JPH0253496A - Ｂｃｇ菌由来のｍｐｂ５７蛋白及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は組換えＤＮＡ　＠により生産し７’ｊ　ＢＣＧ
菌由来のＭＰＢ　５７蛋白（カラム操作で得られ九ＲＣ
Ｇ菌の５７番目のミコバクチリアル　プロテインのこと
をＭＰＢ　５７蛋白と略する〕、ＢＣＧ菌由来のＭＰ　
Ｂ５７蛋白をコードする遺伝子、及びＢＣＧ菌由来のＭ
ＰＢ　５７蛋白をコードする遺伝子を含有するグラスミ
ドにより形Ｉｔ転遺され念形質転撲体を培養して、目的
とするＢＣＧ菌由来のＭＰＢ　５７蛋白を生産する製造
法ＫｐＡする。

〈従来技術〉 臨床医が胸部写真と病状から結核症と疑われる場合でも
、一般に患者の痰から鏡検で結核盾を見出すことが困難
な場合が多い。このような場合には菌の培養全行なって
菌を検出するが、この培養に約３週間かかる。′１友、
肺結核と肺ガンの症状の類似性から肺ガンを肺結核と誤
診して抗結核薬を試験投与するうちに肺がンが進行して
手遅れになるケースが増えているうそこで、本発明者等
は、ＢＣＧ　Ｉや結核［Ｋ存在する蛋白ＭＰＢ　５７に
着目し、ＭＰＢ　５７を遺伝子工学的手法により純粋な
形で大量に取得すべき研究を開始し念。何故ならば、こ
のＭＰＢ　５７金利用する抗原抗体反Ｚ　ＣＥＬＩＳＡ
法）を駆使する診断薬を開発でき友ならば極めて正確か
つ迅速に肺ガンと結核、を見分けることができるからで
ある。

しかし、現実的には、結核菌及びＢＣＧ　醒が分泌する
蛋白は約３ｎＯｉ’ｌにのぼり、この中から結核菌及び
ＢＣＧ薗由来のＭＰＢ　５７蛋白を純粋にとり出すｔめ
には、電気泳動や数種類の複雑なカラム操作が必要であ
る。

従って菌の培養でＭＰＢ　５７蛋白を大ｔにしかも純粋
な形で得ることは曳めて難しい。

このことより、遺伝子工学的手法により、結核菌及びＢ
ＣＧ薗が分泌するＭＰＢ　５７蛋白を純粋な形で大量に
提供することが望まれている。

〈本発明が解決すべき課題〉 本発明の裸鎖は、ＢＣＧ菌由来のＭＰＢ　ｓ　？蛋白を
コードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えＤＮＡに
より形質転換され九形質転喚体を用いるＢＣＧ菌由来の
ＭＰＢ　５７蛋白の製造法、及び組換えＤＮＡ法で生産
され＊　ＢＣＧ　Ｍ由来のＭＰＢ　５７蛋白の提供であ
る。

〈訴辿を解決する為の手段〉 本発明者等は、上記課題’を解決する為に、まず、ＭＰ
Ｂ　５７蛋白のＮ床端アミノ醜配列？：調べた。そ列２
０コと１個の相違で一致していｔｏ（ＩＮＦＥＣＴＩＯ
Ｎ　ＡＮＤ　ＩＭＦｉｌ［ＵＮＩＴＹ　１９８４　Ｖｏ
　ｌ　４６Ａ２５１９〜５２５） しかしながら、その後、彼らがその遺伝子の単離、およ
びその遺伝子の発現に成功したという報告はされていな
い。そこで決定し九ＭＰＨ５７ＯＮ末端末端アミノ列配
対応する化学合成オリゴヌクレオチドグローブを作成し
、これを基に、　ＭＰＢ５７蛋白を分泌するＢＣＧ菌か
らＭＰＢ　５７蛋白をコードする遺伝子を単離し、十の
塩基配列を決定し、次に該遺伝子を適当な発現ベクター
に組み込むことにより、大腸菌で、該ＭＰＢ　５７蛋白
金大量に製造提供することができ、本発明’ｋ　’５Ｅ
　Ｍに至らしめた。

以下に本発明を、 （１）　　ＢＣＧ　Ｗ染色体ＤＮＡの調製（２）ＭＰＢ
５７蛋白全コードする遺伝子のクローニング （３）ＭＰＢ５７蛋白金コ蛋白デコード子の形質発現に
分けて説明する。

（１）　　ＢＣＧ菌染色体ＤＮＡの調製ＢＣＧ菌の染色
体ＤＮＡは、鈴木らの方法（Ｊ。

Ｂａｅｔ＠ｒｉｏ１．１６９（２）　８３９　（１９８
７）　）により調製できる。抽出したＤＮＡは、塩化セ
シウム−エチジウムプロはド密度勾配遠心分離法により
絹製する。

ダ７ （２）　　ＭＰＢ命噌蛋白金コードする遺伝子のクロー
ニング 上記（１）で得九染色体ＤＮＡの種々の制限酵素による
消化物音アガロースｒル電気泳動による分画し。

