JPH0321865B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、動物及びヒトの組織及び体液中の
菌類及び藻類の検出のための方法、該方法のため
に適当な光学白化剤を含有する調製物、及び該方
法の実施のためのキツトに関する。 〔従来の技術〕 適用すべき治療方法を選択する際に、動物及び
ヒトにおける感染の原因の正確な診断が極めて重
要である。確実な診断のための最良の方法は臨床
標品から感染の原因生物単離し、そしてそれを形
態学的に同定することである。しかしながら、こ
の様な理想的な状態はほとんど達成されない。な
ぜなら、単離は複雑であり、同定はしばしば不確
実だからである。菌類の感染の試みの診断でさえ
組織検体又は体液の包括的な試験を必要とし、例
えば菌類のある種の抗原を選択的に認識する一連
の異る抗体を用いる血清学的試験を必要とする。 〔発明が解決しようとする問題点〕 複雑で時間を必要とする血清学的試験に代り得
るか、又は少なくともこれらの試験を感染を惹起
する菌類の属についての正確な情報が必要な場合
に限定するような迅速でしかも確実診断法の広範
な必要性が存在する。この様な迅速な診断は、例
えば手術中に生ずる物、菌類により生ずる排出物
を分析するための綿棒、皮膚糸状菌症が疑われる
場合の皮膚綿棒、新生児からの小児科綿棒、並び
に全身感染及び粘膜上の真菌症の疑いのある衰弱
児及び新生児からの他の被検材料、例えば口及び
咽頭食道粘膜及び小児の場合の白血病的及び他の
腫瘍の場合の食道及び気管上のキヤンデイダによ
る鵞口瘡からの被検材料の試験において重要であ
る。迅速診断はまた、内科的、腫瘍学的及び外科
的実際において、日和目真菌感染が疑われる患者
から採取された組織材料の試験において、例えば
AIDSの患者の場合に、特に食道炎及び気管支炎
の形のキヤンデイダ症を認識するために、腫瘍疾
患の静細胞治療を受けた患者の場合、及び抗生物
質及び／又は免疾抑制剤による治療を受けた患者
の場合、さらには、真菌症、特にキヤンデイダ症
が疑われている場合に、粘膜上の鵞口瘡の形で、
皮膚及び／又は粘膜上の全身性真菌症を有する抵
抗性が低下している患者を検査する場合の老人に
おいて、そして藻類、例えばプロトセコシス
（protothecosis）による皮膚及び器官の場合にお
いて重要である。 菌類疾患の診断はまた、家畜及びペツトの養生
において、例えばウシにおける乳腺炎を検査する
場合に、そして例えばイヌ、愛玩用小鳥及びまれ
なそして高価な動物園用動物における菌類疾患の
場合にも重要である。菌類を同定するための単純
で確実な方法はまた、人為的に生じさせた菌類感
染を有する実験室動物、例えばマウス及びラツト
に対して潜在的に抗菌性の療法剤を試験する場合
にも重要である。 〔問題点を解決するための手段〕 この発明は今や、菌類感染の迅速且つ確実な診
断を可能にする。この発明は菌類（fungi）及び
藻類（algae）の検出方法に関し、この方法は、
少なくとも４個のスルホ基を有する光学スチルベ
ン白化剤（optical stilbene whitening agent）
又はその塩により動物又はヒトの組織又は体液を
処理し、そして蛍光顕微鏡を用いて観察すること
を特徴とする。 光学白化剤は、無色であるか又はわずかな可視
色のみを有しそして例えば340〜400nmの紫外線
を吸収し、そしてこの吸収したエネルギーを例え
ば400〜440nmの波長の可視光の形で再び放出す
る有機化合物である。良好な光学白化剤は高い量
子収率により特徴付けられる。光学白化剤は例え
ばスチルベン類、クマリン類及びカルボスチリル
化合物類、１，３−ジフエニル−２−ピラゾリン
類、ナフタリミド類、又はベンゾキサゾリル化合
物及び他のヘテロ芳香族置換芳香族化合物又はエ
チレン化合物類に属し、そして常に共役π−電子
系を有する。 この発明の光学白化剤は置換スチルベン類に属
し、そして少なくとも４個、例えば４〜６個のス
ルホ基を担持する。これらのスルホ基は該光学白
化剤に良好な水溶性を付与する。少なくとも４個
のスルホ基を有する光学スチルベン白化剤及びそ
れらの塩は既知であり、そして例えば総説及び専
門の書籍、例えば“Fluorescent Whitening
Agents”，Anliker及びMueller編集、Georg
Thieme Verlag，スツツツガルト、1975年に記
