JPH03236779A - 生体触媒固定化成形物および製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ、産・上の１ 本発明は、バイオリアクターなどに用いられる酵素およ
び微生物などの生体触媒の固定化成形物およびその製法
に関する。

旦−」Ｌ迷」口耘街− 近年、酵素・微生物などの生体触媒を固定化して、その
機能を効率よく利用する研究が行われている。

生体触媒を固定化する方法のひとつに、高分子素材を用
いて生体触媒をそのまま包み込む包括固定化法があり、
この方法によく用いられる高分子素材として、寒天・ア
ルギン酸塩・カラギーナン・ポリアクリルアミド・ポリ
ビニルアルコール・光硬化性樹脂などがある。このうち
ポリビニルアルコール（以下ＰＶＡと略記することがあ
る）含水ゲルは、生体触媒を包括させることにより、優
れた固定化担体として利用できることが知られている。

一方、この包括固定化によって生体触媒を固定化して生
体反応を行なわせる反応槽には、固定漕（充填ｔＩり、
流動槽、撹拌槽などがあるが、これらの反応槽で用いら
れる固定化担体の形状としては、活性表面が広くとれろ
点、流動性や充填効果が良い点、取り扱いの容易さから
球状あるいは繊維状であることが望ましい。

特に工業上の実用面において、高強度の固定化担体が容
易にかつ安価に製造可能なことが重要てある。

従来、生体触媒の固定化担体として広く用いられている
アルギン酸塩は、常温でアルギン酸ナトリウム水溶肢を
Ｃａ”、Ａ１２””のようなカチオンを含む水溶液に接
触さげると、容易にゲルを形成する安価で使いやすいゲ
ルである。しかしながら、アルギン酸塩のゲルはリン酸
塩でゲルが破壊したり、排水処理などの利用においては
ゲルそのものが浸食、溶解することもある。また、機械
的強度ら必ずしも充分とはいえず、反応槽での長期間の
使用において損壊することが多い。

また、光硬化性樹脂やアクリルアミドから形成されるゲ
ルら、常温で使用できるがこれらはＰＶＡゲルに比べ原
料価格が非常に高価なため、生体触媒の包括固定化担体
として実用面では、付加価値の高い生体反応への適用に
限られる。

従来、ＰＶＡゲルを成形する方法としては、ＰＶＡ水溶
液を凍結−解凍する方法、ＰＶＡ水溶液を有機溶剤や飽
和ホウ酸水溶液に接触させてゲル化する方法、ＰＶＡ水
溶液を硫酸塩水溶液に接触させ凝固させる方法が知られ
ている。

Ｃが　　しよ”とする ＰＶＡゲルは生体触媒との親和性に富み、各種の反応槽
形式にも適用できる強度と耐久性を有し、しから耐水性
・耐薬品性に優れており、生体触媒の包括固定化担体と
して望ましい特徴を備えている。特に凍結−解凍による
ゲル化においては有機溶剤、酸・塩基などの生体触媒に
有害な薬液を一切使用しないため、生体触媒固定化用担
体として優れている。

球状あるいは繊維状のＰＶＡ凍結ゲルを製造する方法と
しては、ＰＶＡと多糖類の混合水溶液をカチオン含有化
合物水溶液と接触させて球状あるいは繊維状に成形した
後、凍結−解凍操作を行なうという方法か知られている
が、成形後ただちに凍結操作を行なうと球どうし、ある
いは繊維どうしが膠着をおこすため、活性表面積が広く
、流動性・充填効果がよく、取り扱いが容易であるとい
う球状あるいは繊維状ゲルが本来持つ特徴が得られない
という欠点があった。

Ｄ、　題を　　すめ−めの 本発明は、球状あるいは繊維状のＰＶＡゲルを膠着する
ことなく製造する技術を提供する。

また、本発明により製造された球状あるいは繊維状のＰ
ＶＡゲルは、生体触媒との親和性に富み、各種の反応形
式にも適用できろ強度と耐久性を有し、また、耐水性・
耐薬品性に優れており、生体触媒の包括固定化担体とし
て望ましい特徴を備えている。

