節＞ 若干のSPS−アーゼ産生微生物の特性 SPS−アーゼ産生微生物に関する、本明細書中
に記載したスクリーニング法により、下記の表の
上部で挙げた微生物がSPS−アーゼ産生菌である
ことが判つた。この表には、SPS−アーゼ産生菌
でないアスペルギルス・ヤポニクスに属する菌株
も記載した。
【表】 前記の菌株の簡潔な同定は下記の培養カタログ
に見ることができる。 オランダ国、バールン（Baarn）のセントラル
ビユロー・フオア・シンメルカルチヤース
（Centraalbureau voor Schimmelcultures）の
リスト・オブ・カルチヤース（List of
Cultures）1978. 日本国、大阪府大阪市淀川区十三本町２−17−
85（電話番号06−302−7281）の財団法人醗酵研究
所の培養リスト（List of Cultures）（1972年）
第５版。 メリーランド20852、ロツクビル・パークロウ
ン・ドライブ12301のアメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨン・カタログ・オブ・ストレ
インズ（American Type Culture Collection
Catalogue of Strains）、第14版（1980）。 前記の表中の菌株はすべて、ザ・ジイーナス・
アスペルギルス・オブ・レイパー・アンド・フエ
ンネル（The genus Aspergillus of Raper and
Fennel）1965年（特に327〜330頁参照）に見ら
れる種アスペルギルス・ヤポニクス及びアスペル
ギルス・アクレアトウスの分類の記載に密接に相
当する。 前記３菌株は、1982年４月14日に本願出願人で
あるノボ・インダストリ・アクテイーゼルスカブ
によつてドイチエ・ザンムルンク・フオン・ミク
ロオルガニスメン（Deutsche Sammlungvon
Microorganismen）に再寄託された。 ＜６節＞ 免疫電気泳動法と関連した重層法の一般的説明 上層寒天重層法と記載する方法は、酵素複合体
中のすべての酵素成分に対する多特異性抗体との
交差免疫電気泳動により酵素複合体の個々の成分
を同定するため、本出願人によつて開発されたも
のである。この方法は、酵素が特異的酵素−抗体
結合後にもなお活性であること、または換言すれ
ば活性酵素部位が酵素−抗体結合の部位と同一で
ないことに基づく。酵素−抗体複合体は、電気泳
動の間にゲル中に明瞭な円弧として沈殿する。ゲ
ル板を上層寒天中の可溶性SPSで被覆する。相対
湿度100％の雰囲気中で45℃に20時間加熱した後、
SPS−アーゼ活性を有する円弧は、エタノール及
びアセトンの等容量部の混合物で沈殿した後の
SPS被覆中に、黒色背景に対して見たときに透明
化帯域として見えるであろう。SPS−アーゼ活性
を有しない円弧は見えないままである。 ＜７節＞ 多特異性抗体を用いるSPS−アーゼの免疫電気泳
動特性及び重層 例１に示したように（KRF68）、アスペルギル
ス・アクレアトウスDSM2344（CBS101.43）の発
酵により得られたSPS−アーゼ含有酵素複合体で
家兎を免疫し、多特異性抗体をそれ自体公知の方
法で回収した。この多特異性抗体を用いて、例１
に示したように（KRF68）、アスペルギルス・ア
クレアトウスDSM2344の発酵によつて得られた
酵素複合体の交差免疫電気泳動を、アクセルセン
（N.H.Axelsen）ら著、「ア・マニユアル・オ
ブ・クアンテイタテイブ・イムノエレクトロフオ
レシス（Ａ Manual of Quantitative
Immunoelectrophoresis）」、６（1977年印刷）に
記載されているようにして行なつた。第１１図に
は、その微生物によつて産生された種々の蛋白質
に相当する円弧を示す。前記の上層寒天重層法に
より、ハツチングをした部分がSPS−アーゼに相
当することが判る。 SPS−アーゼが少なくとも２種の酵素から成る
という仮定を含む前記の仮説が正しいとすれば、
ハツチングをした部分は、SPS−アーゼ活性に応
答する酵素がすべて存在する部分である。本発明
の他の実施態様におけるこれらの酵素を、共通の
領域を被覆しないように免疫電気泳動によつて分
離すべき場合には、SPS−アーゼ活性の一部を
SPS及び市販のペクチナーゼで重層する免疫電気
泳動によつて同定することもできる。 ＜８節＞ SPS−アーゼ製剤の精製 SPS−アーゼ製剤KRF92（例１参照）の精製を
イオン交換によつて行なつた。緩衝液はHClでPH
7.0に調節した50ｍＭトリス（トリス−ヒドロキ
シメチルアミノメタン）である。カラムはスウエ
ーデンのフアルマシア社製のK5／30である。イ
オン交換物質はスウエーデン、ブロンマ
（Bromma）のLKB製のDEAE・トリスアクリル
である。流速は100ml／時間である。 15ｇのSPS−アーゼ製剤KRF92を６℃の水450
mlに溶かし、下記の操作をすべて６〜10℃で実施
した。1MトリスでPHを7.0に調節した。カラムを
緩衝剤で平衡させ、次にSPS−アーゼ試料をカラ
ムに導入した。OD280及び導電率を溶出液につい
て測定し、第１２図に示す。フラクシヨン１はイ
オン交換物質に結合していない溶出液である。次
に、カラムを緩衝液2000mlで洗浄し、フラクシヨ
