JPH03183473A - 糸状菌の連続培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分封］ 本発明は、糸状菌を培養して菌体あるいは酵素などの有
用物質を製造するにあたり、雑菌の汚染を防止して収率
良く目的物質を得る糸状菌の液体連続培養法に関する。

〔従来の技術〕

従来、糸状菌４体の製造あるいは糸状菌による種々の有
用物質例えば各種酵素、抗生物質、有機酸、色素などの
製造は、固体培養法や液体回分培養法により行なわれて
いる。

ところが、これらの培養法では、培養環境が絶えず変化
して、菌体や有用物質の収率が低いなどの欠点がある。

これに代る方法として、液体連続培養法が採用され、例
えばプロテアーゼやα−アごラーゼなどがより収率よく
製造されているが、該連続培養法には、雑菌汚染の問題
点がある。

そしてこの雑菌の汚染を防ぐ方法の１例としてたとえば
、培地に１０％程度の食塩を存在させ、耐塩性麹菌を連
続培養する方法などが開発されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、前記のごとく、雑菌汚染防止のため、食塩の存
在下で培養する方法では、耐塩性のない菌の連続培養に
は適用できないなどの大きな制約がある。

このように液体連続培養における雑菌の汚染、特に長期
間培養時のそれに関しては、技術的に未だ十分解決され
ていない現状にある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、糸状菌の液体連続培養における雑菌汚染
防止につき鋭意研究した結果、液体連続培養装置を用い
て糸状菌を培養する場合、液体培地貯槽に保存中の液体
培地及び培養槽に連通ずる連結部内の液体培地が雑菌の
汚染を最も受は易く、またそこでの雑菌の増殖が著しく
、そのために培養槽内が汚染されて菌体や有用物質の収
率が低下することを先ず突き止めた。

更に種々検討した結果、炭素数が６以下の脂肪酸又はそ
の塩を添加した液体培地を用いれば、糸状菌の増殖、有
用物質の生産には影響することなく、その抗菌作用によ
り前記の雑菌の汚染あるいは増殖が防ぎ得ること、また
、液体回分培養においては、糸状菌の増殖、有用物質の
生産が阻害される脂肪酸又はその塩の添加濃度でも、液
体連続培養のときは、特定範囲では、その阻害を受ける
ことなく、長期に亘り糸状菌の正常な培養、有用物質の
安定的な生産が行なわれることの新知見を得、これらの
知見に基づいて本発明を完成した。

すなわち、本発明は、液体培地貯槽と、連結部を介して
これと連通ずる培養槽とからなる液体連続培養装置を用
いて糸状菌を培養するに際し、前記培地貯槽の液体培地
に炭素数が６以下の脂肪酸又はその塩を０．０１％から
３χ（ｉｙ／ｖ）の濃度となるように含有させることを
特徴とする糸状菌の連続培養法である。

以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、本発明において用いられる微生物としては、例え
ばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ　Ｉｕｓ）属、ペ
ニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ムコール（
Ｍｕｃｏｒ）属、リゾーデス（Ｒｉｚｏｐｕｓ）属、コ
リオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属、レンチヌス（Ｌｅｎ
ｔｉｎｕｓ）属、トリコロマ属（Ｔｒｉｃｏｌｏｍａ）
属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属などの糸状菌が
ある。

