JPH0272862A - 高度なガス飽和媒体を用いた細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は生体条件内で細胞を培養する方法に関し、特に
中空繊維膜を用いた細胞の培養方法に関する。

（従来の技術） 細胞の最適な成長及び維持にとって主要な因子は、酸素
である。媒体に酸素を添加する各種の方法が記載されて
いる。Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄの米国特許第３．１７２．２
３５号には、培養フラスコへの直接的酸素添加が開示さ
れている。Ｍｉｃｈａｅｌｓ等の米国特許第４．４４０
，８５３号と第４，４４２．２０６号は、リザーバ内で
媒体に直接酸素を添加する方法を記載している。

Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇの米国特許第４．６２９．６８６号
とＷａｌｋｅｒの米国特許第４，６１８，５８６号は、
媒体源の容器内における媒体の酸素添加を記載している
。

媒体のオンライン式酸素添加が、Ｗｅｉｓｓ等の米国特
許第３，４０７，１２０号に記載されており、この同特
許には媒体が細胞培養装置へ送られる前に、媒体に酸素
を添加する曝気カラムが開示されている。

Ｋｎａｚｅｋ等の米国特許第２，８２１．０８７号、第
３，８８３，３９３号及び第４，２２０．７２５号は、
酸素光生気つまりシリコーンゴムの膜を有する人工肺を
使って、媒体を潅流するためのガス転送を与えることを
記載している。Ｙｏｓｈ　ｔｄａ等の米国特許第４，３
９１，９１２号は、中空繊維のカートリッジを用いて媒
体に酸素を添加することを記載している。

オンラインで媒体に酸素を添加する別の方法がＨａｒｍ
等の米国特許第４，６５０．７６６号に開示されており
、この特許は、ガス緩和（ｄｅｆｕｓａｂｌａ）配管を
介して媒体中にガスを導入するためにガス発生ブロック
を用いることを記載している。

Ｎｏ１１の米国特許第４，５１４，４９９号は、循環ル
ープ内のりザーバの上流で媒体に酸素を添加するガス浸
透器を記載している。リザーバ下流のポンプが、媒体を
細胞培養装置内へと送る駆動力を与える。

また最近、生体条件内で細胞を培養する開発が、飛躍的
に成長してきた。この種の一つの細胞培養方法は、中空
繊維のカートリッジを用いており、媒体が中空繊維の管
腔を通って連続的に輸送される一方、中空繊維と中空繊
維カートリッジの外殻（シェル）との間の超毛管スペー
ス内で細胞が培養される。

（発明が解決しようとする課題） 中空繊維のカートリッジを用いた細胞の連続培養では、
高度に酸素添加された媒体、すなわち酸素の飽和レベル
近くまで酸素添加された媒体を用いる際に問題が生じる
。媒体が管腔の壁を横切るとき、圧力降下が発生し、媒
体の酸素溶解度レベルを低下させる。この減少は、超毛
管スペース内に酸素が残るという結果をもたらす。そし
て、酸素が中空繊維カートリッジの細胞培養領域内の一
部を占めることによって、細胞の成長に利用可能なスペ
ースを減少させてしまう。

（課題を解決するための手段） 本発明は、高度にガス添加された媒体を用いて、中空繊
維のカートリッジ内で細胞を培養する方法を含む。本方
法は、媒体がそのガス溶解度レベルを越えて飽和される
ように、空気などのガスを媒体に混入することを含む。

次いで媒体は、可溶でない空気が媒体から抜けでるよう
に、実質上静止状態に寝かせられる。過剰の空気が媒体
から抜けでた後、媒体はその空気溶解度レベルが高まる
ように加圧されて、中空繊維に送られる。

さらに、本発明の方法は、中空繊維を通る媒体の流れを
所定の間隔で反転させることを含む。中空繊維を通る媒
体の流れを反転させることによって、細胞培養スペース
内における流れの方向を変え、空気、栄養素及び廃物の
濃度勾配を乱し変化させることによって、細胞培養のよ
り優れた維持を可能とする。

（実施例） 本発明の方法は、高度にガス添加された媒体を中空繊維
に与え、中空繊維の外側で細胞を維持培養する。まず初
め媒体に、そのガス溶解度レベルを越えてガスが混入さ
れる。ガス添加後、媒体は例えばリザーバ内で、溶液中
に可溶でないガスが媒体から抜けでるように、実質上静
止状態で寝かせられる。その後、媒体はリザーバから取
り出され、媒体のガス溶解度レベルを高めるように加圧
されてから、加圧状態で中空繊維に送られる。

本発明の方法は、図面中１０で全体を示した細胞培養装
置を用いて実施される。特定の一細胞培養装置を図示し
たが、その他の構成も本発明の範囲に含まれるのはもち
ろんである。