ン２を生じる。次に０〜500ｍＭのNaCl勾配を作
り、フラクシヨン３〜９を生じる。９個のフラク
シヨンをすべて200mlに濃縮し、透析法〔アメリ
カ合衆国マサチエセツツ州のアミコン
（Amicon）社製のホロー・フアイバー（Hollow
Fiber）DP2〕により２ｍSiの導電率になるまで
水に対して透析した。次に、９個のフラクシヨン
を凍結乾燥した。フラクシヨン１及び２だけが
SPS−アーゼ活性を示した。 フラクシヨン１を更にゲル過により精製し
た。1.5ｇのフラクシヨン１をPH4.5の50ｍＭ酢酸
ナトリウム（500ｍＭ KCl）10mlに溶かした。
カラムはLKB製の2.5×100cmのものである。ゲ
ル過充填物質はスウエーデンのフアルマシア社
のセフアクリルＳ−200である。流速は30ml／時
間である。球状蛋白質で検量して分子量70000〜
100000の物質を含むフラクシヨンは、定性寒天試
験により試験したときにSPSを分解することので
きないフアクターＧと言われる酵素複合体を含ん
でいた。しかしながら、フアクターＧをペクチナ
ーゼと混合すると、定性寒天試験によりSPSを分
解する。フアクターＧがSPSからガラクトース、
フコース及び若干のガラクツロン酸を脱離するこ
とができ、HPLC分析による主分解生成物はな
お、SPSに極めて良く似た高分子生成物であるこ
とが判つた。 ＜９節＞ SPS−アーゼのPH活性依存性、温度活性依存性及
び安定性 第１３図はSPS−アーゼ製剤KRF68の活性の
PH依存性を示す。PH2.7〜PH3.5ではギ酸緩衝剤系
を使用し、PH3.7〜5.5では酢酸塩緩衝剤系を使用
した。 第１４図は、SPS−アーゼ製剤KRF68の活性
の温度依存性を示す。 第１５図は、SPS−アーゼ製剤KRF68の温度
安定性を示す。 ＜10節＞ 酵素活性の測定 下記の表は、本発明による種々の酵素活性測定
の結果を示す。
【表】 前記の表の最終欄に示した文献を下記の表に詳
述する。
【表】 セルラーゼ活性測定に関して、分析をAF149／
６−GBに記載したように実施し、測定の原理は
アナリテイカル・バイオケミストリイに説明され
ている。 ＜10a節＞ SPS−アーゼの酵素測定法 SPS−アーゼの酵素測定は２工程で、即ち定性
的寒天平板試験及び全遊離糖の量の測定に基づく
定量的SPS−アーゼ活性の測定で実施する。定性
的寒天平板試験が陰性である場合、SPS−アーゼ
活性は、定量的SPS−アーゼ活性測定からの数値
にかかわらず、ゼロである。定性的寒天平板試験
が陽性である場合には、SPS−アーゼ活性は定量
的SPS−アーゼ活性測定から得られる数値に等し
い。 定性的寒天平板試験 SPS−寒天平板を下記の方法で製造した。
0.3M酢酸を1N NaOHにより4.5のPH値に調節
することによつて緩衝液(B)を製造する。 SPS1ｇをB20mlに溶かす。アガロース
（HSBLitei）１ｇをB80mlと混合し、撹拌しな
がら沸点に加熱する。アガロースが溶解した
ら、SPS溶液を徐々に添加する。生ずる１％
SPS−アガロース溶液を60℃の水浴中に置く。
１％SPS−アガロース溶液15mlを寸法10cm×10
cmの水平ガラス板上に注ぐことにより平板を注
型する。次いで、SPS−アガロースの固化層に
2.5cmの距離の９個の穴をあける。各穴に、
SPS−アーゼ活性について試験すべき酵素タン
パク質の１％溶液10μを導入する。平板を50
℃、相対湿度100％で18時間インキユベートす
る。未分解SPSをエタノール及びアセトンの等
容量部の溶液によつて沈殿させる。特定の穴に
置いた試料に関するSPS−アーゼ寒天平板試験
は、この穴の周りに透明な環状帯域が現われる
場合に、陽性である。 定量的SPS−アーゼ活性測定試験 この試験の目的は、分解生成物が大豆蛋白質
に対する吸着または結合親和性を著しく減少し
ているかまたは全く示さない程度にSPSを分解
しうる酵素活性を測定することである。SPS分
解生成物のうち水及びエタノールの等容量の混
合物によつては沈殿しない部分は、大豆蛋白質
に対する吸着または結合親和性を有しないこと
が実験により判つた。 SPS−アーゼ測定は、標準条件下でのSPSの
加水分解とそれに続くSPSの、エタノールで加
水分解されない部分の沈殿に基づく。沈殿後、
沈殿しない炭水化物の含有量を全糖に関する定
量分析（バグスバード2880のノボ・インダスト
リ社から入手しうるAF169／１による）により
測定する。 標準条件は下記のとおりである： 温度：50℃ PH：4.5 反応時間：対照基質だけで210分、次に酵素を添
加して２分：主として212分。 装置は下記の部品を含む： 50℃に恒温保持された振盪水浴、ホイーリミキ
サー（Whirlimixer）撹拌機、遠心分離機、及び
氷水浴。 試薬は下記のものを含む： 緩衝液：(a)脱イオン水中の0.6M酢酸、(b)
1.0MNaOH 基質：a50mlのPH値をｂで4.5に調節し、次に
SPS4.0ｇを加え、SPSを溶解した後、PHを4.5
に再調節し、容量を脱イオン水で100mlに調節
する。 停止試薬：無水エタノール 1SPS−アーゼ活性単位は、前記の標準条件下
で毎分、1μmolのガラクトースに等しい50％エタ
ノールの溶ける炭水化物の量を放出するSPS−ア
ーゼ活性と定義する。 酵素標準曲線の最初の部分が直線である場合で