その具体例としては、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）（ＩＡＭ　２７０３）
、アスペルギルス・ソーヤ（ＩＡＭ　２６３１Ｌアスペ
ルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙ
ｚａｅ）（ＩＡＭ　２６０９）、アスペルギルス・オリ
ゼー（ＩＦＯ４１７６）、アスペルギルス・オリゼー（
ＡＴＣＣ２０３８６）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔａｍａｒｉｉ）（ＩＡＭ　２１
５６）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（ＨＵＴ　４０１
９）、ペニシリウム・ルテウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ
　Ｉｕｔｅｕｍ）（ＡＨＵ８０２２）、ムコール・ラセ
モサス（Ｍｕｃｏｒ　ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）（ＡＨＵ　
６００２）、ムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ　ｈｉ
ｅｍａｌｉｓ）（ｔｆＵＴ　１１３１）、リヅーブス・
フォルモサエンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｆｏｒｍｏｓ
ａｅｎｓｉｓ）（ＩＦＯ４７３２）、リゾーデス・ジャ
バニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ）（
ＩＦＯ５４４１）、カルオルス・ベルシカラー（Ｃｏｒ
ｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ＞（ｒＦｏ　８７５
４）（カワラタケ）、レンチヌス・ニドデス（Ｌｅｎｔ
ｉｎｕｓ　ｅｄｏｄｅｓ）（ＩＦｏ　６６５４Ｎシイタ
ケ）、トリコロマ・マツタケ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ　
ｍａｔｓｕｔａｋｅ）（ＩＦＯ６９１８）（マツタケ）
、モナスカス・アンカ（Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ａｎｋａ）
（ＩＦｏ　５９６５）等が挙げられる。

本発明に使用する液体培地（以下、単に培地という場合
は液体培地を意味する）としては、連続培養開始前のい
わゆる前培養（培地を培養槽に連続的に供給を開始する
迄の培養、すなわち単に菌体を増殖させる迄の培養）及
び液体連続培養とも、従来糸状菌を培養するための培地
であればいかなるものでもよく、そして培養の目的例え
ば糸状菌々体の製造、酵素、その他有用物質の製造など
に適した培地を適宜選択して使用すればよい。

その例として、培地の炭素源としては例えば、グルコー
ス、可溶性澱粉、シュークロース、デキストリン、セル
ロース、グリセリン、醤油油、艷など、窒素源としては
例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、糠
、カゼイン、ポリペプトン、グルテンなど、無機塩とし
ては例えば、各種リン酸塩、硫酸塩、塩酸塩などが用い
られ、さらに必要によりビタミン頚、核酸などを適宜加
えた培地が用゛いられる。

本発明においては、前培養後に培養槽へ供給する培地に
添加する脂肪酸又はその塩は、抗菌作用、性状（液状、
油状、ロウ状の別）、水溶性などの観点から炭素数が６
以下、好ましくは４以下の脂肪酸又はその塩である。

そしてこのときの該脂肪酸又はその塩の培地への添加量
は、前記液体培地貯槽内及び連結部内の雑菌の汚染、増
殖の防止、並びに連続培養時の糸状菌が抗菌作用を受け
ず正常に培養されることのために、０．０１〜３χ（ｗ
／ｖ）の濃度となるようにすることが肝要である。すな
わち、該添加量が濃度として０．０１χ（ｗ／ｖ）未満
のときは雑菌汚染防止が十分でなく、一方３χ（ｗ／ｖ
）を越えるときは、糸状菌の正常な培養及び有用物質の
安定した生産ができなくなるからである。そして特に０
．０７〜２χ（ｗ／ｖ）の濃度となるようにするのが好
適である。即ち０．０７χ（ｉｖ／ｖ）以上の場合には
雑菌の汚染防止がより完全であるばかりでなく、液体回
分培養では糸状菌の増殖、を用物質の生産に阻害がある
にも拘らず、液体連続ｔ＠養ではそれがなく、一方２χ
（ｗ／ｖ）以下の場合には糸状菌の極めて正常な培養及
び安定的な有用物質の生産が行われるからである。

なお、該脂肪酸又はその塩を添加した培地（培養槽への
供給する以前の培地）のｐＨは、６以下好ましくは５以
下となるようにすることが、雑菌の汚染防止の観点から
更に好ましい態様である。

前記脂肪酸の具体例としては、例えば蟻酸、酢酸、プロ
ピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸などが好適なもの
として挙げられ、中でも特に酢酸が好ましい。

