JPH0276587A - α―アミラーゼを生産するためのプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ズブチリシン・カールスベルグ（ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓｉｎ　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）の場合と同し条件下
で、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）においてアミラーゼ
を産生ずることかできるプラスミドに関する。

アミラーゼは、デンプンのα−１，４−および／または
α−１，６−結合を開裂できる酵素と考えられている。

アミラーゼは、デンプンの改変に工業的に使用されるが
、もっとも、これはデンプンを含んだ汚れを除去するた
めの洗剤としても使用することができる。熱安定性のα
−アミラーゼは、例えばバシルス・リシェニフォルミス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）か
ら工業的な量で入手することかできる。

このα−アミラーゼは通常、発酵によって得られる。そ
して、主としてバシルス・リシェニフォルミスの指数増
殖期の後期に分泌される。この酵素の産生性を改善する
ため、現在では、必要な物を培地に添加して収量を増大
させたり、または選択によって過剰産生性突然変異体を
入手する、などが試みられている。また、バシルス・ズ
ブチリス（枯草菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ）内でクローン化遺伝子を増幅させて増大した産生性
を有する菌株を人手することも試みられている［ピコッ
ト（Ｐｉｇｇ。

ｕ）ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　
、　Ｒｅｓ、　、　Ｃｏｍｍ、　ｌ　２２．　Ｉ　７５
（１９８４）、　ヘッダ（Ｇ、　ｌ１ｅｐｐ）ら、シー
ン（Ｇｅｎｅ）、　２３．２６７（１９８３）］。

これらの方法はすへて、グルコースによるいわゆるカタ
ボライトリプレッション（異化代謝産物抑制）を受け、
このことは著しい不都合である。

換言すれば、発酵培地中のデンプンにα−アミラーゼが
作用することによって生成されたグルコ−スは、それ以
上のα−アミラーゼの合成を抑制してしまうのである。

この要因は、欧州特許出願第０　２０５　３７］号に記
載された方法においては考慮が払われており、そこでは
、Ｂ、リシェニフォルミス由来の熱安定性α−アミラー
ゼの遺伝子を、バシルス・ズブチリスのレバンーサツカ
ラーセ（ｌｅｖａｎ−ｓａｃｃｈａｒａｓｅ）の遺伝子
部分、５ａｃＲ−ｓａｃＢ’−８Ｃ−８Ｄａｍｙｓに連
結させることが教示されている。この構築物では、α−
アミラーゼは、カタボライトリプレッションもなく、砂
糖の存在下に指数増殖期にあるバシルス・ズブチリスか
ら産生される。

しかし、レバン−サツ力う−セプロモーターを活性化で
きる工業的発酵条件は、研究されておらず、おそら（は
コントロールが困難である。さらに、この欧州特許出願
第０　２０５　３７１号の方法は、技術的な課題として
特に望まれるアミラーゼとプロテアーゼとの混合物が、
両システムにとって最適の条件下では同時に産生される
、という可能性を示唆していない。

従って、本発明が解決しようとする課題は、プロテアー
ゼの生産に使用されている確立された方法を利用して大
量の酵素を過剰に生産することができるように、アミラ
ーゼ遺伝子、例えばＢ、リフェニフォルミス由来の熱安
定性α−アミラー七の遺伝子の発現性を改変することで
ある。

このように、本発明は、タンパク質を発現するためのプ
ロモーター、およびそれと機能的に連結した酵素の構造
遺伝子を含有している、バシルス・リシェニフォルミス
で発現可能なバシルスプラスミドであって、アミラーゼ
構造遺伝子と連結したプロテア−七プロモーターを含有
することを特徴とするプラスミドに関する。

本発明はさらに、本発明のプラスミドによって形質転換
された微生物、およびアルカリ性プロテアーゼの通常の
条件下でアミラーゼを、所望ならばそれとプロテアーゼ
との混合物として生産する方法に関するものである。

