JPH0367587A - 低フォスファターゼ活性のプロテアーゼ液の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、低フォスファターゼ活性のプロテアーゼ液の
製造方法に関するものであり、とりわけ糸状菌を培養し
て得られるフォスファターゼ活性、プロテアーゼ活性の
混在する溶液中でプロテアーゼ活性を失わずに、フォス
ファターゼ活性を失活させることのできるプロテアーゼ
液の製造方法に関するものである。

〔従来の技術〕

従来、プロテアーゼ溶液の製造法は、プロテアーゼ生産
能を有する糸状菌を固体培養法により増殖させ、その後
、水もしくは塩類を含む水溶液に浸してプロテアーゼ溶
液を得ていた。

この場合、プロテアーゼは、糸状菌体内外より液部分へ
溶解するため、菌体内に存在するフォスファターゼも同
時に液部分へ溶解してしまい、得られたプロテアーゼ液
は、高いフォスファターゼ活性（４，５１３／　ｌｌ１
１程度）を有していた。

〔発明が解決しようとする課題〕

このため、動物タンパクをこのプロテアーゼ液を用いて
分解すると、呈味成分としての核酸関連分質（ＩＭＦ、
　ＧＮＰなど）が、混在しているフォスファターゼによ
り分解されてしまい、調味液製造は、不可能であるとい
う問題点があった。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者は低フォスファターゼ活性のプロテア
ーゼ液の生産方法を開発すべく種々検討を重ねた結果、
プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を培養して得られた
プロテアーゼ含有液の９Ｈをアルカリ剤を添加してアル
カリ側に移動させ、かつ一定温度下で一定時間保持する
ことにより所期の目的が達成されることを見い出し本発
明を完成するに至った。

すなわち、本発明は糸状菌を培養して得られたプロテア
ーゼ含有液にアルカリ剤を添加して、前記含有液のｐＨ
を上昇させるとともに、３０〜５０°Ｃに一定時間保持
することを特徴とする低フォスファターゼ活性のプロテ
アーゼ液の製造方法である。

本発明で言う低フォスファターゼ活性とは０．３ｕ／Ｉ
ｄ以下、好ましくは０．１０／ＩＩＩＮ以下のものを指
す。

フォスファターゼは酸性フォスファターゼ、プロテアー
ゼは中性、アルカリプロテアーゼである。

とりわけ本発明では酸性フォスファターゼを特に効果的
に失活させることができる。即ち、酸性フォスファター
ゼ活性とアルカリ、中性両プロテアーゼ活性では、酵素
タンパク質として変性するｐＨの領域が異なり、酸性フ
ォスファターゼはｐＨ６，５以上で変性による失活がは
じまる。両プロテアーゼは、ｐＨ７，５でも変性による
失活はおこらない。そこで、各酵素タンパク質変性領域
の違いを利用して、フォスファターゼ活性だけを失活さ
せるものである。

本発明において用いられる微生物は、アスペルギルス属
、ペニシリウム属、ムコール属、またはリゾプス属等に
属するプロテアーゼ生産能を有する糸状菌であり、具体
的にはアスペルギルス・ソーヤ（ＩＡＭ　２７０３）、
アスペルギルス・ソーヤ（ＩＡＭ２６３１）、アスペル
ギルス・オリゼー（ＩＡＭ　２６０９）、アスペルギル
ス・オリゼー（ＩＦｏ　４１７６）、アスペルギルス・
タマリ（ＩＡＭ　２１５６）、ペニシリウム・クリソゲ
ナム（ＨＵＴ　４０１９）、ペニシリウム・ルテウム（
ＡＨＵ　８０２２）、ムＤ−ルーラｔ！モサス（ＡＨＵ
　６００２）、ムコール・ヒエマリス（ＩＩＵＴ　１１
３１）、リゾープス・フォルモサエンシス（ＩＦＯ４７
３２）、リゾープス・ジャバニカス（ＩＦＯ５４４１）
などが挙げられる。

本発明に用いられるプロテアーゼ生産能を有する糸状菌
は雑菌汚染防止の観点から耐塩性を有するものであるこ
とが望ましい（耐塩性の目安としては食塩５％以上、好
ましくは食塩１０％以上である）。

本発明に使用する培地としては、従来プロテアーゼ生産
能を有する糸状菌の培養法に於いて用いられる液体又は
固体培地であれば何れを用いても良い。

液体培地の場合は、炭素源としては油脂、グルコース、
可能性澱粉、シュクロース、デキストリン、セルロース
、グリセリン、賊等、窒素源としては例えば脱脂大豆、
大豆粉、ペプトン、肉エキス、ヌカ、カゼイン、ポリペ
プトン、グルテン等、無機塩としては、例えば各種リン
酸塩、硫酸塩、塩酸塩等が用いられ、必要によりビタミ
ン類、核酸等を適宜加えた液体培地が用いられる。