また該脂肪酸の塩としては、例えばアルカリ金属塩（ナ
トリウム、カリウムなどの塩）、アルカリ土類金属塩（
カルシウム、マグネシウムなどの塩）などである。

そして該脂肪酸又はその塩は、１種又は２種以上組合せ
て用いることができる。

次に適宜選択された培地の殺菌方法はどのような方法で
もよい。例えば脂肪酸又はその塩を添加した、又はしな
い培地を系外にて、予め回分式や連続式で加熱殺菌ある
いはＩＩＩ濾過による除菌処理をしたのち、液体培地貯
槽に注入し、脂肪酸又はその塩を添加しないときは、こ
れを殺菌又は除菌した該培地に無菌的に加えればよい。

また脂肪酸又はその塩を添加した培地を、液体培地貯槽
内で殺菌するか、更には連結部の適当位置に設けた連続
殺菌装置で殺菌する方法を用いてもよい。この後者の場
合は、未殺菌の培地は、脂肪酸又はその塩の添加によっ
て雑菌の増殖が抑制されるので、その殺菌も容易である
。

一方、培養槽では、例えば脂肪酸又はその塩を含まない
以外は前記培地貯槽内と同様の培地などを用い、これに
目的とする糸状菌を接種して前培養を行ない、菌が対数
増殖期を経である程度増殖した時期より、前記培地貯槽
の培地を連結部を介して培養槽へ連続的に供給する。こ
のときの培地供給速度は、−船釣には希釈率０．０１〜
０．５０ｖ／ｖ−ｈ位が適当であるが、使用菌あるいは
目的生産物などに応して適宜変更すればよい。

次に糸状菌の前培養及び連続培養条件としては、使用す
る菌株、培地組成などにより多少異なり、適宜の条件を
採用すればよいが、通常培養温度は２０〜４０°Ｃ１培
養中のｐＨは３〜８、通気量は、０．１〜２　Ｖ、Ｖ、
Ｍ、程度であり、培養は例えば攪拌翼、通気などによる
完全混合培養法を用いる。

なお、前記前培養の期間は、使用する菌株の性質に応し
て決めればよいが、通常は２４時間〜１０日間位である
。また担子菌の′ように極端に遅い場合には、２週間以
上を要することもある。

以上のごとくして糸状菌を連続培養して得る培養液より
、菌体製造を目的とする場合には、常法例えば濾過など
によって菌体を採取し、また酵素、その他の有用物質を
製造することを目的とする場合には、常法例えば濾過に
よる菌体の除去、透析、塩析、イオン交換樹脂処理、ゲ
ル濾過などの種々の精製法を適用して目的物質を得るこ
とができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、雑菌汚染のない安定した糸状菌の連続
培養が可能となり、菌体あるいは有用物質の収率の顕著
な向上が図られるので、本発明は産業上極めて有意義で
ある。

［実施例］ 以下に示す実施例においては、加圧殺菌可能な５１容の
液体培地貯槽（２槽設け、交互に使用）と、連結部を介
してこれと連通ずる加圧殺菌可能な３１容の培養槽（ジ
ャーファーメンタ）とからなる液体連続培養装置を用い
た。

また以下の実施例及び実験例において、培養液中の雑菌
数（個／ｍｌ）は、培養液を濾過して糸状菌を除き、菌
数との関連で希釈倍率を考慮して生理食塩水で希釈し、
このうち１　ｍｌを下記組成の寒天培地７ｄに混合し、
これを３７°Ｃで２４時間培養したのち、出現したコロ
ニー数を生細菌数として測定した。

（中細菌数測定用培地組成） 肉エキス１′＆（ｗ／ｖ）、ポリペプトン１χ（ｗ／ｖ
）、酵母エキス０．５　Ｚ（ｗ／ｖ）、グルコース１χ
（−／ν）、寒天１、５　Ｘ（ｗ／ｖ）、ｐＨ７，０ そしてまた培養液中のプロテアーゼ活性（ＰＵ／−）は
アンソン−萩原変法により測定した。