載されている。 少なくとも４個のスルホ基を有する光学スチル
ベン白化剤の例として、次の式（）： （式中、R¹は少なくとも１個のスルホ基を有
する芳香族又はヘテロ芳香族置換基、例えば置換
されたフエニル基、ピリジル基又はトリアゾリル
基、例えばスルホ置換４−フエニル−１，２，３
−トリアゾール−２−イル基であり、あるいは少
なくとも１個のスルホ基を有する芳香族又はヘテ
ロ芳香族基により置換されたアミノ基、例えば置
換されたトリアジニルアミノ、例えば少なくとも
１個のスルホ基を有する２，４−置換１，３，５
−トリアジン−６−イルアミノ基であり、そして
２個の基R¹は同一でもよく又は異つていてもよ
い）により、あるいは次の式（）； （式中、Ａはスルホ基により置換された１，４
−フエニレン基又は４，4′ビフエニレン基であ
り、そしてR²はスルホ、ヒドロキシ、低級アル
コキシ、例えばメトキシ、ヒドロキシ−低級アル
コキシ、例えば２−ヒドロキシエトキシ、ハロゲ
ン、例えば塩素、シアノ、カルボキシ、低級アル
コキシカルボニル、例えばメトキシカルボニル又
はエトキシカルボニル、又はカルバモイルであ
り、あるいはR¹の意味を有し、そして基R²は同
一でもよく又は異つていてもよく、そしてさらに
複数個存在してもよい） で表わされる化合物が挙げられる。 低級アルキル基、及び低級アルコキシ基中の低
級アルキル基は１〜７個、好ましくは１〜４個の
炭素原子を有し、そして例えばメチル、エチル、
プロピル、イソプロピル又はブチル基である。フ
エニル、ピリジル、トリアゾリル又はトリアジニ
ル基の好ましい置換基は例えばR³のもとに後で
記載する基である。 塩は特に水溶性塩、例えばアルカリ金属塩、例
えばナトリウム塩又はカリウム塩であり、しかし
またアンモニウム塩であつてもよい。 次の式（）： 〔式中R³はヒドロキシ、低級アルコキシ、例
えばメトキシ、ヒドロキシ−低級アルコキシ、例
えば２−ヒドロキシエトキシ、低級アルコキシ−
低級アルコキシ、例えば２−メトキシエトキシ、
低級アルキルアミノ、例えばメチルアミノ、ジ−
低級アルキルアミノ、例えばジメチルアミノ、ヒ
ドロキシ−低級アルキルアミノ、例えば２−ヒド
ロキシエチルアミノ又は２−ヒドロキシプロピル
アミノ、低級アルキル−ヒドロキシ−低級アルキ
ル−アミノ、例えばメチル−２−ヒドロキシエチ
ル−アミノ、ジ（ヒドロキシ−低級アルキル）ア
ミノ、例えばジ（２−ヒドロキシエチル）アミノ
又はジ（２−ヒドロキシプロピル）アミノ、低級
アルコキシ−低級アルキルアミノ、例えば２−メ
トキシエチルアミノ、低級アルキル−低級アルコ
キシ−低級アルキル−アミノ、例えばメチル−２
−メトキシエチル−アミノ、ジ（低級アルコキシ
−低級アルキル）アミノ、例えばジ（２−メトキ
シエチル）アミノ、モルホリノ又はフエニルアミ
ノ（場合によつてはフエニル環においてスルホ基
により置換されている）、例えばアニリノ、２−，
３−もしくは４−スルホフエニルアミノ又は２，
５−ジスルホフエニルアミノ基であり；R⁴はス
ルホ、例えば２−，３−又は４−スルホ基であ
り；そしてR⁵は水素、スルホ、例えば４−もし
くは５−スルホ基、又は環状化されたフエニル
環、例えば２，３−、３，４−もしくは５，６−
ベンゾ基であり；そして２個の基R³、２個の基
R⁴及び２個の基R⁵はそれぞれ同一であつてもよ
く又は異つていてもよい〕で表わされる光学スチ
ルベン白化剤、及びその水溶性塩、例えばアルカ
リ塩、例えば、ナトリウム塩及びカリウム塩が、
この発明の方法において好ましい。 R³がヒドロキシ−低級アルキルアミノ、例え
ば２−ヒドロキシエチルアミノ、ジ（ヒドロキシ
−低級アルキル）アミノ、例えばジ（２−ヒドロ
キシエチル）アミノ、又はスルホにより置換され
たフエニルアミノ、例えば３−スルホ−フエニル
アミノ基であり、R⁴はスルホ、例えば２−，３
−又は４−スルホ基であり、そしてR⁵が水素、
スルホ、例えば５−スルホ基、又は環状化された
フエニル環、例えば２，３−ベンゾ基である式
（）の光学スチルベン白化剤、及びその容易に
水溶性の塩、例えばナトリウム塩がこの発明の方
法において特に好ましい。 この発明は特に、R³がジ（２−ヒドロキシエ
チル）アミノ又は３−スルホフエニルアミノ基で
あり、R⁴が３−スルホ基であり、そしてR⁵が水
素である式（）の化合物、及びその水溶性塩、
