JPH03123488A - ネコ免疫グロブリンκ鎖の定常領域をコードする遺伝子断片およびマウス×ネコキメラ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＩＬ工ＬＭＪｆＪｊｊ 本発明は、ネコの疾病、特に伝染病の診断、治療及び予
防に期待できる新規なネコモノクローナル抗体に関する
。さらに詳細にはネコモノクローナル抗体を構成するネ
コ免疫グロブリンに鎖の定常領域をコードする遺伝子断
片およびこれを利用したマウス×ネコキメラ抗体に関す
る。

九肌五１盪 ネコはベットとして昔から人間に愛着のある動物である
が、近年の欧米では、　「伴侶、仲間、相棒としての動
物Ｊ　　（Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ　５ｐｅｃｉｅｓ）と称
され、人間社会の一員としての地位を獲得しつつある。

もう一方では、医学、薬学、畜産学、獣医学から心理学
にいたる実験動物としての貢献度は従来から大きなもの
であったが、近年では医薬品の効果検定や安全性試験に
ｍｉｎｉｍａｌ　ｄｅｓｅａｓｅ　ｃａｔなどの呼称の
もとて更に貢献度が高まっている。いずれの場合にも当
然の事として、これらのネコの疾病、特に伝染病に関す
るより確実な知識がますます必要となり、その診断、治
療、予防のための方法が確立される事が要求されている
。

ネコのウィルス性疾患は多く、なかでもネコ鼻気管炎ウ
ィルス、ネコバルボウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウィル
ス等の疾患は急性で致死率が高い。

予防としてのワクチンは開発されているものの、感染・
発症したネコの治療法としては、抗生物質、サルファ剤
等の二次細菌感染予防の対症療法しかないこと等、現在
の治療法には問題を残している。

従来より治療法として高度免疫血清や血清由来の免疫グ
ロブリンが使用され有効な実績を残してきた。しかし、
現在では、動物愛護思想の高まりと共に、ネコ血清原料
の入手が困難になりこの治療法は使いたくとも使用でき
ない状況になっている。

従って、従来の高度免疫血清に代わって感染ウィルスを
中和できるモノクローナル抗体が出来れば、これらウィ
ルス性疾患の治療に大きく貢献することが可能である。

梵東肢ｌ 上記のような高度免疫血清の代替品として、ウィルス中
和活性を有するモノクローナル抗体の使用が考えられる
。モノクローナル抗体作製に関する基本的な技術は、こ
れまでに主としてマウス型モノクローナル抗体において
確立されている。ハイブリドーマ等の細胞が産生ずるモ
ノクローナル抗体は大量にしかも半永久に得られ、原料
不足の問題を解消できうる。しがし、ここにおけるモノ
クローナル抗体は、副作用〈マウスモノクローナル抗体
をネコに使用した場合、異種タンパクとしてアナフィラ
キシ−ショックや血清病などの副作用を起こすことが考
えられる）をなくす意味から、従来のマウスモノクロー
ナル抗体ではなくネコモノクローナル抗体でなければな
らない。

これらのネコウィルス性疾患の治療薬としてのネコモノ
クローナル抗体の作製法には次のようなものが考えられ
る。（１）ネコ×ネコハイブリドーマを用いる方法、（
２）ある種のウィルス及び化学薬剤等でトランスフオー
ムさせたネコリンパ球を用いる方法、（３）ネコ×マウ
スヘテロハイブリドーマを用いる方法、（４）ネコ×マ
ウスヘテロハイブリドーマを親株としたネコ×（ネコ×
マウス〉バイブ］ノドーマを用いる方法、（５）キメラ
モノクローナル抗体（抗原と結合する可変（Ｖ）領域は
ウィルス中和活性を有するマウスモノクローナル抗体か
ら、抗原性あるいは免疫原性及び生理活性に関与する定
常（Ｃ）領域はネコモノクローナル抗体からなる、マウ
ス（ｖ）−ネコ（Ｃ）キメラモノクローナル抗体）を遺
伝子組換えで作製する方法、等であるが、これらの方法
による成功例は一切報告されていない。

ここで、（１）については融合効率が低いことや適当な
ミエローマ親株がないこと、（２）についてはヒトの場
合のＥＢウィルスに相当する適当なウィルスや適当な化
学薬剤がないこと、さらに、＜３）　（４）の方法では
ヒト型モノクローナル抗体作製例から考えて、目的のネ
コ型モノクローナル抗体を高効率に得るまでには多くの
円錐が予想される（例えば、安定性の問題等）、従って
、（５）のキメラモノクローナル抗体法がより実現性の
高い方法であると考えられる。