更に培養液中のα−アミラーゼ活性（Ｕ／ｍ１）はＷｏ
ｈ　ｌ　ｇｅｎｕ　ｔｈ突変法酵素研究法■、ｐ、１０
８、朝倉書店（１９４Ｂ）　）により測定した。

実施例１ （］）前培養： 下記組成の培地２１を培養槽に注入し、１２０°Ｃで１
０分間加熱殺菌した。

次いで該培地にアスペルギルス・オリゼー（Ａ。

ｏｒｙｚａｅ）　（ＩＡＭ　２６０９）の胞子勉濁液を
接種し、Ｄ。

（溶存酸素濃度）０．５〜１．０　ｐｐｍとなるように
攪拌を制御しつつ、また培養中のｐＨが６．３となるよ
うに５　Ｎ−Ｈ，ＳＯ４又は５　Ｎ−ＮａＯＨで制御し
つつ、３０°Ｃで４８時間培養した。

（培地組成） 可溶性澱粉１．０　！（ｉｖ／ｖ）、大豆粉０．５χ（
ｗ／ｖ）、醤油油１．０χ（ｗ／ｖ）、リン酸１カリウ
ム０．２　Ｘ（ｗ／ｖ）、ｐＨ無調整 （２）連続培養： 第１表に記載の脂肪酸をその濃度となるように添加する
以外は、前記（１）と同様の組成の培地を液体培地貯槽
に注入し、１２０°Ｃで１０分間加熱殺菌した。前培養
を終了した培養槽へ該培地を、連結部を介して供給速度
（希釈率Ｄ）　０．０２ｖ／ｖ−ｈｒで連続的に供給し
、一方、培養槽の取り出し口より供給量と同量の培養液
を連続的に排出するようにし、前培養と同様の培養条件
で１５日間連続培養した。

このときの各培養液の雑菌数及びプロテアーゼ活性の測
定結果を第１表に示す。

第１表 なお、脂肪酸を無添加とする以外は、上記と同様に連続
培養（但し培養日数５日間）して得た培養液の生細菌数
は０個／ｍｌ（培養日数が５日と短いため、この時点で
の雑菌汚染は無い（実施例２参照））であり、プロテア
ーゼ活性は５００ＰＵ／ｉｎ！であった。

第１表より、脂肪酸を０．０１〜３　Ｋ（ｗ／ｖ）の濃
度となるように培地に添加することにより、雑菌汚染防
止及びプロテアーゼの安定的生産の効果が顕著であるこ
とがわかる。

実験例　゛　　　　　での　　　の 前記実施例１の前培養における培地と同様の組成の液体
培地に酢酸を０．１χ（ｗ／ｖ）及び０．５χ（ｗ／ｖ
）添加したもの（試験区１及び試験区２という）と、酢
酸無添加のもの（対照区という）を、おのおの５Ｎ−Ｎ
ａＯｔｌでｐＨ５，５に調整したのち、５００成容坂ロ
フラスコに１００−分注し、オートクレーブにて１２０
°Ｃで１０分間加熱殺菌した。次いで該培地にアスペル
ギルス・オリゼー（ＩＡＭ　２６０９）の胞子懸濁液を
接種し、３０°Ｃで７２時間好気的条件（１８０ｓｐｍ
）で攪拌混合培養した。得た培養液より、濾紙で菌体を
除去し、濾液中のプロテアーゼ活性を測定した。

その結果を第２表に示す。

（本頁以下余白） 第２表 第２表より、液体回分培養においては、脂肪酸がプロテ
アーゼ生産を著しく阻害していることがわかる。

実施例２ （１）前培養： 下記組成の培地を用いる以外は実施例１の（１）と同様
にしてアスペルギルス・オリゼー（ＩＡＭ　２６０９）
の前培養を行なった。

（培地組成） 可溶性澱粉３χ（ｗ／ｖ）、大豆粉０．５χ（ｗ／ｖ）
、醤油油０．５２（ｈ／ｖ）、リン酸１カリウム０゜Ｉ
　＄（ｉｖ／ｖ）、ｐＨ無調整 （２）連続培養： 培地に酢酸を０．１χ（ｗ／ｖ）の濃度となるように添
加すること及び連続培養日数を２０日間とする以外は、
実施例１の（２）と同様にして連続培養したく本発明の
方法）。