好ましくはナトリウム塩の使用方法に関する。 特に非常に好ましい光学スチルベン白化剤はジ
アエタノールの名のもとに知られており、そして
４，4′−ビス〔２−ジ（２−ヒドロキシエチル）
アミノ−４−（３−スルホフエニルアミノ）−１，
３，５−トリアジン−６−イルアミノ〕−スチル
ベン−２，2′−ジスルホン酸のナトリウム塩とし
て組織的に命名される。この化合物は例えば米国
特許No.3406118に記載されている方法で製造する
ことができる。 菌類及び藻類の検出のためにこの発明の方法に
より染色され得る動物又はヒトの組織は、任意の
器官及び体の部分に由来することができ、そして
例えば凍結乾燥組織材料又はパラフイン中に包埋
された脱水組織のミクロトーム組織切片の形で、
あるいは印像標本又は綿棒標本の形で試験され
る。この発明の方法によつて菌類及び藻類が検出
され得る体液は、例えば血液、喀痰、気管支分泌
物、リンパ液、脳脊髄液及び他の穿刺液、汗、涙
液、眼内液、尿又は便である。 菌類及び藻類の検出方法はヒト組織又は体液に
おいて特に好ましい。 他の方法により調製される組織切断又は標本、
例えば綿棒、印像標本又は体液から単離された固
体成分は、好ましくは、例えば水、塩溶液例えば
緩衝化生理的塩溶液、又は組織固定溶液、例えば
10％ホルムアルデヒド水性溶液又は水性アルコー
ル溶液中0.05〜５％、好ましくは0.1〜２％の光
学白化剤を含有する水性溶液により、数分間、例
えば２〜30分間、室温にて又はわずかに上昇した
温度、例えば50℃までの温度にて処理される。過
剰の光学白化剤は、もし適当であれば、例えば水
又は塩溶液、例えば緩衝化生理的塩溶液により洗
浄除去する。所望により、次に、試験されるべき
標本を、細胞切片又は細胞成分の染色のために適
当な色素、例えばメチレンブルー、トルイジンブ
ルー、フクシン、メチルバイオレツト等により、
しかし好ましくはエバンスブルーにより対比染色
することによりコントラストを強くする。 この様にして処理された標本を、反射可視青光
又は好ましくは340〜450nmのUV光（エピイル
ミネーシヨン）中、顕微鏡下で観察する。観察さ
れ得る菌類又は藻類の特徴的構造の緑がかつた蛍
光色がこの様な病原生物の存在を直接示す。ほと
んどの場合、染色された菌類成分の形態から菌類
の属及び種を推定することが可能である。所望に
より、顕微鏡下で見られる像を通常の市販の感色
フイルムにより写真記録することができる。 この発明の方法は簡単で時間を要しない手順及
び高度な確実性により特徴付けられ、そして菌類
感染を診断するための他の方法に明らかに卓越す
る。従来の染色法、例えば一般に使用されている
ゴモリ（Gomori）膜−銀染色法又は過ヨウ素酸
−シツフ染色法と比べて、この発明の方法は次の
様な利点を有する。すなわち、菌類が選択的に染
色され、蛍光染色が非染色バツクグラウンドに対
して良好に現われ、そしてこの方法は２時間未満
で確実な結果を与える。これに対して従来の染色
法は24時間又はそれ以上を必要とする。この発明
の方法はブランコホール（Blankophor）（商標）
BA又はカルコフルオール（Calcofluor）（商標）
ホワイトM2Rニユーによる染色に明らかに卓越
している。これらはいずれもわずか２個のスルホ
基を有するトリアジニルアミノスチルベン白化剤
であり、動物及びヒトの組織を染色するために推
奨されているものである。上記の理由は、この発
明によればすべての菌類及び藻類が選択的に染色
されるが、上記の白化剤は幾つかの菌類を染色せ
ず、又はそれらを貧弱にのみ染色し、そして染色
された菌類が組織中に容易に見出されないからで
ある。 この発明を実施するために必要なものは、微生
物学実験室又は医学実験室において通常使用され
る簡単な蛍光顕微鏡及び容易に入手できる試薬が
すべてである。 好ましい水溶性光学白化剤であるジアエタノー
ルによる陽性蛍光は、すべての真菌症の場合、例
えば皮膚のロボ（lobo）の真菌症、肺の分芽菌
症、脾臓の砂毛症、腎臓のキヤンデイダ症、肺の
ヒストプラズマ症、肝臓の放線菌症、腎臓のアス
ペルギルス症、そしてさらにアジアスピロミコシ
ス（adiaspiromycosis）、コクシジオイデス症、
クリプトコツカス症、リノスポリジウム症、マズ
ラ足、及び他の多くの疾患観察される。単離され
そして培養された菌類、例えばオイミコタ
（Eumycota）属に属する代表、例えばチゴミセ
