JPH03992B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ シエルが第１および第２端、第１および第２
口、並びに第１端と第２端の間に延びる複数の毛
細管を有し、前記毛細管の少くとも若干が選択的
透過性壁を有し、細胞培養空間がシエルと毛細管
との間に構成されるとともに第１口および第２口
が前記細胞培養空間と流体連結しており、第１培
地供給物が第１の圧力で毛細管の中へ供給され、
第２培地供給物が第２の圧力で供給される、生体
外細胞成長用改良細胞培養装置であつて、 第１口および第２口に流体連結され、第２培地
供給物を収容する室、 第１口および第２口から培養空間への第２培地
供給物の流れを選択的に制限する装置であつて、
細胞培養空間内で循環を行なわせ、培養空間外へ
の老廃物の拡散および培養空間中への培地成分の
拡散を高めるために第２培地供給物の流れを第１
口および第２口を通して交互に生じさせるように
操作される弁装置、 第２培地供給物を収容する室をほぼ一定の圧力
に保持するための加圧装置、 を含み、第一培地の供給装置を弁装置と一緒に選
択的に制御して毛細管中の圧力を第２培地供給物
を収容する室中の圧力より上又は下に交互に増減
させ細胞培養空間内で循環を行なわせる、細胞培
養装置。

２ 第２培地供給物を収容する室が、第１導管お
よび第２導管によりシエルの第１口および第２口
に流体連結され、弁装置は第１導管および第２導
管を通る流れをそれぞれ制御する第１弁および第
２弁を有する、請求の範囲１記載の装置。

３ 毛細管の透過性壁が約50000ドルトン以下の
選択的分子量カツトオフを有する、請求の範囲１
記載の装置。

４ 毛細管の透過性壁が約15000ドルトン以下の
選択的分子量カツトオフを有する、請求の範囲３
記載の装置。

５ シエルとこのシエルを通つて延びる複数の毛
細管とを有し、毛細管とシエルとの間に第２培地
収容室に流体連結された細胞培養空間が構成さ
れ、第１培地供給物が供給装置により毛細管に供
給され、膨張室は第２培地供給物を収容し、かつ
該室を加圧するための装置を有している、中空繊
維カートリツジ中で細胞を培養する方法であつ
て、 毛細管内の圧力を前記第２培地供給物を収容す
る室内の圧力より上または下に交互に増減し、 該室と毛細管外空間との間の第２培地供給物の
流れを、カートリツジから伸びている導管に設け
られた第１弁および第２弁を交互に開閉すること
により制御して、細胞培養空間中に循環を行なわ
せることからなる、細胞の培養方法。

６ 毛細管壁を通して細胞培養空間中への培地か
らの成分の限外濾過、および毛細管の内腔への細
胞培養空間中の細胞に有害な成分の限界濾過を、
それぞれ起させるに十分なように圧力を増減す
る、請求の範囲５記載の方法。

７ さらに、上水準感知点および下水準感知点を
第２培地供給物を収容する室に設け、培地が上水
準および下水準に達したときを感知し、下水準を
感知したときに毛細管内の圧力を増加させ、上水
準を感知したときに毛細管内の圧力を減ずること
を含む、請求の範囲６記載の方法。

８ シエルが第１端および第２端、第１口および
第２口、並びに第１端と第２端の間に延びる複数
の毛細管を有し、前記毛細管の少くとも若干が選
択的透過性壁を有し、細胞培養空間がシエルと毛
細管との間に構成され、第１口および第２口はこ
の細胞培養空間と流体連結しており、第１培地供
給物が第１の圧力で毛細管へ供給され、第２培地
供給物が第２の圧力で供給される、生体外細胞成
長用改良細胞培養装置であつて、 第１口および第２口に流体連結され、第２培地
供給物を収容する室、 第１口および第２口から培養空間への第２培地
供給物の流れを選択的に制限する弁装置であつ
て、細胞培養空間内で循環を行なわせ、培養空間
外への老廃物の拡散および培地空間への培地成分
の拡散を高めるために、第２培地供給物の流れを
第１口および第２口を通して交互に生じさせるよ
うに操作される弁装置、 第２培地供給物を収容する室を、ほぼ一定の圧
力に保持するための加圧装置、 該室内の選定した上水準および下水準に配置さ
れ培地の下水準および上水準を感知する上および
下水準センサーを含み、供給装置が弁装置と一緒
に選択的に制御され、下水準が感知されると室中
の圧力に関して毛細管中の圧力を上げ、高水準が
感知されると室中の圧力に関して毛細管中の圧力
を下げて細胞培養空間内で循環を行なわせる、細
胞培養装置。