次に、サデンらの方法［Ｊ、Ｍａｌ、Ｂｌｏｌ、　９８
　、５０３（１９７５））によりＤＮＡ断片を結合しｔ
フィルターにトロセルロース又ハナイロンメンプラン）
を醐裂する。

ついで、このフィルターに対し、５′リンＩｌｌ！基を
３２Ｐで標識し几合成オリゴヌクレオチドプローブをハ
イプリダイゼーシ、ン〔メソッド　イン　エンデイモロ
ジー６８，４１９（１９７９）］させることにより、Ｍ
ＰＢ　５７遺伝子を含むＤＮＡ断片を検出することがで
きる。このＤＮＡ断片全アガロースゲル電気泳動により
分画し念後回収バッファー（５０％グリセロール泳動バ
ッファー）で溶出することにより、目的ＤＮＡバンド全
回収する。

次に、このＤＮＡ断片をプラスミドｐＵｃ１８に導入し
、ハナハンの方法（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、、　１６６
　。

５５７（１９８３）］に準じて宿主細胞（例えばＥ。

ｃｏｌｔ　ＪＭＩ　０９株など）に導入して形質転換さ
せｆ択（ｇ、ｅｏｌｉ　ＪＭＩ　０９　ａであれば、ア
ンピシリン耐性でβ−がラクトシダーゼ活性非保有株を
選択）することによりＤＮＡライブラリーを作製する。

このＤＮＡライブラリーについて、前述の　Ｐ標識オリ
ゴヌクレオチドグローブを用いたコロニーハイツリダイ
ゼーシ、ンテスト（メソッド　インエンデイモロシーＪ
　　３７９　　（１９７９））を行ない、目的のクロー
ン全スクリーニングする。

かくして得ｔクローンからクローン化ＤＮＡ断片ｔ−調
委し、メッシング等の方法（：　Ｎ、　Ａ、　Ｒ，、９
。

３０９（１９８１’））によって１基配列を解析し、Ｍ
ＰＢ　５７蛋白のアミノ末端部分のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を求め、！＆終的にＭＰＢ　５７　Ｅ白
の全翻訳領域に対応する塩基配列金倉むクローン化ＤＮ
Ａ　ｔ−得ることができる。

（３）　　ＭＰＢ　５７蛋白全コードする遺伝子の形質
発現上記（２）で得たＭＰＢ　５７蛋白をコードする遺
伝子を用いてＭＰＢ　５７蛋白を生産するにはまず、ク
ローン化ＤＮＡの実質的な配列を形質発現ベクターに組
み込むことにより、ＭＰＢ　５７　ｆｆｌ白生産用の組
み換えＤＮＡを作製する。ついで、この組み換えＤＮＡ
を適当な宿主細胞に導入して形質転換する。

このようにして得られｔ形質転換株を培地中で培讐する
ことにより、目的とするＭＰＢ　５７蛋白を得ることが
できる。

本発明において、クローン化し九ＭＰＨ５７蛋白の遺伝
子を形質発現させるひには、広範囲の原核生物もしくは
、真核生物の宿主細胞と形質発現ベクターの組み合わせ
を採用することができる。

宿主細胞として原核生物を用いる場合には、特に制限は
ないが例えは大腸窮に１２床（尚、以下、大ｍ　’６１
４　ｆ　Ｅ、　ｃｏ　ｌ　１と表わす）に属するＥ、ｃ
ｏｌｌＸ１７７６株、Ｅ、　ｅｏｌｉ　ＪＭ１０３株（
Ｎ、　Ａ、　Ｒ，９。

３０９　（１９８１）　Ｅ、　ｃａｌｌ　ＪＭ１０９株
が好ましい。

また、この他、枯草菌をも用いることができる。

ま危真核生物金用−る場合にも特に制限はないが、例え
ば、サツカロマイセス　セレビシェ等が好ましいり ま之、形質発現用ベクターとしては、上記宿主細胞に適
合し得るレグリコンとｌ１１能を含むベクター及び該宿
主細胞がそれ自身の蛋白質を発現するのく必要なプロモ
ーターｔ−含有するか、もしくは含有するように改良逼
れ九ものが好ましい。

これらの各組み合わせの具体例を示すと以下の通りであ
る。

・宿主細胞がＬ　ｃｏｉｌの場合ニ ゲラスミドとしてｐＢＲ３２２［Ｇ＠ｎｅ　、　２　、
９５（１９７７））、ブロモ−ターとしてラクトース（
ｌｅｅ）７’ａモーターＣＮａｔｕｒｅ　、　２８１　
＋　５４４（１９７９）　〕、トリプトファン（ｔｒｐ
　）ブロモ−ターＣＮ、Ａ、Ｒ，８，４５０７（１９８
０ン〕およびタック（ｔａｅ　）ブロモ−ター（Ｐｒｏ
、　Ｎ、　Ａ、　８１７８．２１　（１９８３））など
を有するものがあげられる。

