JPH03277294A

JPH03277294A - 組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンの製造方法

Info

Publication number: JPH03277294A
Application number: JP7703190A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Murakami; 和雄村上
Original assignee: SAITETSUKU RES KK
Current assignee: SAITETSUKU RES KK
Priority date: 1990-03-28
Filing date: 1990-03-28
Publication date: 1991-12-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】【産業上の利用分野】

本発明は、組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンの製造
方法に関するものである。

【発明の背景】

精製された組換え型アンジオテンシノーゲンは、例えば
次のような目的に利用される。（１１！換え型アンジオテンシノーゲンを大量に精製し
て、結晶化すると共に、３次元構造を決定し、レニンが
アンジオテンシノーゲンに３次元レヘルでどのように反
応するかを推定し、レニンが作用しないような阻害剤の
開発（２）過剰量の組換え型アンジオテンシノーゲンを用い
、血液中のレニン量を測定（３）精製した組換え型アンジオテンシノーゲンの抗体
を作製し、各組織におけるアンジオテンシノーゲンの局
在部位を明確（４）　　アンジオテンシノーゲンは糖タンパク質であ
るが、組換え型アンジオテンシノーゲンのＩ！鎖結合部
位を改変し、Ｗ鎖をなくした組換え型アンジオテンシノ
ーゲンを作製し、糖鎖の役割を推定（５）　　アンジオ
テンシノーゲンはホルモン前駆体タンパク賞であるが、
アンジオテンシンＩを遊離した（デスアンジオテンシノ
ーゲ刈タンパク賞の血中での役割を解明ところで、これまでに確認されているアンジオテンシノ
ーゲンの性質は、次の通りである。（１）血圧ｙ１節酵素レニンの基質である。（２）プロペプチドホルモン（アンジオテンノン■の前
駆体）である。

