JPH0334936A - トリアジン色素アフィニティクロマト法を医薬品等の製造に応用した場合に遊離混入の否定できない色素リガンドを除去する方法及びその方法を利用して製造された医薬品 - Google Patents
トリアジン色素アフィニティクロマト法を医薬品等の製造に応用した場合に遊離混入の否定できない色素リガンドを除去する方法及びその方法を利用して製造された医薬品Info
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- JPH0334936A JPH0334936A JP7334389A JP7334389A JPH0334936A JP H0334936 A JPH0334936 A JP H0334936A JP 7334389 A JP7334389 A JP 7334389A JP 7334389 A JP7334389 A JP 7334389A JP H0334936 A JPH0334936 A JP H0334936A
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野］
本発明は、トリアジン色素アフィニティクロマト法を、
例えばワクチン等の医薬品等の製造に応用した場合に、
当該医薬品等に遊離混入することの否定できない色素リ
ガンドを簡便に除去する方法及びその方法を利用して製
造された医薬品に関するものである。
例えばワクチン等の医薬品等の製造に応用した場合に、
当該医薬品等に遊離混入することの否定できない色素リ
ガンドを簡便に除去する方法及びその方法を利用して製
造された医薬品に関するものである。
現在、我国はもとより世界各国で全閉百日咳ワクチンが
使用されており、このワクチンについては接種後の副反
応が問題となるところから、我国では１９８１年から百
日咳毒素（以下ＰＴと略す）及び繊維状血球凝集素（以
下ＦＨＡと略す）を主成分とする精製百日咳ワクチンが
接種され副反応の問題は大幅に改善されたが、一方では
、上記精製百日咳ワクチンの製造には超遠心機等の高価
な機器が必要であったり、塩析と濃縮を繰り返す結果抗
原蛋白が不溶化することにより回収率が低下したり、更
には、得られた抗原の同定がかならずしも容易でない等
の難点が指摘され得るものでちった。
使用されており、このワクチンについては接種後の副反
応が問題となるところから、我国では１９８１年から百
日咳毒素（以下ＰＴと略す）及び繊維状血球凝集素（以
下ＦＨＡと略す）を主成分とする精製百日咳ワクチンが
接種され副反応の問題は大幅に改善されたが、一方では
、上記精製百日咳ワクチンの製造には超遠心機等の高価
な機器が必要であったり、塩析と濃縮を繰り返す結果抗
原蛋白が不溶化することにより回収率が低下したり、更
には、得られた抗原の同定がかならずしも容易でない等
の難点が指摘され得るものでちった。
一方、上記と異なる方法として、５ｅｋｕｒａ等は種々
の活性物質と親和性を示ずＣ１ｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ
Ｆ＋ＧＡ色素をリガン］・としたＡｆｆｉＢｅｌ Ｂ
ｌｕｅ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ社米国）によるアフィニティ
クロマト法を用いた１）′Ｆの部分精製を報告し、Ｃｈ
ｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ等は上記方法に準し、Ｂｌ
ｕｅ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａ
ｃ ｉａ社スエーデン）を使用したアフィニティクロマ
ト法によるＰＴとＦＨＡを主成分とする菌体成分百日咳
ワクチンの調製について報告しており、これらの方法に
よれば、前記超遠心機等のａ器を使用した場合の問題を
回避して、簡便なｌノクチン用抗原の精製ができるとさ
れていた。
の活性物質と親和性を示ずＣ１ｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ
Ｆ＋ＧＡ色素をリガン］・としたＡｆｆｉＢｅｌ Ｂ
ｌｕｅ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ社米国）によるアフィニティ
クロマト法を用いた１）′Ｆの部分精製を報告し、Ｃｈ
ｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ等は上記方法に準し、Ｂｌ
ｕｅ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａ
ｃ ｉａ社スエーデン）を使用したアフィニティクロマ
ト法によるＰＴとＦＨＡを主成分とする菌体成分百日咳
ワクチンの調製について報告しており、これらの方法に
よれば、前記超遠心機等のａ器を使用した場合の問題を
回避して、簡便なｌノクチン用抗原の精製ができるとさ
れていた。
〔発明が解決しようとする問題点］
然しながら、上記アフィニティクロマト法には、色素リ
ガンドと担体との結合が不安定であることに起因して、
精製したワクチンに当該色素リガンドの相当量が遊離混
入する可能性を否定できず、しかもその色素リガンドを
簡便に除去する方法も確立されていないために、実用に
はやはり問題があると考えられた。
ガンドと担体との結合が不安定であることに起因して、
精製したワクチンに当該色素リガンドの相当量が遊離混
入する可能性を否定できず、しかもその色素リガンドを
簡便に除去する方法も確立されていないために、実用に
はやはり問題があると考えられた。
そして、この難点はワクチンに関してだけのものではな
く、多種多様の生理活性物質が、特にその構造中にダイ
ヌクレオタイドフォール１ζを佇するものを中心に、ト
リアジン色素例えばＣｉｌ］ａｃｒｏｎＢｌｕｅ Ｆ３
ＧＡ色素と特異的親和性を示すことが知られているが
、これらの生理活性物質については、研究目的での製造
−・の応用例はあるものの、やはりリガント除去の困難
性から医薬品等への応用が困難であり、従って、ｌ・リ
アジン色素アフィニティクロマト法を応用した場合にＩ
ＩＩ Ｋｌ混入の否定できない色素リガンドを除去する
方法は、広く一般医薬品の製造にとって重要であり、そ
の開発が待望されていた。
く、多種多様の生理活性物質が、特にその構造中にダイ
ヌクレオタイドフォール１ζを佇するものを中心に、ト
リアジン色素例えばＣｉｌ］ａｃｒｏｎＢｌｕｅ Ｆ３
ＧＡ色素と特異的親和性を示すことが知られているが
、これらの生理活性物質については、研究目的での製造
−・の応用例はあるものの、やはりリガント除去の困難
性から医薬品等への応用が困難であり、従って、ｌ・リ
アジン色素アフィニティクロマト法を応用した場合にＩ
ＩＩ Ｋｌ混入の否定できない色素リガンドを除去する
方法は、広く一般医薬品の製造にとって重要であり、そ
の開発が待望されていた。
本発明は、上述した従来技術を背景としてなされたもの
で、その構成は、トリアジン色素アフィニティクロマト
法により精製或は製造した医薬品等を、更に疎水性クロ
マトグラフに付すことを特徴とするものであり、又、そ
の方法を利用して製造された医薬品は、少なくとも、ト
リアジン色素アフィニティクロマト法と、その後の疎水
性クロマトグラフ法により精製されていることを特徴と
するものである。
で、その構成は、トリアジン色素アフィニティクロマト
法により精製或は製造した医薬品等を、更に疎水性クロ
マトグラフに付すことを特徴とするものであり、又、そ
の方法を利用して製造された医薬品は、少なくとも、ト
リアジン色素アフィニティクロマト法と、その後の疎水
性クロマトグラフ法により精製されていることを特徴と
するものである。
以下、本発明の詳細な説明する。
先ず、トリアジン色素アフィニティクロマト法による精
製或は製造は、例えばＡＰ−Ｂｌｕｅ Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒ１６５０旧Ｉ （東洋曹達工業株式会社の商品名）の
ような物理強度の高い担体に、Ｃ１ｂａｃｒｏｎ Ｂｌ
ｕｅ Ｆ、 ＧＡ色素を多量に共有結合させたり１コマ
ｌ−利等を使用して、目的物質を効率良く吸着、回収す
るものである。
製或は製造は、例えばＡＰ−Ｂｌｕｅ Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒ１６５０旧Ｉ （東洋曹達工業株式会社の商品名）の
ような物理強度の高い担体に、Ｃ１ｂａｃｒｏｎ Ｂｌ
ｕｅ Ｆ、 ＧＡ色素を多量に共有結合させたり１コマ
ｌ−利等を使用して、目的物質を効率良く吸着、回収す
るものである。
百日咳菌体酸分ワクチン製造の場合は、例えば、ｐ１１
６．０乃至７．４、食塩濃度０．２５Ｍ以下に調整した
菌培養上清、若しくは、菌培養の３０％飽和硫安沈殿の
抽出液に対し、上記クロマト材のゲルを力１１えて混合
し、４°Ｃで２４時間撹拌することにより、ワクチンの
有効成分であるＰＴ及びＦ ＨＡのほぼ全量を当該クロ
マト材に吸着することができる。
６．０乃至７．４、食塩濃度０．２５Ｍ以下に調整した
菌培養上清、若しくは、菌培養の３０％飽和硫安沈殿の
抽出液に対し、上記クロマト材のゲルを力１１えて混合
し、４°Ｃで２４時間撹拌することにより、ワクチンの
有効成分であるＰＴ及びＦ ＨＡのほぼ全量を当該クロ