また対照として、培地に酢酸を無添加とする以外は、前
記と同様にして前培養及び連続培養を行なった（対照の
方法）。

このときの各培養液の雑菌数及びプロテアーゼ活性を経
口的に測定した。その結果をおのおの第３表、及び第４
表に示す。

第３表 雑菌数（生細菌数）の経口的変化（ＸＩＯ５個／１ｄ）
第４表 プロテアーゼ活性の経口的変化（ＰＵ／ｍｌ）第３表、
及び第４表から、本発明の方法によれば、連続培養期間
中、雑菌の汚染が完全に防止されていて、プロテアーゼ
活性も高水準で安定しているのに対し、対照の方法では
、連続培養後１２日目から雑菌汚染が始まって、日数が
経過するにつれて急激に増加し、これに対応してプロテ
アーゼ活性が低下していることがわかる。また、このこ
とから雑菌の汚染がプロテアーゼ活性の低下の原因であ
ることもわかる。

更に、培地へ添加する脂肪酸は、液体回分培養では、前
記実験例が示すごとく、有用物質の生産を阻害するが、
液体連続培養では、前記第４表が示すごとく、有用物質
の生産に影響を与えないことがわかる。

実施例３ 酢酸を液体培地貯槽の培地に含有させた場合と、培養槽
の培地に直接添加、含有させた場合との比較を次のごと
く行なった。

（＋）　　前培養： 下記組成の培地２１を培養槽に注入し、１２０°Ｃで１
０分間加熱殺菌した。該培地にアスペルギルス・ソーヤ
（Ａ、５ｏｊａｅ）　（ＩＡＭ　２７０３）の胞子懸濁
液を接種して、通気量０．８　ｖｖｍで、Ｄｏ　（溶存
酸素濃度）が０．５〜１．０　ｐｐｍとなるように攪拌
を制御しつつ、かつ培養ｐＨを６．３となるように５　
Ｎ−１１２ｓＯ４又は５Ｎ−Ｎａｉｌ（で制御しつつ３
０’Ｃで３日間培養した。

（培地組成） ポリペプトン２χ（ｗ／ｖ）、可溶性澱粉１．　Ｏχ（
Ｗ／Ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４０，５２：（ｗ／ｖ）、ＭｇＳ
Ｏ４・７）１ｚ００．０５χ（ｗ／ｖ）、酵母エキス０
．０３Ｚ（ｗ／ν） （２）連続培養： ■　酢酸を添加、含有させる方法及び供給方法（ｉ）本
発明の方法；上記組成の培地に酢酸を０．２χ（−／ν
）の濃度となるように添加したものを液体培地貯槽へ注
入し、１２０’Ｃで１０分間加熱殺菌する。また連結部
を介して培養槽への供給速度（希釈率Ｄ）は０．０２ν
／ν・ｈｒとする。

（ｉｉ）対照の方法；上記組成の培地を液体培地貯槽へ
注入し、１２０°Ｃで１０分間加熱殺菌する。

そして連結部を介して該培地の培養槽への供給速度（希
釈率Ｄ）は０．０１９６ｖ／ｖ　−ｈｒとし、一方殺菌
した１０χ（ｗ／ν）酢酸水溶液を無菌的に培養槽へ直
接（液体培地貯槽及び連結部を経由させることなく　）
　０．０００４ν／ν・ｈｒの供給速度（希釈率Ｄ）で
供給する　（結果的には培養槽への培地の供給速度は、
酢酸０．２χ（ｗ／ｖ）含有培地として０．０２ν／ｖ
−ｈｒとなるが、酢酸の添加場所が異なる）。

■　培養方法 前培養槽を終了した培養槽へ、前記■の方法により培地
を連続的に供給し、一方取り出し口より培地供給量と同
様の培養液を排出するようにし、攪拌数、通気量、培養
ｐＨ１培養温度などの培養条件は前記（１）と同様にし
て３０日間連続培養した。このとき雑菌数及びプロテア
ーゼ活性を経口的に測定した。その結果を第５表に示す
。