テス（Zygomycetes）、エンドミセテス
（Endomycetes）、アスコミセテス
（Ascomycetes）又はドイテロミセテス
（Deuteromycetes）（不完全菌）、特にブラストミ
セス・デルマチデイス（Blastomyces
dermatidfs）、キヤンデイダ・アルビカンス
（Candida albicans）、アスペルギルス・フミガ
ツス（Aspergillus fumigatus）、スポロトリカ
ム・シエンキー（Sporotrichm schenkii）、トリ
コフイトン・メンタグロフイテス
（Trichophyton mantagrophytes）、トリコフイ
トン・クインケアヌム（Trichophyton
quinkeanum）、ミクロスポルム・カニス
（Microsporum canis）、トルロプシス・グラブ
ラタ（Torulopsis glabrata）等、及び藻類、例
えばプロトテカ（Prototheca）を染色すること
ができる様である。常にそして驚くべきことに、
細菌及び寄生虫は染色されず、特にスタフイロコ
ツカス（Staphylococci）、例えばスタフイロコツ
カス・アウレウス（Staph.dureus）K1326、スト
レプトコツカス（Streptococcus）、例えばストレ
プトコツカス・フエカリス（Strept.faecalis）、
サルモネラ（Salmonellae）、例えばサルモネラ
K1385、コリ（Coli）細菌、例えばエシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）K1322、シユドモ
ナデー（Pseudomonadeae）、例えばシユードモ
ナス（Pseudomonas）K1407、及びミコバクテ
リア（Micobacteria）、例えばミコバクテリウ
ム・スメグマチス（Mycobact.smegmatis）は染
色されない。菌類に属さない重要な病原性感生
物、例えばニユーモシステイス・カリニー
（Pneumocystis carinii）、ギアルデイア・ランブ
リア（Giardia lamblia）、レイシユマニア・ド
ノバニ（Leishmania donovani）、レイシユマニ
ア・カガシ（Leish.chagasi）及びレイシユマニ
ア・インフアンタム（Leish.infantum）が染色さ
れないことも注目される。 この発明はまた、この方法を実施するために適
当な光学白化剤を含有する調製物に関する。この
様な調製物は、例えば、前記の少なくとも４個の
スルホ基を有する光学スチルベン白化剤の水性
液、及び固体混合物、例えば粉末状又は顆粒状混
合物である。 この発明の水性溶液は、例えば0.05％〜５％、
好ましくは0.1〜２％、例えば１％の光学スチル
ベン白化剤、及び所望により他の化合物、例えば
塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムもしくはカ
リウム、リン酸水素二ナトリウムもしくは二カリ
ウム、又は他の緩衝化合物、例えばＮ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−N′−２−エタンスル
ホン酸、３−モルホリノプロパンスルホン酸、Ｎ
−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−グリシン
もしくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、及びこれらのアルカリ金属塩、例えばナトリ
ウム塩、及び／又は酸付加塩、例えば塩酸塩、変
性及び／又は可溶化有機溶剤、例えばメタノール
又はエタノール、及び固定化化合物、例えばホル
ムアルデヒド、そしてさらに、所望により稀釈
剤、例えば尿素、湿潤剤、例えば脂肪族又は芳香
族スルホネート、又はカルシウムイオンの錯化
剤、例えばエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを
含有する。水溶液中の光学スチルベン白化剤の濃
度は５％以上、例えば20％までであることができ
る。この様な溶液は、それがこの発明の方法に適
用される前に稀釈されなければならない。 この発明の固体混合物は光学スチルベン白化剤
と前記の塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム及び／又は緩衝塩、例えばリン酸二水素ナトリ