とりわけ、本発明のように、低フォスファターゼ活性の
プロテアーゼ含有液を製造するという観点からは培養液
中のフォスファターゼ活性自体が低いことが望ましい。

この意味で、培地の炭素源として油脂を用いると、フォ
スファターゼ活性の低い培養液が得られるので好ましい
、油脂としては醤油油、オリーブ油、大豆油、魚油等が
挙げら。

れる。

油脂の添加量は任意で良く、通常１．５〜５％（−／Ｖ
）程度である。

一方、固体培地の場合は、通常の培地、例えば脱脂大豆
、大豆、小麦、憩などから選ばれる少なくとも１種から
戒る培地が用いられる。

糸状菌の培養法としては通常の連続培養法、流加培養法
もしくは回分培養法の何れを用いても良いが、特に連続
培養法を採用すれば、培養効率を向上させる上で有効で
ある。

又、前記プロテアーゼ生産能を有する糸状菌の培養条件
としては、使用する菌株、培地組成等により多少異なる
が、通常培養温度は２５〜４０°Ｃである。液体培養の
場合では培地のｐｔｉは５．０〜７．０種度、通気量は
０．１〜２ν、Ｖ、Ｍ、程度である。

なお、このとき培地のｐＨを６．５以下に調整して培養
すると、プロテアーゼ生産効率がもっとも良くなり、好
ましい。

一方、固体培養にて得られる培養物よりプロテアーゼ含
有液を得るには、常法たとえば水もしくは塩類を含む水
溶液に固体培養物を浸漬する等の方法が用いられる。

このようにして糸状菌を培養して得られたプロテアーゼ
を含む培養液はそのまま本発明の処理を施してもよいが
、菌体からのフォスファターゼの溶出を防ぐために、濾
過や膜分離等の固液分離手段により、予め菌体を分離し
ておく方が好ましい。

このようなプロテアーゼ含有液にアルカリ剤を加えて含
有液のｐＨをアルカリ側に移動する。用いられるアルカ
リ剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸
化カルシウム等の通常用いられるアルカリ剤が例示され
る。

含有液のｐＨをアルカリ側に移動させる程度としては、
ｐＨ０，１以上、好ましくは０．５以上とする。

一方、プロテアーゼ含有液の温度条件は３０〜５０°Ｃ
１好ましくは３０〜４０°Ｃとする。この範囲内であれ
ば一定時間中に温度変化があってもさしつかえない。

プロテアーゼ含有液を加熱するだけではフォスファター
ゼとともにプロテアーゼも失活するが、ｐＨをアルカリ
側に移動させることにより、プロテアーゼの失活よりも
フォスファターゼの失活をはるかに大きくすることがで
きる。

作用時間は、ｐＨ，温度によって決定され、ｐＨが高い
ほど、そして温度も高いほど短時間でフォスファターゼ
を失活できる。

例えば、ｐＨ７，５に調節した場合、４０°Ｃ以上では
５分以上でフォスファターゼは失活する。また、３５°
Ｃでは４時間以上で失活する。

一方、ｐＨを６．５に調節した場合、４０°Ｃでは２０
時間以上、４５°Ｃでは２時間以上で失活する。詳細は
後述のとおりである。

こうして、低フォスファターゼ活性のプロテアーゼ含有
液が得られるが、必要に応じてフォスファターゼ失活後
、酸、例えば塩酸、硫酸等を用いてプロテアーゼ含有液
のＤＨを調節する。

〔作　用〕

プロテアーゼとフォスファターゼを含む液にアルカリ剤
を添加してｐＨをアルカリ側に移動させ、かつ３０〜５
０°Ｃに維持することにより、プロテアーゼの失活より
もフォスファターゼの失活をはるかに大きくすることが
できる。

以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する
。

なお、以下の実施例で用いられる％はＷ／Ｖ％である。

また酵素活性測定法は次のとおりである。

１）プロテアーゼ活性の測定 アンソン−荻原変法によった（但し、反応中のｐｔｒは
７．０である）。

２）フォスファターゼ活性の測定 基質として、Ｐ−ニトロフェルリン酸２ナトリウム（６
水和物）　０．７４２ｇをＭ／１０酢酸Ｂｕｆｆｅｒ（
ｐＨ４，５）に溶解し、１００ｍｆｆ１に定容したもの
を使用した。