形質発現用ベクターとしては、ｐＢＲ３２２に前記ブロ
モ−ター全含有するｐＵｃ１８などのｐＵＣベクター〔
メソッド　イン　エンデイモロジー１０１．２０（１９
８３）］、りるいはｐＫＫ２３３−２（スウェーデン、
ファルマシア社裂）などがあげられる。

・宿主細胞がサツカロマイセス　セレビシェの場合ニ プラスミドとしてＹＲｐ　７　（Ｎａｔｕｒｅ、　２８
２　、３９（１９７９））が、ま危プロモーターとして
グリセルアルデヒド−３−ホスフェート　デヒドロｒナ
ーゼプロモーター（Ｊ、　Ｂ、　Ｃ，、２５４、９８３
９（１９７９））や、α−ファクタープロモーターなど
があげられる。

本発明においては宿主細胞として、原核生物細胞を用い
ても真核生物を用いてもよいが、より好ましくは、原核
生物を用りる方が良い。

かくして得られるＭＰＢ　５７蛋白生産用の組み換えＤ
ＮＡ金言有含有宿主細胞（形質転換体）の培養は、液体
培地中、好気的に行なえばよい。培地としては、例えば
ポリ（プトン、酵母抽出物１食塩、グルコースなどを含
有する通常の栄養培地の他、Ｍ９最小培地などを用いる
ことができる。培養は、約３０〜４０℃で行なうのが好
ましい。

″また培饗に際し用い九プロモーターに応じて適当な誘
導剤、例えばｌａｅグロプロターの場合であれは、イソ
プロビルーβ−Ｄ−チオがラクトシトを培地中に添加す
ることにより、形質転換体の培養をより効率的に行うこ
とができる。

尚１本発明におｈては以下の略号全使用する。

Ａニアｆニン Ｃ：シトシン Ｇニゲアニン Ｔ：チミン ｄＣＴＰ　ニブオキシシチジン二リン酸ＥＤＴＡ　：エ
チレンジアミン四酢酸 ｋｂ：キロ塩基 ｋｂｐ　：キロ塩基対 ＤＥＡＥ　ニジエチルアミノエチル ＳＤＳ　ニドデシル硫酸ナトリウム ＳＳＣ：　０．１５　Ｍ塩化ナトリウム０．０１５Ｍク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）緩衝液 ＩＰＴＧ　：イソ！ロビルーβ−Ｄ−チオがラクトシト Ｘ−ｇａｌ　：　５−プロモー４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−がラクトピラノシド 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。

〈実施例１〉 （１）　　ＢＣＧ萌染色体ＤＮＡの調製Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｓ＋ｒｉｕｍ　ｂｏｖｔｓ　ＢＣＧ　Ｔｏｋｙｏ株を
ツートン培地（組成：アス・ヤライン０．４％、クエン
酸０．２チ、クエン酸ナトリウム０．２８％、リン酸カ
リウム０．０５％、硫Ｃλマグネシウム０．０５％、ク
エン酸ｍｌ鉄アンモニウム０．００５％、グリセリン６
％）ｌｌ中、３７℃で培養し、対数増殖期に達した時点
で遠心分離により集層した。菌体を１０　ｍＭ　トリス
−［ｒ９（Ｆ”　８．０　）　１　ｍＭ　ＥＤＴＡバッ
フ　７　５　ｔｎｌに＠濁し、リゾチーム５　ｍ、９　
ｆ加えて、３７℃１５分間インキ−ベートしたのち、１
０％ＳＯ８水溶液０．５−を加え次。フェノール：クロ
ロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１の混
合ｆｉ６−で３回抽出したのち、水７）をとって、エタ
ノール１０−を加え、沈澱するＤＮＡをがラス捧にまき
とッｆｊ　ｏ　このＤＮＡ　ｆ　１０　ｍＭ　）リス−
塩酸（ｐｉ（８，０）１　ｍＭ　ＥＤＴＡバッファー６
．６−に溶解し、塩化セシウム７Ｉ、エチデウムプロミ
ド水溶液（５ｍ、９／ｄ）０．７−を加えて溶解し友。

該溶液？遠心チューブ（米国ベックマン社裏りイックシ
ールチ、−プ）中に入れ、　６００００　ｒｐｍ。

６時間遠心して、染色体ＤＮＡのバンド全遠心チューブ
上方より採取し念。このＤＮＡ　Ｑ液を１０ｍＭトリス
−ｔＸＷｌ　（ｐＨ８，０）　１　ｍＭ　ＥＤＴＡバッ
ファーに対して透析することにより悦１して絹製ＢＣＧ
染色体ＤＮＡを得念。

（２）　　ｅ成オリプヌクレオチドゾロープのｆ！、Ｄ
　製今回、決定し友ＢＣＧ　呵由来のＭＰＢ　５７３Ｍ
白のＮ末端より２０個のアミノ酸配列、即ち ’Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａａｎ　ＩＩ＠Ｌｙｓ　Ｐ
ｒｏ　Ｌ會ｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ”Ｌｙａ　ＩＩｓ　Ｌｅ
ｔ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｉｍ
　Ｇｌｕ２０に対する３種類の合皮オリプヌクレオチド
グロー１を調製し几。つまり、下記のグローブ１．］Ｉ
及び■である。