さえ、（０、０）点を通らないことに注意しなけ
ればならない。 ＜10b節＞ SRUM120と表わす残分可溶化活性の酵素測定 原 理 加水分解活性の測定方法において、脱脂し、蛋
白質を除去し、外皮を除いた大豆粉を標準条件下
で加水分解する。酵素反応を停止試薬で停止し、
不溶分を去する。溶解した多糖類の量を、バグ
スバード2880のノボ・インダストリイ社から入手
しうるAF169／１により酸性加水分解をした後、
分光光度計により測定する。 エンド−活性及びエキソ−活性を有するカルボ
ヒドラーゼをこの方法により測定する。 この酵素測定に適合する基質はSRU法のため
記載した残分基質と同一である。基質を下記のク
エン酸塩緩衝液中の３％溶液として溶解する： 0.1Nクエン酸塩−燐酸塩緩衝液（PH4.5） クエン酸−水和物〔メルク・アルト（Merck
Art）244〕5.24ｇ 燐酸水素二ナトリウム・二水和物（メルク・ア
ルト6580）8.12ｇ 脱イオン水を加えて 全量１ PH4.5±0.05 14日間安定 停止試薬は下記の組成を有する： 0.5N NaOH 100ml 96％エタノール 200ml 使用するまで冷蔵庫に保持する。 標準条件 温度 50℃ PH 4.5 反応時間、試料 120分 反応時間、ブランク ５分 単位の定義 １大豆残分可溶化単位（SRUM）120（Ｍはマ
ニユアルに関する）は所定の反応条件下で、毎
分、ガラクトースの１マイクロモルに等しい可溶
化多糖類を遊離する酵素の量である。 ＜10c節＞ 蛋白分解活性の酵素測定 蛋白分解活性を、情報小冊子アナリテイカル・
メソツドAF92／２−GB（請求すれば、デンマー
ク国、バグスバード2880、ノボ・アレのノボ・イ
ンダストリイ社から入手しうる）に記載されてい
るHUT法により測定するが、下記の変更または
修正を行なう： １ 小冊子に渦動ミキサー（Whirlmixer）と記
載されている場合には、渦動ミキサーをホイー
リミキサー（Whirlimixer）に修正すべきであ
る。 ２ 「試薬」の見出しの下の第１段落に示した
0.5M酢酸塩緩衝液に基づいて、脱イオン水で
適切に希釈することにより0.2M及び0.1M酢酸
塩緩衝液を製造する。 ３ 「試薬」の見出しの下の段落の試薬２及び３
を削除する。 ４ 「ヘモグロビン基質」の見出しの下の段落の
１行の4.0ｇを5.0ｇに変える。同じ行に、「ヘ
モグロビンは１％チオマーサレート
（Thiomersalate）で防腐し、凍結乾燥したウ
シヘモグロビン粉である。」という文章を加入
する。 ５ 「ヘモグロビン基質」の見出しの下の段落の
６行の「0.5M酢酸ナトリウムを用いて」を
「1N NaOHを用いて」に変える。 ６ 「ヘモグロビン基質」の見出しの下の段落の
８行の「脱イオン水」を「0.2M酢酸塩緩衝液」
に変える。 ７ 「酵素試料」の見出しの下の段落の４行を全
部削除し、「すべての試料を0.1M酢酸塩緩衝液
に溶かす。」に代える。 ８ 「試料」の見出しの下の段落の１行を「基質
を室温に保持する」に代える。 ９ 「ブランク」の見出しの下の段落の１行、３
行、４行及び６行を削除する。 10 「ブランク」の見出しの下の段落の５行の
「３〜４秒」を「１秒」に変える。 11 「ブランク」の見出しの下の段落の７行を
「正確に５分後、トリクロロ酢酸５mlを加える。
ホイーリミキサー中で３〜４秒振盪し、管を室
温に置く」に代える。 12 「測定」の見出しの下の段落の１行の「30〜
60」を「40」に変える。 13 PH値4.7をすべての場合に3.2に代える。従つ
て、緩衝液の組成を変える。 KRF68中のプロテアーゼの安定性のPH依存性
の研究をPH値2.0〜8.0でHUT分析により実施し
たところ、PH８以上でプロテアーゼの安定性が極
めて小さいことが判つた（第１６図参照）。 次に、例１〜例８に基づいて本発明を詳述する
が、例１はSPS−アーゼの製造例、例２〜８は
SPS−アーゼの応用例である。 実施例に記載するアスペルギルス・アクレアト
ウス及びアスペルギルス・ヤポニクスの菌株を用
いる若干の発酵は、実験室規模で実施した。これ
によりより本明細書中に記載したSPS−アーゼ試
験によりSPS−アーゼを含む製剤が得られた。し
かし、応用試験を行なうには、むしろ多量のSPS
−アーゼを必要とするので、同様の発酵をパイロ
ツトプラント規模で行なつた（例１参照）。 例 １ パイロツトプラント規模でのSPS−アーゼの製
造 アスペルギルス・アクレアトウスCBS101.43の
深部発酵によりSPS−アーゼを製造した。 フエルンバツハ（Fernbach）フラスコ中で下
記組成の寒天培地を調製した： ペプトン〔デイフコ社（Difco）製〕 ６ｇ アミノリン・オルタナ（Aminolin Ortana）
４ｇ グルコース １ｇ 酵母エキス（デイフコ） ３ｇ 肉エキス（デイフコ） 1.5ｇ KH2PO4（メルク） 20ｇ 麦芽エキス〔エバース（Evers）〕 20ｇ イオン交換水を加えて 全量1000ml PHを5.30〜5.35に調節した。次に寒天（デイフ
コ）40ｇを加え、混合物を120℃で20分間オート
クレーブ滅菌した（この培地をＥ−寒天と言う）。 菌株CBS101.43を斜面Ｅ−寒天上で培養した
（37℃）。斜面からの胞子を殺菌スキム−ミルク中