細胞培養装置は、中空繊維のカートリッジ１２、超毛管
ループ１４及び媒体循環ループ１６を備えている。

中空繊維のカートリッジ１２は、外殻（シェル）２０内
を縦方向に延びた複数の中空繊維（上管）１８を内部に
含む。細胞は、中空繊維１８の外表面と外殻２０の内表
面との間の空間で培養され、以下この空間を超毛管スペ
ースと称する。中空繊維１８は選択的に浸透可能な壁膜
を有し、酸素、ＣＯ□、各種栄養素及びその他の化学化
合物は壁を通って超毛管スペース２２内へ拡散可能だが
、乳酸などの廃物は中空繊維の管腔内へと逆に拡散可能
としている。

入口導管２４が超毛管スペースと流体連通し、各種要素
（ファクタ）を超毛管スペースに送るための手段及びア
クセスを与える。出口導管２５が、超毛管スペース２２
から出る通路を与える。

嬬動ポンプなどのマルチ出力ポンプ２８が、流体を超毛
管スペース内に導入し、各種要素及びその他の栄養素を
そこで維持すべき細胞に送るための駆動力を与える。さ
らに、ポンプ２８は細胞によって作られた生成物を収穫
するのにも使われる。

超毛管スペースは、アクセスライン３０を介してサンプ
リングまたは接種可能である。

超毛管スペースを通じた媒体の循環は、１９８４年ＩＯ
月９日に出願され、本願と同じ譲受人に譲渡された米国
特許出願第６５８．５４９号、名称「中空繊維細胞培養
装置及び動作方法」に基づく優先権を主張した、１９８
６年４月２４日公布の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ　８５
１０１９４８に記載されており、同出願は参照によって
ここに含まれるものとする。

媒体循環ループ１６は主な構成部品として、ジェットポ
ンプ３２、リザーバ３４、及び媒体循環ポンプ３６を備
えている。ルー１１６は媒体を、リザーバから中空繊維
のカートリッジへと連続的に循環させる。さらに、切り
換え繊維３８が中空繊維への流れを、所定の時間間隔で
反転可能とする。媒体循環ポンプ３６の副次部品として
、温度センサ４０、溶解温度プローブ４２及びｐｌ＋プ
ローブ４４が含まれる。１つのサンプルライン４５がカ
ートリッジ１２の下流に設けられ、別のサンプルライン
４７がカートリッジ１２の上流に設けられている。

媒体循環ループ１６は、細胞培養装置内で“脱ガス”し
ないガス添加された媒体を与える。ここで“脱ガス”と
は、媒体のガス溶解度レベルの低下のためガスが溶液か
ら抜けでる現象を意味する。

超毛管スペース内における脱ガスは、溶液内にガスを保
持している流体が管腔の壁を横切って超毛管スペース内
へ入り、溶解との低下をもたらす圧力減少を受けたとき
に発生する。予め溶液内に維持されていたガスの一部が
超毛管スペース内に解放され、細胞によって占められる
べきはずの容積を占める。細胞はガスによってだけ占め
られたスペース内では成長できないので、“脱ガス”は
中空繊維のカートリッジ内における効率的な成長にとっ
て有害である。

媒体は導管４６を介して中空繊維の管腔を出てから、ジ
ェットポンプ３２によってガス添加される。ジェットポ
ンプは周知で、１９８４年にＶａｎＮｏｓｔｒａｎｄ　
Ｒｅｌｎｈｏｌｄ社から刊行されたＲｏｂｅｒ　Ｄ。

Ｂｌｅｖｉｎｓ著、「応用流体動力学ハンドブック」に
記載されている。ジェットポンプ３２は、一つの流体を
他の流体に混入可能とする装置である。本発明では、ラ
イン４８で表した供給源から、酸素などのガスを混入す
るのにジェットポンプ３２が使われている。空気力９昆
入されて、媒体に酸素を添加する。ＣＯ２等他０ガスも
、同じように導入できる。媒体内に混入されるガスが、
媒体のガス溶解度レベルを越えたレベルで混合される。

ここでガス溶解度レベルとは、媒体がもはやガスを含む
均一な溶液を形成し得なくなるレベルを意味する。もは
や均一な溶液を形成し得なくなったとき、媒体はそのガ
ス飽和点に達したことになる。混入されるガスの量は、
媒体に溶解しないガスの過剰分が生じるように選ばれる
。

ガスが混入された媒体は、導管５０を介してリザーバ３
４内に送られる。媒体は、溶液内部のガスが上昇して媒
体から出ていくように、リザーバ３４内で実質上静止状
態で寝かせられる。リザーバ３４は媒体に混入されてい
たガスを通気するためのライン５２で表した通気孔を備
え、このガスにはジェットポンプによって導入された過
剰のガスや細胞から生じた排ガスが含まれる。