第５表 注：生細菌数 ×１０５個／　ｍＱ 第５表から、液体連続培養法においては、脂肪酸を直接
培養槽へ添加、含有させた場合、雑菌汚染が防止できず
、このためプロテアーゼ活性も低下して、本発明の目的
を遠戚することができないことがわかる。

実施例４ （１）前培養： 下記Ｍ１或の培地１００ｍｊ！を５００　ｍｌ容坂ロフ
ラスコに分注し、オートクレーブにて１２０°Ｃで１０
分間加熱殺菌した。該培地にレンチヌス・ニドデス（Ｌ
。

ｅｄｏｄｅｓ）　（ＩＦＯ６６５４）　（シイタケ）の
菌糸を接種し、２５′ＣでｌＯ日間坂口培養した（種培
養）。

一方、下記組成の培地２１を培養槽へ注入し、１２０°
Ｃで１０分間加熱殺菌した。

次いで該培地に前記種培養物を添加し、攪拌数４５０ｒ
ｐｍ、通気Ｎｏ、７ｖｖｍ、２５°Ｃの条件下で２０日
間培養した。

（培地組成） グルコース５χ（ｗ／ｖ）、ポリペプトン０．２５χ（
Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．２５χ（ｗ／ｖ）　、ＫＨｚ
ＰＯａ　Ｏ，ＩＸ（ｗ／ｖ）、Ｍｇ５Ｏａ−’／Ｈｚ０
０．０５Ｘ（ｗ／ｖ）、ＣａＣＩｚ・２Ｈｚ００．０５
χ（Ｗ／Ｖ）、ｐＨ５，０ （２）連続培養： 酢酸を０．２χ（−／ν）の濃度となるように添加する
以外は、前記（１）と同様の培地を液体培地貯槽に注入
し、１２０℃で１０分間加熱殺菌した。

前培養を終了した培養槽へ、該培地を連結部を介して供
給速度（希釈率Ｄ）　０．０１５ν／■・ｈｒで連続的
に供給し、一方墳養液をチューブポンプにて１時間毎に
、この供給培地量と同量取り出すようにし、また攪拌数
、通気量、培養温度などの培養条件は前記（１）と同様
にし、培養ｐＨを５　Ｎ−Ｎａ０１（で４．５になるよ
うに調整しながら４５日間連続培養した。

このときの雑菌数及び菌体Ｎ（乾物量）を経口的に求め
た。その結果を第６表に示す。

（本頁以下余白） 第６表 第６表から培養中の雑菌汚染は完全に防止され、目的と
する菌体が安定的に得られることがわかる。

実施例５ （１）前培養： 下記組成の培地２１を培養槽に注入し、１２０°Ｃで１
０分間加熱殺菌した。該培地にアスペルギルス・ソーヤ
（Ａ、５ｏｊａｅ）　（ＩＡＭ　２７０３）の胞子懸濁
液を接種して、通気Ｍ！　０．８ｖｖｍ、　Ｄ　Ｏが０
．５〜１．　Ｏｐｐｍとなるように攪拌を制御しつつ、
かつ培養ｐＨを５ＮＮ　ａ　Ｏｔｌ又は５Ｎ−ＨｇＳＯ
４を用いて６．３に調整しながら、３０°Ｃで３日間培
養した。

（培地組成） ポリペプトン２　Ｘ（ｗ／ｖ）、可溶性澱粉１．０χ（
Ｗ／Ｖ）、ＫＨｚＰＯｎ　Ｏ，５χ（ｗ／ｖ）、Ｍｇ５
０４４８ｚＯＯｏ−０５Ｘ（／ｖ）、酵母エキス０．０
３＄（ｗ／ｖ） （２）連続培養： 酢酸を０．５χ（御／ν）の濃度となるように添加する
以外は、前記（１）と同様の培地を液体培地貯槽に注入
し、１２０°Ｃで１０分間加熱殺菌した。

