JPH03133397A

JPH03133397A - クレアチニン及びクレアチンの定量方法及びそれに用いる試薬組成物

Info

Publication number: JPH03133397A
Application number: JP27237589A
Authority: JP
Inventors: Yoji Marui; 丸井　洋二; Noriyuki Kimura; 木村　礼志
Original assignee: SEROTETSUKU KK
Current assignee: SEROTETSUKU KK
Priority date: 1989-10-19
Filing date: 1989-10-19
Publication date: 1991-06-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】り粟上例科几立■ 本発明は、腎機能障害の尺度として重要な検査上の指標
となるクレアチニン及び筋肉性疾患の診断上の検査指標
となるクレアチンの定量方法、およびそれに用いる各Ｖ
：薬組成物に関する。

災米吸■ 従来、クレアチニンの定量法として■クレアチニンがア
ルカリ溶液中でピクリン酸と紅色の付加化合物を形成す
る反応を応用したＪａｆｆｌｔ法ＣＢｏｎｓｎｅｓ＆　
Ｔａｕｓｓｋｙ　”Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、”、１５
８　１９４５）、■クレアチニン含有試料にクレアチニ
ンアミドヒドロラゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ
、及びザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成物にペ
ルオキシダーゼと色原体を作用させる方法（大沢進、”
Ｍｅｄ、Ｔｅｃｈ、”　１４．３３５．１９８６）■ク
レアチニン含有試料にクレアチニンアミドヒドロラーゼ
、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシ
ダゼ及びホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ
るサルコシンオキシダーゼホルムアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ法（臨床化学１４８９１９８５）、■クレアチニ
ン含有試料にクレアチンキナーゼとグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼを作用させるクレアチニンディミナーゼグル
タミン酸デヒドロゲナーゼ法（Ｅｎｚｏ、　Ｔａｎｇａ
ｎｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ、　”Ｃｈｉｎ。

Ｃｈｅｍ、　、”２８．１４６１１９８２）が知られて
おり、一方クレアチンの定量法として■クレアチニン含
有試料にクレアチニンアミドヒドロラーゼを作用させて
試料中のクレアチニンをクレアチンとなしたものに、ク
レアチンキナーゼとピルビン酸キナーゼを作用させるこ
とからなるタレアチンキナーゼピルビン酸キナーゼ乳酸
デヒドロゲナーゼ法（安原正善ら、第９回日本臨床化学
会夏期セミナー資料集、８８．１９８９）が知られてい
る。また、クレアチンの定量法として上記■、■及び■
の各方法において、クレアチニン含有試料にクレアチニ
ンアミドヒドロラーゼを作用させる第１段階の反応を省
略してクレアチン含有試料に直接第２段目からの反応を
行う方法が用いられている。

これらのクレアチニンの定量方法のうち、現在量も一般
的に普及しているのは上記■乃至■の方法である。しか
し、■の方法は、検体としての血清中の他の物質と偽反
応を起すため、正の誤差を受ける欠点があり、■及び■
の方法は、その反応系で使用しているサルコシンオキシ
ダーゼが生体成分のし一プロリンと反応するため正の誤
差を与える欠点があり、加うるに■の方法では生体中の
阻害物質、例えばビリルビン等により負の誤差を受ける
など種々の問題点がある。

なお、上記■の方法は、血清中のタレアチニン正常値０
．６〜１．２１ｍｇ／ｄ１範囲内での正確さに難点があ
り、さらに抗真菌剤による正誤差を受ける欠点がある。

一方、クレアチンの定量法のうち上記■の方法は、正確
さは良いものの、反応時間に２０〜３０分を要するため
、多数の検体処理には適さないという問題がある。なお
、最も一般的に普及しているクレアチンの定量法は、上
記■の方法から一段目の反応を省略した方法である。

シよ゛と　る本発明は、クレアチニン及びクレアチン定量上の上述し
たような問題に鑑みなされたものであって、検体中のク
レアチニン及びクレアチンを、従来法にみられるごとき
たの生体成分との反応を生ずることなく、正常値レベル
の低値においても高い正確度で定量し得る方法及びそれ
に用いる試薬組成物を提供することを課題とする。