生体触媒、ＰＶＡおよびカチオンとの接触によりゲル化
する能力のある水溶性高分子多糖類を含有する混合水溶
液を、カチオン含有水溶液と接触させることにより、容
易に球状あるいは繊維状物が形成され、ただちに表面が
固化する。得られた球状あるいは繊維状成形物を界面活
性剤と接触させて、分離後、−５℃以下に凍結し、少な
くとも２時間以上保持後、解凍することによって、ＰＶ
Ａがゲル化して生体触媒を包括固定化した成形物が得ら
れる。

以上のようにして得られたＰＶＡゲルは、ＰＶＡゲル本
来の特徴を有し、ゲルどうしが膠着するという従来の問
題点を解決した。

以下、本発明の生体触媒固定化成形物の製法につき、よ
り詳細に説明する。

ここで１本発明において使用される生体触媒としては、
特に制約はなく、いかなる微生物および酵素も本発明に
より固定され得る。微生物の代表例を挙げるならば、ア
スペルギルス（Ａｇｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス
（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ）属なとのカビ類；シュ−トモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アセトバクター（Ａｃ
ｅｔｏｂａｃｔｏｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒ
−ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　）属、エンエリシア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ）　ｍ等の細菌；サツカロマイセス（５
ａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ）属、キャンデイダ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ）属等の酵母を挙げることができる。また、酵
素の代表例を挙げるならば、ラクテートヒドロゲナーゼ
（１，１，２，３，）、ラクテートオキシダーゼ（１，
１！、２．）　、グルコースオキシダーゼ（１，１！、
４）　、ホルメートデヒドロゲナーゼ（１，２，１，２
，）　、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（１，２，ＩＪ）
　、アルデヒドオキシダーゼ（１２，３，１）　、キサ
ンチンオキシダーゼ（１，２，３，２）、ピルビン酸オ
キシダーゼ（１，２４，３）　、ピルビン酸リダクター
ゼ（１，２，４，１）　、コルチゾン−αリダクターゼ
（１，３，１，４）　、アシルＣＯ＾−デヒドロゲナー
ゼ（１３，９９，３）　、３−ケトステロイドΔ１−デ
ヒドロゲナーゼ（１，３，９９，４）、３−ケトステロ
イドΔ４−デヒドロゲナーゼ（１，３，９９，５）　、
Ｌ　−アラニンデヒドロゲナーゼ（１，４，１，１）　
、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（１，４，１，３
）　、Ｌ　−アミノ酸オキシダーゼ（１，４，３，２）
　、　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（１，４，３，３，）
　、ピリドキサルリン酸オキシダーゼ（１，４，３，５
）　、カタラーゼ（１，１１゜Ｌ、Ｓ）　、カテコール
メチルトランスフェラーゼ（２゜１．１．６）　、カル
ニチンアセチルトランスフェラーゼ（２，３，１，７）
　、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（２，
３，１，９）　、アスベルテートアミノトランスフエラ
ーゼ（２，６，１，１）、アラニンアミノトランスフェ
ラーゼ（２，６，１，２）　、ピリドキサミンピルベー
トトランスフェラーゼ（２，６，１）　、ヘキソキナー
ゼ（２，７，１１）　、グルコキナーゼ（２，７，１゜
２）、フルクトキナーゼ（２，７，１，４）　、ホスホ
グルコキナーゼ（２，７，１，ＩＯ）　、ホスホフルク
トキナーゼ（２，７，１，１１）　、ピルベートキナー
ゼ（２，７，１゜４０）、カルボキシエステラーゼ（３
，１，１，１）、アリールエステラーゼ（３，１，１，
２）　、リパーゼ（３，１゜１．３）　、ホスホリパー
ゼＡ　（３，１，１，４）　、アセチルエステラーゼ（
３，１，１，６）　、コレステロールエステラーゼ（３
，１，１，１３）　、グルコアミラーゼ（３，２゜１．
３）　、セルラーゼ（３，２，１，４）　、イヌラーゼ
（３゜２．１．７）　、α−グルコシダーゼ（３，２，
１，２０）　、β−グルコシダーゼ（、３，２，１，２
１）　、α−ガラクトシダーゼ（：（，２，１，２２）
　、β−ガラクトシダーゼ（３゜２．１．２３）　、イ
ンベルターゼ（３，２，１，２６）　、ペプシン（３，
４，４，１）、トリプシン（３，４，４，４）　、キモ
トリプシンＡ　（Ｌ４．４゜５）、カテプシンＡ（３，
４）、パパイン（３，４，４，４０）、トロンビン（：
（，４，４，Ｈ）、アミダーゼ（３，５，１，４）　、
ウレアーゼ（３，５，１，５）、ペニシリンアシダーゼ
＜　３．５．１．Ｌｌ）　、アミノアシラーゼ（３，５
，Ｌ、１４）　、アデニンデアミナーゼ（３゜５．４．
２）　、Ａ　、Ｔ　、Ｐ　、アーゼ（：（，６，Ｌ、：
（）　、ピルベートデカルボキシラーゼ（４，１，１，
ｌ）、オキザレートデカルボキシラーゼ（４，１，１，
２）、トリプトファンデカルボキシラーゼ（４，１，１
，２７）　、アルドラーゼ（４，１，２，１３）　、マ
レトドシュダーゼ（４，１，３゜２）、トリプトファン
シンターゼ（４，２，１，２０）、アルドラ−ゼ（４，
３，１，ｌ）　、リジンラセマーゼ（５，１，１，５）
　、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（５，３，１
，９）　、ステロイドΔ−イソメラーゼ（５，３，３，
１）　、マクシニルＣｏＡシンセターゼ（６，２゜１．
５）、［（註）カッコ内の数字は酵素番号を表わす］な
どが挙げられる。

