JPH03103196A - 溶液中のイオン化可能成分の選択的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業」二の利用分野） 本発明は、溶液中のイオン化可能成分の選択的測定方法
に関するものである。

（従来の技術） 溶液の比重の測定は、食品工業や醗酵工業あるいは臨床
検査の分野で多く行なわれている。例えば、臨床検査の
分野では、尿中の比重測定による腎臓病の診断等が行な
われている。

尿比重は、尿中の溶質量を示すもので、腎臓の機能のバ
ロメータとして有用である。また、その値は、尿ψのイ
オン濃度および浸透圧と良奸な相関性を示すことが知ら
れている。通常、健常人の尿比重は、１．０１６〜１．
０２２であるが、その値が該範囲よりも小さい場合には
尿崩症、急性腎不全、腎流炎等の疑いがあり、一方、大
きい場合には、ネフローゼ症候群、種々の水分喪失量等
が考えられる。尿比重は、従来、比重瓶、比重計（浮秤
）等を使用するか、あるいは尿比重と相関性がある尿屈
折計または浸透圧計を用いて測定されてきた。

（発明が解決しようとする課ａ） しかしながら、比重瓶、比重計等を川いるこれらの方法
では、高価な測定器具を必要とするばかりでなく、破損
し難い器具を使用せざるを得ない、あるいは複雑な操作
を必要とするなど多くの問題点を有していた。

このような問題点を解決するために、液体の比重もしく
はオスモラティーの関数である検知再能な応答をなすこ
とができる物質を封入し、浸透による圧に対して壊れや
すくかつ半透明性の高分子膜の壁を有する少なくとも有
効数のマイクロカプセルからなり、該マイクロカプセル
がカプセル内外に一定の浸透圧勾配が生じた時に、膜壁
を介して封入された内容物を放出し、検知可能な応答を
生じることよりなる供試液体の比重もしくはオスモラリ
ティーの測定用組成物および該組成物を用いてなる測定
器具（特公昭６０−４６，３７４号）、（Ｂ）弱酸性も
しくは弱塩基性の多価高分子電解質および該電解質と試
験対象の試料との間のイオン交換に対して検知可能な応
答を生起せしめることができるｐＨ支持物質とからなる
液体試料のイオン強度測定用組成物（特公昭６２−１２
，８５８号）および（Ｃ）水溶液のイオン強度に対応す
る吸水量を示す湿潤性物質と、該吸水量の変動幅に対応
する溶解度を示すことにより透明度の変化を生じる吸水
指示物質を含む拭験層および該試験層の光学的バックグ
ランドとなる支持体よりなる水溶液試料の比重拭験用具
（特開昭６２−９５，４６２号）が知られている。

しかしながら、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の組成物を
使用する方法は、いずれもコスト高となるだけでなく、
測定作業も煩雑であり、しかも、充分な精度が得られな
いという問題があった。

したがって、本発明の目的は、溶液中Ｃイオン化可能戊
分の選択的測定方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 上記目的は、被測定物質を選択的にイオン化するための
イオン化剤を被測定溶液と接触させ、生成したイオンを
イオン濃度に溶解度が相関する色素と接触させて該色素
を溶出させ、かつ色素溶出量に応じた呈色濃度を検出す
ることを特徴とする溶液中のイオン化可能成分の選択的
測定方法により達成される。

本発明はまた、該イオン化剤が酵素である上記選択的測
定方法である。本発明はさら・に、被測定溶液とイオン
化剤との接触が酵素反応に適するｐＨを得るための緩衝
剤、酵素活性化剤および酵素安定化剤よりなる群から選
ばれた少なくとも１挿のものの存在下に行なわれる」二
記選択的測定方法である。本発明はまた、該被測定物質
が尿素であり、かつ該イオン化剤がウレアーゼである上
記選択的測定方法である。本発明はさらに、該色素がイ
オン性官能基を有する水溶性色素である」二記選択的測
定方法である。

（作用） 本発明によれば、ある秤の水溶性色素の溶解度が、溶液
中のイオン濃度に対応することを基本原理とするもので
あり、この原理を利用して溶液中のイオン濃度を測定す
ることができるのである。