ジー　　ｌ　るため９１段本発明は、クレアチニン並びにクレアチンを含有する検
体にクレアチンアミジノヒドロラーゼを作用させて生成
する尿素を定量系へと導き、ＮＡＤＰＨの吸光度の減少
により、クレアチニン並びにクレアチンを定量するもの
である。

本発明におけるクレアチニン並びにクレアチンの定量上
の反応系を示すと下記のとおりである。

クレアチン ■ サルコシン＋采素 ■　　　　　ウレアーゼ尿素＋（１□Ｏ２アムモニア十ＣＯ□ ■アムモニア＋α−ケトグルタル酸＋ＮＡＤＰＨＬ−グ
ルタミン酸＋Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　＋ｌ＋２０■クレアチン
十８．０ ■　　　　　ウレアーゼ尿素＋ｌｈ０サルコシン＋尿素２アムモニア＋ＣＯ□ ■アムモニア＋α−ケトグルタル酸±ＮＡＤＰＨＬ−グ
ルタミン酸＋Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　＋ｕｚ。

上に示した反応系にみられるとおり、本発明では、１分
子のクレアチニン又はクレアチンより終局的には２分子
のアムモニアを生成させ、このアムモニアを定量系へ導
いて測定するものである。

本発明により、試料中のクレアチニン並びにクレアチン
を定量するに当っては、測定時の反応系のｐＨを通常７
．５〜８．５、好ましくは８．０付近に調整する。この
ｐＨ調整は公知の緩衝剤、例えば塩酸トリエタノールア
ミンバッファー　トリスバッファー、グツドバッファー
等を用いるとよく、通常は、塩酸トリエタノールアミン
バッファーを用いて行う。

本発明の定量方法は下記に示す組成から成る試薬組成物
を用いて行うとよい。

クレアチニンの定量では、クレアチニンアミドヒドロラーゼ　５０〜５００単位／
戚クレアチンアミジノヒドロラーゼ、４０〜３００　単
位／戚つレアーゼ　　　　　　　　　　　２０〜２００
単位７ｍｌα−ケトグルタル酸　　　　　　　５〜１５
　ｍＭグルタミン酸デヒドロゲナーゼ　　１〜１０　　
単位／ｍｉＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ０，１５〜０．３０　ｍ
ＭｐＨ７，５〜８．５クレアチンの定量では、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、４０〜３００単位／
ｄウレアーゼ　　　　　　　　　　　２０〜２００単位
／戚α−ケトグルタル酸　　　　　　　　５〜１５　ｍ
Ｍグルタミン酸デヒドロゲナーゼ　　１〜１０　　単位
／ｄＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　ＨＯ，１５〜０．３０１１１Ｍｐ
Ｈ７，５〜８．５上記組成の試薬組成物を用いて実際に検体中のクレアチ
ニンを定量するには、その試薬組成物中、クレアチニン
アミドヒドロラーゼ以外の組成分を緩衝液（ｐＨ８，０
）に溶解した溶液をＡ液とし、クレアチニンアミドヒド
ロラーゼを緩衝１ｆ（ｐＨ８，０）に熔解した溶液をＢ
液とし、検体に上記Ａ液を加えて３７°Ｃの温度に加温
し、次いでこれに上記Ｂ？ｆｆｌを加え同温度に加温し
て反応させて行う。反応時間は、Ａ液を加えて５分間程
度、さらにＢ液を加えて５分間程度、合計して１０分間
程度の短時間で反応は完了する。

また、クレアチンの定量では、その試薬組成物中、タレ
アチンアミジノヒドロラーゼ以外の組成分を緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に溶解した溶液をＡ液とし、タレアチンアミ
ジノヒドロラーゼを緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した溶
液をＢ液とし、検体に上記Ａ液とＢ液を、クレアチニン
の定量の場合と同様の手順により反応させて行う。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。