本発明における界面活性剤としては、脂肪酸塩類・高級
アルコール硫酸エステル塩類・液体脂肪油硫酸エステル
塩類・脂肪族アミン硫酸塩類・脂肪族アマイド硫酸塩類
・脂肪族アルコールリン酸エステル塩類・二塩基性脂肪
酸エステルスルホン酸塩類・脂肪酸アミドスルホン酸塩
類・アルキルアリルスルホン酸塩類・ホルマリン縮合ナ
フタリンスルホン酸塩類などの陰イオン界面活性剤、脂
肪族アミン塩類・第４アンモニウム塩類・アルキルピリ
ジニウム塩類などの陽イオン界面活性剤、ポリオキシエ
チレンアルキルエーテル類・ポリオキシエチレンアルキ
ルフェノールエーテル類・ポリオキシエチレンアルキル
エステル類・ソルビタンアルキルエステル類・ポリオキ
シエチレンソルビタンアルキルエステル類などの非イオ
ン界面活性剤、カルボン酸型・硫酸エステル型・スルホ
ン酸型などの両性イオン界面活性剤、あるいはこれらの
併用が考えられるが、とりわけ陽イオン界面性剤が好ま
しい。

本発明の成形物の特徴は、上記の界面活性剤が成形物の
表面近傍に吸着していることを特徴とする。

本発明の成形物の形状については特に制限はなく、球状
、繊維状など全て含まれる。また成形物の大きさについ
ても特に制限はなく、好ましくは、０．１＝ｌＯｍｍ、
より好ましくは０．２〜５■のものが用いられる。

本発明において、生体触媒および界面活性剤以外の他の
成分としては、ＰＶＡおよびカチオンとの接触により、
ゲル化する能力のある水溶性高分子多糖類が好ましい。

ＰＶＡとしては平均重合度が１０００以上、好ましくは
、１７００以上で、ケン化度は９８．５モル％以上、好
ましくはケン化度９９８５モル％以上の完全ケン化ＰＶ
Ａがゲルの形成上、望ましい。また本発明のＰＶＡとし
ては、本発明の目的を阻害しない範囲において、公知の
種々の変性ＰＶＡを用いることができる。

ＰＶＡ水溶液の濃度が高いほど、より強固なゲルが生成
するか、必要なゲル強度が得られれば、ＰＶＡａ度が低
い方が原料コスト面から有利である。ＰＶＡ以外の添加
成分の種類や濃度、ＰＶＡ混合水溶液の液濫および演腐
形成法によって、適切な濃度を選定する必要はあるが、
常温でＰＶＡ屋合水廖液を満干する場合は、ＰＶＡ濃度
０．３〜４０ｖｔ％か球状化が容易であり、実用上充分
なゲル強度が得られる。