マト材に吸着することができる。
尚、比較的使用回数の少ないクロマト材の場合は、菌体
由来の内毒素は吸着されず、上清に残存して除去される
こととなる。
由来の内毒素は吸着されず、上清に残存して除去される
こととなる。
次いで、上記ゲルをブフナーロー１・上に回収し、例え
ば０．２５Ｍの食塩を加えた０、０５Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）にて洗浄後、カラムに詰め、更に非特異的
に吸着している内毒素を除去するため、再度洗浄する。
ば０．２５Ｍの食塩を加えた０、０５Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）にて洗浄後、カラムに詰め、更に非特異的
に吸着している内毒素を除去するため、再度洗浄する。
この操作により、大部分の内毒素が容易に除去される。
そして、上記カラムより、例えば０．５）Ｉのチオシア
ン酸カリウムを含む、０．５Ｍの食塩を加えた０、０５
）ｊ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，４）にて吸着画分を溶
出すると、高濃度の抗原液を得ることができるのである
。
ン酸カリウムを含む、０．５Ｍの食塩を加えた０、０５
）ｊ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，４）にて吸着画分を溶
出すると、高濃度の抗原液を得ることができるのである
。
上記のようにして抗原液を得てから、或は、上記カラム
からの溶出画分をそのまま連続的に、例えばＢｕｔｙｌ
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ （東洋曹達工業株式
会社の商品名）等を使用した疎水性カラムに添加し、ト
リアジン色素アフィニティクロマＩ・法を応用した場合
に遊離ｌ昆入の否定できない色素リガンドを除去するの
である。
からの溶出画分をそのまま連続的に、例えばＢｕｔｙｌ
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ （東洋曹達工業株式
会社の商品名）等を使用した疎水性カラムに添加し、ト
リアジン色素アフィニティクロマＩ・法を応用した場合
に遊離ｌ昆入の否定できない色素リガンドを除去するの
である。
尚、得られた高密度のワクチン用抗原液については、直
ちに透析され、例えば０．５Ｍの食塩を加えた０、０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）中で、次の何れかの方法
にまり滅毒されることとなる。
ちに透析され、例えば０．５Ｍの食塩を加えた０、０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）中で、次の何れかの方法
にまり滅毒されることとなる。
滅毒法１
蛋白濃度が１ｍＢ／ｍｌとなるように抗原液を調整し、
０．５Ｍの食塩を加えた０、０５Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ
＋７．４）中で０．４Ｖ／Ｖ％となるようにホルマリン
を加え、３９°ＣでＩＯ日間加温後、リン酸緩衝液や、
生理食塩水を加えた酢酸緩衝液等のワクチン用最終浮遊
液に透析する。
０．５Ｍの食塩を加えた０、０５Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ
＋７．４）中で０．４Ｖ／Ｖ％となるようにホルマリン
を加え、３９°ＣでＩＯ日間加温後、リン酸緩衝液や、
生理食塩水を加えた酢酸緩衝液等のワクチン用最終浮遊
液に透析する。
減毒法２
蛋白濃度が１ｍｇ／ｍＲとなるように抗原液を調整し、
グルタルアルデヒ１−′をｌｏｍＭとなるように加え、
３７°Ｃで３０分間処理した後、０．２Ｗ／Ｖ％のＬ−
リジン及び０．５Ｍの食塩を加えた０、０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，４）に透析し、減毒法１と同様リン酸緩
衝液や、生理食塩水を加えた酢酸緩衝液等のワクチン用
最終浮遊液に透析する。
グルタルアルデヒ１−′をｌｏｍＭとなるように加え、
３７°Ｃで３０分間処理した後、０．２Ｗ／Ｖ％のＬ−
リジン及び０．５Ｍの食塩を加えた０、０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，４）に透析し、減毒法１と同様リン酸緩
衝液や、生理食塩水を加えた酢酸緩衝液等のワクチン用
最終浮遊液に透析する。
以上のように、本発明でばｌ・リアジン色素アフィニテ
ィクロマト法と疎水性クロマ１〜法とを併用するので、
