JPH0265797A - Ｄ‐フェニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は医薬中間体として有用なり一フェニルアラニン
を選択資化法によって工業的に製造する方法に関するも
のである。

〈従来の技術〉 ＤＬ−５−ベンジルヒダントインを微生物によりＮ−力
ルバミルーＤ−フェニルアラニンにしたのち、加水分解
によりＤ−フェニルアラニンを得る方法はすでに知られ
ている（特開昭６１−１５２２９１号公報）。

〈発明が解決しようとする課題〉 前記方法はＤＬ−５−ベンジルヒダントインからＤ−フ
ェニルアラニンを得る方法として優れている。

しかしながら、Ｄし−５−ベンジルヒダントインからＮ
−カルバミル−Ｄ−フェニルアラニンを得る反応の収率
は６０％以上と高いが、生菌体を使用する場合には５０
ｇ／ｊ！もの分甜菌体を必要とすること、また得られた
Ｎ−カルバモイル−Ｄ−フェニルアラニンからＤ−フェ
ニルアラニンへの加水分解か困難なことなど工業的な製
造法として有利な方法とはいえない。

く課題を解決するための手段および作用〉そこで、本発
明者らは工業的に実用化可能な方法を堤供することを目
的として、ＤＬ−フェニルアラニンを含有する培地で（
殺生物を培養することにより１．−フェニルアラニンの
みを選択資化ぜしめ、Ｄ−フェニルアラニンを製造する
方法を検討した。

この方法によれば、し−フェニルアラニンは微生物か生
Ｒするためのエネルギーとして消費されるために、し−
フェニルアラニンを全量資化した時点では培地中にＤ−
フェニルアラニンのみが蓄積される。しかも、Ｌ−フェ
ニルアラニンの代謝中間体は、蓄積するとしても少量で
あり、Ｄ−フェニルアラニンの通常の単離操作において
容易に分解が可能である。

加えて、選ばれた微生物がラセマーゼを保有しないか、
あるいは保有したとしても不活性化される条件下で培養
することにより、ＤＬ−フェニルアラニンに含まれるＤ
−フェニルアラニンは実質的に理論量蓄積されることに
なる。

本発明者らは、このような条件に合致する微生物を探究
すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。

すなわち、ＤＬ−フェニルアラニンを炭素源および窒素
源として含む培地中で、し−フェニルアラニンのみを資
化し、Ｄ−フェニルアラニンを実質的に資化しない遷択
資化能を有する微生物を見い出すべく研究した結果、ロ
ドトルラ属、ロドスボリジウム属、またはプロビデンシ
ア属に属する微生物をＤＬ−フェニルアラニンを含有す
る培地中で培養することにより、数十ｇ／！以上の蓄Ｍ
濃度でＤ−フェニルアラニンが得られることを見い出し
、本発明を完成した。

すなわち、本発明はＤ　Ｌ−フェニルアラニンを含有す
る培地中で、ロドｌ〜ルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕ　ｌａ
　）属、ロドスボリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉ
ｕｎ）属またはプロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉ
ａ）属に属し、Ｉ−一フェニルアラニンを資化する能力
を有し、かつＤ−フェニルアラニンを実質的に資化しな
い微生物を培養し、培養液中からＤ−フェニルアラニン
を単離採取することを特徴とするＤ−フェニルアラニン
の製造法である。

本発明で使用する微生物としては、ロドトルラ属、ロド
スボリジウム属またはプロビデンシア属に属するｔ殺生
物が挙げられる。これらの微生物のうちし一フェニルア
ラニンを資化する能力を有しかつＤ−フェニルアラニン
を実質的に資化しない微生物が本発明では用いられる。

ここで、Ｄ−フェニルアラニンを実質的に資化しない能
力を有する微生物とは、本発明の効果を実質的に阻害し
ない範囲においてＤ−フェニルアラニンを少量のみ資化
する微生物、あるいは、し−フェニルアラニンを資化し
たのち、Ｌ−フェニルアラニンの不存在下ではＤ−フェ
ニルアラニンを資化する微生物ら含まれる。