【発明の開示】

本発明者は、アンジオテンノーゲンの性質を検討する為
に、組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンの大量培養を
試み、そして精製した。すなわち、組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンｃＤＮ
Ａを動物細胞発現ベクターに組み込み、これをリン酸カ
ルシウム法により動物細胞に挿入し、動物細胞成育用培
地にて大量に発現させ、精製することにより組換え型ヒ
トアンジオテンシノーゲンを大量に得たのである。尚、この組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンの製造方
法において、組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンｃＤ
ＮＡは動物細胞発現ベクターにおける制限酵素切断部位
の（ＢａｍＨＩ）と（ＥｃｏＲ■）との間に挿入されて
なることが好ましく、又、組換え型ヒトアンジオテンシ
ノーゲンｃＤＮＡを挿入した発現ベクター（ｐＳＶＨａ
ｇＤ）を動物細胞にリン酸カルシウム法にて挿入する際
のリン酸カルシウムの濃度は０．５〜１．０Ｍであるこ
とが好ましく、又、動物細胞成育用培地にはアミソプテ
リンが添加されてなることが好ましい。ここで、アミソ
プテリンの濃度は５０〜１１０００ｎであることが好ま
しく、又、このアミソプテリンは徐々に添加されること
が好ましい。ところで、組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンｃＤＮ
Ａを発現ベクターに組み込み（ｐＳＶａｇＤ）、チャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞といった動物細胞
（ｄｈｆｒ欠損株、ＤＸＢ−１１）に挿入する際にリン
酸カルシウム法を用いたのは、核酸とリン酸カルシウム
が共沈し、その沈澱物を動物細胞が取り込むという性質
を利用するからである。そして、組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンｃＤＮＡ
を動物細胞発現ベクターに組み込み、これをリン酸カル
シウム法により動物細胞に挿入した後には、組換え型ヒ
トアンジオテンシノーゲンｃ　Ｄ　ＮＡが組込まれた動
物細胞発現ベクターが動物細胞に挿入されているか否か
調べる為、発現ベクター中のジヒドロ葉酸還元酵素（ｄ
ｈｆｒ）が陽性であるか陰性かのテストを行う。尚、ｐＳＶａｇＤがＣＨ○細胞に挿入されているかの識
別にｄｈｆｒを用いたのは、宿主のＣＨ○細胞がｄｈｆ
ｒの生合成系を欠いている為、ｄｈｆｒを含んだ細胞で
ないと成育できない性質を利用したからである。組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンｃＤＮＡを動物細
胞発現ベクターに組み込み、リン酸カルシウム法により
動物細胞に挿入した後には、動物細胞成育用培地にて大
量に発現させられる訳であるが、この培地にアミソプテ
リン（メソトレキセイト）が添加されるのは、ＣＨＯ細
胞に挿入したｐＳＶａｇＤが染色体に入り、遺伝子が増
幅し、発現効率が上がり、大量に組換え型アンジオテン
シノーゲンを得ることが可能となるからである。尚、こ
の際、アミソブテリンの濃度が５０〜１０１０００ｎよ
り望ましくは５０〜６０ＱｎＭ）であることが好ましい
のは、このような濃度で最も良く成育するからであり、
そしてこのアミソブテリンが徐々に添加（例えば、５０
ｎＭ、１１００ｎ、２００ｎＭ、　４００ｎＭ、６００
ｎＭといったように低い濃度から高い濃度に）されるこ
とが好ましいのは、−度に大量のアミソブテリンが添加
されると死んでしまう細胞もあるからである。ところで、大量培養において、例えば２２の培地（例え
ばＤＭＥ＋１０％ＦＣ５，１００ｕ／ｄペニシリン、１
００μｇ／ｒｄストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−Ｇｌ