このキメラモノクローナル抗体は、可変（ｖ）領域の原
料となるマウスモノクローナル抗体を産生ずるマウスＸ
マウスハイブリドーマからクローニングしたそのＶ遺伝
子と、定常（Ｃ）領域の原料となるネコモノクローナル
抗体を産生するネコ抗体産生細胞からクローニングした
Ｃ遺伝子とを結合させたマウス（Ｖ）−ネコ（Ｃ）キメ
ラ抗体遺伝子を含むプラスミドベクターを、動物細胞（
例えば、マウスミエローマ）宿主中で発現させ、その培
養上清中に得られるものである。ヒトにおいてはすてに
キメラ抗体に関するいくつかの報告が見受けられる（特
開昭６０−１５５１３２号、特開昭６１−４７５００号
）。

このようにネコキメラ抗体の作製には、目的の抗原と結
合能を持つ抗体分子の可変（■）領域のアミノ酸配列を
コードする遺伝子とネコ免疫グロブリンの定常（Ｃ）領
域のアミノ酸配列をコードする遺伝子が必要となる。キ
メラ抗体の可変（■）領域遺伝子は、前述した種々のネ
コウィルス等に対して中和活性を有するマウスモノクロ
ーナル抗体を産生する細胞から得られるもので、この細
胞は従来のマウス×マウスハイブリドーマ法で比較的容
易に作製することが出来る。しかしながら、キメラ抗体
の定常領域遺伝子となるネコ免疫グロブリンＣ領域遺伝
子については現在のところ全くその構造が知られておら
ず、遺伝子もクローニングされていない、従って、ネコ
キメラ抗体を作製するためには、ネコ免疫グロブリンの
定常（Ｃ）領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を見
いだすことが非常に重要な要素となっている。

先咀立旦光 このような状況にあって、本発明者らは、ネコ免疫グロ
ブリンの定常領域のアミノ酸配列をコードしている遺伝
子を単離すべく研究を重ねた結果、これを単離すること
に成功した。すなわち、本発明は、これまでに−切報告
されていないネコ免疫グロブリンに鎖の定常領域をコー
ドする遺伝子を提供するものであり、これによりネコキ
メラ抗体の作製を可能にするものである０本発明のネコ
免疫グロブリンに鎖をコードする遺伝子を用いて作られ
たネコキメラ抗体は、ネコの疾病、特に伝染病に対して
副作用のない診断薬、治療薬・予防薬への応用を可能に
するものである。

免疫グロブリンのに鎖としては、すでにヒト及びマウス
［Ｐ、Ａ、旧ｅｔｅｒら、Ｃｅ１ｌ、　２２．　ｐ１９
７（１９８０）；Ｈ，５ａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ　
２８０．　ｐ２８８−２９４　（１９７９）］で発見さ
れ、さらに、他の動物種のに鎖では、ラビット　［Ｌ、
Ｅｍｏｒ　ｉｎｅら、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　
　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８０、　ｐ５７０９−５７１３　（１９８３＞１、等が
報告されている。

しかしながら、本発明の対象となるネコの免疫グロブリ
ンに鎖の遺伝子については、これまでには何等解析がな
されたという報告はない。

一方、ネコの免疫グロブリンし鎖のタイプは、主として
λ鎖であることが判っている［　Ｌ、　ｔｌｏｏｄら、
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｆ［ａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、
　Ｑｕ＆ｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　３２゜ｐ１３３−１４６
　（１９６７）］、　　このために鎖を発現しているリ
ンパ球は非常に少ないと考えられ、抗体産生細胞のメツ
センジャーＲＮＡからｃＤＮ人クローニング法により目
的の遺伝子を得ることは困難であると考えられた。しか
しながら、遺伝子組換えによりマウス×ネコキメラ抗体
を作る場合には、Ｌｌ可変領域の遺伝子として、通常マ
ウス由来のに鎖の可変領域遺伝子を用いることから、ネ
コの免疫グロブリンＬ鎖のに鎖定常領域の遺伝子を得る
ことが必要となる。

本発明者らは、ネコ肝臓細胞の染色体ＤＮＡから、種々
のプローブ並びに種々のハイブリダイゼーションの条件
を用いて、目的のネコ免疫グロブリンに鎖定常領域をコ
ードする遺伝子断片を単離すべく研究を重ねたところ、
ネコ免疫グロブリン定常領域をコードすると思われる遺
伝子断片を得ることに成功した。