７’ｏ−プ■（１４Ｍｍ１−　”Ｇｌｕに対応）：〆　
　０ ５ＧＴＧ（！ＡＧＧＣＣＡｉＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧ３′
（２１ｍａｒ） ？−１７ グローブｎ　（Ｇｌｕ　　　Ａａｎに対応）：５６ＡＧ
ＧＡＣＡＡＧ人ＴＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＡＣ”
　　　　（２７ｍａｒ）グローブＭ　（２Ｌｙｓ　−”
Ａｌｍに対応）：具体的に合成操作を以下に示しｔｏま
ず、自動ＤＮ人合成装置ｉ！（米国、アプライド　バイ
オシステムズ社、３８０Ａ型）で目的とするＤＮ人プロ
ーグを合放し次のち、ジメトキシトリチル基以外の保護
基金除去し、逆相中圧カラムクロマトグラフィー（条件
：Ｃ１８−シリカダルカラムを用い、移動相として１０
０　ｍＭ　トリエチルアミンアセテートバッファー（ｐ
Ｈ７，０）中、アセトニトリルからなる濃度勾配液を用
いる）で精製し次。

ついで８０％酢酸を用いてジメトキシトリチル基を除去
し文後、逆相ＨＰＬＣ（条件：　ＹＭＣＰＡＣＫＡＭ−
３１４ＱＤＳカラムを用い、＃動相として１００ｍＭト
リエチルアミンアセテートバッファー（ＰＨ７，０）中
アセトニトリルからなる濃度勾配液を用いる）で精整し
、凍結乾燥し念。

かくして、得られた３ｆｌ！ｉ類のオリゴヌクレオチド
グローブｔ−０，００２０Ｄ／μｔの濃度になるように
１０　ｍＭ　トリス塩＠（ｐＨ８，０）　１ｍＭＥＤＴ
Ａバッフγ−に溶解し九〇このオリゴヌクレオチド溶液
１００　ｐｍｏＡとキナーゼ反応バッファ（５０ｍＭト
リス−ｔｘ散パック７　　（Ｐ）１７．５　）、　　１
０ｍＭ頃化マグネシウム、１０−ジチオスレイトール。

０．６６μＭＡＴＰ、１００μＣ１Ｃｒ−Ｐ：１ＡＴＰ
（比活性３０００　Ｃ１／ｍｍｏｔ）、１５単位　ポリ
ヌクレオチドキナーゼ〕の重量５０μｔで３７℃１時間
反応させ友。この反応液をフェノール抽出し、クロロホ
ルムで洗浄後、ＮＥＮ　５ＯＲＢ　　２０　ＤＮＡ楕裂
用カートリッヂを通し、未反応の　ｐＪＰ共存蛋白質、
塩を取り除き、５０％メタノール溶液としてラベル化ヌ
クレオチドｆ＝−１を回収した。次に溶媒全留去し＊ｉ
”ｐのｃｏｕｎｔ　ｆ測定し、１０　　ａｐｍ／μを重
上の濃度になるようにＩ　Ｑ　ｍＭ　）　！ｊスス−酸
（ｐＨ８，０）　１　ｍＭ　ＥＤＴＡバクファーニ溶解
しｔｏ（３）サデンハイプリダイゼーシ、ン ＭＰＲ５７蛋白の遺伝子を持つ染色体ＤＮＡ断片を検出
、分画するため、サインハイプリダイゼーシ胃ンテスト
ｋ　５ｏｕｔｈｅｒｎらの方ＩＥ　（Ｊ、　Ｍｏ１．　
Ｄｉａｌて分画したのち、このアがロースグル′に１．
５　Ｍ塩化ナトリウム０゜５Ｍ水歌化ナトリウム水＠液
中で、４０分間搬とつした。

次に、このグルｉ３Ｍ塩化ナトリウム、０．５）リスー
塩餓バッファー（ＰＨ７，０）中で、１時間攪とつした
。最後に２００倍濃のＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム０．
３Ｍクエン酸ナトリウムバッフフー（ｐ）ｉ　７．０　
）中で３０分間碌とうする。このグルに、２０倍１度の
ＳＳＣ＠液にひ之したナイロンメンブランフィルタ−（
米国、ＮＥＮ社＃！Ｇｏｎｅ　５ａｒｒｅｎＰｌｕｓ　
）をのせ、ＤＮＡを吸着させた。このフィルター全２１
誤度のＳＳＣで洗浄し友のら、室温で３０分間、３７℃
で１８時間乾燥することによりＤＮＡ結合フィルターを
調夷し友。

