JPS58879B2

JPS58879B2 - クエン酸の製造法

Info

Publication number: JPS58879B2
Application number: JP51057924A
Authority: JP
Inventors: 吉田忠; 七種茂; 大森大陸; 中西透; 木暮正祐
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1976-05-21
Filing date: 1976-05-21
Publication date: 1983-01-08
Also published as: JPS52143273A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は微生物を利用して発酵生産するに際し発酵原料
として、糖類を含有する天然物を殺菌、多孔性化および
顆粒化したものを使用することを特徴とする発酵生産法
に関する。

従来、固体培養法による有用な発酵生産物の製造法には
バット、麹ふた等にデン粉粕、米糠などの発酵原料を薄
層になるように広げて、菌を接種し、培養を行う方法（
特公昭３７−６３４１号、特公昭４１−１６５５５号、
特公昭４０−６３９６号、特公昭４３−２０７０８号等
）、デン粉粕などの発酵原料を積みあげて発酵を行う堆
積培養法（特公昭２９−４１９６号、特公昭３７−３５
９７号等）などがある。

これらの従来法はいずれも発酵開始に先立ち、発酵原料
を蒸煮により、α化および殺菌するものである。

しかしながら蒸煮によっては充分な殺菌が期し難いこと
や、また蒸煮後冷却時における雑菌混入等のため、雑菌
の繁殖による目的発酵生産物の収率低下、汚染等がしば
しば問題となっていた。

また堆積培養法は他の方法に比べ、床面積を要しないと
いう点で優れているが、従来法による場合には、発酵中
、自重による沈下のため空気の流通が悪くなり、温度が
上昇して、目的発酵生産物の収率低下を起しやすいとい
う問題点があった。

本発明者らは、従来の固形培養法における上記のごとき
種々の問題点を解決すべく種々検討した結果、糖類を含
有する天然物を、例えば加熱加圧の可能なスクリュー型
押し出し機などにより、加工して得られる殺菌、多孔性
化および顆粒化したものを発酵原料としてたとえば、固
形培養するときは従来の固形培養における問題点を解決
できるとともに、種々の著しい効果をあげることができ
ることを見い出し、さらに研究をすすめて本発明を完成
した。

次に本発明を、殺菌、多孔性化および顆粒化した糖類を
含有する天然物を得るまでの工程と得られた該加工天然
物を用いて培養を行う工程に分けて、さらに詳しく説明
する。

糖類を含有する天然物を殺菌、多孔性化および顆粒化し
て発酵原料を製造する工程糖類を含有する天然物としてはクビオカデン粉粕、米糠
、小麦皺、コーンスターチ、小麦、米等デン粉を含有す
る天然物、これらの混合物、またはこれらのデン粉を含
有する天然物とグルコース、フラクトース、ショ糖、麦
芽糖、糖蜜、廃糖蜜等の単糖類、少糖類もしくはこれら
を含有する天然物との混合物が好適に用いられる。

しかしながら上記のごとき単糖類、少糖類もしくはこれ
らを含有する天然物とおがくず等の担体との混合物も使
用可能である。

上記において混合物を使用する場合、多孔質の顆粒状物
を得るためにはデン粉を含有する天然物同志を混合する
場合は比率はいずれでもよいが、デン粉を含有する天然
物と単糖類、少糖類もしくはこれらを含有する天然物と
を混合する場合は前者に対し後者を乾燥重量で１〜３倍
使用するのがよい。

上記のごとき糖類を含有する天然物を殺菌、多孔性化お
よび顆粒化する手段としては、例えば該天然物を加熱加
圧の可能なスクリュー型押し出し機に通して処理する方
法がある。

すなわち糖類を含有する天然物に水もしくは該天然物以
外の種々の栄養を含有する水溶液を加えて、水分含量を
２０〜５０％（重量／重量）に調整し、該押し出し機内
の温度を１００〜１８０℃の範囲に適当な時間維持し、
該押し出し機のノズルより該天然物を常圧下に噴出せし
め、該噴出物を切断して多孔性の顆粒状物質を得ること
ができる。