９ 第２培地供給物を収容する室が第１および第
２導管によりシエルの第１口および第２口に流体
連結され、弁装置は第１および第２導管を通る流
れをそれぞれ制御する第１弁および第２弁を有す
る、請求の範囲８記載の装置。

１０ 毛細管の透過性膜が約50000ドルトン以下
の選択的分子量カツトオフを有する、請求の範囲
８記載の装置。

１１ 毛細管の透過性膜が約15000ドルトン以下
の選択的分子量カツトオフを有する、請求の範囲
９記載の装置。

発明の背景 発明の分野 本発明は細胞培養装置に関する。更に詳しく
は、本発明は酸素、栄養素および他の化学刺激剤
（stimuli）を、有効かつ選択的に移送し、老廃物
を除去し、生体外（in vitro）で、細胞を高い細
胞密度に成育しかつ維持し、単位反応装置容積当
りの産生物生成の高収率をうる複数の中空繊維膜
を有する細胞培養装置に関する。

従来技術の説明 複数の中空繊維膜を有するシエル（shell）を
有する、生体外細胞成長用の細胞培養装置は、既
に知られている。すなわち、酸素、栄養素および
他の化学刺激剤を含有する培地が、中空繊維膜の
内腔を通して運ばれ、圧力降下をうけて装置の入
口で外向放射状対流および装置の出口で内向流を
生ずるようになつている。細胞は中空繊維とシエ
ル壁との間の、流体空間中で成長する。

中空繊維培養装置は生体外で多くのタイプの細
胞を高密度に繊維するために理想的であることが
証明された。中空繊維培養装置の物質移動特性
は、栄養素を供給し、かつ培地から老廃物を除去
する効率的な手段を作る。セミポーラス中空繊維
膜としては、種々の細孔大きさを有するものを選
ぶことができる。適当な細孔大きさを選択するこ
とにより、細胞産生物を中空繊維の外側に保持す
ることができ、一方老廃物および汚染タンパク質
は該膜細孔を通つて中空繊維の内腔（lumen）中
へ進み、その後それらを培地から除去することが
できる。

細胞由来の生成物を、中空繊維培養装置中で経
済的に産生させるためには、多数の細胞を産生物
形成に最適の培養条件において、長時間生存状態
で保持しなければならない。

従来技術の中空繊維培養装置は、商業的な量で
の細胞由来生成物の経済的生産における使用を妨
げるような多くの制約を有する。

これらの制約には；(1)細胞区画室中の勾配（例
えば濃度勾配）の形成されること；(2)細胞環境を
直接、モニターして制御することができないこ
と；(3)細胞区画室中の流体移動の不足が細胞の周
囲に微環境（microenvironment）を生ずるこ
と；(4)中空繊維が培養装置中で等距離離れておら
ず無酸素またはデツドスペースを生ずること；(5)
効率的な物質移動が高細胞密度で困難になるこ
と；および(6)装置を横切る圧力降下が装置の拡大
とともに増大して前記各種欠点を増大し、かくて
規模能力が制限されること、等が含まれる。