さらに、ある物質を特異的にイオン化するイオン化剤を
この系に共存させることによりイオン化され得る物質の
測定ができるのである。

本発明方法は、被測定物質を選択的にイオン化するため
のイオン化剤を被測定溶液と接触させ、生成したイオン
をイオン濃度に溶解度が相関する色素と接触させて該色
素を溶出させ、かっ包素溶出量に応じた呈色濃度を検出
することにより行なわれる。

被測定溶液とイオン化剤との接触は、例えば被測定物質
を選択的にイオン化するためのイオン化剤を含脊するイ
オン化反応層内で行なわれる。イオン化剤としては、被
測定物質を選択的にイオン化し得るものであればいずれ
も採用でき、通常、酵素が用いられる。例えば被測定物
質が尿素であれば、酵素としてウレアーゼまたは尿素カ
ルボキシラーゼが用いられ、これにより溶液中の尿素量
を知ることができる。すなわち、尿素はウレアーゼまた
は尿素カルボキシラーゼによってアンモニアと炭酸に分
解する。これらの分解物は溶液中ではイオンとして存在
するために、尿素量がイオン濃度として検出される。尿
比重は、尿素中のイオン濃度に相関を示すだけでなく、
尿素量にも高い相関を示すことが知られているので、こ
の方法を用いた場合、尿中のイオン濃度と尿素の濃度を
同時に測定することが可能であり、より正確な比重値が
求められるのである。

尿素以外の被測定物質と酵素との関係には、例えばニコ
チン酸アミド、ビチオン、アニリド類等に対してはアミ
ダーゼ類をイオン化剤用の酵素として作用させてアンモ
ニウムイオンを、ヌクレオチド等のリン酸エステルに対
してフオスファターゼ類をイオン化剤用の酵素として作
用させてリン酸イオンを、核酸塩基、遊離アミノ酸等の
アミンに対してはデアミナーゼ類をイオン化剤用の酵素
として作用させてアンモニウムイオンを、タンパク質に
対してはプロテアーゼ類を作用させてアミノ酸イオンを
、また、アセチルＣｏＡ，スクシニルＣｏＡ，パルミト
イルＣｏＡ等のアシルーＣｏＡに対してはヒドラーゼ類
を作用させて脂肪酸イオンを解離させることができる。

これらイオン化剤は、通常、濾紙あるいは織布、不織布
、編布等の布吊等に担持されてイオン化反応層として使
用される。この場合、イオン化剤が最も効率よく反応す
るための他の戊分を含有させてもよい。例えば、イオン
化剤が酵素の場合、至適ｐＨを有する緩衝剤や酵素の反
応活性化剤、安定剤等がこれに該当する。例えば、ウレ
アーゼを用いた場合、安定剤としてジチオエリスリトー
ル、グルタチオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ
）等が添加される。

イオン化反応層内で生成したイオンは、色素と接触する
ことによりイオン濃度に応じて該色素が溶出してくる。

該色素の溶出は、溶液中のイオン濃度に溶解度が相関す
る色素を担持した試薬層内で行なわれる。

本発明における色素としては、イオン濃度に溶解度が相
関する水溶性色素であれば、いずれも使用できる。すな
わち、該色素は、その溶解度が、溶液のイオン濃度によ
って変化することを必要条件とする。溶液中のイオン濃
度に溶解度が相関する色素は、通常イオン性の官能基を
有しており、反対イオンでカウンターされた形である。

例えば、べ−シックブルー３の場合、イオン性官能基と
してアミノ基を有し、塩素イオンでカウンターされてい
る。

本発明で使用される水溶性色素としては、インジゴカル
ミン、ベーシックブルー３、ベーシックレッド９、ベー
シックレッド２９、アシッドブル−１２０、アシッドレ
ッド１１、アシッドレッド９７、クリスタルバイオレッ
ト、ブリリアントプルー６１ナフトールグリーンＧ，プ
ロシオンブル−ＨＢ等がある。