このフィルター全ハイツリダイゼーシ、ン溶液〔５倍濃
度Ｄ＊ｎｈａｒｄｔ　（０，１％フィコール、　０．１
％ポリビニルピロリドン、０６１％ウシ血清アルブミン
）、５倍濃度ＳＳＣ、０，Ｉ　ＳＤＳ溶液〕に浸し、６
５℃で６時間静置し次。次に上Ｅノ・イブリダイゼーシ
、ン？８液５ゴに前記（２）の　Ｐ　ｑ　Ｑ　７’ロー
プ４０μｔ′ｆ：加え、５５℃で１８時間静置し逢う次
にフィルターを２倍濃度のＳＳＣ０，１俤ＳＤＳ中５５
’Ｃ２０分間洗浄した。この操作を３回繰り返し行なっ
念後風乾し、オートラジオグラフィーを行ないＭＰＢ　
５７蛋白の遺伝子を含むＤＮＡ断片を検出しｉ（第１図
）。

第１図の結果より分かるよう罠グローブＩ、ＴＩ及びｍ
のいずれにも反応し九のは約９０００　ｂｐにバンドを
示し７’？：、　ＤＮＡ断片だけであった。

（４）　　ＤＮＡライブラリーの作成 ■　Ｐ＠ｔｌＤＮＡ断片のａｍ＋裏 （３）Ｋよって検出できた約ｃｔｏｏｏｂｐの制限酵素
Ｆ’ｓｔｌ消化ＤＮＡ断片全クローン化する之めＢＣＧ
染色体ＤＮＡ　２０μｇを側１畏酵素Ｐｓ＋ｔｌで完全
消化し友後、０．８％アがロースダル電気泳動により分
画した。目的とする９　０００　ｂｐのバンドの下流に
溝を作り１回収バッファ（５０％グリセロール、４０ｍ
Ｍ　）リス、　２０　ｍＭ昨酸ナトリウム、　２　ｍＷ
　ＥＤＴＡｌ　８　ｒａＭ　ＮａＣ１）を加え、ＤＮＡ
を泳動させ回収し友。

この溶液に２倍量のエタノール、Ｏ，ＯＳ倍棄の５ＭＮ
ａＣｔｔ−加え、ＤＮＡを沈澱させ念。この沈＃全減圧
乾燥後１０　ｍＭ　）リス−ｉ＃１（ｐＨ８，０）　１
　ｒｎＭＥＤＴＡバッファーに溶解して・ＰｓｔｌＤＮ
Ａ断片溶液とじ九〇 ■　クローニングベクターｐＵｃ　１８の処理１０　ｒ
ｎＭ　’ｐリス順限バッフ７　　（Ｐ１４７．５）、１
０ｍＭ　ｍ　化マグネシウム、１ｒｎＭジチオスレイト
ール、４μｓベクターｐＵＣ１８（宝酒造製〕％２０単
位制限１５％素ＰｍｔＩの混合物を３７℃で２時間反応
させ友後、フェノール、クロロホルムでそれぞれ１回ず
つ抽出し九のち、エタノール沈澱させ次。この沈澱を減
圧乾燥しｍのち＊　５０　ｍＭ　トリス塩酸バッファー
（ｐＨ８，４）１９４μｔに溶解し、１．５単位アルカ
リホスファターゼ（Ｅ、　ｃｏｌｔ　Ｃ７５）を加えて
、６５℃で１時間反応させた。さらに％１．５単位のア
ルカリホスファターゼを加えて、６５℃で１時間反応さ
せた後、フェノール、クロロホルムでそれぞれ２回ずつ
抽出し、水層にエタノールを加えて、ＤＮＡ　？：沈澱
させた。この沈Ｒを１０ｍＭトリス塩酸バッフｙ　　（
ｐＨ８，０）　１　ｍＭｇＤＴＡ　２０μｔに溶解し、
約２．７　ｋｂｐのベクターＤＮＡ　ｍ液全１Ｉｌｌｆ
Ａシた。

■　組み換えＤＮＡおよびＤＮＡライブラリーの作成 （４）−■で調製し九Ｐｓｔｌ　ＤＮＡ　ｔ！’ｒ片溶
液４μｔ（０，１μｇ）、（４）−〇で調製し念ベクタ
ーＤＮＡ　溶ｉ　１μｔ（０，１μｇ）とＤＮＡ　ライ
ｙ−シ、　：ｙ＊　ｙ　）　（宝ｍ造製）のＡ溶液３０
μｔ、Ｂ溶液５μｔの混合物を１６℃で３０分間反応さ
せ九後１反応混合物１６μＬ　ｔ−Ｅ、　ｃｏｉｌ　Ｊ
ＭＩ　Ｏ９株コンピテントセル（宝酒造製）１００μｔ
に加え、０℃で６０分間静置し友、この後、更に４２℃
で９０秒間、次いで０℃で５分間静置し友。