本発明はまた、α−アミラーゼを、所望ならばそれとア
ルカリ性プロテアーゼとの混合物の形で生産する方法で
あって、増殖の定常期でα−アミラーゼを産生ずること
ができるプラスミドを含有する、バシルス属のバシルス
・リシェニフォルミスまたはバシルス・ズブチリスの微
生物を、ズブチリシン・カールスベルグ（ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓｉｎ　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）の生産条件下で培養し
、細胞外に産生された酵素を分離し、後処理することを
特徴とする、α−アミラーゼの生産方法に関するもので
ある（ここに、該プラスミドは、バシルスで発現でき、
かつタンパク質を発現するためのプロモーターおよびそ
れと機能的に連結した酵素の構造遺伝子を含有している
プラスミドであって、アミラーゼ構造遺伝子と連結した
プロテアーゼプロモーターが該微生物内のプラスミドに
存在することを特徴とするプラスミドである）。

その最も一般的な態様として本発明は、制限部位に挿入
されたプロテアーゼプロモーター、特にバシルス・リシ
ェニフォルミス由来のプロテアーゼであるズブチリシン
・カールスベルグのプロモーター、およびそれと機能的
に連結したアミラーゼ遺伝子、特にバシルス・リシェニ
フォルミス由来のα−アミラーゼ遺伝子を含有する、バ
シルスにとって適切な典型的プラスミドフラグメントか
ら構成されるプラスミドを提供するものである。

さらに、この挿入されるフラグメントは、機能するため
に必要な他のＤＮＡフラグメン１−１例えばプロ／プレ
（ｐｒｏ／ｐｒｅ）配列、開始コドンおよび停止コドン
なども含有していなければならないのであるが、さらに
特定の発現作用を示さない過剰な配列を含有していても
よい。

出発プラスミドは、１つまたはそれ以」−の耐性マーカ
ー、および１つまたはそれ以」二の代表的な制限酵素に
対する制限部位も含有する必要がある。

プロテアーゼプロモーターおよびアミラーゼ遺伝子の構
築物は、酵素の制限部位、または２つの酵素の切断によ
って創製される制限部位に挿入することができる。

本発明のプラスミドは、例えばアルカリ性プロテアーゼ
であるズブチリシン・カールスヘルグなどのプロテアー
ゼのプロモーターおよび構造遺伝＝７− 子を含有する、それ自体公知のプラスミドなどから調製
することができる。所望のアミラーゼの構造遺伝子を含
有するプラスミドを以後の出発構成要素として使用する
ことができる。プロテアーゼプラスミドの場合、特異的
突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓ　ｉ
ｓ）によってプロテアーゼ構造遺伝子の開始コト゛ンの
前に酵素制限部位を押入する。この操作は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　（大腸菌）における周知の方法によって実施するの
が好ましい。アミラーゼの場合にも制限部位を開始コド
ンの前に創製し、これにより、所望ならば、特定の発現
作用を示さない過剰の配列を停止］−コドンの後ろに含
有したアミラーゼ構造遺伝子の全体を除去することがで
きる。そして、プロテアーゼプロモーターは、開環およ
び再連結（再ライゲート）によってアミラーゼ遺伝子を
導入することができるプラスミドに挿入することができ
る。