本発明で使用する微生物としては具体的にはたとえば次
のらのが挙げられる。

ロドスボリジウム・トルロイデス （Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅ
ｓ）ＡＴＣＣ１０７８８ ０ドトルラ・グルティニス （Ｒｈｏｄｏｔ、ｏｒｕｌａ　　ｇｌｕｔ、１ｎｉｓ）
ＩＰＯ１０９９ プロビデンシア・レトゲリ− （ＰｒｏｖｌｄｅｎｃＬａ　　ｒｅｔｔｇｅｒｔ）ＡＴ
ＣＣ２１１８ 本発明では、上記（殺生物を使用することにより、ＤＬ
−フェニルアラニンを炭素源、窒素源として含有する培
地中で培養を行うことができる。池の炭素源および／ま
たは窒素源、たとえば、グルコース、グリセロール、塩
安などを含有してらよいが、好ましくは、ＤＬ−フェニ
ルアラニンを単一炭素源、窒素源として含有する培地中
で培養を行う。

培地中のＤＬ−フェニルアラニン４度はｌｌ中に１〜１
００ｇ、好ましくは１０〜６０ｔｒである。ＤＬ−フェ
ニルアラニン濃度が低いと生産効率が悪く、逆に高いと
培養時間が長くなったり、微生物の生育が阻害される傾
向となる。

ＤＬ−フェニルアラニンは始めから培養液に全量仕込ん
でもよいが、濃度が高くなると１紋生物の生育が遅くな
り培養時間が長くなるので、初濃度を１０〜３０ｇ／氾
にし、残りのＤＬフェニルアラニンを分割添加する流加
培養が好ましい２ 培養温度は通常２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５゛
Ｃである。

培養は通気しながら撹拌する１通気量は通常、ｏ、　＝
　〜２．　Ｏｖ　ｖ　ｌ、好ましくは０．６〜１．２ｖ
ｖｎで島る。通気量が少なずぎるとし一フェニルアラニ
ジ資化速度が遅くなる傾向となり、また、多ぐても効果
に変わりなく、むしろ培養液の蒸発を促進するために培
養液濃度が高くなったり、発泡が激しくなり好ましくな
い。

し−フェニルアラニンがすべて資化された時点で通常培
養を終了する。し−フェニルアラニンの全量資化は溶存
酸素濃度＜Ｄｏ）をモニターすることにより知ることが
できる。

ｌ、−フェニルアラニンがすべて資化されたのち、さら
に培養を続けるとＤ−フェニルアラニンも徐々に資化さ
れる場合らあるので、培養の終点を明確に知ることが好
ましい。

かくして得られた培養液を遠心分離により菌体を除去し
たのち、通常の方法によってＤ−フェニルアラニンを単
片すればよい。たとえば、培養液をイオン交換樹脂５Ｋ
−ＩＢ（三菱化成■製）に通液してフェニルアラニンを
樹脂に吸着させたのぢ、よく水洗し、次いでアンモニア
水溶液で溶出させたのち、溶出液を濃縮することにより
Ｄ−フェニルアラニンを単離することができる。ここで
得られた［Ｄ−フェニルアラニンを水で再結晶すれば精
製されたＤ−フェニルアラニンが得られる。

〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例においてフェニルアラニンの光学純度分析は、濃
縮乾燥したＤ−フェニルアラニン含有粉末をメタノール
−塩酸によりメチルエステル化したのち３，５−ジニト
ロフェニルイソシアネートと反応させ、これを次の条件
により高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析
する方法によって行った。

カラム：０Ａ−１０００（住友化学） 移動智：ｎ−ヘキサン：ジクロルエタン：エタノール（
６８：２８：４） 流　速：　１　ｍ１７’Ｆ　ｌ　ｎ 検　　出　：ＵＶ２５４ｎｍ 実施例１ 乾燥ブイヨン３０　ｇ／　１　（ｐ　）［６，Ｏ）を含
む培地１００ｍ１を１β三角フラスコに分注し、１２０
゛Ｃｌ２Ｏ分間滅菌し、種培養培地とした。

