JPH02504512A - アンジオゲニンに対する抗体：免疫療法剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アンジオデエンに対する抗体二兎疫療法剤発明の背景 本願は、１９８７年８月６日に出願され、現在、継ｎｕａｔｉｏｎ−１ｎ−ｐａ ｒｔ　）である。

１、発明の分野 脈管形成（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓ、ｉｇ　）は、ａｔ形成誘導因子に応答する増 大した血管新生の過程である。これは、存在する血管中の内皮細胞が刺激されて 有糸分裂する結果として生じ、そのことにより、この刺激に向けて進行する新し い毛細管ｌＩ４を生ずる。

固体腫瘍は、本来、Ｉｌ瘍に栄讐を供給し、その排泄物を除去する、広範囲の血 管網により支持されている。

この広範囲の血ＩＦ網は、櫂瘍脈管形成誘導因子として知られている物質の分泌 に応答して、宿主の正常の、そして、それほど広範囲ではない血管網から展開す ると考えられている。

脈管形成誘導因子は、喋瘍のみに対して特異的なものではない。最近、脈管形成 誘導因子が炎症性疾患の慢性間接リウマチを患らっている患者の嘴接液から分離 された。この脈管形成誘導因子は炎症を生じた滑液から分離され、これは、実験 的−瘍を有する動物から分離される膿瘍脈管形成誘導因子と血清学的に同一であ った（　Ｌａｎｃｅｔ　１　、６８２　、　Ｍａｒ、　１９８０　）。

加えて、脈管形成は、糖尿病性の網膜症として知られている病的状書、及び、通 常の傷害治癒にも関連する。

本発明は、ヒトの脈管形成誘導因子である、アンジオｐエン（ａｎｇｉｏｇｅｎ ｉｎ　）に特異的な抗体に関する。

本発明の抗体はヒトのアンジオｒニン分子に結合し、その活性を抑制し、そのこ とにより、脈管形成を抑制する。本発明の抗体は、ヒト及び池の動物において、 １１婆、糖尿病性の網膜症、炎症性の疾患、及び、脈管形成が；ｉｊましくない 病的状籟の治療において、脈管形成を抑制するための有用な医薬である。

２、関連技術の説明 ＬｅＶｅｅｎ　（米５特許＄４，５２９．５９０号）は、牛の脈管形成誘導因子 をＩｌｌ！する之めの方法ｆ：紀載している。Ｌｅ　Ｖｅｅｎの方法は、動物の 体腔に刺激物を注入した後、牛において、持続的な炎症反応を引き起こすことか ら成る。’Ｌｅ　Ｖｅｅｎが刺激箇所の体液から分離した脈管形成物質は、一部 分の特性が示されているにすぎない：ニワトリひなの漿尿嗅における脈管形成活 性に対しては陽性と評価され、そして、動物において免疫応答を引き起こすこと が可能であるが、ＤＥＡＩＥセルロースのような陰イオン交換クロマトグラフィ ーを可能とするのに十分な低い等電点ｔ−有する点でアンジオデ二ンとは区別さ れる。

Ｖａｌｌｅｅらは、１９８５蛇９月２０日に出願された米国特許出願第７７８． ６８７号明細書中にて言及しているように、ヒトのアデノカルチノーマ・セルラ （ｙＨＴ−２９からの脈管形成蛋白のアンジオル二ンノ精＃及ヒＷｌ！をｒ述し ている。アンジオ−エンハ、マタ、ＦｅｔｔらのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、 　２４巻、　５４８０〜５４８６ｇ、（１９８５）にも記載されている。