このようにしてクローニングされた遺伝子断片の塩基配
列から予測されるアミノ酸配列と、他の動物種の免疫グ
ロブリンのＣ領域遺伝子の配列とを比較し遺伝子解析を
行った結果、本発明により得られた遺伝子断片は、に鎖
に属する免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子断
片であることが判明した。

本発明のネコ免疫グロブリンに鎖の定常領域をコードす
る遺伝子断片は、１０９個のアミノ酸からなるペプチド
をコードするＤＮＡ配列であり、定常領域のカルボキシ
末端から４個のアミノ酸配列が、−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｕであることがその特徴として挙げられる。

すなわち、これまでに報告されているヒトやマウスのに
鎖定常領域のアミノ酸配列では、カルボキシ末端がＣｙ
ｓ　（システィン〉となっていることが知られており、
本発明で得られたネコ免疫グロブリンに鎖定常領域遺伝
子のように、カルボキシ末端側に存在するＣｙｓのＣ末
端側に、さらに３つのアミノ酸が続くようなアミノ酸配
列からなる定常領域は極めてめずらしい例であり、本発
明のネコ免疫グロブリンに鎖定常領域に特徴的な配列で
あると言える。

さらに本発明のネコ免疫グロブリンに鎖定常領域をコー
ドする遺伝子は、下記に示された制限酵素切断地図によ
り示される遺伝子断片を有する。

００ｂｐ ４−一一一一一一一ン 本発明のネコ免疫グロブリンに鎖定常領域をコードする
遺伝子のうち、その好ましい一例を示すと、下記に示す
アミノ酸配列をコードする遺伝子断片が挙げられる。

Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖ
ａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＧｌｎＰｒｏ　Ｓｅｒ
　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　ｔ（ｉｓ　Ｔｈｒ
　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＡｌａＳｅｒ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｃ
ｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｙ
ｒ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔ
ｒｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＧｌｙＶａｌ　ｌ／ａ
ｌ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ
　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＴｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａ
ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙ
ｒ　５ｅｒＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　
Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＴｙ
ｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ
　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＶａｌＴｈｒ　Ｈｉｓ　Ｌ
ｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｖａｌ　ＬｙｓＳｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　
Ｓｅｒ　ＧＩＬＩ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｕこ
のようなアミノ酸配列もしくはこれをコードする核酸塩
基配列については一切その報告例はなく、本発明により
初めて開示されるものである。

尚、本発明のネコ免疫グロブリンに鎖定常領域をコード
する遺伝子断片は、上記のアミノ酸配列をコードする遺
伝子断片のみに限られず、部分的にアミノ酸が置換され
ているアロタイプの異なる遺伝子をも包含する。このよ
うなアロタイプの異なる遺伝子が存在することは、ヒト
、ラビット等・の免疫グロブリンに鎖の遺伝子解析にお
いて、１ケ所〜数ケ所のアミノ酸が異なるペプチドをコ
ードする遺伝子が存在することが報告されていることか
らも予想される。

また、本発明のネコ免疫グロブリンに鎖のＣ領域をコー
ドする遺伝子の具体的核酸塩基配列の一例としては、第
４図に示された塩基配列が挙げられる。

本発明のネコ免疫グロブリンに鎖のＣ領域遺伝子を直接
用いてマウス−ネコキメラ抗体を作製することが出来る
が、さらにこれをプローブにネコ抗体産生細胞のｃＤＮ
Ａライブラリィ−から免疫グロブリンに鎖ＣｆＩＩ域ｃ
ＤＮＡをクローニングし、これを用いてキメラ抗体を作
製することも出来る。キメラ抗体の作製方法はすでにマ
ウス−ヒトキメラ抗体で示された方法［液通ら、Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ、　４７．　ｐ９９９−１００
５　（１９８７）］に準じて行うことが出来る。すなわ
ち、キメラ抗体遺伝子は、基本的にＶ領域遺伝子とＣ領
域遺伝子の２種類の遺伝子断片を結合させることにより
構築される。さらに、遺伝子の単離法に応じて、主とし
て２つの結合の組合せがある。すなわち、染色体ＤＮ人
から単離したＶとＣ領域遺伝子、ｃＤＮＡから単離した
■とＣ領域遺伝子の組合せである。