カチオンとの接触によりゲル化する能力のある水溶性高
分子多糖類としては、具体的には、水溶性アルギン酸塩
、カラギーナン、マンナン、キトサン等が挙げられるが
、とりわけアルギン酸ナルリウムが好ましい。

ＰＶＡ水溶液に添加する少なくとも１種のカチオンとの
接触によりゲル化する能力のある水溶性高分子多糖類、
好適にはアルギン酸ナトリウムの濃度は、水に対して０
．２〜４ｗｔ％、好ましくは０．５〜２％ｗｔ％が良い
。０．２ｗｔ％未満では、ＰＶＡ混合水溶夜の形成能が
乏しく、また、４ｖｔ％より大の場合は、固い成形物が
得られるが、溶液粘度の上昇をもたらす上、原料コスト
上昇の要因となり好ましくない。

また本発明における、カチオン含有化合物としては、具
体的には、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ス
トロンチウムイオン、バリウムイオン、アルミニウムイ
オン、カリウムイオン、セリウムイオン、ニッケルイオ
ン等の金属カチオン；アンモニウムイオンなどのカチオ
ンのうちの少なくとも１種を含有する化合物が挙げられ
るが、なかでも２価以上のカチオン含有化合物が好まし
く、とりわけＣａＣｌ２＊が望ましい。

次に前述の各成分を用いた成形物の製法について説明す
る。

ＰＶＡとカチオンとの接触によりゲル化する能力のある
水溶性高分子多糖類の混合水溶液に目的とする生体触媒
を混入、攪拌してＰＶＡ混合水溶液を調製する。

また、このＰＶＡ混合水溶液には、ＰＶＡのゲル化を阻
害しない範囲で、微生物の培地、固定化担体の強度を上
げろための浦強剤、生成ゲルの比重を調整する充填材な
どを添加してもよい。

以上のＰＶＡ混合水溶液を吐出・層下・噴霧などにより
、カチオン含有化合物、好適にはＣａＣＬを含有する水
溶液と接触させ、球状あるいは繊維状の成形物となる。

この成形物を界面活性剤、好適には陽イオン性界面活性
剤と接触させる。成形物の表面がすべて界面活性剤と接
触しさえすれば接触時間は短くてよい。

これを、−５℃以下、好ましくは一１Ｏ℃以下に凍結し
、少なくとも２時間以上、好ましくは１０時間以上保持
後、生体触媒に悪影響を与えない温度範囲において解凍
する操作を少なくとも１回以上、好ましくは２回以上繰
り返すことによってＰＶＡがゲル化し、生体触媒固定化
成形物が得られろ。

このようにして得ら乙たＰＶＡゲルは、従来の問題点で
あったゲルどうしの膠着という問題点がなく、ｆ！を種
の形式の反応槽において、長期間にわたって変形・損壊
しない強度を有し、水や各種薬液に対しても侵されるこ
となく、連続運転が可能となり、生体触媒固定化成形物
としての実用性が発現する。

Ｌ−」Ｌ九側− 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの実施例により限定されるしのではない。

実施例１ （味）クラレ製のＰＶＡ　（平均重合Ｆ　１７４０、ケ
ン化度９９．８５モル％）を４０℃の温水で約１時間洗
浄後、ＰＶＡ濃度１６ｗｔ％になるように水を加え、オ
ートクレーブ中で１３０℃、３０分処理してＰＶＡを溶
解させ、室温まで放冷した。このＰＶＡ水溶荘４００ｇ
に対し、アルギン酸ナトリウム８ｇを加え、さらに（株
）クラレ岡山工場（岡山県岡山市海岸通り１丁目２番１
号）の排水処理槽より採取し、ａ縮操作を施して得られ
た活性汚泥（Ｍ　Ｌ　Ｓ　Ｓ　　４００００ｍｇ／（１
）を４００ｇ加え、充分に攪拌させた。この微生物混合
液を内径２ＩＩＩＩｌφのビニル管１本を使用したロー
ラーポンプで２−７分で送液し、内径１ｓｍの注射針の
先より押し出すことにより、０．２ｍｏ１２／ＣのＣａ
ＣＱ　を水溶液に演表面から５ｃｍの高さより滴下させ
た。滴下液はＣａ”イオンの凝固作用でただちに球状化
し、沈降した。この球状物を塩化カルシウム水溶液と分
離した後、陽イオン界面活性剤であるポリオキシエチレ
ンアルキルアミンを１０％含む水に５秒間浸漬後、軽く
水洗した。これを−２０±３℃の冷凍庫で凍結させ、２
０時間後に常温で解凍させた。成形物の強度を上げるた
め、この凍結−解凍操作をさらに２回繰り返した。粒子
は径が３〜３．５師の球状で弾性に富んだもので、粒子
どうしの膠着はまったく見られなかった。