これにロドスボリジウム・トルロイデスＡＴＣＣ１０７
８８を一白金耳植閑し、３０℃で一口振どう培養した。

一方、ＤＬ−フェニルアラニン１０　ｇ　／　ｉ、リン
酸−カリウム２　ｇ　／′ｊ！　、硫酸マグネシウム０
．５　ｇ　／　１　、粉末酵母エキス１゜０　ｇ　／　
Ｒを含む培地（ｐＨ５，０）９００ｍｌを３λカミニジ
ヤーフアーメンターに仕込み滅菌して主培養培地とした
。これに先の種槁秀液を接種し、３０°Ｃ１１，ＯＶ　
Ｖ　１通気撹拌培養をした。

なお、培養中は２Ｎ硫酸によりｐ　Ｉ−（５，０±０．
１に：ＪＩ整を行った。約２０時間後、乾熱滅菌したＤ
　Ｌ−フェニルアラニンの粉末２０ｇを添加し、３時間
後にさらに同３０１ｒを添加し、培養を続けた。培養を
始めてから約４７時間で培地中のＬ−フェニルアラニン
は全量資化され、Ｄ−）工二ルアラニン２５．８　ｇを
含む培養液を得た。

この培養液を１０．０００　ｒρ１．１０分間遠心分Ａ
Ｍ　して菌体を除いたのち、イオン交換樹脂５Ｋ−ＩＢ
（Ｈ型）を充填したカラムに通諭し、Ｄ−フェニルアラ
ニンを吸着させた。このカラムを十分水洗したのち、４
％アンモニア水でＤフェニルアラニンを溶出した。この
溶出液を濃縮、乾固してＤ−フェニルアラニン２５．０
ｇを得た。水で再結晶して精製されたＤ−フェニルアラ
ニン２２．２ｇを得た。化学純度９９９％以上、光学純
度９９．　ｓ　ｑｇ以上であった。

実施例２〜４ 乾燥ブイヨン３０　ｇ　／　Ｒからなる種培地（ｐＨ５
，０）５ｏｎｌを１．８　Ｘ　］−８０ｒａｔ＋φの試
験管に分注し、滅菌した。これに表１に示した微生物を
一白金耳植菌し、３０°Ｃで１〜２日振口振培養した。

一方、ＤＬ−フェニルアラニン１０ｇ／ｌ、リン酸−カ
リウム２　ｇ　／　１　、ｒｒｆｉ敢マグネシウム０．
５１ｒ／　１　、粉末酵母エキス０．５　ｇ　／　ｉ’
よりなる主培養培地（ｐＨ５，０）５ｍｌを１８Ｘ１８
０＋ｕ＋φ試験管に分注して滅菌した。これに先の神培
養ン（ｊを５２６シードて゛接種し、３０℃て・振どう
培養した。２４時間後、遠心分離して菌体を除いたのち
減圧濃縮して乾固ののち乾燥した。

＜ｌ）られた固形分についてＨＰ　Ｌ　Ｃによりフェニ
ルアラニンの１一体、Ｄ１本の残存率を求めた。

結果を表１に示した。

表 〈発明の効果〉 本発明は次の効果を発揮する。

（１）Ｌ−フェニルアラニンを高選択的に資化づ゛るこ
とかできる。

（２）蓄積濃度か高く、短時間でＤ−フェニルアラニン
が得られる。

（３）さらに、ＤＬ−フェニルアラニンを実質的な炭素
源および窒素源として（放生物を培養することができる
。

（４）消費されたし一フェニルアラニンはほとんど炭酸
ガスと水にまで変換されて、代謝中間体の蓄積は少量で
ある。そして、この代謝中間体はＤ−フェニルアラニン
の通常の単Ｍ操作で完全に分離が可能であり、Ｄ−フェ
ニルアラニンの単離精製は容易である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ＤＬ−フェニルアラニンを含有する培地中で、ロドトル
   ラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（
   Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｌｄｉｕｌ）属またはプロビデンシ
   ア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属に属し、Ｌ−フェニル
   アラニンを資化する能力を有し、かつＤ−フェニルアラ
   ニンを実質的に資化しない微生物を培養し、培養液中か
   らＤ−フェニルアラニンを単離採取することを特徴とす
   るＤ−フェニルアラニンの製造法。