本発明の目的はこれらの各種制約を克服し、中
空繊維培養装置を細胞由来（誘導）生成物の経済
的生産に用いることを可能にすることにある。

以下に、従来技術の各種制約を、より詳細に説
明する。

(1) 細胞区画室中の勾配（gradients）の形成 細胞区画室中の培地の栄養素、PH、O₂、CO₂、
乳酸、アンモニアおよび他の成分の勾配の形成
は、中空繊維培養装置においてごく普通の問題で
ある。そのような勾配は、栄養培地が該装置を通
つて流れる状態のために生ずる。栄養素は、中空
繊維からの外向流のために、入口付近で細胞によ
り多く利用される傾向がある。栄養培地は出口ま
で流れるので、代謝老廃物、例えば乳酸およびア
ンモニアが、細胞区画室中に蓄積して細胞の生存
性に好ましくない影響を及ぼす傾向がある。

(2) 細胞区画室のモニターおよび制御の不能 従来技術の中空繊維カートリツジの性質のため
に、細胞区画室にモニター装置を組込むことがで
きない。従つて、最適培養条件の維持が非常に困
難である。細胞区画室の環境の唯一の制御は、中
空繊維の内腔から細胞区画室への生成物の拡散に
よる。

(3) 微環境の形成 流体移動は、従来技術の中空繊維培養装置の細
胞区画室の中では殆んど起らない。これは速やか
に代謝する細胞の周囲に微環境を形成し、PHの変
化により装置中の他の細胞に悪影響を及ぼす。

(4) 無酸素ポケツトの形成 中空繊維がカートリツジにつめられている。通
常、中空繊維が等距離（等間隔）で離れておら
ず、従つてある細胞は他の細胞よりも栄養素から
遠く離れていることがある。これは酸素の欠乏、
または拡散により細胞に到達する栄養素の不足の
ために、細胞が死んでしまうようなポケツトを生
じさせてしまう。

(5) 物質移動の制約 細胞が高い細胞密度に成長すると栄養素は細胞
のより大きい層を通つて拡散しなければならな
い。そのため拡散による物質移動が制限されて、
培養装置中に維持できる細胞の数が制限される。

(6) 圧力低下 中空繊維培養装置は、細胞区画室中の細胞を潅
流し、カートリツジを横切つて生ずる圧力降下に
よつて生ずる力により老廃物を移動させる。この
圧力降下は繊維の長さが増すにつれて大きくな
る。この圧力低下はまた前記勾配問題を生ずる。
従つて繊維の長さが勾配問題を高める圧力降下に
より制限される。

なお、従来技術の細胞培養装置の若干の例が、
次の特許に記載される。発明者 特許番号 マツムラ 第3734851号 ナゼツク（Nazek）ほか 第3821087号 ナゼツク（Nazek）ほか 第3883393号 オズボーン（Osborne）ほか 第3911140号 デレンテ（Delente） 第3997396号 フエデル（Feder）ほか 第4087327号 ナゼツク（Nazek）ほか 第4184922号 ナゼツク（Nazek）ほか 第4200689号 フエデル（Feder）ほか 第4201845号 ナゼツク（Nazek）ほか 第4206015号 ナゼツク（Nazek）ほか 第4220725号 チツク（Chick）ほか 第4242460号 ヨシダほか 第4391912号 セイ（Hesi） 第4396510号 マイクル（Michaels）ほか 第4440853号 マイクル（Michaels）ほか 第4442206号 発明の概要 本発明は生体外細胞成長用の改良された培養装
置および方法に関する。該装置は、シエルと、該
シエルを通つて延びる複数の毛細管とを有し、該
毛細管の少くとも若干が選択的透過性の膜壁を有
する中空繊維カートリツジを備えている。