例えば、マウス染色体ＤＮＡから単離したＶ領域遺伝子
を、ネコ染色体ＤＮＡから単離したＣ領域遺伝子と結合
させた場合、マウスＶ領域遺伝子には発現に必要なプロ
モーターやエンハンサ−等の発現調節領域を含んでいる
ことが好ましい、ただし、プロモーターやエンハンサ−
等はマウス由来である必要はなく、ネコ由来でもヒト由
来でもウィルス由来でも差しつかえない０弦な、プロモ
ーターはＶ領域の５′上流域に位置し、エンハンサ−は
Ｖ領域遺伝子とＣ領域遺伝子の間に位置するのが好まし
いが、エンハンサ−については必ずしもこの位置に限定
されるものではない、一方、マウスｃＤＮ＾がら単離し
たＶ領域遺伝子を、ネコｃＤＮＡから単離したＣ領域遺
伝子と結合させる場合、その結合部分は適当な制限酵素
サイトや、必要であれば適当な合成リンカ−を用いて、
■領域遺伝子のコードしているアミノ酸配列とＣ領域遺
伝子のコードしているアミノ酸配列がずれないよう、ま
たＶ領域アミノ酸配列とＣ領域アミノ酸配列が変化しな
いよう結合しなければならない、さらに、動物細胞中で
発現を可能にするための適当なプロモーターやエンハン
サ−等の発現調節領域を遺伝子の５゛上流域に付加して
やる必要がある。このようにして作製したキメラ抗体遺
伝子を、例えば、ｐｓＶ２−ｇｐｔ［Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ、　７８．ｐ２０２７　（１９８１）］
、ｐｓＶ２−ｎｅｏ　　［Ｐ、　　Ｊ、　　５ｏｕｔｈ
ｅｒｎら、　Ｊ、Ｍｏ１．　　Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、　、　１．　ｐ３２７　（１９８２）　］
等の選択マーカーの付いた適当なベクタープラスミドに
、あるいは、宿主細胞内でプラスミド状態で増殖できる
ウィルス遺伝子の一部（パピローマウィルスなど）を持
ったベクタープラスミドに、Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子を
別々に、あるいは同時に組み込み、キメラ抗体遺伝子プ
ラスミドを構築することが望ましい、マウス−ネコキメ
ラ抗体を得るためには、このようにして調製されたキメ
ラ抗体遺伝子を含むプラスミドを用いて宿主動物細胞を
形質転換することが必要である。宿主動物細胞としては
、不死化されたマウス及び他の動物細胞、好ましくはＢ
リンパ系細胞株［例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８−６５３　
（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ・
１　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９７）、Ｐ３／ＮＳＩ／Ｉ
　Ａｇ４−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１８）、Ｓｐ２１０−Ａ
ｇ１２　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）等の形質細胞腫
、ハイブリドーマ］である。　　ＤＮＡによる細胞の形
質転換方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法、燐酸
カルシウム共沈降法、プロドブロスト融合法、エレクト
ロポレーション法等の方法［例えば、Ｂ、　Ｄ、　　［
（ａｍａｓら編集＋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎ
ｄ　ＴｒａｎｓＩａｔｉｏｎ”　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　
（１９８４）参照コがあり、いずれの方法でもよい、■
鎖とＬＨのキメラ抗体遺伝子を同時に持つプラスミドで
形質転換を行う場合には選択マーカーは１種類でよいが
、■鎖り鎖別々の場合には２種類のマーカーが必要であ
る。この場合には、１つのプラスミドで形質転換を行っ
た後に、さらにもう一方のプラスミドで形質転換を行う
二重形質転換法を用いるのが好ましい、このようにして
形質転換された細胞を通常のハイブリドーマと同じ適当
な条件下（例えば、１０％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１
６４０培地中〉で培養すれば、この細胞から通常のハイ
ブリドーマの産生ずる抗体と同様にマウス−ネコキメラ
抗体が分泌産生される。このキメラ抗体は通常の抗体と
同様な方法により精製することが出来る。

本発明により提供されるネコ免疫グロブリンをコードす
る遺伝子断片は、ネコ免疫グロブリンに鎖のＣ領域の特
異的アミノ酸配列もしくはＤＮＡ配列を開示するもので
あり、この遺伝子を用いて、上述のようにして得られる
マウス−ネコキメラ抗体は、ネコの疾病に対して、これ
までになかった実質的に有効な診断、予防及び治療剤と
なりうるものである。

次に、その実施例を示すが本発明はこれに限定されるも
のではない。

ネコに鎖遺伝子をクロスハイブリダイゼーション法によ
りクローニングするために、ヒトに鎖とのクロスハイブ
リダイゼーションの条件を検討した。ここで使用したヒ
トＣに領域を含んだ遺伝子は、ヒト培養細胞ＡＲＨ７７
株［ＡＴＣＣＣＲＬ　１６２１１よりクローニングされ
たものであり、乳用大学・生体防御医学研究所・渡邊武
教授より分与されたものである［１藤ら、　Ｇｅｎｅ、
３３．　　ｐ１８１　　（１９８５）；　　画材ら、　
Ｃａｎｅｅｒ　Ｒｅｓ、、、　４７．　ｐ９９９　（１
９８７）参照］、このヒトＣｘ遺伝子より、Ｃにエクソ
ンを含むＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ旧断片を切り出し、プロー
ブとして使用した。