ｎ、０．１ｍＭのα−メチルマンノシド）で３７°Ｃ１
５％ＣＯ！の存在下にて培養する（２Ｘ１０’！Ｉ＋胞
）と、細胞が付着性である為、中３〜５日でプレートに
付着する。そこで、リン酸緩衝液で３回洗い、次に無血
清培地（ＳＦ＝０２、ペニシリン１００ｕ／Ｍ１、スト
レプトマイシン１００μｇ／ａ１．０．１ｍＭのα−メ
チルマンノシド、２ｍＭのＬ−Ｇｉｎ）で３７℃、５％
ＣＯ□の存在下にて中３〜５日培養する。尚、この培養
の第１段階で血清培地を用いたのは、成育の際に血清が
必要であるからであり、次に無血清培地を用いたのは、
精製の段階でタンパク’ＩＩが少ないと精製の効率が上
がるからである。この培養の後、培養上清を回収し、再び５Ｆ０２を加え
培養（３７°Ｃ１５％Ｃ○２の存在下）する。このような大量培養の後、組換え型ヒトアンジオテンシ
ノーゲンの精製が行われる。まず、組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンを含む２Ｎ
の５Ｆ−０２を遠心分離器にかけ（５０００ｒｐｍ　、
２０ｓｉｎ　、４℃）で細胞残金を除き、上清を例えば
ミリボアペリカンカセットシステム（３００００ｃｕ　
ｔの膜）を用い５〇−以下、例えば４〇−まで濃縮する
。次に、透析（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７，０）
　、４°Ｃ、サンプル１紙に対し、透析溶液１００１ｄ
　　、３回）を行う。ここで、濃縮及び透析を行うのは、次の陰イオン性クロ
マトグラフィに適用する量を減らして精製効率を上げる
為と緩衝作用を持たせる為である。そして、イオン交換クロマトグラフィによる処理が行わ
れる。ここで、イオン交換体には、ジエチルアミノヘキシル交
換体（ＱＡＥ）やジエチルアミノエチル交換体（ＤＥＡ
Ｅ）等の陰イオン交換体が用いられる。又、溶出には、
塩化ナトリウムや塩化カリウム等の一価の金属塩が用い
られ、直線濃度勾配により溶出される。次に、アフィニテイクロマトグラフイによる処理が行わ
れる。これには、糖タンパク質と結合する例えばコンカナバリ
ンＡアガロース（ファルマシア社）を用い、その溶出は
５ｍＭ及び１００ｍＭのα−メチルマンノシドを溶出液
として２段階で行い、又、緩衝液として、コンカナバリ
ンＡアガロースのタンパク質の吸着を防止する為、例え
ば１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，０）、５０ｍＭ塩化ナ
トリウム（アガロースへのタンパクの吸着防止）及び１
ｍＭ塩化マンガン、１ｍＭ塩化カルシウム（ＭｎＣ１ｚ
とＣａＣ１ｚはアガロースの吸着に必要）を用いる。これは、コンカナバリンＡアガロースに娠タンパク質の
吸着が必須であるという理由に基づく。そして、活性ピークを回収し、上記と同様にして透析を
行う。次いで、等；点；気泳動法による処理を行い、最終的な
精製をする。この最終精製段階で等電点電気泳動法を用いたのは、個
々のタンパク質において等電点が異なることに基づくも
ので、組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンの等電点は
５〜６の範囲であることが推定され、この画分を電気泳
動することにより単一のバンドが得られ、精製は完了す
る。このようにして得られた組換え型ヒトアンジオテンシノ
ーゲンは、次のような特性を有していた。（１）ＣＨＯ細胞に組み込まれた組換え型ヒトアンジオ
テンシノーゲンは、メソトレキセイトにより濃度が約９
〜１０倍に増加した。（２）　　イオン交換クロマトグラフィにより塩化ナト
リウム濃度３０〜１２０ｍＭの範囲に岨換え型ヒトアン
ジオテンシンノーゲンは溶出されることが判った。（３）　　コンカナバリンＡアガロースクマトグラフィ
において、５ｍＭのα−メチルマンノシドで溶出される
画分には２本のピークのあることが判っ（４）等電点電
気泳動により２つのピークが得られ、それぞれを電気泳
動すると、後者のピークで電気泳動的に６２ｋＤａの組
換え型ヒトアンジオテンシフ″−ゲンの単一なバンドを
得ることが出来た。

