JPH03251593A - シアリルラクトース - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、シアル酸の２位の炭素とラクトースのグルコ
ース部分の６位の炭素がαアノマーで結合した新規シア
リルラクトースに関する。

従来の技術 シアル酸含有糖は強い生理活性を持つものが多く、結合
している糖やその結合位置の違いにより様々な薬理効果
が期待できる。このため、新規シアル酸含有糖の開発と
、その性質の検討が望まれており、その製法、利用開発
が現在急速に進められている。

シアル酸含有糖の中、シアリルラクトースは最も普遍的
なものであるが、これまで、自然界ではシアル酸の２位
の炭素とラクトースのガラクトース部分の３位の炭素が
αアノマーで結合したα−２，３シアリルラクトース、
シアル酸の２位の炭素とラクトースのガラクトース部分
の６位の炭素がαアノマーで結合したα−２，６−シア
リルラクトースの２種類しか知られていない。

発明が解決しようとする問題点 本発明は有用な生理活性が期待される新規シアル酸含有
糖の開発の一環として新規シアリルラクトースを提供す
ることを目的とする。

課題を解決するための手段 即ち本発明は、式 Ｇａ／　　（βｌ→４）Ｇｌｃ ６ ↑ Ｓｉａα２ で表されるシアリルラクトースに係わる。

本発明化合物は、シアル酸の２位の炭素とラクトースの
グルコース部分の６位の炭素がαアノマーで結合したシ
アリルラクトースであって、文献未記載の新規化合物で
ある。

本発明のシアリルラクトースは、自然界に存在するシア
ル酸がラクトースのガラクトース部分に結合したシアリ
ルラクトースとは、シアル酸と糖との結合位置を異にす
る。そのため、本発明化合物は病原菌やウィルスの感染
防止及びビフィズス因子としての効果、並びにシアル酸
含有糖の有する各種生理活性を有するものと期待され、
それに基づく各種用途に有用な化合物である。

本発明者らは、先にノイラミニダーゼの逆反応を用いて
シアル酸とシアル酸受容化合物とからシアル酸含有化合
物を製造する方法を示した（特願平１−２９３４０２）
。引き続く本発明者の研究により、上記方法によりシア
リルラクトースのシアル酸がラクトースのグルコース部
分に結合した新規化合物を生成することを見出した。従
って本発明化合物は、ノイラミニダーゼの存在下に、シ
アル酸とラクトースとを反応させることによって得られ
る。

本明細書において使用される糖の略号はＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢの規定或いは当技術分野における慣用記号に従うも
のとし、その例を次に挙げる。また、特に明示しなけれ
ば、各糖はＤ一体を示すものとする。

Ｇａ／　　　ニガラクトース Ｇｌｃ　　　ニゲルコース Ｓｉａ　　　ニジアル酸 本発明化合物の製造法に於いては、反応供与体としてシ
アル酸を、受容体としてはラクトースを用いる。また、
ノイラミニダーゼとしては、とくに制限されず公知のも
のが使用でき、例えば、アースロバフタ−ウレアファシ
ェンス （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ
）　、ビブリオ　コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｅｈｏｌｅｒ
ａｅ）、クロストリジウム　パーフリンゲンス（Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ストレ
プトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ、）
等の細菌起源のものを挙げることができ、その中でもア
ースロバフタ−ウレアファシェンス起源のものがとくに
好ましく使用できる。

本発明の酵素反応は、シアル酸とラクトース及び緩衝液
を含む原料液にノイラミニダーゼを加えて行われる。

シアル酸及びラクトースの使用量はとくに制限されず、
いずれも飽和量まで使用できるが、通常反応液１ｍ／当
り１〜４０重量％程度、好ましくは１０〜４０重量％程
度とすればよい。

ノイラミニダーゼの使用量も特に制限されず広い範囲か
ら適宜選択できるが、反応液１ｍ／当り通常０．００１
ユニット以上、好ましくは０．０１〜１００ユニット程
度とすればよい。