陽イオン界面活性財の微生物への影響を調べるためゲル
中の生菌数を測定した。ゲル１ｇを９−１！の滅菌水と
ともにホモジナイザー（１５０００ｒｐ−１ｌＯ分間）
で均一に分散させた後、滅菌水で適宜希釈し、その０．
１−を普通寒天培地へ広げ、３０℃恒温槽で２４時間培
養後、出現したコロニーの数と希釈倍率からゲル中の生
菌数を求めた。結果を第１表に示す。また、このゲルを
純水に浸漬させ、４！１℃の冷蔵庫で３０日間放置後、
前記と同じ方法でゲル中の生菌数を求めた。結果を第１
表に示す。

比較例！ 実施例１と同じＰＶＡを４０℃の温水で約１時間洗浄後
、ＰＶＡＩ度１６ｖｔ％になるように水を加え、オート
クレーブ中で１３０℃、３０分間処理したＰＶＡを溶解
させ、室温まで放冷した。このＰＶＡ水溶液４００ｇに
対し、アルギン酸ナトリトウム８ｇを加え、さらに実施
例１と伺じ活性汚泥（ＭＬ　Ｓ　８４００００ｍｇ／１
２）を４００ｇ加え、充分に攪拌させた。この微生物混
合液を内径２ｆｆｉＩｌφのビニル管１本を使用したロ
ーラーポンプで２ａ＋ｆｆ／分で送液し、内径ｌ■の注
射針の先より押し出すことにより、０．２ｓｏ（１／（
ｌのＣａＣ１！　を水溶液に演表面から５ｃｍの高さよ
り滴下させた。滴下液はＣａ”″イオンの凝固作用でた
だちに球状化し、沈降した。この球状物をカルシウム水
溶液と分離した後、軽く水洗した。これを２０±３℃の
冷凍庫で凍結させ、２０時間後に常温で解凍させた。成
形物の強度を上げるため、この凍結−解凍操作をさらに
２回繰り返した。凍結解凍の過程で粒子どうしの膠着が
生じた。

また、実施例■と同じ方法で生菌数を測定した。

結果を第１表に示す。

第 ！ 表 本発明によれば、上記の実施例から明らかなとおり、生
体触媒に悪影響を与えずかつゲルどうしの膠着を防止す
ることができる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）成形物の表面近傍に界面活性剤が吸着しているこ
   とを特徴とする生体触媒固定化成形物。
2. （２）（Ａ）生体触媒、 （Ｂ）ポリビニルアルコール、および、 （Ｃ）カチオンとの接触によりゲル化する能力のある水
   溶性高分子多糖類 からなる請求項１記載の生体触媒固定化成形物。
3. （３）水溶性高分子多糖類がアルギン酸ナトリウムであ
   る請求項２記載の生体触媒固定化成形物。
4. （４）界面活性剤が陽イオン系界面活性剤である請求項
   １〜３のいずれか１つの項に記載の生体触媒固定化成形
   物。
5. （５）請求項２記載の（Ａ）成分、（Ｂ）成分および（
   Ｃ）成分からなる混合水溶液をカチオン化合物を含有す
   る水溶液と接触させることにより該混合水溶液を成形さ
   せた後、界面活性剤を含有する水溶液に浸漬させ、さら
   に−５℃以下で凍結させることを特徴とする請求項１〜
   ４のいずれか１つの項に記載の生体触媒固定化成形物の
   製法。