ネコ肝臓細胞より、Ｎ、　Ｂ１１ｎとり、　Ｗ、　５ｔ
ａｆｆｏｒｄの方法［Ｎｕｃ、＾ｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、
、　３．　ｐ２３０３　（１９７６））に従って染色体
ＤＮＡを単離し、各染色体ＤＮＡｌ０μ９を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ（宝酒造製；以下本実施例で使用した試薬は、
特に断りのない限り宝酒造あるいは東洋紡製を使用した
）で切断する。制限酵素切断ＤＮＡを電気泳動で０．７
％アガロースゲルに展開し、ニトロセルロースメンブレ
ンフィルター（Ｓ＆Ｓ社製：ＢＡ　８５）に転写後、ヒ
ｌ−Ｃに領域を含んだ［３２ｐ］標識ＤＮＡプローブと
サザンハイプリダイゼーションを行った。サザンハイプ
リダイゼーションの条件は、６χＳＳＣ［０，０９Ｍ　
Ｎａ３Ｃａ［ｌ５Ｏｖ　・２Ｈ２０，０，９Ｍ　ＮａＣ
ｌコ、１０ｄ　ＥＤＴＡ［同仁化学］、０．５％ＳＤＳ
　［バイオ・ラッドコの溶液中で６５℃−晩行った。フ
ィルターの最終的な洗浄条件は、０、ＬｘｂＳＣｌｏ、
１％ＳＤＳの溶液中で４５℃、１５分間行った。

このフィルターをオートラジオグラフィーにかけた結果
は、第１図に示すように約５．５ｋｂの単一バンドを形
成した０分子のサイズはλフアージＤＮＡをＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断したマーカーＤＮＡによって算出した。

この５．５ｋｂのＤＮＡ断片にはネコに鎖遺伝子が含ま
れていると思われたので、これをクローニングするター
ゲットとした。

に ネコ肝臓の染色体ＤＮＡ１００μ９をｌ１ｃｏＲＩで完
全消化した後、この５．５ｋｂに相当するＤＮＡ断片を
しょ稠密度勾配遠心［シ↓糖１０〜４０％（ｗｔ／ｖｏ
　ｌ）、２６００Ｏｒｐｍ。

１８時間、１５℃］により調製した１次にこのＤＮＡ断
片とλｇｔｌ　１ベクターＤＮＡ（ストラタジーン社）
のＥｃｏＲＩアームとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結
させ、ストラタジーン社のキットを用いて、ｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏパッケージングを行い、ネコ肝臓細胞のに鎖遺伝
子ライブラリィを得た。このライブラリィから、ヒトＣ
にプローブを用いて前述のクロスハイブリダイゼーショ
ンと同じ条件でプラークハイブリダイゼーション［Ｗ、
Ｄ、　Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｉｓ、　５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　１９６゜ｐ１８０　（１９７７）］を行
い、ネコＣに鎖エクソンを含むクローンＣＨに８ａを選
択した。このクローンの制限酵素切断点地図を第３図に
示す、このクローンのＥｃｏＲＩ挿入断片をＴｈｏｍａ
ｓとＤａｖｉｓの方法［Ｍ、ＴｈｏｍａｓＲ，Ｗ、　Ｄ
ａｖｉｓ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９１．　
ｐ３１５　（１９７４）参照］によりファージＤＮＡよ
り単離し、さらにｐｕｃ　１８ベクターのＥｃｏＲＩサ
イトにサブクローニングした。

ＣＥに　＆　　　いた　　　　ン　　　　　　　　　ゝ
　　　ロ　　ト析 初めにこのＣＥにδａを用いたサザンプロット分析を行
った。ネコ肝臓細胞の染色体ＤＮＡｌ０μ９を制限酵素
ＲｃｏＲＩで切断し、このＤＮＡを電気泳動で０ゴ％ア
ガロースゲルに展開し、ナイロンメンブレンフィルター
（シーンスクリーンプラス、ＮＥＷ・リサーチ・プロダ
クト）に転写後、ネコＣに鎖領域を含んだ［３２ｐ］標
識ＣＥにδａプローブとサザンハイブリダイゼーション
を行った。サザンハイプリダイゼーションの方法はシー
ンスクリーンプラスに付属していたマニュアルのプロト
コールに従った。検出されたバンドのパターンを、以前
行ったヒトＣに鎖プローブを用いたクロスハイブリダイ
ゼーションのパターンと比較した結果、全く同じ位置（
約５．５ｋｂ）にバンドがみとめられた０分子サイズは
λフアージＤＮＡを旧ｎｄｍで切断したマーカーＤＮＡ
によって算出した。この結果より、ネコＣに領域遺伝子
は、他にサブタイプをもたない１種類の遺伝子であるこ
とが推定された。これは、ヒト及びマウスの例［Ｐ、　
Ａ。