被測定溶液にこのような色素を接触させたとき、非溶解
物と溶解物との間で下記のようなイオン平衡が形成され
る。

Ｐ−Ａ”Ｂ−　一　Ｐ−Ａ”　十Ｂ−　　　（Ｉ）Ｐ−
Ｂ″″Ａ”　　４　　Ｐ−Ｂ−＋Ａ”　　　　（ＩＩ）
ただし、（Ｉ）は塩基性色素の場合であり（Ｉｔ）は酸
性色素の場合である。

溶液中のイオン濃度が高いときには、解離平衡が左向き
、すなわち、イオン化しない方向へ傾き、一方、溶液中
のイオン濃度が低いときには、解離平衡が右向き、すな
わち、イオン化し易い方へ傾く。したがって、イオン濃
度が低いほど色素は溶液に溶解し易く、一方、イオン濃
度が高いほど色素は溶液に溶解し難くなる。この原理を
試験紙形態の測定器具にするには、色素を保持した試薬
層と展開層から成る複合体が好ましく、検体試料に接触
させ、溶解した色素のみ展開層表面に溶出し、色素溶解
量は呈色濃度に反映されるという機構を持つ。

試薬層は前記色素が担持されかつ水透過性のものであれ
ばいずれでもよく、通常、該色素は、担体に直接担持さ
せるかあるいは微粒子に吸着させた色素を分散担持させ
る。この際、バインダーとしての水溶性高分子材料とと
もに担持させれば、色素が均一に分散して安定的に担持
され、しかも使用時に水溶液と接触すると容易に溶解す
るからである。

担体としては、濾紙あるいは織布、不織布、編布等の水
透過性担体が用いられる。また、バインダーとして使用
される水溶性高分子材料としては、ポリビニルビロリド
ン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプ口ピルセルロ
ース、ゼラチン等があり、これらの１挿または２挿以ト
を組合わせて用いられる。

微祉子としては、色素に対して吸着性を有するものであ
ればいずれも使用でき、その平均拉径は１０〜４００μ
ｍ１好ましくは５０〜１５０μｍである。一例を挙げる
と、例えばセライト、シリカゲル、ポリアミド、アルミ
ナ等があり、これらの１種または２種以上を組合わせて
も用いられる。

色素溶出量は、展開層表面の呈色濃度を検出させること
により行なわれる。

色素の展開層は、適当な摩さと濾水時間を何する吸水性
物質であり、例えば濾紙あるいは織布、不織布、編布等
の布帛が好適に使用される。また、この展開層に界面活
性剤ないし湿潤剤を付１ｊすることにより良好な呈色が
得られる場合がある。

界面活性剤ないし湿潤剤としては、例えば、アルキルサ
ルフエート、アルキルベンゼンスルホネート、コハク酸
ジアルキルエステルスルホン酸ナトリウム、アミドスル
ホネート、リシノール酸エステルの硫酸エステルナトリ
ウム、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩、モノソジ
ウムα−スルホノ脂肪酸エステル、ソジウムジアルキル
ホスフ工一ト等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエチ
レンアルキルフェノール、ポリオキシエチレンーポリオ
キシプロピレンーポリオキシエチレングリコール、ポリ
オキシエチレン−９，１０−オクタデカンジオール、ポ
リオキシエチレン−９．１０−ジヒドロキシステアロニ
トリル、直鎖二級アルコールのエチレンオキサイド付加
物等の非イオン界面活性剤等がある。

本発明による測定器具を製造するに際して、色素あるい
は色素を吸着させた微粒子をバインダーに分散させて試
薬層を形成する場合には、支持体または展開層に試薬層
をコーティングする方法を用いてもよい。色素を溶解ま
たは懸濁させたバインダーを含有する溶媒をコーティン
グマシンまたはスプレーガンを用いて担体または展開層
に塗布、含浸させ、ついで乾燥することにより試薬層が
得られる。このようにして得られる試薬層は、必要によ
り接着剤を用いて展開層を積層することにより本発明の
測定器具が得られる。また、さらに両面テープ、接着剤
を用いて支持体を固着することもできる。また、試薬層
が担体に色素を吸着させた形状である場合、試薬層と展
開層は水溶性バインダーで接着したりあるいは接着する
ことなしに支持体（ホルダー）に封入してもよい。