ウム及びリン酸水素二ナトリウム、又は有機の固
体緩衝化合物、例えばトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン及び対応する塩酸塩との混合物
である。これらの混合物は、それがこの発明の方
法に使用される前に稀釈されなければならない。 好ましい調製物は、前に好ましいものとして記
載した光学スチルベン白化剤、例えばジアエタノ
ールとして知られている４，4′−ビス〔２−ジ
（２−ヒドロキシエチル）アミノ−４−（３−スル
ホフエニルアミノ）−１，３，５−トリアジン−
６−イルアミノ〕−スチルベン−２，2′−ジスル
ホン酸の水溶液である。蒸留水又はリン酸緩衝化
塩溶液中に0.1〜２％、例えば１％の好ましい白
化剤を含有する溶液が好ましい。 この発明の調製物はそれ自体既知の溶解、混
合、粉砕、造粒及び／又は凍結乾燥法により得ら
れる。 この発明はまた、この発明の方法を実施するた
めの試験キツトに関する。この様な試験キツトは
例えば少なくとも４個のスルホ基を有する光学ス
チルベン白化剤それ自体又は前記のこの発明の調
製物、対比染色のための色素又は染色液、緩衝剤
又は緩衝液、そしてさらに任意的装置、例えばピ
ペツト、顕微鏡用スライド及びカバーグラス、こ
の発明の方法を実施するための指示書、比較検体
等を含む。 この発明の試験キツトはまた血清学的試験溶
液、例えばポリクローナル又はモノクローナル抗
体溶液を含有することができ、これを用いて光学
スチルベン白化剤による染色による菌類の属の第
１の仮の同定をさらに確認することができる。
種々の菌類の属のマーカー抗原に対して向けられ
ておりそして対応する菌類に特異的に結合する上
記のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
は知られており、又は既知の方法により製造する
ことができる。抗原／抗体反応が蛍光顕微鏡下で
容易に見える様にするためには、フルオレツセイ
ン標識抗体、例えばローダミン−又はフルオレツ
セイン−イソチオシアネートにより標識された抗
体を使用するのが好ましい。試験キツトはまた、
ある種の細菌又はある種の原生動物と特異的に反
応する抗体の溶液を含むことができる。好ましく
は、この発明の光学スチルベン白化剤の蛍白色か
ら識別され得る蛍光色を発する蛍光標識抗体、例
えばローダミン−イソチオシアネートで標識され
た抗体使用して、１つの操作において平行して菌
類と細菌又は菌類と原生動物を区別することがで
きる様にするのが好ましい。 例１ 組織切片中の菌類の染色 組織片、例えば生検材料を常法に従つてカプセ
ル中のパラフインに包埋し、このパラフインを硬
化せしめ、そしてブロツクをミクロトーム中で３
〜4μｍの層厚に切る。パラフイン切片をスライ
ド上に適用し、水浴中で伸ばし、そして乾燥し、
そしてパラフインをキシレンにより３回、次にア
ルコール、アルコール／水混合物、水、そして最
後にリン酸緩衝化生理的塩溶液（PBS）により
洗浄する。パラフイン切片の代りに、深冷凍結組
織材料の約10μｍ厚のミクロトーム切片に適用
し、これをPBSにより条件下することができる。 組織切片をPBS（PH７）中１％ジアエタノール
の溶液で飽和する。10〜30分間の後、切片を
PBSですすぎ、次にPBS中エバンスブルーの0.2
％溶液で処理し、PBSで再び洗浄する。水中切
片をスライド上に置き、カバーし、そして次にネ
ールエナミルでシールする。この組織切片をオリ
ンパスBHTU顕微鏡下、エピフルオレツセント
光中で観察する。菌類の細胞壁及び細胞漿が蛍光
性緑色又は緑黄色に染色され、他方バツクグラウ
ンドが明褐色となり、良好なコントラストをもた
らす。コダツクのカラーフイルムASA400を用い
てライカ小型カメラにより写真を撮る。 例２ 培養液又は体液からの材料の染色 被験材緑をスライド上に拡げ、空気乾燥し、火
炎で熱固定し、そしてメタノールで１分間覆う。
スライドを0.1％ジアエタノールの水溶液の層に
より覆う。５分間後、染色液を除去し、そしてス
ライドを水で洗浄しそして空気乾燥する。検体を
カバーグラスで覆い、そして40倍のデイアルツク
ス−20顕微鏡下で、フイルターH2（波長390−
490nm）を通過した反射UV光（エピイルミネー
シヨン）を用いて観察する。 白化剤により処理されたサンプルをエバンスブ