プロテアーゼのプロモーターおよび構造遺伝子を含有す
る適切な出発プラスミドは周知であり、例えばＤＥ−Ｏ
５３５２７９１３に記載されている。これに引用された
プラスミドは、１つまたはそれ以上の耐性マーカーおよ
び自由に使用できる制限酵素に対する制限部位を有する
、一般に入手可能な出発プラスミドから誘導される。こ
れら出発プラスミドは、バシルスに適したものでなけれ
ばならない。出発プラスミドとしては、例えばｐＢｃＥ
１６、ｐｃ１９４、ｐＵＢ］Ｉｏ、ｐＥ１９４、ｐＳＡ
２］００、ｐＰＩ、６０８、ｐＢＤ６４などが挙げられ
る。これらのプラスミドは次ぎに挙げた文献中に見いだ
すことができる：バーナード（Ｂｅｒｎｈａｒｄ　Ｋ、
）、シュリンプ（ＳｃｈｒｅｍｐｈＨ，）、およびゲベ
ル（Ｇｏｅｂｅｌ　’Ｉ１．）ら、ジャーナル・オブ・
バタテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、
　１３３：８９７−９０３（１９７８）、 グリツクサン（Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、　Ｊ、　）、コ
ンテント（ＣｏｎＬｅｎｔｅ、Ｓ、）、およびデユラン
−（Ｄｕｂｎａｕ、　Ｉ）、　）ら、ジャーナル・オブ
・バクテリオロシー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）
。

世３］８−３２３（＋９７８）、 ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｄ、Ｍ、）、デュバ
ル（Ｄｕｖａｌｌ、１シ、Ｊ、）、およびロヘソト（Ｌ
ｏｖｅｔｔ、　Ｐ、　Ｓ、　）ら、ンヤ−ナル・オブ・
バクテリオロン−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）。

月６：１１６２−１１６５（１９８１）、グリックザン
（Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、　）、シベイクマ−（Ｓｈｉ
ｖａｋｕｍａｒ、　Ａ、　Ｇ、　）、およびデュブノー
（Ｄｕｂｎａｕ、　Ｄ、　）ら、ジャーナル・オブ・ハ
タテリオロシー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、川：
２４６−２５３（１９８０）、エールリッヒ（Ｅｈｒｌ
　ｉｃｈ、　Ｓ、　Ｄ、　）、ビュルステユーンーペテ
グロウ（Ｂｕｒｓｚｔｙｎ−ＰｅＬｔｅｇｒｅｗ、　Ｉ
Ｉ）、ストロイノウスキー（Ｓｔｒｏｙｎｏｗｓｋｉ、
　Ｊ、　）、およびリーデルペルク（１、ｅａｄｅｒｂ
ｅｒｇ、　Ｊ、　）ら、リコンビナント・モレキュルズ
（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ）　：
科学および社会への影響（Ｉｍｐａｃｔ　ｏｎ　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｏｃｉｅｔｙ）、レイブン出版（
Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、　６９−８
０頁（１９７７）、ならびに ウェイズブラム（Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、　Ｂ、　）、グラ
ハム（Ｇｒａｈａｍ、　Ｍ、　Ｙ、　）、グリックザン
（Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、　）、およびデュブノー（１
）ｕｂｎａｕ、　Ｄ、　）ら、ジャーナル・オブ・バク
テリオロン−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、　１
３７：６３５−６４３（１９７９）。

適切な出発プラスミドを選択する際の重要事項として、
これらは、特定の制限酵素により、その特性を喪失する
ことなく、線状化され得る必要かあることを忘れてはな
らない。これら出発プラスミドの特性として考えられる
のは、ハ／ルスにおいて複製、耐性、および発現が可能
であることなどである。適切な出発プラスミドを線状化
できる、現在の特定の制限酵素には、例えばＢａｍＨＩ
、ＥｃｏＲＴ、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＰｓｔｌなどがあ
る。

ＤＥ　　３５　２７　９１３に教示されているように、
これらの出発プラスミドは制限酵素で開裂でき、プロテ
アーゼ、特にズブチリシン・カールスヘルグのプロモー
ターおよび構造遺伝子を含有する、単離２本鎖ＤＮＡフ
ラグメントを導入でき、次いで再度閉環することかでき
る。

特に適切な出発プラスミドはバシルスプラスミドｐＢｃ
Ｅ１６であり、これは、ＤＥ　　３５　２７９１３に従
って、ＢａｍＨＩで線状化し、次いでズブチリシン・カ
ールスベルグ遺伝子を挿入することが可能である。本明
細書では、このようにして得られたプラスミドをｐｃ５
０と命名する。非常に適切な他のプラスミドは類似の方
法によってバシルス出発プラスミドｐＵＢ１１０から誘
導される。