また、必要により界面活性剤ないし湿潤剤で処理された
展開胎の一面から前記色素を溶解または懸濁させたバイ
ンダーを含何する溶媒を一面に憧布または展開層を残し
て部分的に含浸させて試薬層と展開層を一体的に形成し
てもよい。

つぎに図面を参照しながら、本発明で使用される測定器
具の一実施態様を説明する。

第１図（Ａ）は、本発明で使用される測定器具の第１の
実施態様を示すもので、基本的には、イオン化反応層１
に隣接して展開層３が設けられさらに該展開層３に隣接
して試薬Ｊｍ２形戊されてなるもので、該試薬屓２には
、必要により支持体５が両面粘着テーブ４または接着剤
層（図示せず）等を介して取付けられる。

第１図（Ｂ）は、第１図（Ａ）の変形例であって、イオ
ン化反応層１、展開層３および試薬層２を積層してなる
あるいはそのうちのいずれか２層を一体的に形成してな
るものを保持部６を備えた支持体５に固定してなるもの
である。

第２図（Ａ）は、本発門で使用されるｍリ定器具の第２
の実施態様を示すもので、イオン化反応層兼展開層１７
に隣接して試薬層１２が形成されてなるもので、該試薬
層１２には、必要により支持体１５が両面粘着テーブ１
４または接着剤層（図示せず）等を介して取付けられる
。

第２図（Ｂ）は、第２図（Ａ）の変形例であって、イオ
ン化反応層兼展開層１７と試薬層１２との積層体を保持
部１６を備えた支持体１５に固定してなるものである。

第３図は、本発明で使用される測定器具の第３の実施態
様を示すもので、イオン化反応層２１に隣接して試薬層
２２が設けられ、さらに、該試薬層２２に隣接して展開
層２３が形成されてなるもので、これらは透明フィルム
２８を保持部２６および開口部２つを備えた支持体２５
に固定してなるものである。

本発明による測定器具は、被測定溶液に浸漬させること
により被測定物質がイオン化剤の作川により選択的にイ
オンに解離し、該解離イオンは色素と接触して前記色素
が前記式■または■によってイオンに解離し、非溶解物
と溶解物内でイオン平衡を形成しその解離度に応じて呈
色濃度が変化して展開層に現われるので、これを例えば
、展開層に特定波長の光を投射し、反射吸光度を測定す
ることにより測定される。また、標準呈色濃度表との比
較によって測定することもできる。さらに、第３図に示
す測定器具の場合には、上方よりイオン化反応層２１に
被測定溶液、例えば尿を滴下すると、尿中の尿素は前記
イオン化剤によりイオンに解離し試薬層２２で前記イオ
ン平衡を形成して色素を溶出させて展開層２３に至るの
で、色素がそのイオン濃度に対応して展開層２３の呈色
濃度が変化する。これを下方の開口部２９より光を投射
し、その反射吸光度を測定することにより、着色尿であ
っても、着色成分の影響を受けることなく呈色濃度を測
定することができる。

なお、第４因はインジゴカルミン、第５囚はべ一シック
ブルー３、第６図はベーシックレッド２９の場合の溶解
度助線をそれぞれ示す。

このような吸光度は、後記実施例から明らかなように、
被測定溶液の濃度および比重と相関関係にあるので、該
吸光度を測定することにより該濃度および比市を測定す
ることができる。また、該吸光度は、イオン濃度、すな
わち浸透圧とも相関するので、該吸光度を測定すること
により浸透圧を測定することができる。さらに、検出は
比色によって行なうこともできる。

（実施例） つぎに、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する
。

実施例１ 濾紙（アドバンテックＮｏ．５１Ａ）を、０．　　２５
％ウレアーゼ（非活性１４０ユニット／■）、０．１％
ＥＤＴＡ，１％トライトン　Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ
　Ｘ−１００）　　（０−ム・アンド・ハース社製アル
キルアリルポリエーテル非イオン界面活性剤）および１
％ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）を含有する水溶液に
浸漬して含浸させたのち、４０℃で４０分間乾燥してイ
オン化反応層とした。