第１培地供給物が第１の選定圧力および流量で
毛細管に供給される。細胞培養空間はシエルと毛
細管との間に構成される。本発明では、第２の選
定圧力下の第２培地供給物を有し、中空繊維カー
トリツジの細胞培養空間に流体連結された室が設
けられている。室中の第２培地供給物は、毛細管
の内腔を通つて流れる培地より高い水準に加圧さ
れる。弁機構が配置されて室と細胞培養空間とを
連結する第１および第２の導管をそれぞれ通る第
２培地供給物の流れを選択的にかつ交互に制限
し、細胞培養空間内で流体の循環を行なわせる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の改良細胞培養装置の概略図
である。第２図は、本発明の細胞培養装置の他の
態様の概略図である。第３図は第２図に示す細胞
培養装置に於て毛細管の壁を通して正の限外濾過
潅流が生じている様子を示す概略図である。

好ましい態様の詳細な説明 本発明の装置は第１図に示されている。改良さ
れた細胞培養装置は、細胞培養装置例えば中空繊
維カートリツジ１１を有し、その中に細胞が維持
されて成長する。中空繊維カートリツジ１１は、
シエル１６内を通つて延び全体的に１２で示され
る複数の毛細管を備えている。各毛細管は内腔
（図示されず）を有し、それを通して酸素、栄養
素およびその他の化学成分を含有する培地が運ば
れる。培地中に含有される酸素、栄養素および他
の化学成分は、毛細管の膜壁を通して、細胞を収
容する毛細管外空間１４の中へ拡散する。毛細管
外空間１４は、シエル１６と毛細管１２との間の
空間と定義される。典型的には、毛細管はカート
リツジのインプツト端１８からアウトプツト端２
０へ延びる束として配置される。

本発明の装置における使用に適する市販カート
リツジは、アミコン・コーポレーシヨン
（Amicon Corporation of Danvers，
Massachusetts）により製造されるものである。

カートリツジ１１は、さらに間隔を置いた第１
口２２および第２口２４を備えている。好ましく
は第１口２２および第２口２４は、口２２がカー
トリツジの前端の近くに位置し、口２４がカート
リツジの後端の近くに位置するように間隔をあけ
る。両口は毛細管外空間１４と流体連通してい
る。

本発明の装置で生体外培養をするのに適した細
胞の種類には、天然に存在する、あるいは接合ま
たは遺伝子工学技術例えば形質転換、DNA挿入、
形質導入、融合などにより変更（modify）され
た細胞、酵母および真菌が含まれる。さらに、原
始および形質転換哺乳動物細胞（遺伝子工学技術
およびウイルス生成により改変された哺乳動物細
胞を含む）、腫瘍細胞、ハイブリドーマおよびそ
の他の融合細胞は本発明の装置での培養に適す
る。

供給装置２６は第１培地供給物を適当な導管２
８を通して、毛細管１２の内腔へ供給する。培地
はカートリツジを出て適当な配管３０に流入し、
この配管は培地を供給装置２６へ戻す再循環管路
を形成する。

供給装置２６は、選んだ速度および圧力で培地
を供給する。適当な供給装置は、当該技術で良く
知られている。

膨張室３２は、第１口２２に連結された導管３
４および第２口２４に連結された導管３６を介し
て毛細管外空間１４に流体連結される。第１弁３
８および第２弁４０が操作可能に配置され、毛細
管外空間１４と膨張室３２との間のそれぞれ導管
３４および３６内の流れを制限する。１つの運転
例では、導管３４および３６は可撓性配管を有
し、弁３８および弁４０は配管を挟んで通過流を
止めるピンチ型弁である。

膨張室３２は第２培地供給物３３を収容する。
該培地供給物３３は、加圧装置４６によつて実質
的に一定な水準に選択的に加圧される。本発明の
１つの運転態様では加圧装置４６は、酸素含有ガ
スを圧力下で室３２へ供給するガス装置である。

膨張室３２の中の圧力は、毛細管１２の内腔内
の圧力より高い圧力に保持される。弁３８および
弁４０は、交互に開閉されて毛細管外空間１４内
に循環を生じさせる。例えば、弁４０を開いて弁
３８を閉じると、矢印４８で示すように、配管３
６を通して口２４から、毛細管外空間１４の中へ
培地の流れが生ずる。