制限酵素Ａｖａｌおよび５ｓｔｌを使用すれば、このプ
ロテアーゼプラスミドｐｃ５０から、プレおよびプロ配
列、開始コドンおよび停止コドンを包含する構造遺伝子
、ならびにプロテアーゼプロモーター領域、および両側
に存在する、特別な発現作用を示さない非規定化フラグ
メントを単離することができ、それらを、前もってＸｍ
ａＴおよび５ｓｔＴで切断しておいた大腸菌プラスミド
ｐＵｃ１９に挿入する。この大腸菌プラスミドは、特に
二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、ベーリンガー・マンハイ
ム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）などから
入手可能であり、ヤニッシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ
−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ）らのＧｅｎｅ（１９８５）、　
３３゜１、１０３−１１９に記載されている。

このようにして得られた大腸菌プラスミド（ｐＨ９と命
名する）は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩで切断す
ることができる。一方の制限部位は、プロテアーゼ構造
遺伝子中に見いだすことができ、１ｚ− 他方はプロモーターの上流に見いたされる。次ぎに、単
離された２本鎖ＤＮＡフラグメントを、大腸菌プラスミ
ドｐＭａ２５４のＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩまたはＸｍ
ａＩ制限部位に挿入すれば、ｐＭＧ５５と命名するプラ
スミドを調製することができる。

プラスミドｐＭａ　２５４は、フリッノ（１１、−Ｊ、
　Ｆｒ＋ｔｚ）、マックスプランターインスチチュート
（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−１ｎｓｔｉｔｕｔ　　ＦＬＩ
ｒ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ）
のＭ１３誘導体である。これは、特異的突然変異に特に
適当なプラスミドである。他の適当なプラスミドはＭ１
３ｍｐ９である［クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ。

Ｗ、）およびフリッノ（１，−Ｊ、　Ｆｒ１ｔｚ）、ミ
ュンヘン、１９８７、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、
　１５４．３５０−３６７］。特異的突然変異のための
他の適当な酵素は、例えばベーリンガー・マンハイム、
バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）またはアメルシャム・ブッ
フレル（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｕｃｈｌｅｒ）などから
人手可能である。

本発明において、「特異的突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）Ｊとは、制限部位を創製する
ために、２つまたはそれ以」二の塩基を他の塩基へ特異
的に変換することである。

本発明によれば、本明細書に記載の操作によって、以下
のように、プロテアーセ遺伝子の開始フトンＡＴＧの前
−３位および一２位のＧＴをＴＣに変換することか可能
である・ ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＴＡＡ　ＴＧＡ から　− ＡＧＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＴＧＡｏ このようにして、酵素ＢｃｌＴについての制限部位を創
製することかできる。

プラス：ニド’ｐＭａ２５４を用いた特異的突然変異は
、クレーマーらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ、　］２、９４４１−５６に従って行うこと
ができる。この位置での変化に適切なプライマーを使用
した。ｐＭＧ５６と命名する構築物か調製される。

アミラーゼ構造遺伝子は、このアミラーゼ遺伝子を含有
しているプラスミドから最も良好に単離される。このよ
うなプラスミドは、例えばＦＲ−ＰＳ　　２　５３７　
６０２、ＦＲ−ＰＳ　　２　５３３５８３、およびヨー
エツト（Ｊｏｙｅｔ）らの１９８４．　ＰＥＭＳＭｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔ、　２１．３５３−３５８に記
載されている。