緩衝液としてはｐＨが３〜１１程度の公知のものが使用
でき、例えば１０〜２００ｍＭ程度の酢酸緩衝液（ｐＨ
３，０〜６．　０）　、Ｍｃｌ＃ｖａｉｎｅ緩衝液（ｐ
Ｈ３，５〜７．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜８．
０）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０〜８．
０）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０〜９．０）　、
グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８，５〜１１）等を挙
げることができる。

本発明の酵素反応は、原料液に有機溶媒または硫酸アン
モニウム等を加えて疎水性条件にすることにより、加水
分解反応が抑制され、−層有利に合成反応が進行し、収
率も向上する。

有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プ
ロパツール、ブタノール等の低級アルコール類、アセト
ン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢
酸エチル等のエステル類、ジメチルエーテル、メチルエ
チルエーテル、ジエチルエーテル等のエーテル類、クロ
ロホルム等のハロゲン化炭化水素類、アセトニトリル等
のシアン化炭化水素類を挙げることができる。有機溶媒
の添加量は特に制限されないか、通常原料液１ｍｌ当り
０．１〜０．８ｍ／程度、好ましくは０．３〜０．６ｍ
／程度を有機溶媒に置き換えれば良い。また、硫酸アン
モニウムの添加口も特に制限されないが、原料液１ｍ４
当り０．０１〜０．８ｇ程度、好ましくは０．１〜０．
５ｇ程度とすれば良い。

酵素反応は通常１０〜８０℃程度で、好ましくは２５〜
６０℃程度の温度下及びｐＨ３〜１０程度、好ましくは
ｐＨ４〜８で、通常３０分〜１６８時間程度、好ましく
は５〜４２時間程時間路了する。

生成する本発明化合物は、公知の手段に従って酵素反応
液から分離・精製できる。即ち、ます、酵素反応液から
酵素を除去するには、例えば、酵素反応液を８０〜１０
０℃の湯浴中で１〜６０分、好ましくは１０〜２０分間
加熱するか、または、限外濾過膜を用いても容易に酵素
を除くことができる。もし、これらの過程で沈殿が生じ
た場合、濾過もしくは、遠心分離などの常法により反応
液から酵素を除くことができる。

つぎに、活性炭もしくはゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーを行い、さらに、ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ
−セファデックス、ＤＥＡＥ−セファロース、Ｑ−セフ
ァ０−ス、Ｍ　ｏ　ｎ　ｏ　−ＱまたはダウエックスＡ
ＧＩＸ２等のいずれかの陰イオン交換クロマトグラフィ
ー等によって精製することができる。また、必要に応じ
て、高速液体クロマトグラフィーでの分離・精製工程を
追加することができる。得られた本発明化合物に塩が混
入している場合は、ゲル濾過クロマトグラフィー等の常
法により脱塩することができる。そして、精製標品は凍
結乾燥処理により白色粉末としてｉ尋ることができる。