媒体送出系５６は、入口ライン５６と出口ライン５８、
及び最初に新しい媒体でリザーバを満たし、また必要に
応じてリザーバに対して溶媒を追加及び除去するのに用
いる嬬動ポンプなどのマルチ出力ポンプ６０を備えてい
る。

酸素の飽和された媒体が、導管６２を介しポンプ３６に
よってリザーバ３４から引き出される。

ポンプ３６は、嬬動ポンプなどの容積形ポンプである。

ポンプ３６は三重のポンプを持つ。第１に、このポンプ
はリザーバ３４からの媒体を中空繊維１８に送り、媒体
をループ１６を通って循環させる。第２に本発明のこの
ポンプは、媒体のガス溶解度レベルを高めるのに充分な
圧力下に媒体が置かれるように配置されている。第３に
、リザーバ内で除去されなかった気泡を残らずつぶし、
ガスを溶液内に組み入れることによって、媒体の溶解ガ
スレベルをさらに上昇させる。ポンプは、一定の速度で
媒体をポンプ送りするのが好ましい。

ポンプ３６に入る媒体はそのガス飽和点にあり、可溶で
ないガスのほとんどはリザーバ内で除去されている。ポ
ンプを出る媒体は、ガス溶解度レベルの増加をもたらす
圧力上昇のため、もはやガス飽和点にない。媒体のガス
溶解度レベルを高めることで、除去されていなかった気
泡が溶液に混ざるのを可能にすると共に、実際の可溶レ
ベルと可溶変成との間に余裕を与え、脱ガスを発生させ
ずに可溶変成の変動を許容する。ガス溶解度レベルの増
加量は、主としてジェットポンプによって生じる下流側
背圧の関数である。動作させた一実施例では、ポンプ３
６の出口で測定して１０ｐｓｉｇに加圧された媒体で、
中空繊維のカートリッジ内における脱ガスを防ぐのに充
分であった。中空繊維は再生セルロースで作成し、カー
トリッジ内に５、０７０本の中空繊維を配した。中空繊
維は内径２００μｍ、外径２２０μｍで、繊維の長さは
約２３０ｍｍであった。

切り換え機構３８は、中空繊維のカートリッジへその端
部６４または６６を介して媒体を流入させる。切り換え
機構３８は、全て流体連通している可撓性の配管部３９
ａ、３９ｂ、３９Ｃ及び３９ｄで形成されるのが好まし
い。各配管部３９ａ、３９ｂ、３９ｃ及び３９ｄは、ピ
ンチ（狭搾）部３８ａ、３８ｂ、３８ｃ及び３８ｄをそ
れぞれ備えている。配管部３９ａと３９ｂは切り換え機
構の択一的な入口として作用し、ポンプ３６の出口に接
続された導管６３に流体連通している。配管部３９ｃと
３９ｄは切り換え機構の択一的な出口として作用し、両
方とも配管４６に流体連通している。

配管部３９ａと３９Ｃは、第１のピンチクランプが配管
部３９ａと３９ｃを狭搾すると同時に、配管部３９ｂと
３９ｄは制限されないように配設されている。同じく配
管部３９ｂと３９ｄは、第２のピンチクランプが配管部
３９ｂと３９ｄの流れ制限すると同時に、配管部３９ａ
と３９ｃは制限されないように配設されている。

媒体を中空繊維カートリッジ１２の端部６４へ流入可能
とするためには、ピンチ部３８ｂと３８ｄが狭搾つまり
制限される一方、ピンチ部３８ａと３８ｃは制限されな
い。従って、媒体は配管部３９ａを通って配管６８に入
り、培養装置１２へと端部６４から流入する。また、媒
体は端部６６から培養装置１２を出て、配管７０さらに
配管部３９ｃを通って配管４６に流入する。

媒体を細胞培養装置の端部６６へ流入させるためには、
ピンチ部３８ａと３８ｃが狭搾される一方、ピンチ部３
８ｂと３８ｄは制限されない。従って、媒体は配管部３
９ｂを通って配管７ｏに入り、細胞培養装置１２へと端
部６６から流入する。

また、媒体は端部６４から出て、配管６８さらに配管部
３９ｄを通って配管４６に流入する。

中空繊維内における媒体の流れを反転させることによっ
て、中空繊維カートリッジ内で生じていた酸素、栄養素
及び廃物の濃度勾配が乱される。

流れが端部６４から中空繊維カートリッジ内へと入る場
合には、酸素と栄養素の濃度が端部６４で高く、そこか
ら中空繊維カートリッジの長さに沿って次第に減少する
一方、乳酸の濃度は端部６６へ向かって増加する。媒体
が端部６６から中空繊維カートリッジ内へと入るように
流れを切り換えると、超毛管スペース２２内における濃
度傾斜が反転し、酸素と栄養素の濃度は端部６６で高く
、そこから中空繊維カートリッジの長さに沿って次第に
減少する一方、乳酸の濃度は端部６４へ向かって増加す
る。