ここで種々の栄養とは発酵生産にあたって通常用いられ
る窒素源、無機物、微量栄養素等を意味する。

窒素源としてはアンモニア、塩化アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム等の有機あるいは無機アンモニウム塩
、尿素、アミノ酸等の窒素含有化合物、ペプトン、ＮＺ
−アミン（カゼインの酵素加水分解物の商品名、シェフ
イールド化学会社製）、肉エキス、コーンスターブリカ
ー、カゼイン加水分解物、蛹加水分解物、ソイシュミー
ルおよびその加水分解物、ソイピーン・ミールおよびそ
の加水分解物等の含窒素天然物などが用いられる。

前記糖類を含有する天然物中には小麦皺、米糠等それ自
体窒素源の用もかねるものもある。

無機物としてはリン酸水素二カリウム、リン酸二水素カ
リウム、硫酸マグネシュウム、塩化ナトリウム、硫酸第
一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。

その細微生物が生育に栄養素を必要とする場合には該栄
養源も用いる。

加熱加圧の可能なスクリュー型押し出し機は第１〜５図
に一例を示しであるが、商品化されているものとしては
エクストルーダー（ｅｘｔｒｕｄｅｒ）〔ウエンガー（
ｗｅｎｇｅｒ）社製、米国〕などがある。

以下第１〜５図に従って説明する。

糖類を含有する天然物に水もしくは種々の栄養を含有す
る水溶液を加えて水分含量を２０〜５０％に調整して、
供給口１から連続的に供給し、スクリュー２より順次機
内に送り込む。

また糖類を含有する天然物を供給口１から連続的に供給
し、スクリュー２により順次機内に送り込み、ついで供
給口３から水分含量が２０〜５０％になるように水もし
くは種々の栄養を含有する水溶液を供給する。

送り込まれた混合物はギヤーボックス１１およびスクリ
ュー２により適度に圧縮、捏和されなからアゲブタ−４
へ達し、圧力が上昇するとともに、品温も徐々に上昇す
る。

シリンダー５とアダプター４とノズルホルダー６に、ス
チームヒーター７が設けてあり、圧力の上昇とヒーター
の加熱による品温が１００℃〜１８０℃になるように機
内の温度を調節する。

デン粉を含有する天然物を用いる場合、品温が１００℃
未満ではデン粉のα化が充分でなく、また、１８０℃を
越えると得られる製品が着色するという難点がある。

糖蜜とオガ屑などの担体との組合せのようにデン粉を含
有する天然物を使用しない場合にも、１００℃〜１８０
℃の品温とするのがよい。

該機内の温度（１００℃〜１８０℃）は、約５〜２０秒
維持することにより、糖類を主成分とする天然物はシリ
ンダー５、アダプター４、ノズルホルダー６内において
デン粉を主成分とする原料の場合完全にα化される。

ついで、ダイ８の０．５〜５ｍｍ程度の開孔ノズル９ま
たは０．５〜２ｍｍＸ２０〜３０ｍｍ程度の長方形のノ
ズル１０から押し出し、回転切断刃１２により切断され
る。

かくして、多孔質の顆粒状物質が得られる。

この顆粒状物質は殺菌されているとともに、原料がデン
粉を含有する天然物の場合には、これがα化されている
ので、適当量の水または種々の栄養を含有する水溶液を
含ませることにより、直ちに発酵原料として使用できる
。

糖類を含有する天然物を殺菌、多孔性化および顆粒化し
たものを発酵原料として培養を行う工程糖類を含有する
天然物を殺菌、多孔性化および顆粒化したものは液体培
養の発酵原料としても用いることができるが、固体培養
の発酵原料として用いるのが好ましい。

以下固体培養の場合について述べる。

該発酵原料に水または該天然物以外の種々の栄養を含有
する水溶液を好ましくは水分含量が４０〜８０％になる
ように含ませたのち、種々の有益な発酵生産物、例えば
クエン酸や酵素類等を生産する菌を接種し、培養を行う
。