に懸濁し、懸濁液をバイアル中で凍結乾燥した。
凍結乾燥したバイアル１個の内容物をフエルンバ
ツハフラスコに移した。次に、フラスコを13日間
30℃でインキユベートした。 500の種発酵槽中で下記組成の培地を調製し
た： CaCO3 1.2Kg グルコース 7.2Kg ロフエツク（Rofec）（コーンステイープリカー
乾燥物質） 3.6Kg 大豆油 1.2Kg 水道水を加えて全量約240にした。CaCO3を
添加する前に、PHを約5.5に調節した。種発酵槽
中でこの培地を121℃で１時間滅菌した。接種前
の最終容量は約300であつた。 フエルンバツハフラスコの胞子懸濁液を種発酵
槽に移した。 種発酵条件は下記のとおりであつた： 発酵槽の型：約2.3の高さ／直径比を有する常用
の、通気及び撹拌式発酵槽 撹拌：300rpm（２個のタービン撹拌機） 通気：空気300N／分 温度：30〜31℃ 圧力：0.5ato 時間：約28時間 接種の約28時間後に、種発酵槽から150を主
発酵槽に移した。 2500の主発酵槽中で下記組成の培地を製造し
た： 焼いた大豆粉 90Kg KH2PO4 20Kg プルロニツク（Pluronic） 150ml 水道水を加えて全量約900にした。焼いた大
豆粉を水中に懸濁した。NaOHでPHを8.0に調節
し、温度を50℃に上げた。その後、約925アンソ
ン単位のアルカラーゼ（ALCALASE ）0.6Lを
懸濁液に加えた。混合物を通気せずに、ゼロato
において、100rpmで撹拌しながら４時間50℃、
PH＝8.0（Na2CO3添加）に保持した。その後、残
りの培地成分を加え、燐酸を用いてPHを約6.0に
調節した。主発酵槽中で培地を123℃で１ 1/2時
間滅菌した。接種前の最終容量は約1080であつ
た。 次に種培養物150を加えた。 発酵条件は下記のとおりであつた： 発酵槽の型：約2.7の高さ／直径比を有する常用
の通気及び撹拌式発酵槽 撹拌：250rpm（２個のタービン撹拌機） 通気：空気1200N／分 温度：30℃ 圧力：0.5ato 時間：約151時間 24時間〜約116時間の発酵時間の間、主発酵槽
に約８／分の一定速度で無菌的にペクチン溶液
を加えた。下記の組成を有するペクチン溶液を
500の配合タンク中で調製した： ペクチン・ゲヌ（Pectin genu）〔コペンハーゲ
ン・ペクチン・フアクトリイ社（Copenhagen
pectin factory Ltd.）の柑橘型NF〕 22Kg 濃燐酸 ６Kg プルロニツク （Pluronic ） 50ml 水道水を加えて全量約325にした。培地を配
合タンク中で121℃で１時間滅菌した。配合開始
前の最終容量は約360であつた。この部分が終
了したら、別の部分を作つた。１回の発酵に対す
るペクチン溶液の合計量は約725であつた。 約151時間発酵後、発酵工程を停止した。培養
液約1850を約５℃に冷却し、下記の方法で酵素
を回収した。 ハイフロースーパ−セル（Hy−flo−super−
cel）珪藻土（過助剤）で予め被覆した真空ド
ラム過器〔ドル・オリバー（Dorr Oliver）〕
で培養液を過した。液を蒸発により培養液の
容量の約15％に濃縮した。過助剤として0.25％
のハイフロ−スーパ−セルを用いてザイツ
（Seitz）過シート〔スープラ（Supra）100型〕
上で濃縮液を過した（下記の表に過と記
す）。液を（NH4）2SO4561ｇ／を用いてPH
5.5で沈殿させ、過助剤としてハイフロ−スー
パーセル珪藻土を加える。沈殿物及び過助剤を
フレーム過器で過により分離する。滓を水
に溶かし、不溶分をフレーム過器で過により
分離する。液を過助剤として0.25％ハイフロ
−スーパ−セルを用いてザイツ過シート（スー
プラ100型）でチエツク過する（下記の表に
過と記す）。液を限外過装置で透析する。
透析した後、液体を12.7％の乾燥固形分に濃縮す
る（下記の表に濃縮液中の乾燥固形分と記す）。 プロテアーゼ活性を部分的に除去するため、場
合により塩基処理をこの段階で実施することがで
きる。塩基処理を使用する場合、これをPH9.2で
１時間実施し、その後PH値を5.0に調節する。 次に、液体をチエツク過し、菌減少のため
過し、液をストークス（Stokes）社の凍結乾
燥装置で凍結乾燥する。 下記の方法で４回発酵を行なつたが、その際発
酵に使用した菌株、任意の塩基処理の使用及びそ
の他のパラメータを下記の表に示したように変え
た。
【表】 少量の濃縮濾液を噴霧乾燥し、残り
の部分を凍結乾燥した。
更にプロテアーゼ活性を低減するため、前記製
剤の若干のものを下記のように処理したが、その
際３種の変法Ａ、Ｂ及びＣのうち１種だけを使用
した。 Ａ SPS−アーゼ製剤100ｇを脱イオン１中に
10℃±２℃で撹拌しながら溶かす。4N NaOH
を用いてPHを9.1に調節する。この塩基処理を
１時間実施する。次に氷酢酸を用いてPH値を
4.5に調節し、氷冷脱イオン水に対して３ｍSi
の導電率まで透析する。次に、冷凍及び凍結乾
燥を実施する。 Ｂ SPS−アーゼ製剤500ｇを脱イオン水４中
に撹拌しながら10℃±２℃で溶解する。4N
NaOHでPHを9.1に調節する。この塩基処理を
１時間実施する。PH値を氷酢酸を用いて5.0に
調節する。得られた物質を凍結乾燥する。 Ｃ SPS−アーゼ製剤50ｇを10℃±２℃で撹拌し