この混合物にバク））リプトン１％、酵母抽出液０．５
％、塩化ナトリウム０．５％、グルコース０．１％、か
らなるＬ−グロス培地３００μを全加えて３７℃で３０
分間静置し友。次に５００　Ｏｒｐｍ５分間遠心し、上
清を半分量捨てた後再懸濁し、７ｙビシリｙ　５０４／
ｄ、　０．１　ｒｎＭ　ＩＰＴＧ　、　０．００４％Ｘ
−ｇａＡ′ｆｔ−含むＬ−寒天培地（Ｉ、　−ｂｒｏｔ
ｈに１．３％寒天をＷえる）に塗布し、３７℃で約１６
時間培養し、アンピシリン耐性、β−ガラクトシダーゼ
活性非保持薗のクローンを得て、形質転換株からなるＤ
ＮＡライグラリー七作放し土。

（５）　　ＭＰＢ　５７　ｆｆｉ白の遺伝子を存するり
Ｑ−ンの選択（コロニーハイグリダイゼーシ、ンテスト
）上記（４）−■のＢＣＧ　ＤＮＡライブラリーについ
てＭＰＢ　５７遺伝子を含む形質転換株を選択するため
、上記（２）で調製した　Ｐ標識オリプヌクレオテドプ
ロ−１ヲ用いるコロニーハイプリダイゼーシ、ンテス）
Ｑ行なっ九。即ち、ニトロセルロースメンツレンフィル
ター（ミリボア社製ＨＡフィルター）上で、上記（４）
−〇で調製し友ＤＮＡライグラリーの形質転換株を培！
し常法に従ってフィルターをアルカリ処理後、１Ｍトリ
ス−塩酸バッファー（ｐ）Ｉ７．５）による中和を行い
、そしてＩＭ）リス塩酸バッファー（ＰＨ７，５）１．
５Ｍ塩化ナトリウムで処理しｔ０次に２倍濃度のＳＳＣ
バッファーに浸し次後、室温で風乾した後、８０℃３時
間ペイキングし、ＤＮＡ結合フィルターを調製し次。

このフィルターを上記（３）のサデンハイグリダイゼー
シ、ンと同様の操作全行ない、プローブＩプローブ■、
グローブ■に強く結合するろｌ基配列を含む組み換えＤ
ＮＡ分子全有する形質転換株を選択することＫより、約
３００ｇＪのコロニー小う１個のコロニーを得た。

この形質転換株から！ラスミドＤＮＡを抽出精製した後
ｖＪ限醇素Ｘｈｏｊ及びＢａｍ旧でそれぞれ別々に消化
しく３ンと同様の操作によシ、サデンハイプリグイゼー
シ１ンを行なつ比ゆこの結果、１．０ｋｂのＸｈｏｌ切
断フラグメント、及び０．６ｋｂのＢａｍ）（ｌ切断フ
ラグメントいずれにも結合し之。そこで、両方の７ラグ
メントをクローン化シタ。

即ち、上記で得次形質転換株のグラスミドＤＮＡを制限
酵素Ｘｈｏｌ及びＢａｍＨＩでそれぞれ別々に切断後、
ベクターｐＵｃ　１８の制限酵素Ｓ＆ｌ　Ｉ　（Ｘｈｏ
　Ｉと同じ切断末端となるサイト）及びＢａｍＨ１切断
物と各々ライダーシ、ンし、宿主Ｅ、　ｃａｌｌ　ＪＭ
１０９を形質転換した後、再度コロニーハイツリダイゼ
ーシ、ンを行ない前述したプローブＩ、ＩＩ及びｍのい
ずれにも結合するクローン全取得し友。

（句　クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定（５）で得ら
れたクローンからシラスミドを調製し、コノＤＮＡ　ｆ
ｔメ：／　シｙグらの方法（Ｇｏｎｅ　、　３３１０３
（１９８５）、Ｐｒｏ、Ｎ、Ａ、Ｓ−，７４，５４６３
（１９７７））Ｋより１．０　ｋｂ　Ｘｈｏ　ｌ切断フ
ラグメント及び０．６ｋｂＢ息ｍＨ１切断フラグメント
の塩基配列全決定し次。

このようにして決定し九ＢＣＧ　ｆｆｉ由米のＭＰＢ　
５７蛋白をコードする遺伝子の塩基配列をＭ２図に示し
友。

尚、１．０　ｋｂ　Ｘｈｏｌ　９Ｊ断フラグメントは第
２図に示す２４６番目〜２５２＃ｒ目の）（ｈｏｌサイ
トから下流の約１．Ｏｋｂの塩基を含むフラグメントで
あり、０、６　ｋｂ　ＢａｍＨＩ切断フラグメントとは
第２図に示す３９５〜４００＃ｒ目のＢａｍＨＩサイト
から上流の約Ｑ、６ｋｂの基本を有する７ラグメントで
ある。

この両方の７ラグメントの塩基配列を総合勘案して第２
図に示すような塩基配列紫決定した。

この決定し光塩基配列と既に知られているＭＰＢ５７蛋
白のＮ末端付近のアミノ酸配列を比較することより、第
２図の２２６〜２２８＠目ＧＣＧがＭＰＢ　５７蛋白の
Ｎ末廂アミノ酸Ａ１ｍに対応し、５２３〜５２５番目の
ＴＡＧが終止コドンに該当すると判断した。