アミラーゼ遺伝子のクローニングは、ＤＥ−Ｏ５３５２
７９１，３に記載されたプロテアーゼズブチリシンカー
ルスベルグのクローニングの方法によって実施されるが
、ただし、バチルス・ズブチリスＢＤ３９３　（他方、
プロテアーゼのクローニングではＢＲｌ、５１である）
での形質転換後のアミラーゼクローンの選択は異なって
いる。選択は、１％トウモロコシデンプンおよび１５１
ｇ／σテトラサイクリンを含有するＨＧＰ寒天重層物（
ｏｖｅｒｌａｙ）を使用したＨＧＰ寒天平板（ＨＧＰ寒
天＝１％ペプトン、０．５％ＮａＣ（７，０，５％酵母
エキス、０．５％グルコース、１％アカロース）上で行
った。

約４０時間後、アミラーゼ遺伝子か得られる２つのクロ
ーンは、約１２．．６００個の形質転換体の中から寒天
平板」二で直接同定された。なぜなら、コレラのコロニ
ーは、アミラーゼ陰性宿主［１ｌ株ＢＤ３９３とは対照
的に、デンプンによって白濁化した寒天上に明瞭なハロ
ー（光軸）を呈するからである。安定なアミラーゼクロ
ーンのプラスミドＤＮＡを、」１記の出願公開に記載の
ように単離した（ｐＡＩ）。

このｐＡＩ　　ＤＭＡを各種の制限酵素によって特性化
するため、ＢｃｌＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌおよび５ａ
ｉ１個々で、およびそれらを組み合わせて開裂した。

本発明のプラスミドを調製するため、プロテアーゼプラ
スミドｐｃ５０から特異的突然変異の結果得られたｐＭ
Ｇ５６と命名したプラスミドを、酵素ＥｃｏＲＩおよび
Ｂｅ１ｌ（新しく形成された制限部位に対応）で開環し
た。プロテアーゼの残った構造遺伝子はこのようにして
除去される。本発明によれば、このように調製された発
現ベクターにアミラーゼ構造遺伝子を挿入すればよい。

アミラーゼプロモーターおよびアミラーゼ遺伝子間の制
限部位は、特異的突然変異によって創製される。即ち、
特にＢｃｌＩに対する制限部位を創製するには、アミラ
ーゼの開始コドンの前−５位および−４位のヌクレオチ
ドをＧ’ＡからＴＧに変化させればよい。これにより調
製される構築物を本明細書ではｐＪＯ２と命名する。

制限酵素ＢｃｌＩを使用してアミラーゼ構造遺伝子を得
るためには例えば、プラスミドＩ）ＪＯ２からアミラー
ゼ構造遺伝子を取り出し、ＢｃｌＩで前もって開裂させ
ておいたプラスミドｐＭＧ５６に導入すればよい。プロ
モーターに対し正しい位置で、あるいは反対の位置でア
ミラーゼ構造遺伝子を含有するプラスミドがそれぞれ統
計学上平均して形成される（これらをｐＪＯ３およびｐ
ＪＯ４と命名する）。これに関し、アミラーゼ構造遺伝
子を含有するプラスミドは実際に、プロモーターの読み
取りの支配下に大腸菌において少量のアミラーゼを発現
していることを見いたした。

プロテアーゼプロモーターおよびアミラーゼ構造遺伝子
から構成される構築物をバシルスプラスミドに移入させ
るには、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて開裂する
のが最も良い。これにより、これら２つの制限酵素の制
限部位までの過剰な配列を両末端に有した、プロモータ
ー、構造遺伝子、およびその他の機能的に重要な配列（
プロ／プレ配列、開始および停止コドン）を含有する単
離ＤＮＡ配列が調製される。このようにして得られた単
離２本鎖ＤＮＡ配列は、バシルスプラスミドｐＵＢＩＩ
ＯのＥｃｏＲｒおよびＢａｍＨＩ制限部位間で連結する
ことができる。しかし、これに代わって、この同一フラ
グメントをＩ）ＢＣＥＩ６に導入することもできる。