Ｌｆｉｅｔｅｒら、　Ｃｅ１１．　２２．ｐ１９７　　
（１９８９）：　　Ｈ，Ｅ、Ｍａｘら、Ｐｒｏｃ、　　
Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　
　７６、　　Ｐ３４５０　　（１９７９）コからも示唆
されている。

次にノーザンプロット分析を行った。ハイブリダイゼー
ションに使用したＲＮＡはネコ牌臓細胞がら全ＲＮＡを
グアニジウムチオシアネート法［Ｊ、Ｍ。

Ｇｈｉｎｇｗｉｎら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ、　
　１＋！１．ｐ５２９４　　（！９７９）コにより分離
し、さらにオリゴｄＴカラム（ファルマシア〉を用いて
ポリＡ＋ＲＮＡに精製したものである。このＲＮＡ２μ
９を電気泳動により３％ホルムアルデヒドを含む０．７
５％アガロースゲルに展開し、ナイロンメンブレンフィ
ルター〈シーンスクリーンプラス）に転写後、［３２ｐ
］標識ＣＥにδａプローブとノーザンハイブリダイゼー
ションを行った。ノーザンハイブリダイゼーションの方
法はシーンスクリーンプラスに付属のマニュアルのプロ
トコールに従った。このプローブにより約１．３ｋｂの
位置にバンドが検出された（第２図）、このサイズはマ
ウス及びヒトで知られている免疫グロブリンに鎖遺伝子
のサイズとほぼ同じである。

これら２つの結果より、このＣＥに８ａは機能的なネコ
ＣｘｔＢ域を含む活性な遺伝子であることが推定された
。

ＣＥに　ユ ネコＣに領域の核酸塩基配列を調べるなめに、クローン
ＣＥにδａよりＣＡ−領域を含む約２．　（ｌｋｂのＤ
ＮＡ断片（Ｘｙａｌ−Ａｖａ　Ｉｉ！７？片）を単離し
、ｐＵｃ１８ベクターのＸｖａｌ−Ａｖａｌサイトに再
クローニングしな、このプラスミドを常法Ｆ例えば、Ｔ
、　Ｍａｎｉａｔｉｓ″ＭｏＩｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ″Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂ、　　（１９８２）参照］に従って大量に調製し、さ
らにこのＸｖａｌ−ＡｖａＩ断片からＸｂａｌ−Ｄｄｅ
　Ｉ、　Ｄｄｅｌ−１（ａｅｍ　、　Ｈａｅｍ　−Ｈｌ
ｎｆ　Ｔ、　ＸｂａＩ−Ｒｓａｌの各小ＤＮＡ断片を調
製した。これらの各小断片をＴ４−ＤＮＡポリメレース
を用いて切断面を平滑末端に変えた後、Ｍ１３＋５ｐ１
９ベクターの５ＩＩｌ＆　Ｉサイトに宝ライゲーション
キットを用いて挿入した。東洋紡インストラクトマニュ
アルの方法に従い、ＪＭＩＯ１のコンピテント細胞を調
製し、Ｃに領域遺伝子を挿入したＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡ
で形質転換させ、−重鎖ＤＮＡを抽出精製した。さらに
この−重鎖ＤＮＡの核酸塩基配列決定は、タカラＭ１３
シークエンシングキットと富士・ジェンサー・ゲル・シ
ステムを用いて行った。核酸塩基配列決定を行った方向
は第３図に示す。核酸塩基配列決定の結果、１つのエク
ソンからなるＣに遺伝子が確認された。第４図にその結
果を示す。

さらに、この核酸塩基配列を基にアミノ酸に変換したと
ころ、この遺伝子がオープンリーディングフレームをと
り、疑似遺伝子でないことが示されたく第５図〉。

このＣＨに８ａの核酸塩基配列を基に遺伝子解析ソフト
（Ｇｅｎｅｔｙｘ：ソフトウェア開発社製）を用いて、
ＬＡ３ＬとＥＭＢＬのデータベースをボモロジー検索し
たところ、ヒト及びマウスの免疫グロブリンに鎖と高い
ホモロジーを示し、免疫グロブリンに鎖遺伝子以外の遺
伝子とはホモロジーは示さなかった。