従って、ＢＣＧ菌由来のＭＰＢ　５７蛋白をコードする
遺伝子、即ちＭＰＢ　！５７蛋白の構造遺伝子は第２図
の２２６〜５２２番に該当することを見い出した（図中
の下線部分）。

ＭＰＢ　５７　′ｇ！白をコードする塩基配列から翻訳
されるアミノ酸残基数は９９個であり、その計算分子量
は、１０．８１８でそのアミノ酸配列を第３図に示した
。

〈実施例２〉 形質発現ベクターｐＫＫ２３３−２（スウェーデン。

ファルマシア社製）と化学合成オリゴヌクＶオチドを用
いて、ＭＰＢ　５７蛋白の遺伝子を連結させ、ＭＰＢ　
５７蛋白金生竜した。

このＭＰＢ　５７蛋白の生産の詳細・は以下に示し友。

（１）　ＭＰＢ　５７蛋白の遺伝子全含むフラグメント
の調製 これについては実施例１−（５）で得られ７ｔｊ　１．
０　ｋｂＸｈｏ１７ラグメントを用いた。

（２）　　化学合成オリゴヌクレオチドの請書リンカ−
（上）　５′ＣＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＣ
ＡＡＧＣＣＡＣ３′リンカ−（下）　５′ＴＣＧＡＧＴ
ＧＧＣＴＴＧＡＴＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣ”の２橿を
それぞれ〈実施例１　＞　−（２）と同様に合成、精製
し念。

このリンカ−（上）、（下）各々’ｒ：　１００　ｐｍ
ｏｔずつとり、ＡＴＰ存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（Ｅ、　ｃｏｌｔ　Ａ　ｌ　９　）　（全酒造！
！！！　）　２　ｕｎｉｔｓ、　ｔ−加え、３７℃３０
分間の条件で反応させた。

反応終了後、フェノール処理、クロロホルム処理を行う
ｔ後に６５℃、５分間辺熱しｔ０加熱後、徐冷すること
により、目的とする下記のようなリンカ−を得た。

５′ＣＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＣ
ＣＡＣ”、　／ＣＧＣＴＴＣＣＡＣＴＴＧＴＡＧＴＴＣ
ＧＧＴＧＡＧＣＴ　５ｔこのようにして調製され九リン
カ−は、前述〈実施例２〉の（１）のＸｈｏｌフラグメ
ントのＭＰ　Ｂ５７蛋白の遺伝子の不足部分、即ち、２
２６番目〜２４７番目の塩基配列（＊２図参考）を補う
ばかりではなく、ｐＫＫ２３３−２のＮａｏＩサイトに
も連結する構造をも有してい次。

（３）形質発現ベクターｐＫＫ２３３−２の処理ベクタ
ーｐＫＫ　２３３−２２　μｇｔ　１０　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−Ｈｃｔ〆（８゜５　、７　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．８０
　ｍＭ　ＮａＣ２中においてｆｆｆｔ１限酵素Ｎｃｏｌ
　（１２ｕｎｉｔｓ　）で３７℃２時間処理し友。

次に、アルカリホスファターゼ（Ｅ、　ｃａｌｌ　Ａ１
９）（全酒造Ｎ）３ユニツトをＷえ、６５℃で１時間、
さらにアルカリホスファターゼ３ユニツト′に追加し、
６５℃で１時間反応させた。

この後、フェノール処理、クロロホルム処理、エタノー
ル沈澱、更には８０％エタノール水で洗浄しｔ後乾燥さ
せることにより目的とするＮｃｏｌ切断、ｐＫＫ２３３
−２金稠夷し次。

（４）発現ベクターｐＫＫＭ　５７の構築く実施例２〉
の（３）で得次ベクターｐＫＫ２３３−２ＣＮｅｏ１Ｍ
片）　０．１　μ９　、　（実施例２〉の（１）で得た
Ｘｈａｌフラグメント０．１２μｓ、〈実施例２〉の（
２）で得之リンカ−３，３ｐｍｏｔおよびＤＮＡライゲ
ージ、ンキット（宝酒造製）のＡ溶液２４μｔ、Ｂ溶液
４μｔの混合物音１６℃で３０分間反応させ友。

即ち、この操作によりＭＰＢ　５７蛋白の構造遺伝子含
有する発現ベクターｐＫＫＭ　５７を構築し之（第４図
）。

さて、次に、この反応混合物１６μｔ　ｆ　ｇ、ｅｏｌ
ｌＪＭ１０９味コン？ラントセル（宝酒造裂）１００μ
ｔに加え、６０分間静（ｔ、更に、４２℃で９０秒間、
次いで０℃で５分間静置することにより形質転換させ次
。

この反応溶液をＬ−プロス培地３００μｔを加え、３７
℃で３００分間静置友。

次に５０００ｒｐｍ５分間遠心し、上清を半分借捨て九
後再懸濁し、アンピシリン５０μ／ｉ／ｄ、　Ｈを７含
むＬ−寒天培地 （Ｌ　−ｂｒｏｔｈに１．３％寒天を加える）Ｋ塗布し
、３７℃で約１６時間培養し、アンピシリン耐性。