ルーの0.2％水溶液で0.5分間処理しそして水洗し
た後に乾燥した場合、コントラストが有利に改善
される。 例３ 菌類の染色としての光学白化剤の例 キヤンデイダ・アルビカンスK1133、アスペル
ギルス・フミガツスK76、及びミクロスポルム・
カニスK240をマイコフイル（Mycophil）天寒上
で培養し、一連の試験のために生理的塩溶液に懸
濁し、そして等量部のマウスの腎臓の懸濁液と混
合する。各回に１滴のこの混合物をスライドに置
き、空気乾燥し、火炎中を３回通して固定し、メ
タノールで１分間覆い、そして蒸留水で洗浄し
た。固定された菌類サンプルを５分間、試験され
るべき光学白化剤の１％溶液で覆い、リン酸緩衝
化生理的塩溶液（PBS）で洗浄し、PBS中0.2％
エバンスブルー溶液で0.5分間覆い、PBSで洗浄
し、そしてカバーグラスで覆つた。サンプルを40
倍のダイアルツクス−20顕微鏡下で、反射UV光
（エピイルミネーシヨン、390−490nm）により観
察した。 バツクグラウンドの染色に対する菌類の蛍光の
強度を任意スケールにより評価する。菌類当り２
〜３実験を行い、そして平均値を計算する。次の
結果が得られる。 非常に良好な染色 ４，4′−ビス−〔２−ジ（２−ヒドロキシエチ
ル）アミノ−４−（３−スルホフエニルアミノ）−
１，３，５−トリアジン−６−イルアミノ〕−ス
チルベン−２，2′−ジスルホン酸ナトリウム塩
（ジアエタノール）；及び、 ４，4′−ビス−〔２，４−ジ（３−スルホフエ
ニルアミノ）−１，３，５−トリアジン−６−イ
ルアミノ〕−スチルベン−２，2′−ジスルホン酸
ナトリウム塩。 良好な染色 ４，4′−ビス−〔２−ジ（２−ヒドロキシエチ
ル）アミノ−４−（４−スルホ−１−トフチルア
ミノ）−１，３，５−トリアジン−６−イルアミ
ノ〕−スチルベン−２，2′−ジスルホン酸ナトリ
ウム塩； ４，4′−ビス〔２−ジ（２−ヒドロキシエチ
ル）アミノ−４−（２，５−ジスルホフエニルア
ミノ）−１，３，５−トリアジン−６−イルアミ
ノ〕−スチルベン−２，2′−ジスルホン酸ナトリ
ウム塩； ４，4′−ビス−〔２−（２−ヒドロキシエチル）
アミノ−４−（３−スルホフエニルアミノ）−１，
３，５−トリアジン−６−イルアミノ〕−スチル
ベン−２，2′−ジスルホン酸ナトリウム塩；及
び、 ４，4′−ビス−〔２−ジ（２−ヒドロキシエチ
ル）アミノ−４−（４−スルホフエニルアミノ）−
１，３，５−トリアジン−６−イルアミノ〕−ス
チルベン−２，2′−ジスルホン酸ナトリウム塩。 中程度の染色 ４−〔２−ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノ
−４−メトキシ−１，３，５−トリアジン−６−
イルアミノ〕−4′−〔２−ジ（２−ヒドロキシエチ
ル）アミノ−４−（２−スルホエチルアミノ）−
１，３，５−トリアジン−６−イルアミノ〕−ス
チルベン−２，2′−ジスルホン酸ナトリウム塩； ４，4′−ビス−〔２−モルホリノ−４−（２，５
−ジスルホフエニルアミノ）−１，３，５−トリ
アジン−６−イルアミノ〕−スチルベン−２，
2′−ジスルホン酸ナトリウム塩； ４，4′−ビス−〔２−ジ（２−ヒドロキシプロ
ピル）アミノ−４−（３−スルホフエノキシアミ
ノ）−１，３，５−トリアジン−６−イルアミノ〕
−スチルベン−２，2′−ジスルホン酸ナトリウム
塩；及び、 ４，4′−ビス−〔２−ジ（２−ヒドロキシプロ
ピル）アミノ−４−（４−スルホフエニルアミノ）
−１，３，５−トリアジン−６−イルアミノ〕−
スチルベン−２，2′−ジスルホン酸ナトリウム
塩。 ２個のみのスルホン酸官能機又はスルホ基の代
りにカルボキシ基又はアンモニウム基を有するス
チルベン白化剤、及び２，４−ジ置換１，３，５
−トリアジン−６−イルアミノ基を有しないスチ
ルベン白化剤は低い染色を与えるか又は全く染色
を与えない。 例 ４ リン酸緩衝化生理的塩溶液中ジアエタノールの
溶液 10.0ｇの４，4′−ビス−〔２−ジ（２−ヒドロ
キシエチル）アミノ−４−（３−スルホフエニル
アミノ）−１，３，５−トリアジン−６−イルア
ミノ〕−スチルベン−２，2′−ジスルホン酸ナト
リウム塩（ジアエタノール、塩化ナトリウム不
含）、0.2ｇの塩化カリウム、8.0ｇの塩化ナトリ
ウム、1.44ｇのリン酸水素二ナトリウム二水和
物、及び0.2ｇのリン酸二水素カリウムを１の