このようにして調製された、バシルス属、特にバシルス
・リシェニフォルミスＤＳＭ６４　Ｌ　ＤＳＭ３４０６
またはＤＳＭ３４０７のアミラーゼ産生菌株は、大量に
アミラーゼを産生ずることができ、所望ならば、プロテ
アーゼとの混合物として産生ずることができる。アミラ
ーゼの産生性を試験するには、これらの菌株を、１％デ
ンプンを含有するスクリーニング用平板上で増殖させれ
ばよい。デンプンは分解され、菌株の活性が白濁の消失
として視覚化される。

形質転換されていない微生物またはｐＡ■で形質転換さ
れた微生物と比較すると、本発明のプラスミドを含有す
る微生物は高度のアミラーゼ産生を示し、このアミラー
ゼは増殖の定常期に分泌される。即ち、プラスミドｐＡ
Ｉの場合には、形質転換されていない微生物よりも４か
ら５倍多くアミラーゼが産生されるが、ｐＪＯ５および
ｐＪＯ６の場合には４０倍多くアミラーゼが産生される
。

アミラーゼプラスミドを、プロテアーゼを既に産生じて
いる菌株に移入すれば、プロテアーゼ産生の条件下で、
指数増殖期にそれらの酵素の両者を産生ずる菌株を調製
することができる。この場合、アミラーゼプロモーター
を含有するプラスミド（例えば、ｐＡ　Ｉ）によっては
、１５倍多くアミラーゼが産生されるが、他方、プロテ
アーゼプロモーターを含有するプラスミドによっては、
５０倍多くアミラーゼが産生される。

実施附 本実験を行うのに使用したプラスミドＤＮＡは、個々に
、または他の方法と組み合わせて実施できる、当業者周
知の多くの異なる方法によって単離−１９＝ することができるし他の方法に関しては、例えばクレー
ウｓ−）しくＣｌｅｗｅｌ　Ｉ、　Ｄ、　Ｂ、　）　：
ヘリンスキー（Ｈｅｌｉｎｓｋｙ、　ＤＲ，）　：　Ｐ
ＮＡＳ　６２．１１５９（１９６９）、またはホールメ
ス（Ｉｌｏｌｍｅｓ、　Ｄ、　Ｓ、　）　；クイグレー
（Ｑｕｉｇｌｅｙ　Ｍ、　）　；　Ａｎｎｕａｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｉ４１１９３（１９８１）を参照３０次い
で、精製したＤＮＡを適当な緩衝液中で制限酵素で切断
すればよい。

特異的突然変異を行うため、突然変異させるべきプラス
ミド、例えばｐＭＧ５５の１本鎖ＤＮＡをまず始めに単
離しなければならない。本件の場合は、Ｅ、ｃｏｌｉ　
ＢＭＩ−１７１］　８／　ｐＭＧ　６５である対応する
プラスミド含有菌株の一晩培養物２゜５及ρ、およびＦ
１ヘルパーファージ溶菌液Ｍ１３ＫＯ７（）７価ｌＸｌ
０　１２）１００μρをＬＢ培地７．５Ｗ（に接種し、
］　５０πａｍ／３７°Ｃて５時間インキュベートシた
。この培養物１５πａをエソヘントルフ試験管に移し、
エツペンドルフ遠心機の最高速度で５分間遠心した。フ
ァージ含有−１−漬液１μＱを注意して除去し、再度遠
心した。

次いで、」−消液８００　ｕＱを２．５ＭＮａＣρ／２
０％ＰＥＧ６０００　２．５μｇと混合し、室温で１５
分間放置した。５分間遠心した後、上清液を完全に除去
し、得られたファージペレットをＴＥ緩衝液（１０＋ｎ
Ｍ　　ｌ−リス＋ｒｌ　／ＨＣ（！　Ｔ）　ｌ−１８／
　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）１００μρ中に取り、振盪させ
てトリス′ｒ′−飽和フエノール５０μρで抽出した。