ＣＥに８ａ遺伝子のＣに領域とマウス及びヒトのＣに領
域をホモロジー比較すると、核酸レベルでマウスとは７
３．３％、ヒトとは７３，０％であり、アミノ酸レベル
でマウスとは５４．７％、ヒトとは５９．６％であった
。

以上の結果より、ＣＥに８ａ遺伝子は間違いなくネコに
鎖に属する遺伝子であり、マウス−ネコキメラ抗体の作
製を可能にする遺伝子であると思われた。

尚、本発明者らは、このようなネコ免疫グロブリンに鎖
の定常領域をコードする遺伝子が組み込まれているベク
ターを有する大腸菌を、　Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｉａ　ｃ
ｏｎ　ＦＣＫ−ＣＥＫ８Ａとして微工研菌寄第１０９８
５号として寄託している。

マ　　ス　　　　　ロ　　１　ンに　　　　　　　Ｖに
伝３ゴΣ１蔗 抗ＣＰｖ抗体産生ハイプリドーマＪＰ２　（γ１．に）
より染色体ＤＮＡを単離し、染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　１００
μｇを制限酵素旧ｎｄｍで切断する（イヌバルボウイル
スを中和するモノクローナル抗体は、ネコパルボウイル
スをも中和できることが知られている）０次にこのＤＮ
Ａ断片とλＬ４７ベクターＤＮＡ　（ストラタジーン）
をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させ、ＪＰ２細胞の染
色体ＤＮＡライブラリィを得た。このライブラリィから
、プラークハイブリダイゼーション法［Ｗ、　Ｄ、　Ｂ
ｅｎｔｏｎ＋Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｉｓ、　　５ｃｉｅｎｃ
ｅ。

１９６、　（ｐ１８０　（１９７７）参照］によりマウ
スＪにプローブを用いて抗ＣＰ■抗体の■に領域遺伝子
を含むクローンＪＰ２ｇＬ４１１を選択した。第６図は
その制限酵素切断点地図である。゛この遺伝子断片より
■にエクソン部分を含んだＢａ■旧−旧ｎｄｌｌ［断片
を調製し、以下のネコ−マウスキメラ抗体り鎖遺伝子の
材料とした。

（６）マウス−ネコキメラ抗体Ｌｌ遺伝子（ＰＳＶ２−
ＥＰＬ刈ＬｖｊＩ （４）で得られたプラスミドＰＣＥに８ａＸ＾を旧ｎｄ
ｍ及びＥｃｏＲＩで切断し、ネコ免疫グロブリンＣに鎖
遺伝子を含む２ｋｂの旧ｎｄｍ　−ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ
断片を調製した。

一方、（５）で得られたマウス免疫グロブリンＶに鎖遺
伝子を含むプラスミドｐＪＰ２ｇＬ４１１をＢａｍＨＩ
及び旧ｎｄ■で切断し、４．４ｋｂのマウス免疫グロブ
リンＶに−Ｊに領域遺伝子を得た。これらの遺伝子を、
ＥｃｏＲＩ及びＢａｇ旧で切断したｐＳＶ２−ｎｅｏベ
クター［Ｐ、　Ｊ、　５ｏｕｔｈｅｒｎら、　Ｊ、Ｍｏ
１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、　　ｉ、ｐ３２７　　（
１９８２）コ　ともに宝ライゲーションキットを用いて
連結し、プラスミドｐｓＶ２−ＰＬＣＣにを得た０次に
、ヒトγ鎖のエンハンサ−領域を含む１．　ＯｋｂのＲ
ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片［Ｔ、　Ｈ，Ｒａｂ
ｂｉｔｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　３０６．　ｐ
８０６（１９８３）　］の両端をＴ４−ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて平滑末端に変え、宝ライゲーションキット
を用いてこの両端にＢａ１１旧リンカ−（宝社製）を連
結し、両端がＢａｌ６旧サイトに変更されたヒトγ鎖エ
ンハンサ−領域遺伝子を得た。この遺伝子を前述のプラ
スミドｐｓＶ２−ＰＬＣＣにのＢａａ旧サイトに挿入し
プラスミドｐＳＶ２−ＥＰＬＣＣにを作製した。　（第
７図）