蒸留水に溶解する。 塩化ナトリウム（13％）及び水（５〜10％）を
含有する粗製ジアエタノールにより同じ溶液を調
製することができる。ジアエタノール及び塩の量
は調製する。 例５ 試験キツト 菌類染色用試験キツト（多量） ◎リン酸緩衝化塩溶液中１％ジアエタノール溶液
250mlを収容したスクリユーキヤツプフラス
コ； ◎リン酸緩衝化塩溶液中0.2％エバンスブルー溶
液250mlを収容したスクリユーキヤツプフラス
コ； ◎染色法を実施するための指示書。 例６ 試験キツト 菌類染色用試験キツト（少量） ◎リン酸緩衝化塩溶液中１％ジアエタノール溶液
１mlずつを収容したポリエチレンコートアルミ
フオイルの袋20個； ◎リン酸緩衝化塩溶液中0.2％エバンスブルー溶
液１mlずつを収容したポリエチレンコートアル
ミフオイルの袋20個； ◎染色法を実施するための指示書。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 菌類及び藻類の検出方法であつて、動物又は
   ヒトの組織又は体液を４個以上のスルホ基を有す
   る光学スチルベン白化剤又はその塩により処理
   し、そして蛍光顕微鏡を用いて検査することを特
   徴とする方法。 ２ 前記の処理を４〜６個のスルホ基を有する光
   学スチルベン白化剤又はその塩を用いて行うこと
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 ３ 前記処理を、次の式（）： （式中、R¹は少なくとも１個のスルホ基を有
   する芳香族もしくはヘテロ芳香族置換基である
   か、又は少なくとも１個のスルホ基を有する芳香
   族もしくはヘテロ芳香族基により置換されたアミ
   ノ基であり、そして２個の基R¹は同一でもよく
   又は異つていてもよい）、 あるいは、次の式（）： （式中、Ａはスルホ基により置換された１，４
   −フエニレン基又は４，4′−ビフエニレン基であ
   り、そしてR₂はスルホ、ヒドロキシ、低級アル
   コキシ、ヒドロキシ−低級アルコキシ、ハロゲ
   ン、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボ
   ニル又はカルバモイル基であるか、あるいはR¹
   の意味を有し、そして基R²は同一でもよく又は
   異つていてもよく、そしてさらに複数個存在して
   もよい） で表わされ４個以上のスルホ基を有する光学白化
   剤、あるいはその塩を用いて行うことを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４ 前記処理を、次の式（）： 〔式中R³はヒドロキシ、低級アルコキシ、ヒ
   ドロキシ−低級アルコキシ、低級アルコキシ−低
   級アルコキシ、低級アルキルアミノ、ジ−低級ア
   ルキルアミノ、ヒドロキシ−低級アルキル−アミ
   ノ、低級アルキル−ヒドロキシ−低級アルキル−
   アミノ、ジ（ヒドロキシ−低級アルキル）アミ
   ノ、低級アルコキシ−低級アルキルアミノ、低級
   アルキル−低級アルコキシ−低級アルキル−アミ
   ノ、ジ（低級アルコキシ−低級アルキル）−アミ
   ノ、モルホリノ、又はフエニルアミノ（場合によ
   つてはフエニルにおいてスルホ基により置換され
   ている）であり；R⁴はスルホ基であり；そして
   R⁵は水素、スルホ基又は環状化されたフエニル
   環であり；そして２個の基R³、２個の基R⁴及び
   ２個の基R⁵はそれぞれ同一でもよく又は異つて
   いてもよい〕 で表わされる光学白化剤、又はその塩を用いて行
   うことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ５ 前記処理を、R³がヒドロキシ−低級アルキ
   ルアミノ、ジ（ヒドロキシ−低級アルキル）アミ
   ノ、又はスルホフエニルアミノ基であり；R⁴が
   スルホ基であり；そしてR⁵が水素、スルホ基、
   又は環状化されたフエニル環である式（）の化
   合物、又はその水溶性塩を用いて行うことを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ６ 前記の処理を、R³がジ（２−ヒドロキシエ
   チル）アミノ又は３−スルホフエニルアミノ基で
   あり；R⁴が３−スルホ基であり；そしてR⁵が水