実施例１釦　のクレアチニンの　− ■定量用試薬ｉＡ：酵素試薬液Ａの調製：タレアチンアミジノヒドロラーゼ　　４０００単位ウレ
アーゼ　　　　　　　　　　　　２０００単位グルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ　　　　２００単位ＮＡＤＰＨ０
，３ｍＭ α−ケトグルタル酸　　　　　　　　　　１０　ｍＭ以
上の組成物番１００ｍ門塩酸トリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ８，０）で全量４０ｍ１にした。

酵素試薬液Ｂクレアチニンアミドヒドロラーゼ１０，０００単位を１
００ｍＭ塩酸トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８，０
）で全量１０ａｌｌにした。

■クレアチニンの定量検体としての血清４０μ２を採取し、これに上記酵素試
薬液Ａ　１．６１ｄを加え３７°Ｃの温度で５分間加温
し、次に酵素試薬液Ｂ　Ｏ，４ｍｌを加え、３７°Ｃの
温度で５分間反応させた。

これとは別に、血清の代わりに精製水を用いて上記と同
様の手順で反応させ、得られた反応液を試薬ブランク溶
液として用いた。

次に、この試薬ブランク溶液を対照として、波長３４０
ｎｍで酵素試薬液Ｂ分注後の０分目と５分目の吸光度を
測定し、その測定値をＥ、−０ＳＥＳ−５又はＥ　５Ｔ
Ｄ−０、Ｅｓア、、及びＥｌｌ−０、Ｅｌ−５とする。

血清中のクレアチニンの量は下式より求めた。

クレアチニン量（ｍｇ／ｄ１）　＝結果は第１図に示すとおりであって、図は検量線を表わ
し、横軸はクレアチニン濃度（ｍｇ／ｄ１）を縦軸は３
４０ｎｍにおける５分間での吸光度の減少量を示す。

第１図にみられるとおり、本発明によるクレアチニンの
定量は、クレアチニン量として５０ｍｇ／　ｄｉまで精
度よく測定できていることがわえる。

実施例２本例は、実施例１に記載した手順に従って、血清に既知
濃度のクレアチニンを添加し測定した結果を示したもの
であって、その結果は、表１に示すとおりである。

表１（Ｅ、ア、。−Ｅ、アｎ−５）　　（Ｅｓ−０、Ｅ−ｓ
）　　標準液の濃度表１にみられるとおり、本発明によ
る方法は、回収率にして９０％以上であり、精度よくク
レアチニンを定量していることがわかる。

実施例３本例は、実施例１に記載した手順に従って血清中のクレ
アチニンを繰返しく１０回）測定した結果を示したもの
であって、その結果は、表２に示すとおりである。

表２（単位ｍｇ／ｄ１）表２にみられるとおり、本発明による方法は、低値及び
高値においてもその再現性は良好であり、正確度の高い
クレアチニンの測定である。

実施例４本例は、実施例１に記載した手順に従って、血清中のク
レアチニンを測定する際に、生体成のしプロリンを血清
に添加し測定した結果を示したものである。

表３表３にみられるとおり、本発明による方法は、Ｌ−プロ
リンによる影響を全く受けないことがわかる。

従来方法である「サルコシンオキシダーゼーペ酵素試薬
液Ａ　１．６ｍを加え３７°Ｃの温度で５分間加温し、
次に酵素試薬液Ｂ　Ｏ，４ｍを加え３７°Ｃの温度で５
分間反応させた。

次に、この試薬ブランク溶液を対照として、波長３４０
ｒ＋ｗｌで酵素試薬液Ｂ分注後の０分目と５分目の吸光
度を測定し、その測定値をＥ、−０、ＥＳ−５又はＥ、
ア、。、Ｅｓｖｏ−ｓ及びＥｇ−０、Ｅ、−、とする。