また本発明の方法は、細胞培養装置内で培養されている
細胞を用いて、酸素の測定も可能とする。

溶解酸素の測定は、細胞培養装置の下流に位置した溶解
酸素プローブ４２によって行われる。酸素使用量の有意
なデータは、媒体に気泡を混入していた従来の細胞培養
装置では得られなかった。何故なら、可溶でない酸素が
酸素レベルを常に飽和点に保つ酸素源として機能してい
たからである。

本発明の方法を用いれば、脱ガスが発生しないので、細
胞による酸素使用量をモニターできる。

以上本発明を好ましい実施例を参照して説明したが、当
業者であれば、発明の精神及び範囲を逸脱せずに、態様
及び詳細において変更可能であることは自明であろう。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の方法で使われる装置の概略図である。 １０・・・・・・細胞培養装置、１２・・・・・・中空
繊維カートリッジ、１８・・・・・・中空繊維、２２・
・・・・・超毛管（培養）スペース、３２・・・・・・
ガス添加手段（ジェットポンプ）、３４・・・・・・リ
ザーバ、３６・・・・・・ポンプ手段、３８・・・・・
・切り換え弁機構、４２・・・・・・酸素プローブ、４
８・・・・・・ガス供給源、３９ａ、３９ｂ；３９ｃ、
３９ｄ・・・・・・入／出口配管部。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ガス添加された媒体を連続的に細胞培養装置へ供給
   することによって細胞を培養する方法で、媒体が中空繊
   維を通過し、中空繊維の外側スペースで細胞が培養され
   るものにおいて： 媒体にガスを、媒体のガス溶解度レベルを越えて混入す
   る段階； 可溶でないガスが媒体から抜けでるように、前記媒体を
   実質上静止状態で寝かせる段階；前記媒体を加圧し、前
   記細胞培養装置を通る際の圧力降下が媒体のガス溶解度
   レベルを媒体のガス飽和点より下げないようなレベルに
   まで、媒体のガス溶解度レベルを上昇せしめる段階；及
   び 前記加圧された媒体を中空繊維に送る段階；を含む方法
   。 ２、前記中空繊維を通る媒体の流れを所定の時間間隔で
   反転させる段階をさらに含む請求項１記載の方法。 ３、前記媒体が容積形ポンプによって加圧される請求項
   １記載の方法。 ４、前記媒体が一定の速度でポンプ送りされる請求項３
   記載の方法。 ５、前記媒体にジェットポンプを用いてガスが混入され
   る請求項１記載の方法。 ６、前記媒体とガスが細胞培養装置の下流側で混合され
   る請求項５記載の方法。 ７、前記ガスが空気である請求項５記載の方法。 ８、細胞培養装置の下流で酸素レベルをモニターするこ
   とによって、細胞による酸素消費量をモニターする段階
   をさらに含む請求項１記載の方法。 ９、媒体が中空繊維を通過し、中空繊維の外側スペース
   で細胞が培養される細胞培養装置； 前記中空繊維と流体連通し、中空繊維を通るように媒体
   をポンプ送りするポンプ手段； 前記細胞培養装置と連通し、媒体に酸素を添加する手段
   ； 前記ポンプ手段と流体連通した媒体リザーバ：及び 前記細胞培養装置を通る媒体の流れを選択的に反転させ
   る弁機構で、上流端部で相互に流体連通した第１及び第
   ２の入口配管部と、下流端部で相互に流体連通した第１
   及び第２の出口配管部とを備え、一方の入口配管部及び
   一方の出口配管部で流れが制限されたとき、流れが第１
   の方向で細胞培養装置へと流入し、他方の各入口及び出
   口配管部で流れが制限されたとき、流れが前記第１の方
   向と反対の第２の方向に細胞培養装置へと流入するよう
   に流れを反転させる弁機構； を備えた細胞を培養する装置。 １０、前記媒体に酸素を添加する手段がジェットポンプ
   である請求項９記載の装置。 １１、前記ジェットポンプが、前記細胞培養装置の下流
   で前記リザーバの上流に配置されている請求項１０記載
   の装置。 １２、前記ポンプ手段が、前記リザーバの下流で前記細
   胞培養装置の上流に配置されている請求項１１記載の装
   置。 １３、前記各配管部が可撓性の配管によって作成され、
   前記入口及び出口配管部が対をなして配置され、第１対
   の入口及び出口配管部が流れを制限する第１手段によっ
   て同時に制限されるように配置され、また第２対の入口
   及び出口配管部が流れを制限する第２手段によって同時
   に制限されるように配置されている請求項９記載の装置
   。