次いで弁３８を開いて弁４０を閉じると、矢印
５０の方向に口２２を通り、配管３４を通つて膨
張室３２の中へ流れが生ずる。弁の開閉は、毛細
管外空間１４内の流体の循環が、矢印５１で示す
時計回りの方向に行なわれるように交互になされ
る。循環は脈動状態であり、弁３８および弁４０
は瞬時的に開閉される。

毛細管外空間１４内に生ずる循環は、従来技術
において問題であつた毛細管外空間中の栄養素、
PH、O₂、CO₂、乳酸、アンモニアおよび他の成分
の勾配の形成を排除する。速やかに代謝する細胞
により形成される微環境は、循環が毛細管外空間
中に起るので最小化される。さらに、毛細管外空
間中の循環が、従来技術のカートリツジを横切つ
て生じた圧力降下によつて引き起される勾配問題
を最小にする。

本発明の装置の他の態様を第２図に例示する。
この態様は、同様にシエル５８および前端６２か
ら後端６４へ延びる複数の半透過性の毛細管６０
を有する中空繊維カートリツジ５６を有する。毛
細管外空間６６は毛細管６０とシエル５８との間
に構成される。供給装置６８は、前記供給装置２
６と同様に、選択した圧力および流量に於て毛細
管６０の内腔に培地供給物を供給する。培地は中
空繊維カートリツジの出力端６４から配管７０を
通して循環され、供給装置６８に戻される。

室７２はガス加圧装置７６によつて実質的に一
定な水準に加圧された第２培地供給物７４を収容
する。室７２は配管７８，８０によりそれぞれ、
口８２，８４を介して毛細管外空間６６に流体連
結される。弁８６および弁８８は、導管７８およ
び８０にそれぞれ操作可能に連結され、流れを配
管７８および８０中で選択的に制限することがで
きる。

室７２は上水準センサー９０および下水準セン
サー９２を有し、それらは供給装置６８に信号を
送る。上水準センサー９０が室内の培地の高水準
を感知すると、供給装置６８が毛細管６０に培地
を供給している圧力を室７２の加圧より低くかつ
限外濾過条件を生じさせるのに十分な値まで低下
させる。低水準がセンサー９２により感知される
と供給装置が、圧力を増大させ、培地を毛細管に
通して限外濾過条件下に供給して室７２内の培地
の量を増加させる。

運転において、弁８８を開放位置にし弁８６を
閉鎖位置にし、そして供給装置６８が培地を室７
２の加圧より低い圧力で供給しているときには、
毛細管外空間６６中の流れは一般に矢印９４の方
向に生ずる。また、毛細管６０の内腔への老廃物
の拡散が矢印９６で示すように生ずる。さらに室
７２内の水準がセンサー９２を越えて下がると、
センサー９２が供給装置６８へ信号を送り、それ
に基いて毛細管６０へ供給される培地の圧力を室
７２内の加圧の水準以上に上昇させる。次いで弁
８６が開かれ、弁８８が閉じられ、培地が毛細管
外空間から口８２を通つて配管７８の中へ流れ、
矢印９８で初めに示したように室７２の中へ戻
る。酸素、CO₂、栄養素および他の化学成分の正
の限外濾過潅流は、第３図に矢印１００で示すよ
うに、毛細管６０の壁を通して生ずる。

前記の手順が、交互になされるので毛細管外空
間中で循環が行なわれる。さらに、毛細管の内腔
の中へ逆に老廃物および他の好ましくない成分の
拡散、並びに毛細管外空間中への酸素、CO₂、栄
養素および他の化学成分の拡散が増進される。