得られた百日咳菌体成分ワクチン等には、分光学的にも
、又、高速液体クロマトグラフ法によっても、色素リガ
ンドの混入は検出されず、そればかりか、内毒素の含量
も十分少なく、現行市販ワクチンと同様、ワクチンに調
整し生物学的製剤基準に基づき試験を行なったところ、
十分に基準を満たずものであった。
ィクロマト法と疎水性クロマ１〜法とを併用するので、
得られた百日咳菌体成分ワクチン等には、分光学的にも
、又、高速液体クロマトグラフ法によっても、色素リガ
ンドの混入は検出されず、そればかりか、内毒素の含量
も十分少なく、現行市販ワクチンと同様、ワクチンに調
整し生物学的製剤基準に基づき試験を行なったところ、
十分に基準を満たずものであった。
又、本発明方法によれば、超遠心機等の高価な機器は不
必要であり、抗原蛋白の不溶化による回収率の低下を回
避することができてコスト的にも工程上でも有利であり
、しかも、有効抗原物質（ＰＴ及びＦ ＨＡ ）を特異
的に吸着回収できるため得られた抗原の同定が不要であ
るというアフィニティクロマト法の特徴を利用できる。
必要であり、抗原蛋白の不溶化による回収率の低下を回
避することができてコスト的にも工程上でも有利であり
、しかも、有効抗原物質（ＰＴ及びＦ ＨＡ ）を特異
的に吸着回収できるため得られた抗原の同定が不要であ
るというアフィニティクロマト法の特徴を利用できる。
従って、本発明はトリアジン色素例えばＣ１ｂａｃｒｏ
ｎ １ｌｌｕｅ Ｐ３ ＧＡ色素と特異的親和性を示す
ことが知られている多種多様の生理活性物質について、
当該トリアジン色素アフィニティクロマト法を応用した
＋＋ｌ製或は医薬品としての製造の可能性を飛躍的に高
めたものといえる。
ｎ １ｌｌｕｅ Ｐ３ ＧＡ色素と特異的親和性を示す
ことが知られている多種多様の生理活性物質について、
当該トリアジン色素アフィニティクロマト法を応用した
＋＋ｌ製或は医薬品としての製造の可能性を飛躍的に高
めたものといえる。
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明する。
日 ワクチンの３周
次に示すような方法で調整した。
百日咳菌Ｉ相東浜株。
スタイナー・ショル
吸着ゲル
ＡＰ
ブルー
トヨパール
６５０ＭＨカラム
第１図は、毎時４０ｍ１の流速において１０雌づつ分画
した場合におけるカラムからの溶出パターンを示すもの
であり、ＰＴ及びＦ ＨＡは共にｌピークとして溶出さ
れることがわかる。
した場合におけるカラムからの溶出パターンを示すもの
であり、ＰＴ及びＦ ＨＡは共にｌピークとして溶出さ
れることがわかる。
尚、蛋白はＬｏｗｒｙ法で、ＰＴ及びＦ ＨＡはＥＬＩ
ＳＡ法で測定した。
ＳＡ法で測定した。
又、蛋白、ＰＴ及びＦ ＨＡの回収の度合いをまとめる
と、次の表土のようになり、ＰＴ及びＦＨＡの９０％以
上がゲルに吸着され、洗浄操作による損失は殆どなく大
部分が溶出画分に回収されることが分かり、第２図に示
す電気泳動像からも、市販ワクチン抗原液と同様、Ｐ′
Ｆ及びｌ” ＩＴ Ａを主成分とする抗原液の得られる
ことが分かった。
と、次の表土のようになり、ＰＴ及びＦＨＡの９０％以
上がゲルに吸着され、洗浄操作による損失は殆どなく大
部分が溶出画分に回収されることが分かり、第２図に示
す電気泳動像からも、市販ワクチン抗原液と同様、Ｐ′
Ｆ及びｌ” ＩＴ Ａを主成分とする抗原液の得られる
ことが分かった。
更に、上記抗原液を前記の方法で滅毒し、沈降ワクチン
に調整してから生物学的製剤基準に基づいて毒性及び力
価試験を行なったところ、何れもが基準を満たしている
ことも確認された。
に調整してから生物学的製剤基準に基づいて毒性及び力
価試験を行なったところ、何れもが基準を満たしている
ことも確認された。
色〜リガンドの、−
次に示すような方法で行なった。
ＡＰ−ブルートヨバール
６５０旧（カラム溶出両分
百日咳菌体成分ワクチン抗原液
ワクチン原液
即ち、上記した抗原液の調製においては、クロマト材を
使用直前に尿素等で洗浄している限り、精製物中に色素
リガンドは検出されなかったため、」二足した抗原液１
０ｍｇに対し人為的に １２５μｇのＣ１ｂａｃｒｏｎ
Ｂｌｕｅ Ｆ＋ ＧＡ色素を混合し、Ｂｕｔｙｌ Ｔ
ｏｙ。
使用直前に尿素等で洗浄している限り、精製物中に色素
リガンドは検出されなかったため、」二足した抗原液１
０ｍｇに対し人為的に １２５μｇのＣ１ｂａｃｒｏｎ
Ｂｌｕｅ Ｆ＋ ＧＡ色素を混合し、Ｂｕｔｙｌ Ｔ
ｏｙ。
ｐｅａｒｌ ６５０ （東洋曹達工業株式会社の商品
名）を充填したカラムに適用し、？容出させた。
名）を充填したカラムに適用し、？容出させた。
第３図及び次の表２は、その分画像を示したものであり