クエン酸生産菌としては通常使用されるクエン酸生産菌
、例えばアスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・ピリ
ド等に属するクエン酸生産菌が使用しうる。

酵素類を生産しうる菌としては通常使用される酵素類の
生産菌、例えばアスペルギルス・オリーゼ、アスペルギ
ルス・ニガー等に属するアミラーゼ生産菌、バチルス・
ズブチリスに属するプロテアーゼ生産菌、アスペルギル
ス・ニガーに属するヘミセルラーゼ生産菌等が使用しう
る。

培養はバット上における通常の固形培養のほかに、該発
酵原料を積み重ねて培養を行うこともできる。

この場合の層高としては３０ｃｍぐらいまで可能であり
、酸素の供給、蒸発水分の補給などのため湿潤空気を供
給するのがよい。

培養は２５〜４５℃で行うことにより５〜７日で培養物
中に著量のクエン酸、酵素類等が生成蓄積する。

培養は雑菌の混入しない条件下で行ってもよいが、それ
は必須条件ではない。

培養終了後、培養物に水を加え、圧搾して抽出液を得る
。

クエン酸発酵の場合にはこの抽出液から常法に従ってク
エン酸カルシウムあるいはクエン酸・１含氷結晶として
クエン酸を回収する。

すなわち、この抽出液に石灰乳を加えて、クエン酸カル
シウムを得、これを硫酸で溶解し、生成する石こうを濾
別した濾液に活性炭を加えて脱色したＰ液に、さらに石
灰乳を加えてクエン酸カルシウムを生成させたのち、こ
れを濾別するのか、あるいは脱色後の濾液を濃縮して、
クエン酸・１含水物の結晶を得る。

酵素の発酵生産の場合は、培養物の圧搾抽出液を酵素活
性に影響を与えない温度で、好ましくは４０℃以下で減
圧下に濃縮し、濃縮物を硫酸アンモニウムにより塩析し
て酵素を沈殿せしめ、これを濾別して粗酵素を得る。

粗酵素はリン酸バッファー溶液等に溶解し、分子節、吸
着樹脂などに通塔して、さらに精製する。

その他の通常行われる精製も可能である。

本発明によってもたらされる利点には次のごときものが
ある。

（１）糖類を含有する天然物の殺菌、および該天然物と
してデン粉を含有する天然物を使用する場合の原料のα
化が完全に行われるため、雑菌の繁殖およびα化の不完
全化による目的発酵生産物の収率低下、および目的発酵
生産物の汚染の恐れがない。

（２）発酵原料の顆粒状物は多孔性で通気性がよく培養
中、自重による沈下もあまりなく、従って通風による培
養中の温度コントロールが容易である。

（３）発酵原料の顆粒状物を用いて培養を行う際には、
蒸煮工程が不要なので簡単に培養に入ることができる。

（４）発酵原料の顆粒状物質を固形培養に好適な任意の
大きさ、形態に整形でき、通常のバットによる培養のほ
か、層高を高くして培養することが可能である。

また酒造用機械細根による培養も可能となる。

（５）加水量を随意に調節できるため、発酵原料に培養
環境に応じた適当な水分を含ませることが容易になり、
固形培養のほか固形・表面両培養の折衷培養法が可能と
なる。

（６）コーンスターチあるいは糖蜜などのような従来で
は整形され難い天然物でも、この方法によれば顆粒化さ
れるので、固形培養が可能となり、かくして使用可能な
発酵原料の範囲が拡大される。

つぎに本発明の実施例について説明する。

実施例１水分１２．５％、デン粉価８１％のコンスターチ１５．
２ｋｇと水分１１．７％、デン粉価５４．４％の小麦皺
１０．３ｋｇを加水量２８１／ｈｒの速度で捏和圧入し
、温度１３．５℃、押し出し量３．３ｋｇ／分、ナイフ
回転６２０ｒｐｍで切断し、α化率９７％、水分４％、
比容６．７の顆粒状物質を得た。