得られた水層１００μρを再びクロロポルム１００μｇ
で振盪抽出し、次いで３Ｍ酢酸ナトｌ）ラム（ｐＨ６）
１．０μρおよびエタノール３００μｇを加え、−２０
°Ｃで１時間インキュベートシてＤＮＡを水層９０μＱ
から析出させた。遠心した後に得られたＤＮＡ含有ペレ
ットを７０％エタノールＩｍＱで洗浄し、減圧下に乾燥
させ、、’ＦＥ緩衝液２５μρに再懸濁した。

突然変異に必要な部分的１本鎖ＤＮＡを調製するために
、線状ベクターＤＮＡ０．］ｐｍｏｌを１本鎖プラスミ
ドＤＮＡ０．５ｐｍｏｌと混合した。本件の場合は、容
量３５μ［！中、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＴ線状化ｐ
ＭＣ２５４ＤＮＡおよび１本鎖ｐＭＧ５５ＤＮＡであっ
た。１．５Ｍ　ＫＣ（！／ｌ　００ｍＭ　　トリス”−
Ｈｃｆｆ（ｐＨ７，５）５μ（を添加した後、得られた
混合物を１００’Ｃで４分間加熱し、次いて６５°Ｃて
１０分間インキュベートした。部分的２本鎖ＤＮＡの形
成をアカ゛ロースゲル上で確認した。

所望の突然変異を開始させるのに必要なプライマーを、
アプライド・ハイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）のＤＮＡ合成機で調製し、２０％ポリ
アクリルアミ１’／８Ｍ尿素ゲルのゲル電気泳動で精製
し、５°リン酸基を結合させた。この結合は、取り扱い
説明書（ベーリンガー・マンハイム）に従って、精製し
たオリコヌクレオチド１　ｎｍ。

ｌを容量２０μＱでＴ４ボリヌクレオチドキナーセ１０
単位と共にインキュベートして行った。次いて、得られ
たオリコヌクレオチドをフェノールで振盪抽出し、エタ
ノールで沈澱させた。

１０μρ容量中、４　ｐｍｏｌオリゴヌクレオチドを０
、Ｉｐｍｏ１部分的１本鎖ＤＮＡと混合し、６５°Ｃで
５分間加熱した。次いで、８２０　２３μｇおよび緩衝
液（６２５ｍＭ　ＫＣ＋！／２７５ｍＭ　　ｌ・す；１
．　”ＨＣ（ｌ　ｐＨ７，５／　１５０ｍＭ　ＭｇＣ４
２７２０ｍＭ　ＤＴＴｌｏ、５ｍＭ　ＡＴＰｌｏ、２５
ｍＭ　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）
４μ９、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４単位、およびクレノーＤ
ＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム）１単位
を加えた。この混合物を室温で４５分間インキュベート
した。形質転換用に、得られた試料を水上で保存した。

形質転換のため、形質転換するべき試料１０μＱを、受
容能力を有する大腸菌細胞（コーエン（Ｃｏｈｅｎ＋　
Ｓ、　Ｎ、　）　：チャンジ（Ｃｈａｎｇ　Ａ、　Ｃ，
Ｙ、　）　：フス（Ｈｓｕ。

Ｌ、）　ＰＮＡＳ　６９，２１１０（１９７２））　Ｂ
ＭＨ７］　１８ｍｕｔＳ１５０μρと混合し、３０分間
水上に放置し、４２°Ｃで３分間インキュベートした。

次いで、ＬＢ培地ＩＩρを加えた後、３７℃／１５０ｒ
ｐｍで１時間振盪させた。ＬＢ＋１００μｇ／ｍρアン
ピシリン培地１０ＩＲＱに、この形質転換混合物を接種
し、３７°Ｃで一晩振盪させた。