一方、濾紙（アドバンテックＮｏ．２０２）を０．５％
トライトンＸ−１００を含有するエタノールに浸漬して
含浸させたのち、６０℃で３０分間乾燥して展開層とし
た。

さらに、濾紙（アドバンテックＮｏ．４６２）を、４％
のベーシックブルー３水溶液に浸漬して含浸させたのち
、６０℃で３０分間乾燥し、適当な大きさに切断したも
のを試薬層として用いた。得られたイオン化反応層と試
薬層と展開層とを順にホルダーに封入して測定器を得た
。

実施例２ 実施例１と同様の方法でイオン化反応層を形成し、さら
に実施例１と同様の方法で得られた展開層の裏面に、２
％のベーシックプルー３および２％のポリビニルピロリ
ドンＫ−３０００を含有するクロロホルムよりなる色素
懸濁液をスプレーし、室温で３０分間乾燥させて試薬層
を形戊させた。

得られたイオン化反応層と試薬層を形成させた城開層（
試薬層を下側に）を順にホルダーに封入して測定器を得
た。

実施例３ 濾紙（アドバンテックＮｏ．２０２）を０．２５％ウレ
アーゼ（比活性１４０ユニット／■）、０．１％ＥＤＴ
Ａ，１％トライトン　Ｘ−１００およびジチオエリスリ
トール（ＤＴＥ）を含有する水溶液に浸漬して含浸させ
たのち、４０℃で４０分間乾燥してイオン化反応層兼展
開層を形成した。

一方、２％ベーシックブルー３および２％のポリビニル
ビロリドンＫ−３０００を含有するクロロホルムよりな
る色素懸濁液を両面テープにスプレーし、室温で３０分
間乾燥させて試薬層を形成させた。得られた拭薬層を付
与した両面テープの試薬層側を、前記イオン化反応層兼
展開層と接着し、適当な大きさに切断し、ポリスチレン
フィルムの支持体の一端に接着し、測定器を得た。

実施例４ １％のベーシックブルー３および１％のポリビニルピロ
リドンＫ−３０００を含有するメタノールよりなる色素
溶液を両而テープにスプレーし、室温で３０分間乾燥さ
せて試薬層を形戊させた。

得られた試薬層を付与した両面テープの試薬層側を、実
施例３と同様方法で得られたイオン化反応層兼展開層と
接着し、適当な大きさに切断し、支持体の一端に接着し
、測定器を得た。

実施例５ セライト３ｇを３％ベーシックブルー３水溶液３ｍｌ中
で８時間攪件後濾過し、デシケータで乾燥して色素吸着
微粒子を調製した。２％の色素吸着微粒子および２％の
ポリビニルビロリドンＫ−３０００を含有するクロロホ
ルムよりなる色素吸着微粒子懸濁液を、実施例３と同様
の方法で得られたイオン化反応層兼展開層の裏面スプレ
ーし、室温で３０分間乾燥させて試薬冶を形或させた。

得られた拭薬層を付与したイオン化反応層兼展開層を適
当な大きさに切断し、両面テープでボリスチレンフィル
ムの支持体の一端に接着し、測定器を得た。

実施例６ 不織布（セーレンＳＫ−７０６）を、０．２５％ウレア
ーゼ（比活性１４０ユニット／■）、０．１％ＥＤＴＡ
，１％トライトン　Ｘ−１００および１％ジチオエリス
リトール（ＤＴＥ）を含有する水溶液中に浸漬して含浸
させ、４０℃で４０分間乾燥してイオン化反応層兼展開
層とした。ついで、２％ベーシックブルー３および２％
ポリビニルピロリドンＫ−３０００を含−Ｈするクロロ
ホルムよりなる色素懸濁液を両面テープにスプレーし、
室温で３０分間乾燥させて試薬層を形戊させた。

得られた試薬層を付与した両面テープの試薬層側を、実
施例３と同様の方法で得られたイオン化反応層兼展開層
と接着し適当な大きさに切断し、両面テープでポリエチ
レンフィルム支持体の一端に接着し、測定器を得た。

［試験只の評価］ 実施例２の水（比重１．０００標準液）滴下後３分間の
波長６０８ｎｍにおける、展開層表面の反射吸光度の変
化と時間の関係を第７図に示す。測定は大塚電子社製の
ＭＣＰＤ−２００を用いて行った。