ながら脱イオン水400mlに溶かす。4N NaOH
を用いてPHを9.1に調節する。この塩基処理を
１時間実施する。氷酢酸を用いてPHを5.7に低
下する。得られた物質を凍結乾燥する。
【表】 前記製剤は、下記の表に示すように本発明に関
連する酵素活性を有することを特徴とする。
【表】
【表】 例 ２（応用例） 本例は、外皮を除いた脱脂大豆粉である「ソジ
ヤメル（Sojamel）13」〔アールース・オリーフ
アブリク社（Aarhus Oliefabrik Ａ／Ｓ）から
市販されている〕からのp.v.p.の製造を説明する
ものであり、この大豆粉の乾燥固形分は94.0％で
あり、乾燥固形分に基づく（Ｎ×6.25）の含有率
は58.7％であつた。大豆粉を下記の方法でSPS−
アーゼ製剤KRF68BII（例１）で処理した。 大豆粉85.2ｇを50℃において水664.8ｇ中に懸
濁し、撹拌し続け、6N HCl7.5mlを加えてPHを
4.5に調節した。前記SPS−アーゼ製剤4.00ｇを含
む溶液50ｇを加え、次に反応混合物を50℃で240
分間撹拌した。次に、混合物を実験室用遠心分離
機〔ベツクマン（Backman）Ｊ−6B〕中で3000
×ｇで15分間遠心分離した。上澄液を秤量し、ケ
ルダールＮ及び乾燥固形分を分析した。次に固相
を第１回の遠心分離によつて得られた上澄液の量
に等しい量の水で洗浄した。この操作を２回行な
つた。次に、固相を凍結乾燥し、秤量し、デンマ
ーク国、8000アールース・シイ、マーセリス・ブ
ーレバード169のクビスツ・ラボラトリウム
（Qvist's Laboratorium）でケルダールＮ及び乾
燥固形分について分析した。この研究室は飼料及
び酪農製品の分析について国から権限を与えられ
ている。実験で得られた結果を表2.1に示す。
【表】 p.v.p.は、91.4％の蛋白質純度、即ち乾燥固形
分に基づくＮ×6.25及び83％の蛋白質総収率で得
られた。 例 ３（応用例） 本例は、下記の３種の方法で作つた大豆蛋白質
製品の蛋白質収率、栄養品質及び若干の機能的性
質を比較するため実施した： Ａ：大豆蛋白質単離物の製造のため伝統的等電点
沈殿、 Ｂ：大豆蛋白質濃縮物の製造のため伝統的等電点
洗浄、 Ｃ：p.v.pの製造のため残分可溶化酵素を含む本
発明による等電点洗浄、 本発明方法(C)を従来の大豆蛋白質処理方法（Ａ
及びＢ）と真に比較するため、すべての場合に同
じ原料を使用した。対応する温度及び処理時間が
３種すべての場合に同じであるように、実験を行
なつた。PH値だけでは３種の実験の間の基本的差
により異なつていた。 Ａ 大豆蛋白質単離物の製造のため伝統的等電点
沈殿 大豆粉（アールース・オリーフアブリク社製
ソジヤメル13）425.8ｇを50℃の水道水3574.2
ｇ中で抽出した。4N NaOH20.1ｇを用いてPH
を8.0に調節した。１時間撹拌した後、実験室
用遠心分離機（ベツクマンＪ−6B型）中で４
個の１のビーカーを使用してスラリーを3000
×ｇで15分間遠心分離した。遠心分離液及び
沈殿を秤量した。沈殿を水で4000ｇの総重
量に再抽出した。温度を50℃に保持し、4N
NaOHを用いてPHを８に調節し、スラリーを
１時間撹拌した。遠心分離並びに遠心分離液
及び沈殿の秤量を前記のように実施した。ケ
ルダール・Ｎ及び乾燥固形分を測定するため遠
心分離液及び及び沈殿から試料を採取し
た。その後、遠心分離液及びを混合し、50
℃に保持した。次に6N HCl45ｇを用いてPH
4.5で蛋白質を等電点沈殿させた。50℃で１時
間撹拌した後、3000×ｇで15分間遠心分離する
ことにより蛋白質を回収した。遠心分離液を
秤量し、ケルダール−Ｎ及び乾燥固形分につい
て分析した。固相を秤量し遠心分離液の重
量に相当する量で水で洗浄した。50℃で１時間
撹拌することにより洗浄を実施した。洗浄した
蛋白質を3000×ｇで15分間遠心分離することに
より回収した。遠心分離液及び固相を秤量
した。遠心分離液をケルダール−Ｎ及び乾燥
固形分について分析した。固相を50℃の水1550
ｇ中に懸濁し、4N NaOH17ｇを用いてPHを
6.5に調節した。混合物を１時間撹拌して保持
し、必要に応じPH＝6.5に再調節した。最後に、
生成物を凍結乾燥し、秤量し、ケルダール−Ｎ
及び乾燥固形分について分析した。物質の収支
計算を表3.1に示す。
【表】
【表】 Ｂ 大豆蛋白質濃縮物の製造のため等電点洗浄 大豆粉（アールース・オリーフアブリク社製
ソジヤメル13）425.6ｇを50℃の水3574ｇ中で
洗浄した。6N HCl44.8ｇを用いてPHを4.5に調
節した。洗浄を撹拌により４時間実施した。次
に、スラリーを１のビーカー４個を使用して
実験室用遠心分離機（ベツクマンＪ−6B型）
中で3000×ｇで15分間遠心分離した。遠心分離
液を秤量し、ケルダール−Ｎ及び乾燥固形分
について分析した。固相を秤量し、水で4000
ｇの総重量まで再洗浄した。6N HCl1.7ｇを
用いてPHを4.5に再調節し、スラリーを50℃で
30分間撹拌し続ける。遠心分離及び遠心分離液
及び固体の秤量を前記のように実施した。
固相を50℃の水1575ｇ中に再懸濁し、4N
NaOH34.5ｇを用いてPHを6.5に調節した。混
合物を50℃で１時間撹拌し続け、必要に応じPH