血清中のクレアチンの量は下式より求めた。

クレアチンｆｉ（ｍｇ／ｄ１）　＝結果は第２図に示すとおりであって、図は検量線を表わ
し、横軸はクレアチン濃度（ｍｇ／ｄｌ）を縦軸は３４
０ｎｍにおける５分間での吸光度の減少量を示す。

第２図にみられるとおり、本発明によるクレアチンの定
量は、クレアチン量として２５ｎ＋ｇ／　ｄｉまでルオ
キシダーゼ法」では正の誤差を受けるという問題点があ
るのに比べ、不法はその影響もなく、より正確度が高い
測定法といえる。

実施例５゛　　のクレアチンの ■定量用試薬液の調製酵素試薬液Ａ：ウレアーゼ　　　　　　　　　　　　２０００単位グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ　　　２００単位ＮＡＤ　Ｐ
　ＨＯ，３ｍＭ α−ケトグルタル酸　　　　　　　　　　１０　ｍＭ以
上の組成物を１００１１Ｍ塩酸トリエタノールアミン緩
衝液（ｐＨ８，０）で全量４０ｍ１にした。

酵素試薬液Ｂ：クレアチンアミジノヒドロラーゼ４０００単位を１００
ｍＭ塩酸トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８，０）で
全量１（ｌｄにした。

■クレアチンの定量検体としての血清８０ｔｔｌを採取し、これに上記精度
よく測定できていることがねえる。

実施例６本例は、実施例５に記載した手順に従って、血清中のク
レアチンを繰返しく１０回）測定した結果を示したもの
であって、その結果は表４に示すとおりである。

表４（単位ｍ　ｇ　／　ａ）表４にみられるとおり、本発明による方法は、低値及び
高値においてもその再現性は良好であり、正確度の高い
クレアチンの測定である。

光１豫Ｂか果以上述べたごとく、本発明による定量方法では、被検試
料中の生体成分、例えばＬ−プロリンなどによる影響及
び該試料中の共存物質、特に還元性物質による影響を受
けないので、感度の高い定量法である。また、本発明に
よると、試料中のタレアチニン又はクレアチンの試薬組
成分との反応時間が短いため、現在汎用されている自動
分析機への応用が可能となり、したがって、実用性の高
い測定と言える。また、本発明は、従来法の過酸化水素
を生成させ、それをペルオキシダーゼなどを用いて色素
生成反応へ導く方法とは本質的に異なるので、反応中間
体での１員失がなく、したがって、前述したように、正
常値レベルの低値検体においても高い正確度で測定でき
る利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明により血清中のタレアチニンを測定し
た場合の検量線を表わし、第２図は、本発明により血清
中のクレアチンを測定した場合の検量線を表わす。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）クレアチニンを含有する被検試料に、ａ）クレア
チニンアミドヒドロラーゼ、ｂ）クレアチンアミジノヒ
ドロラーゼ、ｃ）ウレアーゼ、ｄ）α−ケトグルタル酸
、ｅ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びｆ）ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰ
Ｈ）を組合せて作用させ、上記被検試料中のＮＡＤＰＨ
の減少量を測定することを特徴とするクレアチニンの定
量方法。
（２）ａ）クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ｂ）クレ
アチンアミジノヒドロラーゼ、ｃ）ウレアーゼ、ｄ）α
−ケトグルタル酸、ｅ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
及びｆ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
還元型（ＮＡＤＰＨ）を有効成分とするクレアチニン定
量用試薬組成物。
（３）クレアチンを含有する被検試料に、ｂ）クレアチ
ンアミジノヒドロラーゼ、ｃ）ウレアーゼ、ｄ）α−ケ
トグルタル酸、ｅ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及び
ｆ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元
型（ＮＡＤＰＨ）を組合せて作用させ、上記被検試料中
のＮＡＤＰＨの減少量を測定することを特徴とするクレ
アチンの定量方法。
（４）ｂ）クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ｃ）ウレ
アーゼ、ｄ）α−ケトグルタル酸、ｅ）グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ及びｆ）ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）を有効成分とする
クレアチン定量用試薬組成物。