JPH03172170A - 細胞の培養方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ｌ卒釆１の利川分封） 本発明は、透析膜を内蔵する培養液の処ｆｉ１部分を持
つ細胞の袷養装置及びそれを川いた墳養方法であっ−（
、史に，洋し〈は、速折に使川ずる』，ｌ；礎，ｔＦτ
養液に酸ｌ５や炭酸ガス等をイ』（給することによって
、培養細胞に酸ぶやＪ：Ａ酸ガス等を供給する’Ａ　Ｉ
Ｉ”ｌ：及びｈ法に関する。

（従來技術とその問題点） 動物は牛４ｊのＬｂに呼吸により絶えず酸ふをＩ■取し
ている。このＰｅｔ素摂取１１１が不足すると酸素欠乏
により意識喪失や、場合によっては命に関わることは白
川である。動物細胞の培養においても酸素の供給は必要
である。動物細胞の人ｌｌｔ培養では、１７−に珀養細
胞のａＬ　４ｆ−たけでなく、倍養細胞にとってト分な
１．１の酸素をイ」（給することが、大２１ｔ　１：’
？養の１１的である却１胞山来の神々の４ｆ川物？１の
牛ｌπ性をｌ：’＋ｌい状態で組持１−るためにも１■
要である。このため幼牛よ〈酸ふを供給コＩ’るために
柿ηの［夫が成されている。

動物細胞の培養で使用されるほとんどの培養液は、気相
の二二酸化炭素濃度によって培養液のｐＨを瓜通に紛持
ずるよう調整されており、酸素の供給と共に炭酸ガス１
！５境の維持もまた動物細胞の培五では必セである。

現７１使用されている酸素や二酸化炭素算を含むカス類
〈通常人気に二酸化炭４．を加えたもの、あるいはさら
に酸ふを加え、酸Ｊ６濃度を高めたものが仙川される）
の供給法には、例えばタンク培養では中純にタンク上部
のむ相にガス類を吹き込む、培養液面で交換する液面交
換法や、タンク内の培五液中に直接ガス穎を吹き込むハ
ブリング法、あるいはタンク内に設置したガス透過機能
を持つ神々のぷ材からなる＋＋ｑによりタンク内を珀養
渣と気相とに１メ切り、１１１コを通してガス文換ずる
力７大＝４′かある。

しかしながら液面文換法では ■気相との接触而梢が限られ、中．｛１７時間ゝｌ′＋
りの文換−ｌｉｔに限界があること、 ■培五液は細胞を浮遊させるため穏やかに攪拌さ？てい
るかこの攪打による剪断力が細胞に対して恕影■をりえ
るため、攪１１速皮は限られ、よって｝ＨＴ五渣令体へ
の溶イｔ力スの拡散には限界かあること、 ■１ハ五液人而にｌｌ′Ｉ核ガス和を供給するためこの
ガス＋ｎからの雑閑のＴＩ；染の社険性があること、パ
ブリング法では （１）　ｌｒＸＡ液中に含まれる蛋白Ｔ′ｉによって培
養液面に多くの気泡か牛し、この気泡の成長により、蓋
等タンクＩ　ｉｌｌｓのタンク外部との拌統部か濡れ、
それに起１／Ｊ　コＩ−る雑１￥１？ｆ，染が発’ｋず
る厄険付かあること、 ■倍五液中を」−］γりずる気泡は培養細胞に対して思
一肥冑を！ｊ，えること、 ■液面文換法と１１リ様、培養液表面に直接ガス類を供
給１−るため、このガス角からのＨ１￥１の７５染の危
険Ｐ［かあること， タンク内にガス交換１漠を設１＋’．ｆする方法では■
久置がＮ　’２８になること、 ■タンク上８養では剪断力の問題よりＷｉ打方法が重要
であるがタンク内にガス交換膜などを設置することはこ
のＷｌ　ｊ’Ｐによる袷養液の流れを乱す原囚になり問
題であること、などの間瑚点かある。