この顆粒状物質４ｋｇに水分含量８０％になるように水
を加え、クエン酸生産能を有するアスペルギルス・ニガ
ーＫＹ１５６３株（微工研菌寄第３５２３号）の胞子を
接種し、たて４０ｃｍ、よこ６０Ｃｍ、高さ６ｃｍのト
レイに高さ６ｃｍになるように積みあげ、約３０℃で固
形培養を行なったところ、６日目に培養物中にクエン酸
・１含水物９．８％を生成していた。

なおりエン酸の固形培養の実施例全般を通じて副生有機
酸をほとんど認めず、クエン酸定量は酸部定法によった
。

また本培養物５ｋｇに温水を加え、圧搾して抽出液を得
、これからクエン酸石灰塩、純度９５．８％の結晶０．
５５ｋｇを収得した。

実施例２水分１３．２％、デン粉価３１．３％の米糠６ｋｇと糖
分５２．４％の糖蜜１９．３ｋｇを加水量３８１／ｈｒ
の速度で捏和圧入し、温度１４０℃、押し出し量３．６
ｋｇ１分、ナイフ回転６２０ｒｐｍで切断し、α化率９
６．５％、水分６．８％、比容３．２の顆粒状物質を得
た。

この顆粒状物質２０ｇを直径９ｃｍのシャーレにとり、
水分含量６０％、硝酸アンモニウム濃度０．１６％とな
るように硝酸アンモニウム水溶液を加え、クエン酸生産
能を有するトリコデルマ・ピリドＡＴＣＣ１３２３４株
の胞子を接種し、約３０℃で固形培養を行なったところ
、６日目に培養物中にクエン酸・１含水物５．８係を生
成していた。

実施例３水分１３．２％、デン粉価３１，３％の米糠５ｋｇと水
分１１．５％、デン粉価６０．７％のクピオカ澱粉粕２
０ｋｇを加水量５０１／ｈｒの速度で捏和圧入し、温度
１６０℃、押し出し量３．０ｋｇ１分、ナイフ回転６０
０ｒｐｍで切断し、α化率９１．０％、水分８％、比容
２．１の顆粒状物質を得た。

（１）この顆粒状物質１５５ｇに水分５５％となるよう
に水を加え、クエン酸生産能を有するアスペルギルス・
ニガーＫＹ１５４７株（微工研菌寄第３５２４号）の胞
子を接種し、直径５．５ｃｍ。

高さ４５Ｃｍのシリンダー中に高さ２５ｃｍになるよう
積みあげて、ビニルパイプを通して堆積層の下部から湿
潤空気を通じつつ、約３３℃で固形培養を行なったとこ
ろ、６日目に培養物中にクエン酸・１含水物１６．９％
を生成していた。

（２）この顆粒状物質１００ｇに水分６５％となるよう
に水を加え、クエン酸生産能を有するアスペルギルス・
ニガーＫＹ１５４７株の胞子を接種し、直径５．５Ｃｍ
、高さ４５Ｃｍのシリンダー中に高さ２０Ｃｍになるよ
うに積みあげて、ビニルパイプを通して堆積層の下部か
ら湿潤空気を通じつつ、約３１℃で固形培養を行なった
ところ、６日目に培養物中にクエン酸・１含水物１４．
３％を生成していた。

（３）この顆粒状物質２０ｇを直径９ｃｍのシャーレに
とり、水分７０％となるように水を加え、ヘミセルラー
ゼ生産能を有するアスペルギルス・ニガー・ヴアンテイ
ーグヘム■ＦＯ−４０３４の胞子を接種し、約３５℃で
６日間固形培養を行ない、培養物抽出液についてヘミセ
ルラーゼ力価を測定した。

すなわち稲ワラから分離したアラビノキシランを基質と
して４０℃で３０分間反応を行ない、生成した還元糖を
キジローズ■を１単位として表示すれば、３１５単位を
得た。