本発明は、ヒトのアンジオＣエンに特異的な抗体及びこれを含有する治僚用ｄｇ 物、ならびに、哺乳動物における脈管形成の抑制のためのその使用に関する。

発明の要約 本発明は、アンジオｒエン、特に、下記式１のアミノ酸配列を有するアンジオｒ ニノと免疫学的に反応性のモノクローナル及びポリクローナル抗体（以下、抗体 として言及）の製造に関する。抗体は、アンジオｒ二ン又：はアンジオＣエンの 種々の断片（これは、合成、又は、アンジオ−エンそれ自体の分解のいずれかに より製造されたものであるが）によシ、哺乳動物、例えば、マウス又はウサザを 刺激することによって、生成できる。使用される各アンジオデニノの断片は、１ 又は複数のエピトープ、機能サブユニット又は活性箇所を有する。かかる断片に よシ生ずる抗体は、アンジオゲニン全体に対する抗体よシも、外来蛋白との好ま しくない交差反応性をより少なく示す；その結果、アンジオゲニンの断片に対す る抗体は、治療上使用される場合には、アンジ第２ニン全体に対する抗体よりも 、１ましくない副作朋がわずかである。アンジ第２ニンのかかる断片に対して生 理された抗体ば、全アンジオｐエンに対して免疫学的に反応性である。

式■は以下のとおりである： Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ− Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−８ｏｒ−Ｉｌｅ−Ｍｅｃ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ＋ ｃ１７（ａｕ−Ｔｈｒ−Ｒｅｒ−Ｐｒｏ−ＣＡＢ−ｔ、％−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａ ｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｈｌｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−８ ｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｙｓ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−’Ｌｙｓ− Ａｇｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｌｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｍ−Ｔｉｕ−Ａ ｒｇ−Ｉｌｅ−８ｅｒ−’Ｌｙｓ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｆｈｅ−Ｇｌｎ−Ｖａｌシ ｈｒ−Ｔｈｒ＜ｙｓ−ｔ、ｙｓ−Ｔｚｕ−Ｈｉｓ−Ｃ１ｙ−Ｇｌｙ−ｈｒ−Ｐｒ ｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ｔａｒｔ−Ａｒｇ−ＡＬａ−Ｔ ｈｒ−Ａｈａ−Ｇｌｙ−Ｆｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａ ｌａ−Ｃｙｓ−Ｃ１ｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−’Ｌａｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ− Ｌｅｕ−Ａｓｐ−０１ｎ−Ｂｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｒ−Ｐｒｏ− ＱＨ。

発明の詳細な説明 Ａ、ポリクローナル抗体の製造 甑）　免疫化：ヒトの寒瘍アンジオビエン又はその断片に対する抗体は、ウサプ 及びマウスにおいて、相応の免疫原奪注射することにより製造される。ウサイは 、６つの方法の１つで免疫される。ウサヤは、使用直前に完全又は不完全なフロ インドアジュバント１ｇ中で乳化されたアフイニティ・ビル・ビーｆに接合され 九、精製アンジオルエンから成るＩＩ！！濁液を皮下注射することにより免疫さ れる。ウサプに、スカシがイ（ＫｅｙｈｏｌｅＬｉｍｐｅｔ　）のヘモシアニン （ＫＬＨ）に接合させるか、又は、担体ｔ−有しないか、のいずれかのｆＲ製ア ンジオデニエンび／又は合成ペプチド誘導体を、一様に、注射直前に完全又は不 完全なフロインドアジュバント１１中に＠濁したものを皮下注射することもある 。

同様に、マウスは、注射ｉｊｔ前に完全フロインドアジュバント中で乳化された アフイニテイ・ゲル・ビーズに接合された、精製アンジオゲニン又はその断片を 注封して免疫される。しかしながら、ウサイとは真なって、マウスは、好ましく は腹腔内に免疫原が注入される。１ｔ１マウスは、Ｋ’ＬＨに接合されたか、又 は、担体を！しない、いずれかの精製アンジオ’ｆ　＝　７　及ヒ／又は合成ペ プチド誘導体を完全又は不完全なフロイントのアジエバントにおいて注射前に乳 化したものを皮下投与することによっても免疫される。

（ｂｌ　　ポリクローナル抗体の精製＝１０〜１６日の間隔で免疫したのち、各 注射の後１２〜１６日で、ウサイ及びマウスから血液を採取し、Ｅｔ、ＩＳＡ　 （酵素結合免疫吸着剤検定法）によシ、％異抗体の存在を検定した。

抗体が血清中に存在する場合には、抗体は、飽和硫酸アンモニウムによる沈澱、 生理食塩水中への再！！濁、通常の生理食塩水に対する透析、プロティンＡ−セ ファロースでのアフイニテイ・デル・クロマトグラフィー、さらに、水に対する 透析、及び凍結乾燥と匹う多段４工穆において精製される。ウサｌとマウスハ、 欠に、不完全フロインドアジュバント中の相応の免疫原で、月ごとに、追加免疫 された。