前培養を終了した培養槽へ、該培地を連結部を介して供
給速度（希釈率Ｄ）　０．０２ｖ／ｖ−ｈｒで連続的に
供給し、一方取り出し口より培地供給量と同量の培養液
を排出するようにし、通気量、ＤＯ１培養ｐＨ１培養温
度などの培養条件は前記（１）と同様にして３５日間連
続培養した。

このときの雑菌数及びα−ア邑クラーゼ活性経日的に測
定した。その結果を第７表に示す。

（本頁以下余白） 第７表 第７表から、培養中の雑菌汚染は完全に防止され、高活
性のα−アミラーゼ含有液が安定的に得られることがわ
かる。

実施例６ （］）前培養： 下記ｍ威の培地２１を培養槽に注入し、１２０°Ｃで１
０分間加熱殺菌した。該培地にアスペルギルス・オリゼ
ー（Ａ、ｏｒｙｚａｅ）　（ＡＴＣＣ２０３８６）の胞
子懸濁液を接種し、以下実施例５に記載したと同様にし
て前培養した。

（培地組成） 大豆粉１．　ＯＺ（ｗ／ｖ）、可溶性澱粉３，５χ（御
／ｖ）、醤油油１．　Ｏχ（ｗ／ｖ）、ＫＦ！２ＰＱ４
０．１χ（ｗ／ｖ）（２）連続培養： 酢酸ナトリウムを０．５２　（ｗ／ｖ）の濃度となるよ
うに添加する以外は、前記（１）と同様の培地を液体培
地貯槽に注入し、１２０°Ｃで１０分間加熱殺菌した。

以下実施例５の（２）に記載したと同様にして連続培養
した。

このときの雑菌数及びアミノペプチダーゼ活性を経口的
に測定した。その結果を第８表に示す。

なお、アミノペプチダーゼ活性の測定は次に示す石山ら
の方法（Ｔ、Ｉｓｈｉｙａｍａ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　６
３．７５　（１９６９））によった。

合成基質ロイシンーｐ−ニトロアニリドを基質とし、３
０°Ｃで５分間反応させたのち、０．　Ｉ　Ｎ−ＨＣｌ
で反応を止め、４１０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。

第８表 第８表から、培養中の雑菌汚染は完全に防止され、高活
性のアミノペプチダーゼ含有液が安定的に得られること
がわかる。

実施例７ アスペルギルス・ソーヤ（ＩＡＭ　２７０３）の代りに
アスペルギルス・オリゼー（ＩＡＭ　２６０９）とする
こと、及び酢酸を０．５χ（ｗ／ｖ）の濃度となるよう
に添加する代りにギ酸を０．２χ（ｗ／ｖ）の濃度とな
るように添加すること以外は、実施例５に記載したと同
様にして、３日間の前培養並びに３０日間の連続培養を
行なった。

このときの雑菌数及びプロテアーゼ活性を経口的に測定
した。その結果を第９表に示す。

第９表 第９表から、培養中の雑菌汚染は完全に防止され、高活
性のプロテアーゼ含有液が安定的に得られることがわか
る。

実施例８ アスペルギルス・ソーヤ（ＩＡＭ　２７０３）の代りに
アスペルギルス・オリゼー（ＩＡＭ　２６０９）とする
こと、及び酢酸を０．５χ（ｗ／ｖ）の濃度となるよう
に添加する代りに酪酸カルシウムを０．３χ（ｗ／ｖ）
の濃度となるように添加すること以外は、実施例５に記
載したと同様にして、３日間の前培養並びに３０日間の
連続培養を行なった。

このときの雑菌数及びプロテアーゼ活性を経口的に測定
した。その結果を第１０表に示す。

第１０表 第１０表から、 培養中の雑菌汚染は完全に防止さ れ、 高活性のプロテアーゼ含有液が安定的に得られることか
わかる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 液体培地貯槽と、連結部を介してこれと連通する培養槽
   とからなる液体連続培養装置を用いて糸状菌を培養する
   に際し、前記培地貯槽の液体培地に炭素数が６以下の脂
   肪酸又はその塩を０．０１〜３％（ｗ／ｖ）の濃度とな
   るように含有させることを特徴とする糸状菌の連続培養
   法。