（４）この顆粒状物質４ｋｇに水分含量６０％になるよ
うに水を加え、クエン酸生産能を有するアスペルギルス
・ニガーＫＹ１８１１株（微工研菌寄第３５２５号）の
胞子を接種し、たて４０ｃｍ。

よこ６０ｃｍ、高さ６Ｃｍのトレイに高さ６ｃｍになる
ように積みあげ、約３５℃で固形培養を行ったところ、
７日目に培養物中にクエン酸・１含水物１６．１％を生
成していた。

実施例４水分１３，２％、デン粉価３１．３％の米糠４０ｋｇと
水分１１．７％、デン粉価５４．４％の小麦皺２０ｋｇ
に加水量５５１／ｈｒの速度で捏和圧入し、温度１５０
℃、押し出し量３．５ｋｇ／分、ナイフ回転６２０ｒｐ
ｍで切断し、α化率９７．３％、水分４．８％、比容３
．１の顆粒状物質を得た。

この顆粒状物質２０ｇを直径９Ｃｍのシャーレにとり、
水分４０％になるように水を加え、αアミラーゼ生産能
を有するアスペルギルス・オリーゼＫＹ８４（微工研菌
寄第３５２６号）の胞子を接種し、約３０℃で４日間固
形培養を行ない、培養物抽出液のαアミラーゼ力価を測
定した。

すなわち０．５％可溶性デン粉溶液２ｍｌに培養物抽出
液の希釈液１ｍｌを加え、４０℃で反応を行ない、培養
物１ｇあたり１分間に加水分解された可溶性デン粉７１
■の値を得た。

実施例５水分１２．６％、デン粉価６４．８％の米糠２０ｋｇに
加水量４０１／ｈｒの速度で捏和圧入し、温度１４５℃
、押し出し量３．７ｋｇ／分、ナイフ回転６２０ｒｐｍ
で切断し、α化率９７．６％、水分７．２％、比容２．
６の顆粒状物質を得た。

（１）この顆粒状物質２０ｇを直径９Ｃｍのシャーレに
とり、水分７０％になるように水を加え、糖化酵素生産
能を有するアスペルギルス・ニガーＫＹ１８１１株（微
工研菌寄第３５２５号）の胞子を接種し、約３２℃で５
日間固形培養を行ない、培養物抽出液の糖化力を測定し
た。

すなわち２％可溶性デン粉溶液１０ｍに培養物抽出液１
ｍｌを加え、５０℃で１時間反応を行ない、生成したブ
ドウ糖■をもって酵素力価とすると、培養物乾燥物１ｇ
あたり１００００の力価を得た。

（２）この顆粒状物質２０ｇを直径９ｃｍのシャーレに
とり、水分７０％になるように水を加え、アルカリプロ
テアーゼ生産能を有するバチルス・ズブチリスＡＴＣＣ
２１４１６を接種し、約３０℃で５日間固形培養を行な
い、培養物抽出液のアルカリプロテアーゼ力価を測定し
た。

すなわちカゼインを基質として、３０℃で反応を行ない
、１分間にチロシン１μｇに相当するトリクロロ酢酸可
溶性のフォーリン試薬呈色物を生成させる酵素量を１単
位とすれば、培養物ＩＩあたり９８００単位が得られた
。

【図面の簡単な説明】

第１図は加熱加圧のできるスクリュー型押し出し機の断
面図を示し、第２図、第４図はノズルの平面図を示し、
第３図、第５図は、矢視方向に見た場合のノズルの断面
図を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１クエン酸を生産する能力を有する微生物を、スクリ
ュー型押し出し機を用い、１００−１８０℃で処理する
ことによって得られる殺菌、多孔性化および顆粒化され
た糖類を含む培地に固形培養して、培養物中にクエン酸
を生成蓄積させ、該培養物からクエン酸を採取すること
を特徴とするクエン酸の製造法。