得られた精製抗木偏製物は、後述する治療研究で使用されるアンジオＣエン又は 、その断片に対して引き起こされたポリクローナル抗体を含有する。

Ｂ、モノクローナル抗体の製造 （ａｌ　　免疫化：　Ｂａ１ｂ／ｃマウスを、完全又は不完全７０インドアジユ バント中のアンジオ−エン又はアンジオルエンのペプチド誘導体を皮下又＃：ｔ ｅｌ腔内注射することにより免疫化した。融合の３日前に、マウスにアンジオ− エン又はアンジオゲニンのペプチド誘導体ｆ：腹腔内投与して追加免疫した。

（ｂｌ　　モ／り０−ナル抗体の精製：モノクローナル抗体を多段階工程におけ るハイデリドーマーコンディションドφメディウム又は腹水のいずれかから部分 的に精製する。ハイデリドーマーコンディションド・メディウムを、まず、ｇｌ 邊、好ましくはがラス繊維フィルターにより澄明化させる。復水は、チャールズ ・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　）ｎｕ　／　ｎｕ異系交配マウスで製 造される。

マウスは１筋のプリスタンの腹腔内注射、続＾で、７日後にＩ　Ｘ　１０’ハイ プリドーマ細胞の腹腔内注射により感作させる。１〜２ＡｒｌＪＩ後に腹水液を 採取し、遠心により細胞を除去し、ぜいて精−するために凍結させる。濾過され たハイゾリドーマーコンディションド・メディウム中の抗体又は復水を飽和硫酸 アンモニウムで沈候させ、遠心によシペレットとし、デカントし、再び簡和硫酸 アンモニウムに懸濁し、再びペレットにし、通常の生理食塩水に再＠鳴させ（０ ，１５ＭＮａＣ４，ｐＨ７，４）、最後に、再び通常の生理食塩水（０，１５Ｍ 　ＮａＣｔ、　ｐＨ７，４）に対して透析させる。得られた溶液を、さらに、プ ロティンＡ−セファロース　クロマトグラフィーで精製し、通常の生理食塩水に 対して透析させ、減ＩＩ４適し、−７０℃でアリコートで（ｉｎａｌｉ−ｑｏａ ｔｓ　）保存する。

（Ｃ）　　モノクローナル抗体の特徴：モノクローナル抗体は、Ｅｔ、ｒｓＡ及 びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　）によシ、牛、豚、及びウサザ由来のアンジ オＣエンのような、他の種類のアンジ第２ニンを認識する能力について特性化さ れた。加えて、我々の５！験室で製造されたアンジオＣエンの変虱体が、さらに 、モノクローナル抗体のエピドーグ結合ｔ−峙性化するために使用された。１つ のセットの変１体は、１個のアミノ酸置換で構成されｆｆｉ：＠４０残基のリジ ンはグルトミン（Ｋ４０Ｑ）又はアルイエン（Ｋ４０Ｒ）のいずれかによシ１１ 換され、第６６残基のアルイエンに、アラニン（Ｒ６６Ａ）で置換され、纂８９ 残基のトリプトファンはメチオニン（Ｗ８９Ｍ）で＃声され、第１１６残基のア スパ２プン＃はヒスチジン（Ｄｌ　１６Ｈ）又はアラニン（Ｄ１１６Ａ）で置換 される。使用ｉｔ体の他のセットは、アンジオゲニンー牛ＲＮアー（ｌ／Ａハイ 、ブリッド（ＡＲＨ）で構成された：アンジオゲニン残基の５８〜７０＃ＺＲＮ アーぜ残基の５９〜７３で置換されたＡＦＬＨ（ＡＲＨ−１）、アンジオゲニン 残基の６８〜４１が’ＲＮアーぜ残基の３８〜４２で＃換されたＡＲＥ　（ＡＲ Ｈ−２）、ＡＲＨ−１において、アンジオｐエン残基８〜２２がさらにＲＮテア −Ａ残基７〜２１で置換されたＡＲＥ　（ＡＲＨ−３）、及び、アンジオｐ＝ン 残基８〜２２がＲＮアーゼＡ残基７〜２１で置換されたＡＲｌ（−４）。