酵素液１　ｍｌを基￥ｔＩＩＩｌに加え、３０’Ｃ１１
ｏ分反応させた後、ＩＭ−Ｎａ、ＣＯ，を５　ｍｌ加え
た反応を停止、発色させ、Ｏｎ　４００ｎｍにて測定し
た。１分間に１μｍｏｌの基質を分解するスピードを１
ユニツト（Ｕ）　とした。

〔実施例〕

実施例１ アスペルギルス・オリゼー（ｒＡＭ　２６０９）を用い
て温度３０’Ｃ，ｐＨ６，０、希釈率０．０２（１／ｈ
ｒ）で連続液体培養した。培地成分は大豆粉２．４％、
醤油油３．０％、小麦粉ｉ、ｏ％、ＫＨｚＰＯ４ｏ、ｔ
％、ＮａＣ１１０％　とした、この連続培養によって得
られた培養液の菌体固形分をＮα２濾祇で濾別し、液体
成分のみとした濾液（ｐ　Ｈ６，０）　（７）プロテア
ーゼ活性は１８００ＰＵ／ｄ、酸性フォスファターゼ活
性はＩｌｌ／ａｊであった。

当該培養液を水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６，５に調
整し、４０’Ｃに保持した結果、約２０時間経過後、フ
ォスファターゼ活性は失活しく０．０２以下）、プロテ
アーゼ活性は１００ＯＰＩＩ／ｍｆであった。（第１図
）これから、本発明方法においては容易に酸性フォスフ
ァターゼ活性を失活させ得ることがわかる。

実施例２ 実施例１で得られたプロテアーゼ含有液を３５℃に維持
し、その９Ｈを塩酸、及び水酸化ナトリウムを用いてｐ
Ｈを５〜７．５に変動させ、各場合についての失活速度
を求めた。

失活速度は縦軸に酵素活性、横軸に時間をとったとき、
その傾きの大きさを表したものである。

言い換えると酵素の失活の経時変化をＹ＝ｂｅ−”とし
たときのａで示されるものである（Ｙは酵素活性、Ｘは
時間を表す）。結果を第２図に示す。

これから培養液のｐＨをアルカリ側に移動させると、フ
ォスファターゼ活性が急激に低下することがわかる。そ
して、そのｐＨの変動中が０．５以上となると顕著とな
ることもわかる。

実施例３ 実施例１で得られたプロテアーゼ含有液をｐＨ７，５に
調整し、その温度を３０〜４５°Ｃに変化させた場合の
失活速度を求めた。結果を第３図に示す。

これかられかるように高温になるほどフォスファターゼ
活性の失活速度は大きくなるが、同時にプロテアーゼ活
性の失活速度も上昇してくるので、３０〜４０°Ｃの間
に維持することが好ましい。

比較例 実施例１で得られたプロテアーゼ含有液の温度のみ変動
させた他は実施例２と同様にして失活速度を求めた。結
果を第４図に示す。

これから明らかなように、温度を変化させたのみではプ
ロテアーゼもフォスファターゼもほぼ同様に失活するこ
とがわかる。

実施例４ 実施例１で得られたプロテアーゼ含有液のｐＨを６．５
又は７．５に調整し、かつ、温度を３０〜５０℃に変化
させたとき、含有液中のフォスファターゼ活性が０．Ｉ
Ｕ／ｌｌ！以下となるに要する時間を調べた。

結果を第５図に示す。

〔発明の効果〕

本発明によれば、プロテアーゼとフォスファターゼ含有
液のｐＨをアルカリ側に移し、かつ、温度を３０〜５０
°Ｃに維持するだけで容易に低フォスファターゼ活性の
プロテアーゼ液を製造することができる。

その結果、動物タンパク質など核酸関連物質を呈味成分
とするタンパク質の分解に、製剤プロテアーゼより安価
なプロテアーゼ液を用いることが可能となる利点がある
。

【図面の簡単な説明】

第１図は培養液を固液分離後、ｐＨ６，５，４０”Ｃに
一定時間保持したときのプロテアーゼ、フォスファター
ゼの活性変化を示す図、第２図及び第３図は温度または
ｐＨを変化させたときのプロテアーゼ、フォスファター
ゼの失活速度を示す図、第４図は培養液を固液分離後、
温度のみを変化させた場合のプロテアーゼ、フォスファ
ターゼの失活速度を示す図、第５図は実施例４の結果を
示す図である。 第　　１ 図 ・フォスフ７ターゼ　　０プロテアーゼ第　　２ｇＡ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 糸状菌を培養して得られたプロテアーゼ含有液にアルカ
   リ剤を添加して、前記含有液のｐＨを上昇させるととも
   に、３０〜５０℃に一定時間保持することを特徴とする
   低フォスファターゼ活性のプロテアーゼ液の製造方法。