さらに人ｈ；培養法としては、例えば中空系や不縄４ｉ
　”．ダを充填した培養チャンバーに、別に設けたＪＲ
λ液溜よりボンブなとの送液手段によって培養液を強制
的に迭液することによって動物細胞を高密坦にｊｎ　ｋ
する方法がある（以下単に高密度培養と称す〉。この高
密皮培養ではガス交換法としてはＦ記タンク培養で用い
られる方法を培養液溜に対して行うほかに、ボンブなど
の送液手段による１バ養１ｌＫ溜から、細胞が高密度に
生イｆする培養チャンバーへの培養液の送液が不何欠で
あるか、この１１，ｉ給養液溜から袷養チャンバーの途
中に設けたカス透過性素材によってガス交換する方法も
行われている。

この晶密度培養においても、Ｉｎ養液溜において用いら
れるガス交換法では、剪断力ｋｑの細胞への１２ｇを除
き１−・記タンク培養法と同様の問題点が在７１ずる。

又培長液而から培養チャンバーの途中に説けたガス透過
＋ｊ［オ８材によってガス交換する方法は優れたｈ法で
あるが、後述する培養液の透析装置を，没ける場介、令
体の構成はｒＭＨになり、ＩＩ．つ１分なカス文換をす
るための表而梢を確保するためにカス文換部分での培養
液！ｌｔは増加し、培養器と梠養液溜以外の部分を占め
る培養液ｎｔ　（ゲットボリューム）か増加してしまい
、例えば培養によりある蛋白？’［を牛産しようとする
場合、実際の培養液Ｉ＋１にたいして同収できる培養液
！ｉｔは少なくなり、問題である。

本允明者は、先に特願平ｌ−　１０　９　１　ｔ　９　
ｙ＞（以ト’　ｌｌ’−に九鮪発明という〉において、
透析膜を内蔵する培養液処理益を持つ細胞の培養装置，
及びそれを用いた培養万法を開発した。上記先頼発明の
費旨は下記のとおりのものである。

■内部に細胞を保持し、細胞の成育空間内に機械的な培
養液の均質化ｆ段を持たない培養器に、培養液を循環さ
せつつ細胞を培養し、この循環培養液を透析１１Ｑを内
蔵する培養液処理番の第１の空間に循環し、一万、該透
析膜で笛１の空間と隔てられたｉ２の窄間には基礎培養
液を循環させることを特徴とする細胞の培養方法。

■内部に細胞を保持し、細胞の成育空間内に機械的な倍
養液の均首化−ｒ段を持たない培養番と、培五液を貯留
する「段と、透析ＩＩ！２を内蔵する培養液処”ｌｌ２
Ｖと、詠透析膜で陥てられた笛１の空間に培養波を循Ｉ
＋２−４−る「段と、ゴ５１のシ：Ｃ間とは異なる第２
の′・；Ｃ間にＪ，Ｌ礎上１１査液を循環する千段と、
該Ｊ＆礎１！７　Ａ液を貯留する「段とからなることを
特徴とする＃ＩＩ胞の培養装置。

そして先覇発明によれば、（＋）　ｋｒ’養液の循環ｆ
段による培養中の細胞に対する物Ｊ＋１！的悪影響かな
い、■培養液処即苓の中空糸外空間への細胞あるい（ま
細胞ノ１の？：ｉ梢か息〈、このため培養の全期間中に
わたり、透析膜の面ｈ１をイ１効に利川できる。

０）タンク内袷養液の流れ附’ｌ’ｉ’の問題に山来す
る培Ａ液の処理−ｌｉｔの限界がない。■培養期間中に
わたって、高い培λ液の処理効率（透析効率）を維持で
き、４’．　ｐＴ性が通常の培養法に比べて道かに高い
。■ＩＩＩＬ　消成分の使用！Ｉ［が少く、コスト的に
優れている。専の穎著な作用、効果を炎ずる。

本発明名は、先翻発明において透析に使用しているＪ，
（礎培五液溜にガスをパブリングさせ、−１一分にガス
文換されたＪ，（礎培養液によって培養液を透析するこ
とにより、栄養物や老ｊ充物と同時にガスもまた文換コ
）一る力法について研究し、非常に優れたｌ，＋’養液
へのガス珀の供給方７去であることを見いたし，本発明
を完ｓ＆．　シたものである。

（問四点を解決するための手段） １！ＩＪち、本発明の璧旨はＦ記のとおりのものである
。

■細胞の成育′４−るｌＨ’７五苓に，珀養液を循環さ
せつつ細胞を給養し，この循環培養液を透析膜を内蔵す
るＪｚ１養液処理益のｉｆの空間に循環し、一方、詠透
析膜で笛１の゛令間と隔てられた、培養液処理悴の笛２
の′・ζ間には、貯溜ｆ段中で細胞の成育に必堂なガス
預のイｊ（給を受けた基礎培ＡＰ＆を循環させることを
特徴とする細胞の培養方法。

■細胞の成育する培養益と，培養液を培養番に循環する
ト段と、透析膜を内蔵する培養液処理番と、該培弄液処
狸器の第１の空間に培養液を循環するｆ段と、培養液が
循環する培養液処理器の第１の空間と透析ｔｌＱで隔だ
てられた第２の空間に火ぱ培長液を循環する手段と、該
基礎培養液を貯溜するｒ段と、（佇溜した基礎培養液に
ガス類を供給するＦ段とからなることを特徴とする細胞
の培養κｌｉｖｊ。

次に、本発明の特徴をその作用と』（に工（体的に説１
りｌ＝１−る。

（角川） これまでの細胞の大｛ｘｔ培養では培養液とガス類とを
いかにＪ縫触させ、ガス交換するかについて研究されて
きた。これに対して本発明では一旦十分ならｌのガス類
を火礎培養液に溶イ７させた後、このＪ工礎培養液によ
って培養液を透析することによって培ＡＭにガス類を供
給しようとするものである。この時透析液側の基礎培養
液の流速と、透析膜の而梢を適当に選択することによっ
て、基礎培養液に対して培養液を十分に透析でき、その
結果ｊＨ″Ｓλ液に十分な量の溶Ｈガス類を供給できる
。基礎珀五液溜にガス類をパブリンクさせることによっ
てカス文換できることは、装置的にも非常にＭｉ　ｒｉ
ｌでアル。

さらに本關発明の効果としては、従来の、培養Ｍｔ溜に
ガス預を吹き込む方法では吹き込んたガス類により雑菌
のｆ’ｊ染をコ１：じる可能性があったが、本酊］発明
の方ｄ、では培養液とは透析膜を隔てて陥課されており
、ガス類供給の際′μ故によりもし雑閑でＪ工礎培養液
が汚染されたとしても、雑菌は透彩１膜を経て培養液側
へ移行することはなく、早期に対処すれば１“Ｌ１ｎな
細胞を無駄にすることがない。この点は実際の大ｉｔ培
養では実川的であり、．Ｊｌ常に４１川である。

ｍ　１　１ｍ、第２レ１は、それぞれ本発明のシステム
例を示すもので、本允明の培養装置は、細胞が成育１−
る培養益（１）と、袷五液を貯留１−る培養液ｆｆ！（
３）と、給養液の辻続的循環ｆ一段（４）とを持つ動物
細胞の培養装碓てあって、ボンブ等の培養液の辻続的循
Ｉｉ２Ｆ段（４）により細胞が成育する給養品（１）に
強制的に培養液を循環させる。

培養液溜（３〉より培養液循環手段（４）により珀弄苓
（１）を経て培養液を透析１模で区切られた培養液処即
器（２）の第１の空間に送る。裁礎培養液溜（６）では
ガス預供給｝−１　（　７　’）から酸素等のパブリン
グを行った後、Ｊ工礎培弄液循環手段（５）により５詠
Ｊ，Ｃ　ｆ２培養液を速析膜にて区切られた珀λ液処浬
路（２）の祁２の空間に送り、透析によってイ１（分（
・’ｔｔ成分及びガス角の交換、即ち老ｊ尭物の除人と
栄養ふ及び酸素の補給を行った後、Ｉｎ養液を、１１ｆ
び培養液溜（３）に戻す（第１図）。第２図のシステム
は、培養液溜（３〉からｌｊ五忍（！）への循環同路と
は別に、培養液溜（３）より直接培養液ＩＪｉｌＩ環−
Ｆ段（８）により透折１ｌ！２にて区切られた培λ液処
理畳（２）の箪１の空間に培養液を送り，第２の空間に
送られる臥礎培五液に対して、透析によって４１（ｍ分
子！ｔ成分及びガス角の交換、即ち老廃物の除去と栄養
素及び酸素のＭｉ給を行った後、培養液を＋Ｉｆび培養
液溜（３）に戻すものである。Ｊ，ｔｉ礎培養液は共礎
培養液溜（６）でガス預供給目（７）からの酸素等のバ
ブリングをうける。ここで３つ培養落について、其休的
に例をあげると．例えば中空糸を用いたもの、不＆Ｉ　
Ｉｊｉ、スポンジ、セラミックス等の多孔体、，：“７
１分ｒ一製のマイクロカプセルやビーズを充填したカラ
八などかある。培養液処理器に快川ずる速析１１！２は
゛Ｖ＋＋ｑでも使Ｊ１レＩｒ能であるが、決められた容
４’ｌでより多くのＩ１’；！　Ｉｔ’ｌｌ　ｈｌか１
ｉＩられる中空系がより４＋効である。透析膜に開いた
細孔径は分画分（−　！＋１で１００，０００ダノレト
ン以下゛、あるレ）は５０，０００ダルトン以下がよい
。望ましくは１０００ダルトン以ト３０，０００ダルト
ン以ドがよい。透析膜の１１＋２而梢は培養器にて培養
する細胞数や細胞の袖類によって決まり、特に規定は不
安である。

以ドに１Ｌ体例を予げて本発明をさらに，ｉｌ’．　シ
＜説明−４”る。

（実施例１） タンク培養装置に本発明を実施した例を、７ｔ１ヌ］で
説明ずる。ｊＨ’ｒ，養液溜（３）としてｌ２のカルチ
ャーボトル（柴ＩＩ＋科学社製〉を用い、これに度沸騰
して脱気したＲＰＭＩ−１６４０に、１０％濃度に牛胎
ｙｌ血？＋”ｔを添加した培養液１．０４！を加えて、
ポンプ（４）（東京理化器械社製、ＭＰ−３）を用いて
、培養液処理器（２）（旭メディカルネ１製、血液透析
品ＡＭＩＯＯＯ−ＨＰ）との間で，流速およそ１０ｍｌ
／分で循環させた。

）Ｊ−　．１，【！２培養液溜（６）（柴ｎ１科学社製
、５角カルチャーボトル）には史礎培養液であるＲＰＭ
Ｉ−ｌ６４０を５角入れ、溶ｈ−酸素濃度測定５時間前
よりＩｆｆｉ／分で空気をガス供給ＩＴＩ（７）からパ
ブリングさせた。Ｊ，（！２培養液はボンブ（５）（旭
メディカル社製、血液ボンブＡＢＰ−０１）により培養
液処理番（２）のｊｊ長液と透析膜を隔てた第２の空間
に、流速およそ２００ｍｌ／分で培養液の送液方１ｒり
と逆方１γりに循環させた。ＩＩｌのカルチャーボトル
、５２のカルチャーボトル共、テフロン製攪拌子を入れ
ておよそ１２０回転／分で攪社した。この時１１カルチ
ャーボトル内で培養液中の溶イＦ酸謹；濃度を、カルチ
ャーフローＴ／Ｃ　−１０００　（旭メディカル社製）
付属のＤｏ電極にてｄ１１１定した。

対象として、燕留水を１度沸騰して脱気した溶イｆ酸Ｊ
９濃度か０．０ｐｐｍ、５００ｍｌの蒸留水に、１分間
にＩＪ２の流！１Ｌで空λを３時間パブリングさせた時
の溶ＪＴ酸素濃度が６．８ｐｐｍとなるように、ＤＯ′
ｉ′ｉｆ棒の出力を調整して用いた。尚、測定は全て室
温（２６〜２８℃）で行った。結果を箪ｌ表に示す。

倍養液の溶４７酸素濃度は、透析開始以前には脱気した
蒸留水と同様ほぼ０であったが、透析２４時間接には６
．４とほぼ飽和濃度に近い濃度に達した。またこの時，
＋１（礎培養液溜ではパブリングによる気氾は液面で直
ちに消失し、長時間消失しないような気泡は土しなかっ
た。

以−１−より本発明によって培養液に酸素を十分に供給
できること、話礎培養液には培養液と異なり気泡による
雑菌汚染は起こらないことが明らかである。

（失施例２） 中空糸を用いた高密度培養に本発明を実施した例を、第
１１メ１で説明する。培養細胞として抗ヒトＩｇＧモノ
クローナル抗体生ｎｎハイブリドーマＳＳ−　１　６を
、培養器（１）としてカルチャーフローＭ（地メディカ
ル社製）を用い、培養液溜（３）（１塁力ルヂャーフロ
−Ｔ／Ｃ−１００Ｏｆ−ｒ嵐）に１０％ノ１，胎鬼血ｔ
＋７を含むＲＰＭＩ−１６４０培λ′ｌｆｋＯ．５１ｌ
を加えて、ボンブ（４）（カルチャーフローＴ／Ｃ−１
０００付屈〉を介して培養液処Ｊ’ｌｌｍ（２）（旭メ
ディカル社製、血液透析ｆＬＡＭ１０００−ＨＰ）との
間で循環させた。

流速は培養状態により仔，０に調節した。一方、Ｊ工礎
培養渣ｆｆｉ’ｌ（６）（柴［ＩＪ科学社製、５ｋカル
ヂャーボトル）には既礎培養液としてＲＰＭＩ−１６４
０にカナマイシン５　０　ｍ　ｇ　／　ｌ添加したもの
を５文入れ，ＩＪ２／分で５％二酸化炭素を含む空気を
ガス供給ＣＩ（７）からパブリングさせた。

？の基礎培養液はボンブ（５）（旭メディカル社製、＋
１１１液ボンブＡＢＰ−０１）により培養液処理苓（２
）の珀養液と透析膜を隔てた箪２の空間に、流連およそ
５０ｍｌ／分で循環させた。１党のカルヂャーホトル、
５ｊ２のカルチャーボトル共、テフロン製攪ｒ［ｒ−を
入れておよそ６０回転／分で攪打した。

１−１：己給五；雰、１８養液溜はカノレチャーフロー
Ｔ／Ｃ−１０００内にセットして培養した。給λ液中の
溶１ｌ酸素濃度は、カルチャーフ口ーＴ／Ｃ−１０００
（旭メディカル社製）付屈のＤＯ電極にて、培五液処Ｐ
ｌ！　＆ｉの出１−１側（培養液溜の人［１側）で袷養
液中の溶イ１−酸素濃度を測定した。ＤＯ電極の調製は
失Ｍｉ例ｌと同様にして行った。結果を軍２表に，１■
ず。

最初２Ｘ１０’ｌｌｌ胞より培養を開始し、培養１０　
［１　１−Ｊには１．２Ｘ１０９細胞（細胞密度１．２
×１０ｆ′細胞／　ｍ　Ｉ　）に達した。この細胞の増
補にもかかわらず、溶存細胞濃皮はほぼ一定であった。

細胞密度１．２ｘｌＯ’細胞／　ｍ　１は通常のｊｚ〕
養法（１０６細胞／　ｍ　ｌ　）に比べて邊かに高い密
皮であるにもかかわらず、十分な１４のガス類の供給が
行われていることが分がる。またこの時幕礎培五液溜（
６）には長１時間消失しないような気泡は生しなかった
。

（発明の効果〉 本発明の培養装Ｍ及び方法は、透析に使用する弘礎培養
疲に酸素や炭酸ガス等のガス類を供給することによって
，培養細胞に＆２Ｊ；や炭酸ガス等のガス類を効率よく
供給するものであり、且つ培養器に直接ガス預を供給す
るものでないがら、攪拌による細胞への尖断力の影響が
ない、雑菌汚染の危険性がない、気泡による培養細胞へ
の悪影響がない、装訳がシンプルであるなど、その効果
は顕署なものがある。

【図面の簡単な説明】

７ｊＩｌ図は、夫施例に／ｊ＜したシスデム例である。 ｍ　２ｆＸＩは、本発明の別のシステム例である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞の成育する培養器に、培養液を循環させつつ
   細胞を培養し、この循環培養液を透析膜を内蔵する培養
   液処理器の第１の空間に循環し、一方、該透析膜で第１
   の空間と隔てられた、培養液処理器の第２の空間には、
   貯溜手段中で細胞の成育に必要なガス類の供給を受けた
   基礎培養液を循環させることを特徴とする細胞の培養方
   法。
2. （２）細胞の成育する培養器と、培養液を培養器に循環
   する手段と、透析膜を内蔵する培養液処理器と、該培養
   液処理器の第１の空間に培養液を循環する手段と、培養
   液が循環する培養液処理器の第１の空間と透析膜で隔だ
   てられた第２の空間に基礎培養液を循環する手段と、該
   基礎培養液を貯溜する手段と、貯溜した基礎培養液にガ
   ス類を供給する手段とからなることを特徴とする細胞の
   培養装置。