＝6.5に再調節した。最後に、蛋白質生成物を
凍結乾燥し、秤量し、ケルダール−Ｎ及び乾燥
固形分について分析した。物質収支を表3.2に
示す。
【表】
【表】 Ｃ p.v.pの製造のための残分可溶化酵素を含む
等電点洗浄 大豆粉（アールース・オリーフアブリク社製
ソルジヤメル12）425.8ｇを50℃の水3524.2ｇ
中で洗浄した。6N HCl43.7ｇを使用してPHを
4.5に調節した。SPS−アーゼ製剤KRF68B
（例１）24ｇを水26ｇに溶かし、洗浄混合物に
加える。次に、洗浄を撹拌によつて４時間実施
した。その後、精製をＢに記載したように実施
するが、6N HCl、4N NaOH及び再懸濁用の
水の量だけは変動する。表3.3に物質収支を示
す。
【表】
【表】 栄養的性質 ３種の蛋白質生成物のアミノ酸組成物を測定
し、表3.4に示す。必要アミノ酸の総含有率、
化学的スコア及び必須アミノ酸インデツクス
（EAAI）を、1957年からのFAO基準パターン
を使用して計算する。 ３種の生成物のトリプシンインヒビター含有
率をA.O.C.S.予試験法（Tentative Method）
Ba12−75〔A.O.C.S.はアメリカン・オイル・ケ
ミスツ・ソサイエテイ（American Oil
Chemists′ Society）の省略である〕に記載さ
れている方法により測定した。その結果並びに
３種の生成物の収率及び蛋白質／乾燥固形分比
を表3.5に示す。
【表】
【表】
【表】 機能的性質 窒素可溶化指数（NSI）をそれぞれ0.2M
NaCl及び蒸質水中のPH7.0の１％蛋白質分散液
中で測定した。磁気撹拌機を用いて45分撹拌し
た後、懸濁液を4000×ｇで30分間遠心分離し、
上澄液を窒素について分析した。窒素の溶解性
を（可溶性Ｎ％／総Ｎ％）として計算した。３
種の生成物に関する、この評価の結果を表3.6
に示す。 乳化力を少し変形したスウイフト（Swift）
滴定により各生成物について３回測定した。生
成物の（Ｎ×6.25）4.0ｇをソルバル・オムニ
ミキサー（Sorval Omnimixer）を用いて低速
で0.5M NaCl250ml中で混合する。懸濁液50ml
をガラスブレンダージヤーに移し、大豆油50ml
を加えた。その後、全混合物を秤量した。次に
この油と水との混合物を氷浴中でジヤーで
10000rpmで均質化した。付加量の大豆油を、
エマルジヨンが崩壊するまで、0.3ml／秒の速
度で加えた。「終点」前に添加した油の総量を
秤量によつて測定した。 乳化力を蛋白質（Ｎ×6.25）１ｇ当りの油の
ml数として計算した。油の密度を0.9ｇ／mlと
した。 ３種の生成物について乳化力を測定した平均
の結果を表3.6に示す。 高速撹拌膨脹をPH6.5の３％蛋白質溶液中で
測定する。蛋白質試料の水性分散液250mlを、
ワイアホイツプを付けたホバート（Hobart）
ミキサー（Ｎ−50型）中で速度で４分間撹拌
した。高速撹拌膨脹を下記の式により記載し
た： 高速撹拌膨脹＝Ｖ−250／250×100％ 〔式中、Ｖはml単位の最終撹拌容量である〕。 Ｖは水でミキサージアーを再充填することに
よつて測定した。３種の試料それぞれについて
２回実験を行なつた。平均の結果を表3.6に示
す。 泡安定性を、30分排水後に残る泡の量と泡の
もとの量との比として測定した。前記の方法で
作つた泡Ａｇをメツシユ寸法１mm×１mmの金網
を有するプラスチツクシリンダー（直径７cm、
高さ９cm）中に導入した。このシリンダーをガ
ラスシリンダーの頂部のロート上に設置し、ガ
ラスシリンダー中に排出された液体の重さ
（Ｂ）を測定する。泡安定性FSは下記の式で規
定される。 FS＝Ａ−Ｂ／Ａ×100％ 測定結果を表3.6に示す。 ゲル強度は、本明細書においては、ブルツク
フイールド・ヘリパス（Brookfield
Helipath）スタンド上のＴ−スピンドルによ
つて測定したブルツクフイールド粘度である。
0.5M NaCl中の12％蛋白質懸濁液の熱処理に
よつてゲルを作つた。熱処理は、80℃及び100
℃にそれぞれ保持した水浴中に置いた直径7.3
cm、高さ５cmの密閉カン中で30分行なつた。カ
ンを開放しそして測定する間に、カンを冷却
し、20℃に恒温保持した。測定結果を表3.6に
示す。
【表】 例 ４（応用例） セルラーゼ活性を部分的にトリコデルマ・レ
ゼーイ（Trichoderma reseei）から誘導した
以外は、例3Cに記載した方法によりp.v.p.を製
造した。ノボ・インダストリ社製の市販のセル
ラーゼ製剤セルクラスト（CELLUCLAST）
を下記の方法で低温で塩基で処理した。水中の
10％セルクラスト溶液のPH値をNaOHを用い
て9.2に調節し、こうして生じた溶液を５℃に
冷却した。このPH及びこの温度で１時間放置し
た後、20％酢酸を用いてPHを4.7に再調節した。
この溶液を５℃に一液保持し、次に滅菌過し
た。液を凍結乾燥した。凍結乾燥した生成物
４ｇをSPS−アーゼ製剤KRF68B（例１）と
一緒に加えた。これらの２種の酵素を、洗浄混
合物に加える前に水172ｇ中に溶かした。この
例の物質収支の測定結果を表4.1に示す。 この実験は、セルクラストの添加が蛋白質／
乾燥固形分比に影響しないと思われるので、こ
の特定のSPS−アーゼ製剤が既に有効なセルラ