【実施例】

〔組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンの大量培養〕組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンｃＤＮＡを動物培
養細胞での発現ベクター（コロンビア大学Ｏｒ、Ｃｈａ
ｓｉｍより分与）の制限酵素切断部位ＢａｎＨＩ／Ｅｃ
ｏＲＶに組み込み、この発現ベクター（ｐＳＶＨａｇＤ
）をＣＨＯ細胞中のジヒドロ葉酸還元酵素欠損（ｄｈｆ
ｒ−）株（ＤＸＢ−１１）にリン酸カルシウム法により
導入する。この時ｐＳＶａ　ｇＤは３μｇを用いた。リン酸カルシウム法を用いてのアンジオテンンノーゲン
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを組込んだ発現ベクター（ｐＳＶＨａｇ
Ｃ）の動物細胞への挿入方法は次の通りである。尚、全
ての操作は無菌室にてｊテう。 ■　まず、４Ｘ１０’個の細胞を３１ｄの血清培地で２
４ｈｒ増殖（３７°Ｃ１５％ＣＯｚの存在下）させる。 ■　ｐＳＶＨａｇＤ　　３μｇを塩化カルシウム（０，
５Ｍ）及びＨＥＰＥＳ　（０，１Ｍ）の緩衝液０．１２
ｍに溶かし、よく混和する。 ■　■と■とを混ぜ、１０分間室温に放置する。 ■　塩化ナトリウム（０，２８Ｍ）、ＨＥＰＥＳ（０，
０５Ｍ）、リン酸二水素ナトリウム（０゜７５ＭＬ　リ
ン酸−水素二ナトリウム（０，７５Ｍ）溶液０．２４雁
を加え、混和する。室温で１５分闇程度置くとｐＳＶＨ
ａｇＤが沈澱してくる。 ■　沈澱物をＣＨＯ細胞に加える。 ■　３７℃、５％ＣＯｚ存在下で６時間培養する。 ■　上清を捨てる。 ■　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）（１５％グリセコ
ールを含む）１．２−を加え、室温下で３分置く。 ■　細胞を無血清培地で１回洗う。［相］　血清培地３ｄを加え、３７°Ｃ１５％Ｃ○２存
在下で２日間放置する。 ■　６０ｍｍの容器から１００ｍｍの容器２個に移す。０３７℃、５％ＣＯ，存在下で１０ｄ血清培地に放置す
る。 ■　これから単一のＣＨＱ　ｄｈｒ「−コロニーをとる
。そして、この単一Ｃｌ（Ｑｄｈｆｒ−コロニーを培養増
殖させる。又、アミツブリチンで遺伝子を増幅させる。この培養は、例えば２Ｘ１０’個の細胞を２１の培地で
中３〜５日培養し、細胞をシャレーの底に付着させる。この時の培地組成は、ダルベツコ変法イーグル培地に１
０％子牛血清、１００　Ｕ／ｄペニシリン、１１００ａ
／ｍストレプトマイシン、２ｍＭ　　Ｌ−グルタミン、
０．１ｍＭの非必須アミノ酸である。二の培養後、上清を捨て、リン酸緩衝液で３回細胞を洗
う。次に、無血゛清培地２Ｎを加え、中３〜５日培養（３７
°Ｃ１５％ＣＯ□存在下）し、培養上清を回収する。〔組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンの精製］ｍｅえ
型ヒトアンジオテンシノーゲンを含む２１の無血清培地
を遠心分離（５０００ｒｐｍ、２０分、４°Ｃ）Ｌ、細
胞残香を除く。そして、上清を限外濾過により３００００カントの膜を
使い５０−以下、例えば４０ｄまで濃縮する。１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，０）４”Ｃにて透析する
。この時、試料１ｍｌ＋に対し透析溶液１００ｄとする
。１回４時間で緩衝液を交換する。この操作を３回行う
。そして、ジエチルアミノエチルクロマトグラムに試料を
適用し、０〜４００ｍＭの塩化ナトリウムの直線濃度勾
配にて試料の画分を集める。次に、試料の画分を回収し、コンカナバリンＡアガロー
スに適用する。非吸着画分を溶出したのち、５　ｍ　Ｍ、１００ｍＭの
α−メチルマンノット′にて２段階溶出する。そして、アンジオテンシノーゲンの活性の画分を回収し
、１０ｍＭ１リス塩酸（ｐＨ７，０）４°Ｃにて透析す
る。この時、試料ｌｌ１ｌｉ！に対し、透析溶液１００
ｄ！とする。１回４時間で緩衝液を交換し、この操作を
３回行う。このようにして得た試料を等電点電気泳動に適用し、ｐ
Ｈ３，５〜８．０のｐＨ直線勾配により分離する。アン
フオラインは終濃度２％とし、電極液は０゜ＩＭのＮａ
ＯＨとＯ，ＬＭのリン酸を用いた。ｐＨ４，５〜５．５にかけて２本の活性の両分が得られ
るが、それぞれの画分を集め、電気泳動したところ、後
者で電気泳動上単一なハンドが得られ、このものの活性
は保持されていた。この得られた組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンは培
養上清２１から４゜７７μｇであり、晴製缶率は３２４゜５倍、回収率は４１゜０％であった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）組換え型ヒトアンジオテンシノーゲンｃＤＮＡを
発現ベクターに組み込み、これをリン酸カルシウム法に
より細胞に挿入し、細胞成育用培地にて大量に発現させ
、精製することを特徴とする組換え型ヒトアンジオテン
シノーゲンの製造方法。
（２）特許請求の範囲第１項記載の組換え型ヒトアンジ
オテンシノーゲンの製造方法において、組換え型ヒトア
ンジオテンシノーゲンｃＤＮＡは動物細胞発現ベクター
における制限酵素切断部位の（ＢａｍＨ I ）と（Ｅｃ
ｏＲＶ）との間に挿入されてなるもの。
（３）特許請求の範囲第１項記載の組換え型ヒトアンジ
オテンシノーゲンの製造方法において、組換え型ヒトア
ンジオテンシノーゲンｃＤＮＡを挿入した発現ベクター
（ｐＳＶＨａｇＤ）を動物細胞にリン酸カルシウム法に
て挿入する際のリン酸カルシウムの濃度は０．５〜１．
０Ｍであるもの。
（４）特許請求の範囲第１項記載の組換え型ヒトアンジ
オテンシノーゲンの製造方法において、細胞成育用培地
にはアミソプテリンが添加されてなるもの。
（５）特許請求の範囲第４項記載の組換え型ヒトアンジ
オテンシノーゲンの製造方法において、アミソプテリン
の濃度は５０〜１０００ｎＭであるもの。
（６）特許請求の範囲第４項又は第５項記載の組換え型
ヒトアンジオテンシノーゲンの製造方法において、アミ
ソプテリンは徐々に添加されてなるもの。