１例において、本発明の装置がハイブリドーマ
細胞の成長、維持に良好に使用され、90日間にわ
たり約１×10⁸〜１×10⁹細胞毎mlの細胞密度に成
長し、多量の単クローン性抗体を生じた。典型的
には、中空繊維カートリツジ中のハイブリドーマ
細胞の成長および維持には、毛細管が約50000ド
ルトン以下の選択分子量遮断を有する膜壁を有す
ることを必要とする。その例において約15000ド
ルトン以下の選択的分子量カツトオフ（cut off）
を有する毛細管を用いた。より小さい分子量カツ
トオフを用いて細胞により生成された抗体の毛細
管の内腔への拡散を著しく排除した。しかし、分
子量カツトオフを減ずると毛細管の壁を通して細
胞への酸素移動および栄養素移動に対する抵抗が
増大する。さらに、毛細管壁を通して内腔への老
廃産物（例えば細胞により生成された乳酸）の移
動に対する抵抗が高められる。高い老廃物濃度
は、細胞の成長および維持に有害である。

出願人は、従来技術の中空繊維カートリツジ装
置の使用においては、酸素および栄養素の濃度勾
配が毛細管外空間中に毛細管束の長さにわたつて
形成され、カートリツジの前端付近に栄養素およ
び酸素が蓄積し、カートリツジの後端付近に老廃
物が蓄積することを認めた。また蓄積が毛細管壁
を横切る濃度勾配を減少させるので、毛細管外空
間の前端付近の栄養素および酸素の蓄積がさらに
酸素および栄養素の拡散抵抗を増加させたと思わ
れる。

膨張室は毛細管外空間の容積にほぼ等しい培地
容積を有し、初めに例えば正100mm水銀柱まで加
圧された。弁８６を開いて弁８８を閉じた。供給
装置６８を操作して毛細管の内腔の圧力を約200
mm水銀柱にした。その結果流体が毛細管外空間か
ら配管７８を通つて膨張室中へ流れ、O₂、CO₂お
よび栄養素が毛細管外空間中へ拡散した。

培地の高水準が室の中で感知されると、毛細管
の内腔内の圧力を膨張室中の圧力以下に低下させ
た。前に閉じた弁８８を開き、前に開いた弁８６
を閉じた。その結果、膨張室７２から配管８０を
通して毛細管外空間の中へ培地が流れ、かつ老廃
産物の負の限外濾過があつた。

運転を続け、毛細管中の相対圧力を交互に変
え、弁８６および弁８８の開閉を交互に行なう
と、細胞培養空間１４を通る培地の循環、および
望ましい成分の毛細管外空間中への正の限外濾過
潅流、並びに毛細管外空間からの老廃物の追出が
行なわれた。細胞培養空間中で循環を行なわせ作
用は、細胞が成長する環境を高めると思われる。
移動が限外濾過条件下に生ずるので、毛細管膜を
通る栄養素および酸素の潅流は、毛細管内腔中の
圧力が、膨張室中より高いときに高められ、毛細
管壁を通る老廃物の拡散は、膨張室中の圧力が毛
細管内腔中の圧力より高いときに高められる。さ
らに、酸素および栄養素を細胞培養空間全体に一
様に分布させ、酸素と栄養素の両方を細胞の大部
分への接近を著しく高める。

また、毛細管外空間１４と膨張室３２との間に
時計回りまたは反時計回りの循環が行なわれても
細胞密度に著しく差が生じないことが認められ
た。

反時計回りの循環は、弁３８を閉じて弁４０を
開き、同時に膨張室３２中の圧力が毛細管の内腔
内の圧力より低い場合に起る。毛細管の内腔内の
圧力を低下させ、膨張室中の圧力を毛細管の内腔
内より高い水準に増大させるときに弁３８を開い
て弁４０を閉じる。

毛細管と膨張室との間の負および正の圧力差に
よつて生ずる限外濾過条件は、高い細胞密度の維
持を助ける。また細胞の層を通る酸素および栄養
素の移動が大変高められる。PHに影響を及ぼして
細胞に害を与える成分の除去を限外濾過条件下で
非常に増大させる。

本発明は好ましい態様について記載されたけれ
ども、本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく形態および細部に変更を行なうことができる
ことは当業者に認められよう。