実施例７ 実施例１〜６で作成した測定器について比重１．０００
〜１．０３０の尿素水溶液を滴下し、反ＪＩＪ吸光度を
測定した。その結果を第１表に示す。

第１表のごとく、それぞれの比市に相関した呈色が獲ら
れた。さらに、インジゴカルミン、ベーシックレッド２
つを用いた場合も同じような比重と呈色の相関か得られ
た。

また、実際に尿検体を用いて、本発明方法と屈折型尿比
重計ユリベット（日本光学株式会社製）で測定した結果
と比較したところ、第８図のグラフが得られた。

（発明の効果） 以］二述べたように、本発明は、被測定物質を選択的イ
オン化するためのイオン化剤を被測定溶液と接触させ、
生成したイオンをイオン濃度に溶解度が相関する色素と
接触させて該色素を溶出させ、かつ色素溶出量に応じた
呈色濃度を検出することを特徴とする溶液中のイオン化
可能成分の選択的測定方法であるから、それ自体は水中
でイオンに解離しない物質であっても、イオン化剤によ
りイオン化され得る物質であればいずれも測定でき、特
に被測定物質が生体由来の成分である場合、多くはそれ
を特異的に分解、イオン化する酵素が存在するため、利
用範囲は広いのである。本発明方法は、それらの酵素を
用いてイオン化したのち、溶液中のイオン濃度に溶解度
が相関する色素を用いた系でイオン濃度として検出する
というメカニズムのため、拭薬組戊や構造が比較的簡単
であり、容易な操作で迅速に正確な結果が得られる。特
にイオン化剤としてウレアーゼを用いた試験法によれば
、尿素量とイオン量とが同時に測定できるため、尿比重
の正確な測定が可能となり、臨床検査の分野における腎
臓病の診断に貢献し得るものである。また、尿の比重測
定の場合、尿素をイオン化するためのウレアーゼを使用
することによって尿中の尿素量を測定することができる
が、この系は、尿中のイオン濃度の影響も受けるため、
結局尿素量とイオン量の両者を検出することが可能とな
る。尿比垂はこの尿素量とイオン量に深い相関性を有す
るため、従来のイオン濃度や浸透圧のみ検出する方法に
比して、より正確な比重値が測定可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図（Ａ）〜（Ｂ）、第２図（Ａ）〜（Ｂ）および第
３図は本発明による測定器具の各実施態様を示す断面図
、第４〜６図は各色素の吸光度と比重との関係を示すグ
ラフ、第７図は展開層表面の反射吸光度の変化を示すグ
ラフであり、また第８図は吸光度と比重との関係を示す
グラフである。 第１図 （Ａ） １，２１・・・イオン化反応層、 ２，１２．２２・・・試薬層、 ３，２３・・・展開層、 ４．１４・・・両面テープ、 ５，１５．２５・・・支持体、 １７・・・イオン化反応層兼展開層。 第２図 （Ａ） ５

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）被測定物質を選択的にイオン化するためのイオン
   化剤を被測定溶液と接触させ、生成したイオンをイオン
   濃度に溶解度が相関する色素と接触させて該色素を溶出
   させ、かつ色素溶出量に応じた呈色濃度を検出すること
   を特徴とする溶液中のイオン化可能成分の選択的測定方
   法。
2. （２）該イオン化剤が酵素である請求項１に記載の溶液
   中のイオン化可能成分の選択的測定方法。
3. （３）被測定溶液とイオン化剤との接触は、酵素反応に
   適するｐＨを得るための緩衝剤、酵素活性化剤および酵
   素安定化剤よりなる群から選ばれた少なくとも１種のも
   のの存在下に行なわれる請求項１または２に記載の溶液
   中のイオン化可能成分の選択的測定方法。
4. （４）該被測定物質が尿素であり、かつ該イオン化剤が
   ウレアーゼまたは尿素カルボキシラーゼである請求項１
   〜３のいずれか一つに記載の溶液中のイオン化可能成分
   の選択的測定方法。
5. （５）該色素がイオン性官能基を有する水溶性色素であ
   る請求項１〜４のいずれか一つに記載の溶液中のイオン
   化可能成分の選択的測定方法。