この培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、これを受容
Ｅ、ｃｏｌｉ（大腸菌）ＭＫ３０−３細胞に形＝２３− 質転換した。この形質転換混合物２００μρ容量をＬＢ
−１−１００μｇｅｍ（アンピシリン平板上に広げ、３
７°Ｃで一晩インキユベートした。

構築物を試験するため、得られたコロニーからプラスミ
ドＤＮＡを単離し、相当する制限酵素で切断した。所望
の突然変異体の収率は、５０％から８０％であった。

使用するプラスミドのすべてを調製するためのりガーゼ
反応には、リガーゼ緩衝液（最終濃度；１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｆ２．／１ｍＭ　ＤＴＴ１５０ｍＭ　　）リス”’−
ＨＣＱｐＨ７，５１ｍＭ　ＡＴＰ）２０ｕＱ中で、相当
する酵素で切断された挿入ＤＮＡ３重量部を開裂ヘクタ
ーＤＮＡ　１重量部と混合し、次いでＴ４　　ＤＮＡリ
ガーゼ７５単位を添加した後、得られた混合物を８℃で
一晩インキニベートした。これらのライゲート混合物を
、既述のように受容大腸菌細胞に、またはＤＥ−Ｏ３３
５２７９１３に記載のようにバシルス属の菌株に形質転
換した。得られた構築物の試験のため、得られたコロニ
ーからＤＮＡを単離し、適当な制限酵素で切断した。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＭＧ５６の構築模式図、第２図は
プラスミドｐＪ０２の構築模式図、ならびに第３図はプ
ラスミドｐＪＯ５およびｐＪＯ５の構築模式図である。 特許出願人　ヘンケル・コマンディットゲゼルシャフト
・アウフ・アクチェン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、タンパク質を発現するためのプロモーター、および
   それに機能的に連結した酵素の構造遺伝子を含有してい
   る、バシルスで発現可能なプラスミドであって、アミラ
   ーゼ構造遺伝子と連結したプロテアーゼプロモーターを
   含有していることを特徴とするプラスミド。２、プロテ
   アーゼプロモーターとしてズブチリシン・カールスベル
   グのプロモーターを含有している請求項１に記載のプラ
   スミド。 ３、バシルス・リシェニフォルミス、またはそのデンプ
   ン加水分解性変異体の熱安定性α−アミラーゼのみをコ
   ードしている構造遺伝子を含有する、請求項１または請
   求項２に記載のバシルス・リシェニフォルミスのプラス
   ミド。 ４、バシルス・リシェニフォルミスＤＳＭ６４１である
   請求項３に記載のプラスミド。 ５、ＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩ制限部位の両者を有して
   いる請求項１から請求項４までのいずれかに記載のプラ
   スミド。 ６、１つまたはそれ以上の選択マーカーを有している請
   求項１から請求項５までのいずれかに記載のプラスミド
   。 ７、選択マーカーが抗生物質に対する耐性マーカーであ
   る請求項６に記載のプラスミド。８、バシルスプラスミ
   ドｐＵＢ１１０から誘導される請求項１から請求項７ま
   でのいずれかに記載のプラスミド。 ９、バシルスプラスミドｐＢＣＥ１６から誘導される請
   求項１から請求項８までのいずれかに記載のプラスミド
   。 １０、増殖の定常期にα−アミラーゼを産生できる請求
   項１から請求項９までのいずれかに記載のプラスミドを
   含有する、バシルス属であるバシルス・リシェニフォル
   ミスまたはバシルス・ズブチリス新規微生物。 １１、請求項１０に記載の微生物をズブチリシン・カー
   ルスベルグの通常の生産条件下で培養し、細胞外に産生
   された酵素を分離し、後処理することを特徴とするα−
   アミラーゼを生産する方法。 １２、アルカリ性プロテアーゼとの混合物としてα−ア
   ミラーゼを生産する請求項１１に記載の方法。 １３、アリカリ性プロテアーゼがズブチリシン・カール
   スベルグである請求項１２に記載の方法。