   素である式（）の化合物、又はその水溶性塩を
   用いて行うことを特徴とする特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 ７ 前記処理を、４，4′−ビス〔２−ジ（２−ヒ
   ドロキシエチル）アミノ−４（３−スルホフエニ
   ルアミノ）１，３，５−トリアジン−６−イルア
   ミノ〕−スチルベン−２，2′−ジスルホン酸のナ
   トリウム塩を用いて行うことを特徴とする特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 ８ ヒトの組織又は体液中の菌類及び藻類を染色
   するための特許請求の範囲第１項〜第７項のいず
   れか１項に記載の方法。 ９ 少なくとも４個のスルホ基を有する光学スチ
   ルベン白化剤又はその塩とキヤリヤーとを含有す
   る、菌類及び藻類の検出のための方法において使
   用するための調製物。 １０ 溶液状である特許請求の範囲第９項に記載
   の調製物。 １１ 0.05％〜５％の光学スチルベン白化剤及び
   塩、有機緩衝剤、有機溶剤及び／又は固定剤を含
   有する水性溶液の形態の特許請求の範囲第９項に
   記載の調製物。 １２ 次の式（）： 〔式中、R³はヒドロキシ、低級アルコキシ、
   ヒドロキシ−低級アルコキシ、低級アルコキシ−
   低級アルコキシ、低級アルキルアミノ、ジ−低級
   アルキルアミノ、ヒドロキシ−低級アルキル−ア
   ミノ、低級アルキル−ヒドロキシ−低級アルキル
   −アミノ、ジ（ヒドロキシ−低級アルキル）アミ
   ノ、低級アルコキシ−低級アルキルアミノ、低級
   アルキル−低級アルコキシ−低級アルキル−アミ
   ノ、ジ（低級アルコキシ−低級アルキル）−アミ
   ノ、モルホリノ、又はフエニルアミノ基（場合に
   よつてはフエニル環においてスルホ基により置換
   されている）であり；R⁴はスルホ基であり；そ
   してR⁵は水素、スルホ基又は環状化されたフエ
   ニル環であり；そして２個の基R³、２個の基R⁴
   及び２個の基R⁵はそれぞれ同一でもよく又は異
   つていてもよい〕 で表わされる化学白化剤、又はその水溶性塩を含
   有する、特許請求の範囲第９項、第１０項又は第
   １１項に記載の調製物。 １３ R³がヒドロキシ−低級アルキルアミノ、
   ジ（ヒドロキシ−低級アルキル）アミノ、又はス
   ルホフエニルアミノ基であり；R⁴がスルホ基で
   あり；そしてR⁵が水素、スルホ基、又は環状化
   されたフエニル環である式（）の化合物、又は
   その水溶性塩を含有する、特許請求の範囲第９
   項、第１０項、又は第１１項に記載の調製物。 １４ R³がジ（２−ヒドロキシエチル）アミノ
   又は３−スルホフエニルアミノ基であり；R⁴が
   ３−スルホ基であり；そしてR⁵が水素である式
   （）の化合物、又はその水溶性塩を含有する、
   特許請求の範囲第９項、第１０項又は第１１項に
   記載の調製物。 １５ ４，4′−ビス〔２−ジ（２−ヒドロキシエ
   チル）アミノ−４−（３−スルホフエニルアミノ）
   −１，３，５−トリアジン−６−イルアミノ〕−
   スチルベン−２，2′−ジスルホン酸のナトリウム
   塩を含有する、特許請求の範囲第９項、第１０項
   又は第１１項に記載の調製物。 １６ 動物又はヒトの組織又は体液中の菌類及び
   藻類の検出のための方法において使用するため
   の、少なくとも４個のスルホ基を有する光学スチ
   ルベン白化剤、又はその塩を含む試験キツト。 １７ 少なくとも４個のスルホ基を有する光学活
   性スチルベン白化剤又はその塩、並びに色素及
   び／又は血清学的試験溶液及び／又は方法のため
   の指示書を含む、特許請求の範囲第１６項に記載
   の試験キツト。 １８ 前記スチルベン白化剤又はその塩をキヤリ
   ヤーとの調製物の形で含むことを特徴とする特許
   請求の範囲第１６項に記載の試験キツト。 １９ ４，4′−ビス〔２−ジ（２−ヒドロキシエ
   チル）アミノ−４−（３−スルホフエニルアミノ）
   −１，３，５−トリアジン−６−イルアミノ〕−
   スチルベン−２，2′−ジスルホン酸のナトリウム
   塩を含む、特許請求の範囲第１６項、第１７項又
   は第１８項に記載のキツト。