ーゼを含むことを証明する。しかしながら、他
のSPS−アーゼ製剤はセルクラストより少ない
セルラーゼを含む（例えばKRF92、前記の例
２の表参照）。
【表】 例 ５（応用例） すべての物質を５倍だけ縮小し、反応混合物
を遠心分離前に約５℃に冷却する以外は例3C
に記載した方法によりp.v.p.を製造した。遠心
分離液に関する分析結果に基づいて、沈殿した
蛋白質が理論的収率で得られ、これを表5.1に
示す。
【表】 例 ６（応用例） SPSの蛋白質結合の証明 市販の大豆蛋白質単離物〔ラルストン・プリ
ーナ（Ralston Purina）製のプリーナ500E〕
からの（Ｎ×6.25）40ｇを水680ｇに溶かした。
混合物を水浴中で50℃に加熱し、6N HClを用
いてPHを4.50に調節した。この混合物90ｇを５
個の250mlのエルレンマイヤーフラスコに移し、
前記のようにして製造したSPS0ｇ、0.2ｇ、0.4
ｇ、0.8ｇ及び1.6ｇをそれぞれ含む水溶液10ｇ
を加えた。次いでフラスコを水浴中で磁気撹拌
機で撹拌しながら50℃で240分間保持した。 その後、スラリーを3000×ｇで15分間遠心分
離し、遠心分離液をケルダール−Ｎ及び乾燥
固形分について分析した。固相を室温の水で洗
浄し、再び遠心分離した。この操作を繰返し
た。次に、固体を水50ml中に分散し、6N
NaOHを滴加することによりPHを6.50に調節し
た。中和した生成物を凍結乾燥し、ケルダール
−Ｎ及び乾燥固形分について分析した。表6.1
に示した分析に基づいて、蛋白質の回収率及び
蛋白質に結合したSPSのパーセンテージを表
6.2に関して示した式により計算する。 本例は、SPSが蛋白質に強固に結合して、
SPSの含有率が増加すると共に蛋白質／乾燥固
形分比が減少することを証明する。蛋白質単離
物５ｇに加えた水10ｇ中の約0.4ｇに匹敵する
SPS含有率が大豆粉中に存在する蛋白率／SPS
比である。 SPSの結合率（％）が計算値である。SPSの
結合率（％）は低い蛋白質／SPS比でSPSに関
して蛋白質が飽和されるため減少する。
【表】
【表】
【表】 例 ７（応用例） 本例は、乾燥物質５％を配合して、SPS−ア
ーゼ製剤KRF92B−を使用してp.v.p.を製造
する例を示す。製造方法は、すべての物質を５
のフアクターだけ縮小する以外は、例3Cと全
く同じであつた。p.v.p.を例２に記載したよう
に分析した。実験で得られた結果を表7.1に示
す。
【表】 例 ８（応用例） 本例は、p.v.p.の製造前にジエツト蒸熱する
ことにより大豆粉を前処理する効果を証明する
ものである。 前処理 100Kg当り大豆粉（アールース・オリーフア
ブリク社製ソジヤメル13）10Kgから成る水中の
大豆粉のスラリーをステームエジエクタ〔ヒド
ロヒーター（Hydroheater）Ｂ−300型〕によ
り送入し、管状加圧反応器中で150℃の最終温
度が25秒維持できるような量及び流速で８バー
ルの蒸気と混合した。その後、フラツシユ室
（サイクロン）中で放圧し、そこからスラリー
を板熱交換器を介して送り、約50℃に冷却し
た。冷却したスラリーを本発明によるp.v.p.の
製造に直接使用することができたが、この場合
にはスラリーを入口温度200℃、出口温度90℃
で噴霧乾燥した。前処理した生成物は96.5％の
乾燥固形分及び56.9％（Ｎ×6.25）の蛋白質含
有率を有することが判つた。 p.v.p.の製造 この製造を下記の方法で実施した。 ジエツト蒸熱し、乾燥した大豆粉の乾燥物質
70ｇを50℃において水560ｇ中に懸濁し、撹拌
し続け、6N HCl6.5mlを用いてPHを4.50に調節
した。この懸濁液90ｇ×６を250mlのエルレン
マイヤーフラスコ６個に移し、磁気撹拌器によ
り50℃の水浴上で撹拌し続けた。各フラスコに
SPS−アーゼ製剤KRF−68−Ｂ−０ｇ、
0.025ｇ、0.050ｇ、0.10ｇ、0.20ｇ及び0.40ｇを
それぞれ含む溶液10ｇを添加した。次に反応混
合物を50℃で240分撹拌した。次に3000×ｇで
15分遠心分離を実施した。 上澄液をケルダール−Ｎについて分析し、固
相を等容量の水で洗浄し、遠心分離した。この
操作を２回行なつた。次に固相を凍結乾燥し、
ケルダール−Ｎ及び乾燥固形分について分析し
た。 出発原料として未処理の大豆粉（アールー
ス・オリーフアブリク社製ソジヤメル13）を用
いて同様の実験を行なつた。この場合、酵素基
質比は0.1％、２％、３％、４％及び８％であ
つた。 上澄液の蛋白質含有率に基づいて、回収され
た蛋白質のパーセンテージを計算することがで
きる。蛋白質の収率は、酵素生成物が反応後に
100％溶解しているという仮定に基づいている。
２つの実験によつて得られた結果を下記の表に
示す。
【表】 既に参照した図面の概説を、一層良好に理解
するため、以下に記載する。
【表】 【図面の簡単な説明】
第１図は大豆粉の分解方法を示す工程図、第
２図はSPSの単離方法を示す工程図、第３図は
デキストランの分子量とRf値との関係を示す
グラフ図、第４図はSPSのHPLCゲル過クロ
マトグラム、第５図はSPS−アーゼによるSPS
の分解生成物のHPLCゲルクロマトグラム、第
６図は大豆蛋白質と共にインキユベートした
SPSからの上澄液のゲルクロマトグラム、第７