本発明をさらに詳しく説明するため、以下（こ実施例を
挙げる。

実施例１ シアル酸１２０ｇ及びラクトース１２０ｇを５０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ６，０）６００ｍ／　ｃこ溶解し、これ
にアースロノくフタ−ウレアファシェンス起源のノイラ
ミニダーゼ１２０００Ｕを力口えた後、さらにアセトン
６００ｍ／を加えて、３７℃で１５時間振盪反応を行う
。反応終了後アセトン層を除去し、９８℃で１５分間加
熱処理【こより酵素反応を停止させる。変性沈殿しｊコ
酵素タンパク質は銅山ロート５Ｂ−４０タイプ（銅山製
作所）により濾過を行う。得られた反応液６００ｍ１を
三等分（各２００ｍ／）Ｌ、脱イオン水で平衡化したバ
イオゲルＰ−２（／くイオウ・ノド社製）カラム（９ｘ
　　１１５ｃｍ）へ添加する。溶出は脱イオン水で行い
、得られた各フラクションはフェノール硫酸法及びレゾ
ルシン塩酸法によりシアル酸及び糖質の測定を行う。測
定結果からシアリルラクトース画分を集めて２００ｍ／
まで減圧濃縮する。次に２ｍＭ酢酸−アンモニア緩衝液
（ｐＨ５，０）で平衡化したダウエックスＡＧ１×２（
ダウケミカル社製）カラム（５Ｘ９０ｃｍ）へ、同濃度
の緩衝液になるように調製した濃縮液を添加する。同濃
度の緩衝液を３７流した後、３０ｍＭの同緩衝液で溶出
する。各両分はフェノール硫酸法及びレゾルシン塩酸法
により測定し、シアリルラクトース画分を集めて２０ｍ
６まで減圧濃縮する。得られた濃縮液から、脱イオン水
で平衡化したバイオゲルＰ−２カラム（５×９０ｃｍ）
処理により、酢酸−アンモニア緩衝液を除去する。得ら
れたフラクションは減圧濃縮の後、凍結乾燥を行う。こ
うして得られた乾燥粉末を１０ｍ／の脱イオン水に溶解
し、移動相としてアセトニトリル：２０ｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ４、０（７０：　３Ｃ１）を用いた分取高速液体
クロマトグラフィー（装置：島津製作所製ＬＣ−８Ａ、
カラム：山村化学社製ＹＭＣ−ｐａｃｋ　　ＰＡ　−４
３）により分離する。検出は、紫外２１０ｎｍの吸収に
より行なう。より高純度の化合物を得るにはリサイクル
分取を行なう必要がある。ここで得られた溶出液は、減
圧濃縮し脱イオン水で平衡化したバイオゲルＰ−２カラ
ム（５Ｘ９０ｃｍ）により添加したリン酸緩衝液を除去
する。得られたフラクションは減圧濃縮の後、−凍結乾
燥を行なう。凍結乾燥粉末をノイラミニダーゼで加水分
解した後、分解産物を薄層クロマトグラフィーで分析し
た。

薄層プレート；ワットマンシリカゲルプレートに５ 展開溶媒：ｎ−プロパツール：ＩＮアンモニア：水−６
：２：１ 発色剤ニレゾルシン塩酸試薬 分解産物のＲｆ値、０．３１（黄色）と０、　６６　（
淡紫色） 標準品シアル酸のＲｆ値、０．６６（淡紫色）標準品ラ
クト−スのＲｆ値、０．３１（黄色）次に分解産物中の
シアル酸量をチオバルビッール酸法で、ラクトース曾を
酵素法（Ｆキット、べ−リンガ−・マンハイム山之内銖
製）でそれぞれ測定した結果、シアル酸：ラクトース−
１：１（モル比）であった。

また、分子量を日立Ｍ８０Ｂ型質量分析計で測定した結
果、分子量が６３３のシアリルラクトースであることを
確認した。

このシアリルラクトースの結合位置は、白色粉末をメチ
ルエステル化およびアセチル化し、ＢｕｒｋｅｒＡＭ４
００型核磁気共鳴装置で測型口磁気共鳴装置のＨ−３ｅ
ｑが２．７３ｐｐｍに現れ２．５ｐｐｍより低磁場であ
ること、かつＪ７．８値が約８Ｈｚと太きくＨ−９−−
Ｈ−９値が約０．２２ｐｐｍと小さいことがらシアル酸
の結合様式は“α”であることを確認した。さらに、ラ
クトースのアセチル−メチルエステル体のスペクトルの
比較からシアル酸が結合していない水酸基はＧｌ　ｃ−
１，２，３，Ｇａ／−２，３，４゜６位水酸基であり、
シアル酸はグルコース６位水酸基とグリコシド結合して
いることが示された。

以上の結果から、白色粉末は新規シアリルラクトースＧ
ａ／　　（β１→４）Ｇｌ　ｃ　（６←２α）ＮｅｕＮ
Ａｃであることが確認された。

（以上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるシアリルラクトース。