JPH03143397A - β―ヒドロキシ酪酸およびその重合体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分封〉 本発明は、活性汚泥を用いて生物分解性バイオブラスヂ
ッつてあるβ　ヒｌ；’　＋　＋　４−シ酪酸、■ｊよ
びその重合体を製造する方法に関ずろ、 ぐ従来の技術・ 多くの微生物は、エネルギー貯蔵物質としてグＪ−１−
）１ンとβ−ヒト１−１１−シ酪酸（Ｐ　Ｉ−Ｉ　Ｂ　
）を菌体内に「？蔵する。

例えば、特開昭５７−１５０３９３号公報には、八Ｉｃ
ａｌｉｇｃｎｃｓ　ｃｕｔｒｏｐｈｕｓなとのｊｌｊ、
　−菌を用いてＰ　Ｉ−Ｉ　Ｂ重合体を製造する方法が
開ホされている。

しかし、活性汚泥のような多種多様の微生物集団を培養
して、Ｐ　ＨＢを安定的に東岸貯蔵させる方法は報ｆｋ
；されていない。

微！Ｌ物は、一般に繁殖のために必要な栄養素の一部が
不足すると生体合成が抑えられ、炭素源を利用しでｒネ
ＪＬ　’１−１１’ｉ’蔵物質を体内にＰ’ｒ積し始め
る傾向のあることが知られている。

人為的に貯蔵物質を蓄積させる場合、不足させる栄養素
として窒素やリンが１よ・く対象となる。

しかし、活１↑汚泥を用いてグルＴ−Ｊ−スやグルタミ
ン酸を炭素源にして培養した場合、ポリグ几＝ｊ−スが
２！；桔されるのみて、Ｐ　Ｈ１３の蓄積はこれ１１、
て接合されてい／ヱい。

〈本発明が解決しようとする課８ン 従来の汚泥・廃棄物処理ては、最終的には焼却埋立てに
より廃棄炭素源をＣＯ２または未分解物質のまま自然界
に放出してきた。

近年ては、この放出量が膨大な量に達し、大気汚染、Ｃ
Ｏ２による地球１品暖化問題、さらには増下水や土壌汚
染などの深刻な環境問題を引き起こしている。

本発明の課題は、（）を未焼却Ｊ′１１！１１で処理さ
れている活性汚泥の培養によって、右用資源であるｐＨ
ｎむよびその重合体を製造、回収することかでＥｋる方
法を提供することにある。

〈課題を解決するための手段〉 本発明者らは、前記の課題を達成ず・＼く鋭意検討した
結果、活１１汚泥の培養にわいて、窒素負荷を連続的に
減少さ七ることにより、閑イイ、内にＩ）　ＩＩＢおよ
びその重合体を蓄積させろことができろことを見出し、
本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明のＰ　Ｉ−Ｉ　ＢｉｓよびそＱ）重合
体の製造方法は、活性汚泥を、同化１′ｉ−炭素含有基
質の水（’Ｉ：　ＪｉＴ地て好気ｆｉｒ　Ｎ　して菌体
；ご度を−Ｉげた後、窒素負荷を連続的に減少させ、さ
らに窒５）１負荷がない条件て好気培養を行い菌体内に
β−ヒドロヤーシ醋酸およびその重合体を蓄積させるこ
とを特徴とする。。

本発明にわいて、活１つ汚泥は特定のｗＩ’Ｉ：物を含
む菌体には限定されず、通常の下水処理場などのｔ”ｊ
ｊ尼をそのま上伸用することがてきる。

活１ゞｌｆ’７′泥（７）　Ｊ−ｉτ養ては、通’；’
ｉ！′適切／ｉ栄養源のバランスとして、 ＢＯＤ　　：　　Ｎ　　：　　Ｐ　−＝］ＯＯ：　　５
　　：　　１が望ましいとされている。

しかしこのＮを単にＯとしただけでは、Ｐ　［１Ｂの蓄
積は起こらず、グツしコースのみか蓄積される。

本発明では、貯蔵促進のための制限栄養前を＋−ｊｌ、
１素とし、この窒素負荷を数時間から数日かｉ、ｌて徐
）２に低減せしめ、Ｐ　ＨＢの蓄積に成功したのである
。。

Ｊ［ず、活性汚泥の菌体濃度を上げるために、バランス
のとれた一１分へ基質て、連続あるいはセミパッチの好
気培養を行う（荊培養）。

基質としては、特に限定されず、例えば通常微生物の培
養に用いられる十分なグルコース、酵Ｕエキス系基質に
、一般に同化てきる形態の元素源（首通は水溶１１：　
Ｊｆ、ｉ　）を添加する。。

このような元素源には、窒素、リン、イオウ。

カリ、リートリウ１１、マグネシウム、ノＪルシウム、
鉄の（汗か、マンノノン、亜鉛、銅なとい微ｂ１元イ；
がある。このときの炭素源、窒素源は通常用いられるも
のであれば何てあってもよい。

なお、前ｊＢ養は、請求項２に記載のように、２没階に
分けて行うのがｂ」′ましい。

第１ステツプではＰ　Ｉ−（Ｂ生成菌を優占種とするた
めに培養炭素源としてグルニー１−スわよび酵母よ、１
−スを、窒素源としで硝酸前空〉）ξをぞれぞれ用い、
また、第２ステップでは厘養窒素源として酢酸を、窒素
源としてアンモ−、ア態窒素をそれぞれ用いる。

その理由は次のと−１３りである。すなわち、Ｐ　Ｉ（
Ｂ生成能を汀ずろ微生物にはＺｏｏｌＨｌｏｃａやへｂ
：ａｌｉｇｃｎｅｓ属があり、これらは活性汚泥中にち
多く確認されている。

従って、活性汚泥からのＰ　Ｉ−（８回収率を向−１ニ
させるにはこれらに微生物が優占種となるバイオマスを
形成する必要がある。

微生物の増殖には炭素、窒素、りんが必須であり、特に
窒素はアンモーフーア態て同化に利用される。。

しかし、へＩｃａｌｉｇｅｎｅｓ等は砧酸・亜硝酸還元
酵素によって硝酸態窒素をアンモニアにまで還元し増殖
することができる。

従って、前培養を上記のように２段階で行うことにより
微生物の特性を有効に利用し、優性種となるバイオマス
の増殖を図ることができる。

第１ステツプで硝酸態窒素による効果を確認するため、
アンモニア態窒素による培養試験を行い、両培養による
ＰＨＢの生産結果を表１に示した。

乾燥菌体重量当たりのＰ　ＨＢ回収効率はアンモニア態
窒素系基質で１．０７　（ｗ　ｔ％）、硝酸態窒素系基
質で、１．４５（ｗｔ％〉となり、１．３６倍の生産効
率が得られることがわかる。

表　Ｉ　　ＰＨＢ回収結果 次に、菌体濃度が高＜ｉ宴った活１’ｌ：　’Ｉ’ｓ泥
を、再びバランスのとれた基質に投入し、ヒミノ＼ツチ
の好気培養を１テう〈＋培養〉。

このとき供給する基質中には窒素源をＮませない。Ｉ）
　）Ｉ　ｔ：、ｔ　（５〜８の範囲力く適当てある。ｐ
　Ｈの調整は、例えば１０％塩酸Ｊｊよび１０％のＮ　
ａ　ＯＨ水溶液を用いて行う。厘養温度は、２５〜３０
℃の範囲が好ましい。

な、ｉ５、本培養を前培養に連続して行ってもよいが、
希釈効果によＱ　章Ｍ負荷がり（激に減少−！Ｊ’　Ｚ
＞　ｈ）ら、この場合には、供給ずろ基質中の窒素源を
徐／、に減らずように１．なｊすればならない。

本培養に才５１Ｊ／）ｌｊ給基質中の炭素源ｉ；ｔ：　
、Ｐ　）Ｔ　Ｂおよびその重合体に代Ａ１できる有機酸
あるいはその塩類が望ましい。

好ましいｎ機酸を例；】：すると、削酸、酪酸、ブ［Ｉ
ピオン酸、安息香酸かある。

本培養を行うと、最７１）のバランス話質中にあった窒
素か菌体増殖に使用されて減少する。

これは数時間から数日の間にほとんどＯになる。０とな
るまでの期間は最初のバランス基質量、最初の投入１′
ｒｉ泥量に依７Ｙずろから、これらを変えることにより
すΔ養ＪＴＡ間をコントローノ１することがてぎる。

かくして、窒素が消滅した段階から、Ｐ　ＩＩ　Ｔ３わ
よびぞの重合体の蓄積が始まる。

蓄積が始まると、菌体型（１’ｃ重量゛１ｉりの炭素量
か増えてくるから、炭素量／乾燥菌体単位重量の埴を指
標にして培養を続ける。

この植がある一定値（約４０〜６０’、；）に収束し、
あまり増えなくなった段階で培養を中１４二する。

その後、菌体を乾燥させ、常法に従ってＰ　ＨＢおよび
重合体を抽出分離する。

〈実施例〉 以下、本発明を実施例により具体的に説明ｊる。

実地例Ｉ リアクターとして３ｅの培養ボッｉ・を用い、ｆｉｒ−
ｒレージＥｉンによる通気域養法を採用した。培養温度
をザーモスタツｈ　（＝Ｉき水浴によって３０°Ｃに調
整し、ｐｌｌをｌＯ％ＮこＩ○ＩＩと１０％１ｆｃＩに
、上って常特ｐ　Ｉ−１を６．９〜７．１に制御した。

本実施例に供した汚泥は、都市下水処理場からの金利’
Ｉｆ′ｉ泥をｌ　ｍｍ開−（ＬＯ）メンシ、：１　テＨ
ＩＮ、Ａ　Ｌ　タ通ｇ液を用い、これをリアクターに１
　’、）　ＯＯｍ　Ｑ投入した。。

活性ｔぢ１尼の培養は、活１ｊｌ−７ち泥の［￥１林僧
舶を図る前培養、さらに窒素濃度を増殖制限因子として
Ｐｌ−Ｉ　Ｂの蓄積を促進させろ本培養の２段階に分（
１て行った。

ａ〉前培養 前培養では、表２に示す、窒素、リンともに十分なグル
コース、酵母エキス系を用い、これをリアクターに５０
０ｍ＆添加し、！＼ツヂ培養を開始した。

なお、基質の交換は、培養時間２４ｈｒ経過毎に１時間
エアレーシミ１ンを停＋ＬＬ、沈殿分離されたＬ澄液を
同組成の基質５００ｎｌと入れ（）え、この操作を７２
時間継続して菌体の増殖を促進させた。

表 ２ 基質Ａ （１，Ｃ ） と基質Ｂ （１−Ｃ ） を混合したち のを基質とした。

ｌ）〉木棺差 前培養終了後、リアクターを取り出し、遠心分＊　（３
５００ｒｐｍ＼ｌｏｍｉｎ）　ｌこ、上って１ｌｆ−ｒ
′ＩＩｊ　Ｌ、た。これを了オン交換水で洗浄し、水種
Ｊ　＋’、）ロー１′クター（＋ｆｉｆ培養で使用した
ボッＩ・）・＼投入した。

これに大；３に、」モ“４−’　：、ｑ−ｘ　水源をＮ
む耐酸りトリウノ、系基質を投入し全量で２ｅとした。

さらに半？くツヂ方式によって窒素源を３よない表４の
Ｐ１１′酸すトリリノ、系基質を２　ｆｆ　　ＣＨ３Ｃ
００Ｎ　ａ　／　ｈ　ｒ・となるように外部から間欠的
に供給し、段階的にリノ′クター中の窒素を低減させて
行った。

培養開始から定期的に反応液をザンブリングし、表５に
示す分析方法によ−）で１音養液中の窒素濃度わよび菌
体組成の経時変化を分析した１、表 本培養開始時の７Ｉ（質相成 表 半バッヂ運転での基質組成 微量元素溶液は表２に準する。

表 分析方法 第↓図ａ、ｂに本培養開始ｆ＆２２０　（ｈ　ｒ　）ま
でのアンモ−、ア、目よび菌体組成の経時変１ヒを示ず
１３アン［二ｒは所期濃度１．９　（ｇ、、’ｃ　）で
あったが、菌の増殖によって指数的に減少し、培養後１
５０（ｈｒ）では完全に欠乏した。菌体中の炭素な有量
は培養開始特に２５（ｗｔ％）であったが、アン［ニア
が７ど全に消費された■↑、１．！、夫から」−界し、
２１Ｇ（Ｉコｒ）後には４（）（ｗｔ％〉に達した。し
かし苗作中の’：’；’、　泰３Ｔｌ′量の」）７は確
謬されなか−、た５、このことから培地中の窒ｆｆｉ：
　’ｆＫｊの欠乏によ−、て微ｔＬ物の増殖が制限され
、菌体内に炭素源を何らかのＴネ７１．−１’−昨蔵体
とり、て苓Ｍ　したちのと考元↓″。

れる。そこて・２２０　（ｈ　ｒ　）後に哨養を中＋Ｉ
し、Ｉ？蔵物質の抽出を行った１、 Ｃ）菌体内貯蔵物質の抽出 本実験て行ったＰ　ＨＢの抽出工程を第２図に示す。

水種養１％了後遠心分離機（５０００ｒ＋＋ｍ＼′、５
ｍ１ｎ）によって集菌した。

沈殿分離された湿潤菌体に対して２倍容量のｉ′セトン
を加え、細胞表面の脱廁処理を行った。

これをデシメノー−ター中にセットシ、アスピレータ−
によって３０時間減圧乾燥した。

その後、Ｃ５られた菌体をつ・４−ターハスによって４
０℃に設定した２倍容クロいボッ１ムに投入し、２時間
撹拌しながら溶α１処即を行った。

これを遠心分ｎ１（３５００ｒｐｍ　ｙｌ　＋ｎｉｎ　
）によ−、て細化の残在を分離除表した。

これに２倍容のへ４゛−ザンを添加し、ＰＨＢの結晶化
抽出を図った。しかし、混合液中にはＰ　Ｉ（Ｂの結晶
化は確認されなかった。

そこで結晶化を促進させるために混合液をフリーザー中
にて４°Ｃ１２時間で・急冷したところ、白Ｌ０沈殿物
がｌ、！られた。

これをメタノ−、Ｉして洗浄し、１００°Ｃ１２時間の
条件で乾燥させ、菌体内貯蔵物質の抽出を完了し）こ　
。

ｄ）菌体内貯蔵物質の相成分担 以１−の抽出に土ってえられた貯蔵物質組成をＣＨＮ　
Ｓコーダーによって分析した。この分析結果を表６に示
す。

Ｐ　ＨＢの組成はＣ４１−１６０２であり、炭素、水素
の重量％は、ぞれぞれ５５．８％、６，９％となる。

一方、本実験より得られた抽出物質の値は、炭素で５５
．４％、水素では６．８％となり、Ｐ　Ｉ（Ｂ　Ｍｉ成
の炭２″：、水）：この即論１Ｒ量％と近似した♀１１
□１とが１１１ら　Ｇ れた１、さらに抽出最終課程の１００℃での加熱乾燥状
態においても形態の変化が生しなかったことから、この
抽出物はポリグツｌ”−７−×てはなく、Ｐ　ＨＢであ
ることが判明した。

表　６　実験抽出物とＰ　ＨＢとの組成比較（ｗ　ｔ、
％） ｅ）Ｘ線回折による構造分析 Ｘ線回折によって構造分析を行った。

この分析結果を表７の左欄に示す。また上記らによって
決定されたＰ　Ｉ−（ＢのＸ線回折結果を同表の右欄に
示“４゜ 両者の特性値が同一であることから、本抽出物質がＰ　
Ｉ−Ｉ　Ｂであることが証明された。

同■Ｙに廃菓炭素源である活１つ一１６泥からのＩ＼１
″ｌプラスチックの生ｙ＋１２が確認された。

表 ｒ）示差熱分析（ＤＴＡ）による測定 高分子物質の融点はその固体構造によって変動するため
、構造解明の」二で重要な手掛かりとなる。そこで活１
１．汚泥から抽出した沈殿物質の融点を示差熱分析器（
ＤＴＡ）によって分析した。

表８に分析条件を示す。Ｐｌ（Ｂの融点１：１：　１７
７°Ｃであるため、２８°Ｃから２３０°Ｃの温度範囲
とし、５℃／　ｍ　ｉ　ｎの割合で昇温した。さらに人
気中の分析では酸化による影響が臀７５・されるため、
Ｎ、ガス置換を行い分析を開始した。

第３図に分析結果を示１　、、吸熱反応は１４０℃から
変化が生し、１７２．１°Ｃでピークを示した後、１７
８℃で終了した。上記らによろ報ｆＩンてはＰ　ＩＩ　
Ｂの融点は１７７℃とあるが、吸熱反応のとのポイント
て融点を決定したかは不明であるため木翔１出物質とＰ
　ＨＢの融点の合致は断言てきないか、Ｐ　Ｔ−Ｉ　Ｂ
の融点として吸熱反応終了温度を採用した場合には本分
析結果と１７′１４ｆｆｉとｆ、）ろ。

１モ８　　　示差熱分析ＤＴＡの設定条件〈本発明の効
果〉 以上説明したように、本発明に１よれば多種多様のｉＨ
／Ｉ−物集団で・（１話ｆｊＩ　？ｆ）泥の１ン１養に
よって、生物解１′Ｉニハイオプラスア・ツクとされる
Ｐ　ｌ−Ｉ　３才５よびその重合体を蓄積、製造するこ
とがてきろ。

従って、本発明による培養方法を排水処理システムの中
に応用することにより、有用資源を有効に用収すること
ができるから、現−ｎ、焼却その伯に多大の１ストを要
する活性汚泥の処理コストの低減と共に、余剰汚染発生
量の低減にも役立つ。

【図面の簡単な説明】 第１図ａ、ｈはそれぞれ本発明の実施例にむけるアンモ
ニアおよび菌体相成の変化を示すグラフである。 第２図は同しく　Ｐ　１．−Ｉ　Ｂの抽出下片を示す説
明図である。 第３図は示差熱分析器（ＤＴＡ）による抽出物り０

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）活性汚泥を、同化性炭素含有基質の水性培地で好
   気培養して菌体濃度を上げた後、窒素負荷を連続的に減
   少させ、さらに窒素負荷がない条件で好気培養を行い菌
   体内にβ−ヒドロキシ酪酸およびその重合体を蓄積させ
   ることを特徴とするβ−ヒドロキシ酪酸およびその重合
   体の製造方法。
2. （２）活性汚泥を好気培養して菌体濃度を上げる工程を
   ２段階で行い、第１ステップでは培養炭素源としてグル
   コースおよび酵母エキスを、窒素源として硝酸態窒素を
   それぞれ用い、第２ステップでは培養炭素源として酢酸
   を、窒素源としてアンモニア態窒素をそれぞれ用いる請
   求項１の製造方法。