図は大豆蛋白質と共にインキユベートした、分
解したSPSからの上澄液のHPLCゲルクロマト
グラム、第８図はペクトリアーゼによるAPS
の分解混合物のHPLCゲルクロマトグラム、第
９図はKRF68によるAPSの分解混合物の
HPLCゲルクロマトグラム、第１０図はペクト
リアーゼによるSPSの分解混合物のHPLCゲル
クロマトグラム、第１１図はアスペルギルス・
アクレアトウスの発酵により得られた酵素複合
体の交差免疫電気泳動図、第１２図はSPS−ア
ーゼのイオン交換溶出液のOD280及び導電率を
示すグラフ図、第１３図はPHとSPS−アーゼ製
剤の活性との関係を示すグラフ図、第１４図は
SPS−アーゼ製剤の温度−活性関係を示すグラ
フ図、第１５図はSPS−アーゼ製剤の活性の温
度安定性を示すグラフ図、第１６図はプロテア
ーゼの安定性のPH依存性を示すグラフ図、第１
７図は大豆残分の製造方法を示す工程図、第１
８図はSPSの製造方法を示す工程図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 出発原料として脱脂植物性蛋白質を用いて蛋
    白質純度約90％の精製植物蛋白質を製造するのに
    適した、大豆蛋白質の存在下において大豆残分を
    分解するための、残分可溶化活性を有する酵素を
    含んでなる大豆残分分解剤であつて、可溶性多糖
    類（SPS）を分解し得る酵素（SPS−アーゼ）を
    含んでなり且つ蛋白質分解活性をほとんど有さな
    い大豆残分分解剤。 ２ 前記SPS−アーゼが、アスペルギルス
    （Aspergillus）属、好ましくは黒色アスペルギル
    ス（Aspergillus niger）のグループに属する微
    生物によつて産生されたものである特許請求の範
    囲第１項記載の大豆残分分解剤。 ３ 活性成分が、アスペルギルス・アクレアトウ
    ス（Aspergillus aculeatus）DSM2344（すなわ
    ち、CBS101.43）によつて産生される酵素から誘
    導される特許請求の範囲第１項または第２項記載
    の大豆残分分解剤。 ４ 前記SPS−アーゼが、アスペルギルス・アク
    レアトウスDSM2344によつて産生されるSPS−
    アーゼと免疫電気泳動で同一であり、免疫電気泳
    動重層法により同定しうる特許請求の範囲第１項
    から第３項までのいずれかに記載の大豆残分分解
    剤。 ５ HUT−単位の蛋白質分解活性とSRUM−
    120−単位の残分可溶化活性との比が約２：１未
    満、好ましくは１：１未満、より好ましくは
    0.25：１未満である特許請求の範囲第３項または
    第４項記載の大豆残分分解剤。 ６ セルラーゼ活性を含み、そのセルラーゼ活性
    の一部または全部がトリコデルマ・レゼエイ
    （Tribhoderma reseei）に由来する特許請求の範
    囲第１項から第５項までのいずれかに記載の大豆
    残分分解剤。 ７ セルラーゼ活性（Cx）、ペクチナーゼ活性
    （PU、PGE、UPTE、PEE）及びヘミセルラー
    ゼ活性（VHCU）を含む特許請求の範囲第１項
    から第６項までのいずれかに記載の大豆残分分解
    剤。 ８ 出発原料としての粗大豆粉蛋白質から残分を
    除去することによる精製大豆蛋白質製品の製造方
    法であつて、 窒素及び乾燥固形分質量収支に基づき少なくと
    も約60％、好ましくは少なくとも約70％、より好
    ましくは少なくとも約80％の残分が可溶化される
    まで、該出発原料の蛋白質部分の主要部の等電点
    から1.5PH単位より多くは異ならないPH値で約20
    乃至約70℃の温度において水性媒体中で、大豆蛋
    白質の存在下で大豆残分を分解するための、残分
    可溶化活性を有する酵素を含み且つ可溶性多糖類
    （SPS）を分解し得る酵素（SPS−アーゼ）を含
    み且つ蛋白質分解活性をほとんど有さない大豆残
    分分解剤によつて該出発原料を処理し、次いで精
    製大豆蛋白質製品を含む固相を上澄液から分離す
    ることを含んでなる精製大豆蛋白質製品の製造方
    法。 ９ 前記分離を、室温及至上澄液の凝固点の温度
    で実施する特許請求の範囲第８項記載の製造方
    法。 １０ 前記出発原料が脱脂されたかまたは脱脂さ
    れそしてさらに一部分精製された大豆蛋白質であ
    る特許請求の範囲第８項または第９項記載の製造
    方法。 １１ 前記出発原料が熱処理した大豆粉、好まし
    くはジエツト蒸着大豆粉である特許請求の範囲第
    ８項から第１０項までのいずれかに記載の製造方
    法。 １２ 前記出発原料がメツシユ寸法約2.5mmの篩
    を通過し得るものである特許請求の範囲第８項か
    ら第１１項までのいずれかに記載の製造方法。
JP57021020A 1981-12-22 1982-02-12 植物残分分解剤及び精製植物性蛋白質製品の製造方法 Granted JPS58111685A (ja)

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