、抗原成分は上記カラムを素通りし、方の色素はカラム
上部に吸着されて除去され、０．５Ｍ Ｖ／シ％ツイー
ン８０を加えた０、０５Ｍリン酸緩得ｉ液により初めて
熔出されることが明かとなっている。
、抗原成分は上記カラムを素通りし、方の色素はカラム
上部に吸着されて除去され、０．５Ｍ Ｖ／シ％ツイー
ン８０を加えた０、０５Ｍリン酸緩得ｉ液により初めて
熔出されることが明かとなっている。
表
ブ
チルトヨバール６
での蛋白と色素リガンドの分離
カラム添加量
分 画 Ｉ
分 画 ■
（ｍｇ） （μ ｇ）
１０、０ １２５９、８７
検出できず 検出できず １２４
検出できず 検出できず １２４
第１図はカラムからのＰＴ及びＦＨＡの溶出パターンを
示すグラフ、第２図は本発明により市販ワクチン抗原液
と同様ＰＴ及びＦＨＡを主成分と性力ラムに付した場合
の分画像を示すグラフである。 特開平３ ３４９３６ （６） ７＼ 皿 杆 欧 妬 手 続 補 正 １Ｌ辷
示すグラフ、第２図は本発明により市販ワクチン抗原液
と同様ＰＴ及びＦＨＡを主成分と性力ラムに付した場合
の分画像を示すグラフである。 特開平３ ３４９３６ （６） ７＼ 皿 杆 欧 妬 手 続 補 正 １Ｌ辷
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、トリアジン色素アフィニティクロマト法により精製
或は製造した医薬品等を、更に疎水性クロマトグラフに
付すことを特徴とする、色素アフィニティクロマト法を
医薬品等の製造に応用した場合に遊離混入の否定できな
い色素リガンドを除去する方法。 ２、少なくとも、トリアジン色素アフィニティクロマト
法と、その後の疎水性クロマトグラフ法により精製され
ていることを特徴とする、トリアジン色素アフィニティ
クロマト法を医薬品等の製造に応用した場合に遊離混入
の否定できないトリアジン色素リガンドを除去した医薬
品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7334389A JPH0645555B2 (ja) | 1989-03-24 | 1989-03-24 | トリアジン色素アフィニティクロマト法を医薬品等の製造に応用した場合に遊離混入の否定できない色素リガンドを除去する方法及びその方法を利用して製造された医薬品 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7334389A JPH0645555B2 (ja) | 1989-03-24 | 1989-03-24 | トリアジン色素アフィニティクロマト法を医薬品等の製造に応用した場合に遊離混入の否定できない色素リガンドを除去する方法及びその方法を利用して製造された医薬品 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0334936A true JPH0334936A (ja) | 1991-02-14 |
| JPH0645555B2 JPH0645555B2 (ja) | 1994-06-15 |
Family
ID=13515419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7334389A Expired - Lifetime JPH0645555B2 (ja) | 1989-03-24 | 1989-03-24 | トリアジン色素アフィニティクロマト法を医薬品等の製造に応用した場合に遊離混入の否定できない色素リガンドを除去する方法及びその方法を利用して製造された医薬品 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0645555B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100740425B1 (ko) * | 2006-09-14 | 2007-07-16 | 최재구 | 운동 기구 |
-
1989
- 1989-03-24 JP JP7334389A patent/JPH0645555B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100740425B1 (ko) * | 2006-09-14 | 2007-07-16 | 최재구 | 운동 기구 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0645555B2 (ja) | 1994-06-15 |
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