Ｃ６抗体の作用 アンジオｐ＝ンと免疫的に反応する能力に加えて、この発明の抗体は、哺乳類に おいて抗鴨瘍活性を有する。特に、この発明の抗体は、免疫予防、的に、かつ、 免疫治療的研究により決定されるように、マウスにおいて腫瘍の増大を防止し、 抑制する。

同様に、アンジオルエンに対する抗体のｔａｂ及びＦ（ａｂ’　）２断片は、類 似の治療効果をもつくずである。

それと込うのも、抗体のＦａｂ又はＦ（ａｂ’　）！＋断片はｔ’ＦＬ体結合部 位を有し、完全抗体と同じように抗原に対する結合能力があることは、当分性で よく知られているからである。

かように、本発明の免疫治療剤は、アンジオ、Ｊエン及び／又はアンジオ−エン の天然及び／又は合成ペプチド断片と免疫的に反応するモノクローナル及ヒポリ クローナル抗体、それらのｔａｂ及びＦ（ａｂ’　）２断片及びそれらの混合物 である。こｎらの免疫療法剤は、哺乳類において、脈管形成が望ましくない発現 ｆ４椙にある、病酌な１Ｍ穆を治療する際の有用な薬剤である。

これらの免疫療法剤は、脈管形成を抑制できるので、これらは特に哺乳類におけ る４瘍の治療において有用でちる。

医薬組成物として、本発明の免疫療法剤はム範囲の投与形ヤリで投与でき、単ｄ 又は他の薬剤的に許容しうる医薬と組入あわせて投与でき、そして、全身注射又 は局所注射、持続性の植込入等に適合した薬剤組成物の形態で投与できる。

典型的には、本発明の免疫治療剤に、本質的にフリーの抗体と薬剤学的担体とか ら成る、注射用に適した薬剤組成−〇形岬で投与される。

薬剤学的担体は、免疫寮法剤が中に溶解、分散又は懸濁され、所望によシ少量の 一緩衝剤及び／又は保存剤を含んでもよい固体又は半固宰物質又は液体のいず１ であってもよい。適当な緩衝剤は、例えば、酢酸ナトリウム及び製剤的なリン酸 塩等を含むことができる。

薬剤的に許容しうる保存剤は、例えば、ベンジルアルコール等を包含する。

薬剤的に有効な投与量の範囲の一例は、用量当たシ、６．６μｇから６６μｓで ある。しかしながら、治療上有効な投与範囲は、選択される特電の抗体の必要件 、治療をうける患者の大きさ、蛇令、体重、その他により変えることが期待され 、そして、簡単な実験によシ容易に決足しうる。

以下の寮＾例は、説明のためにのみ示すものであ夛、材料及び方法において多く の変更がこの開示から当業者にとって明らかのように、本発明をその精神又は範 囲において限にするものと解するべきではない。

実施例１ ３〜５に９の重量に達した雄のニューシーラントホワイトラビット（ＮＺＷ　） 　ｔ−ミルデルツク農場（ＭｉｌｂｒｏｏｋＦａｒｍｓ、　ＭＡ　）から入手し 、ＡＡＡＬＡＳがイド２インに従がって育てた。

ハイプリドーマ生産融合のための膵臓細胞を提供するための免疫のために使用さ れる通交系Ｂ　ａｌｂ　／ｃ（Ｅｈｌｂ／　ＣＡｎＮＣｒｌ　ＢＲ）マウスを、 チャールズ・リバー・うざラトリーのＶＡＦ”　（ウィルス抗体フリー）施設か ら倉入した。９瘍冥峻並びに復水製造の之めに使用されるヌードマウスも、チャ ールズ・リバー・ラビラトリーから請人した。すべてのマウスを、ラミナー・フ ロー、ＨＥＰＡ−フィルタードラック中、オートクレーブしたフィルター　トッ プのおシ中で飼い、手袋及び手術着を着た人によってのみ扱った。