のクローンを 得た。

即ち、このようにして発現ベクターｐＫＫＭ　５７を含
むクローンを得た。

（５）大腸菌によるＭＰＢ　５７蛋白の生産発現ベクタ
ーｐＫＫＭ　５７　を含むＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９
株（Ｅ、　ｃｅｌｌ　ＡＪ１２４０７．ＦＥＲＭ　Ｐ−
１０１５１）及びコントロールとしてｐ！ＧＣ２３３−
２に含むＥ、　ｅｏｌｉＪＭ１０９株を２倍濃度のＹＴ
ｊＩ地（トリプトン１６ｇ／ｌ　、抽出物イーストイク
ストラクト１０　ｆｉ／ＩＩ。

ＮａＣｌ２　ｆｌ／ｌ　）　１０　ｄ　（アンピシリン
５０μＩ／ゴ含有）中で３７℃で５時間培養し友後、Ｉ
ＰＴＧを２００μｆ！／ｍｌになるように添加し、さら
に１５時間培養した。この培警ｉｉ遠心（１２，ＯＯＯ
ｒｐｍｌＯ分間）し、集菌し之後、この筐体を１−の滅
菌水中に懸濁し、超ｆ波処理金行なっ之。そして再度、
集菌し、上清に２倍濃度の試料緩衝液を等量加え。

１００℃３分間煮沸し、菌体抽出液とした。２種の菌体
抽出液および像準のＭＰＢ　５７里白をＳＯ８−ポリア
クリルアミド電気泳動全し之７÷、ニトロセルロースフ
ィルターに蛋白を写し、仇Ｍｌ）８５７　Ｍ白プリクロ
ーナル仇体との反応を調べ比（第５図］。

第５図に示し念ように、標準サンプルと全く同じ位置に
生じるバンドはｐＫＫＭ　５７ベクターを含む大ＭＩＪ
′Ｆｆｉ（ＦＥＢＭ　Ｐ−１０１５１）の菌体抽出液に
のみにしか見られなかっ几ことより、大ｐ＆萌内でＭＰ
Ｂ　５７蛋白の遺伝子が発現され、　ＭＰＢ　５７蛋白
が生産されてい友ことが確脇でき之。

く効果〉 本発明により提供されるＢＣＧ菌由来のＭＰＢ　５７蛋
白は、抗原抗体反ｌｉｄ　（ＥＬＩＳＡ法）Ｋよる結核
の診Ｖｆｒ薬として使用できる。

′！九、本発明により提供されるＢＣＧ　［のＭＰＢ５
７蛋白をコードする遺伝子及びそれを用い之遺伝子工学
的手法によるＢＣＧ　ｌｊｒ由来のＭＰＢ　５７蛋白の
製造性は結核の診断薬として有用なＭＰＢ　５７蛋白を
大量かつ純粋に提供する為に重要である。

更に本発明により提供されるＭＰＢ　５７蛋白をコード
するＤＮＡ配列から好ましい配列に選び、ビオチン又は
ラジオアイソトープで標識し＆　ＤＮＡ！ロープを調製
すれば、これによる結核の診断も可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＢＣＧ　Ｍ染色体ＤＮＡの制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ。 ＫｐｎＩ及びＰａｔｌによる消化物に対するプローブＩ
。 ■１Ｍのサデンハイツリグイゼーシ、ン全示す図であり
、矢印で示した９ｋｂＰＩｔｌ断片をクローニングした
。 第２図は、　ＭＰＢ　５７蛋白金コードするＤＮＡの塩
基配列を示す。 第３図は、ＭＰＢ　５７蛋白のアミノα配列を示す。 第４図は１発現ベクター・ｐＫＫＭ　５７の構築金示す
図である。 第５図は、 ｐＫＫ２３３−２ｔ−含む大腸酊ＪＭ１０９とＫＫＭ　
５ ７ｙｋ會む大腸ｉ！ｉｌＪＭ１０９の蕗体抽出液をウェ
スタンプロッ ト法で分析し九図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ I ）組換えＤＮＡ法で生産した下記のアミノ酸配列
   （ I ）を有するミコバクテリウムボビスＢＣＧ（Ｍｙ
   ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ，以下Ｂ
   ＣＧ菌と称する）由来のＭＰＢ５７蛋白。 アミノ酸配列（ I ）： （Ｎ末端） 【遺伝子配列があります】（Ｃ末端） （２）請求項（１）記載のＭＰＢ５７蛋白をコードする
   遺伝子。 （３）遺伝子が下記の塩基配列（ａ）で示されるもので
   ある請求項（２）記載の遺伝子。塩基配列（ａ）： （５′末端） 【遺伝子配列があります】（３′末端） （４）請求項（２）又は（３）記載の遺伝子が組み込ま
   れたプラスミドにより形質転換された形質転換体を培地
   中で培養し、生産されたＭＰＢ５７蛋白を採取すること
   を特徴とするＢＣＧ菌由来のＭＰＢ５７蛋白の製造法。