【図面の簡単な説明】

第１図は、ネコ肝臓細胞の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで切断し、これをヒトＣに領領域を含んだ［３２
ｐ］標識プローブとサザンハイブリダイゼーションを行
った結果の模式図である。 第２図は、ネコ肺臓細胞から抽出したポリＡ＋ＲＮＡと
［３２ｐ］標識ＣＥに８ａプローブとのノーザンハイブ
リダイゼーションの模式図である。 第３図は、本発明においてクローニングされたネコ免疫
グロブリンに鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片（ＣＥ
に８ａ＞の制限酵素切断地図および塩基配列解析を行っ
た領域〈→）を示す。 第４図は、本発明でクローニングされたＤＮＡ断片ＣＥ
に８ａに存在するネコ免疫グロブリンに鎖定常領域をコ
ードするＤＮＡ塩基配列を示す。 第５図は、本発明においてクローニングされたＤＮＡ断
片ＣＥに８ａ中にコードされるネコ免疫グロブリンに鎖
定常領域の全アミノ酸配列を示す。 第６図は、実施例（５）で調製した抗ＣＰｖ抗体のＶに
領域遺伝子を含むクローンＪＰ２ｇＬ４１１の制限酵素
切断点地図を示す。 第７図は、実施例（６）で構築した抗ｃＰｖマウス×ネ
コキメラ抗体り鎖を発現する遺伝子（ｐｓＶ２−４ＰＬ
ＣＣに）の構築図を示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）ネコ免疫グロブリンκ鎖の定常領域をコードする
   ＤＮＡ配列を有する遺伝子断片
2. （２）該定常領域が１０９個のアミノ酸からなるペプチ
   ドであり、カルボキシ末端側４個のアミノ酸配列が、−
   Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕである前記第（１）項
   記載の遺伝子断片。
3. （３）該ＤＮＡ配列が下記の制限酵素切断地図で示され
   る制限酵素切断パターンを有するものである前記第（１
   ）項記載の遺伝子断片。 ▲数式、化学式、表等があります▼
4. （４）該定常領域が下記のアミノ酸配列かちなる前記第
   （２）項記載の遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】
5. （５）下記の塩基配列を有する前記第（３）項記載の遺
   伝子断片。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
6. （６）マウス免疫グロブリンＬ鎖の可変領域をコードす
   る遺伝子断片の３′側にネコ免疫グロブリンに鎖の定常
   領域をコードする遺伝子断片を接続したことを特徴とす
   るマウス×ネコキメラ抗体Ｌ鎖をコードする組換えＤＮ
   Ａ分子。
7. （７）該定常領域が１０９個のアミノ酸からなるペプチ
   ドであり、カルボキシ末端側４個のアミノ酸配列が、−
   Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕである前記第（６）項
   記載の組換えＤＮＡ分子。
8. （８）該定常領域をコードする遺伝子断片が下記の制限
   酵素切断地図で示される制限酵素切断パターンを有する
   ものである前記第（６）項記載の組換えＤＮＡ分子。 ▲数式、化学式、表等があります▼
9. （９）該ネコ免疫グロブリンκ鎖の定常領域が下記のア
   ミノ酸配列からなる前記第（７）項の組換えＤＮＡ分子
   。 【遺伝子配列があります】
10. （１０）ネコ免疫グロブリンに鎖の定常領域をコードす
    る遺伝子断片が下記の塩基配列を有する前記第（８）項
    記載の組換えＤＮＡ分子。 【遺伝子配列があります】
11. （１１）マウス免疫グロブリンＬ鎖の可変領域をコード
    する遺伝子断片の３′側にネコ免疫グロブリンκ鎖の定
    常領域をコードする遺伝子断片を接続したことを特徴と
    するマウス×ネコキメラ抗体Ｌ鎖をコードする組換えＤ
    ＮＡ分子が組み込まれた細胞用発現ベクターによって形
    質転換された細胞により発現されたマウスＸネコキメラ
    抗体Ｌ鎖ペプチド。
12. （１２）該定常領域が１０９個のアミノ酸からなるペプ
    チドであり、カルボキシ末端側４個のアミノ酸配列が、
    −Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕである前記第（１１
    ）項記載のマウス×ネコキメラ抗体Ｌ鎖ペプチド。
13. （１３）該定常領域をコードする遺伝子断片が、下記の
    制限酵素切断パターンのＤＮＡ配列を有する前記第（１
    １）項記載のマウス×ネコキメラ抗体Ｌ鎖ペプチド。 ▲数式、化学式、表等があります▼
14. （１４）該定常領域が下記のアミノ酸配列であることを
    特徴とする前記第（１２）項記載のマウス×ネコキメラ
    抗体Ｌ鎖ペプチド。 【遺伝子配列があります】