実施例２ ウサイ　ポリクローナル抗体 アンジオルエンの１１＃物を、製造者の指示によシ、５μｇ（全蛋白）／ａｊ沈 降ビーズの濃度で、アフイニティ・−ル、ＡｆｆｉＧｅｌ　Ｉ　Ｑ　（ＢｉｏＲ ａｄ　ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＊Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ　）に接合 させた。ビーｆの未反応部位は、１モルのエタノールアミンを使用してゾロツク し、次いで、カップリング緩衝液、仄に、滅菌蒸留水で良く洗浄した。１０４の 接合されたビーｆの＠濁液５０μｔを、注射の直前に、フロイント完全（又は不 完全）アジュバント１鱈中に乳化させた。

内方、精ａアンジオｐエン及び合成ペプチド断片体を、グルタルアルデヒドを介 して、５０μ９／１１０１の■の濃度で、スカシがイのヘモシアニン（ＫＬＨ） に接合させた。住成溶液を５％９（全蛋白）／―滅菌蒸留水とした。５０μｔ（ １３５μｕ　）ＯＫＬＨ−接合７　ｙ　シ、ｔ　’ｆ二エンはペプチド溶！ｔ− １注射の直前に、１ｗｔの完全（又は不完全）フロイントアジエベント中に乳化 させた。すべてのウサザに１０日間隔で、背部に、続いて、尾方に、皮下注封し た。アジュバントは、フロイント完全物及びフロイント不完全物を交互に使用し 九。各注射後５Ｂ目に、縁部の耳静脈の静脈穿刺１ｃよりウサプから血清を採取 し、ａｔ、１８Ａ　（酵素結合免疫吸着剤検定法）によシ特異抗体の存在を検に した＠加えて、担体を有しないアンジオゲニン又はアンジオゲニンの合成ペプチ ド誘導体で免疫することにより、ウサイで抗体を製造し九〇初めに、ウサヤに完 全フロインドアジュバント中に乳化されたアンジオゲニン（５０Ａｇ）を皮下注 射した。その後の２１１の注射は、２週間間隔で、不完全フロインドアジュバン ト中のアンジオゲニン（５０Ａｇ）にて行なった。３回目の注射の後、１４日目 に、縁部耳静脈の静脈穿刺にょシ血嘴を採磯し、Ｅｔ、ＩＳＡ　（≠素結合免疫 吸着剤検定法）によシ、荷昆的なアンジオゲニン結合仇体の存在を試験した。続 いて、ウサプに１ケ月に１変、不完全フロインドアジュバント中の５０μ９アン ジオＹニンを注射し、各注射後、１２〜１４日に縁部耳静脈の静脈穿刺により血 清を採取した。

等容積の飽和硫酸アンモニウムを滴加することにょ９、イムノグロブリンを血清 から沈澱させた。得られ几＠濁液を室温で１時間攪拌し、次に、ＩＱＯＯＯｇで 遠心分群した。ペレット化された物質を飽和硫酸アンモニウムで洗い、次に、０ −１５Ｍの塩化ナトリウムｐＨ７，４（通常の生理食塩水）の苛小容量中に再懸 濁し、６０００−８０００ＭＷのカットオフ＆析管にかけ、通常の生理食塩水に 対して透析させた。う析されたＩｇ分子ｎを、仄に、５就のプロティンＡ−セフ ァロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｐｉｓｃａ ｔａｕａｙ、　ＮＪχ床に適用し、通常の食塩水で洗った。：＃質的結合イムノ グロブリンは、カラムから、０．２モルグリシン−塩酸…５．５中に溶出された 。これらの分画を、１モルトリス−ＣＬ　（ｐ８８．０　）　０．１容積中に直 ちに集め、中和し、プールし、上述のようにして透析させた。透析さｔ″ＬｔＬ ｔ物ｔＵのＤＥＡＥ−セルロース床に適用し、最初の分画（非結合）ｔ−集め、 プールし、蒸留水に対して６析させ、次に、凍結させた。

ｊｊ！施例３ アンジオゲニンに対するマウスモノクローナル抗体Ｉｌｋ彷に、完全フロインド アジュバント中のアンジオＹエン３０μ、ｑをＢａ１ｂ　／　ｃマウスに皮下注 射した。最初の注射後、１０日及び１７日目に、不完全フロインドアジュバント 中の３０Ａｇのアンゾオゲニンｔ−２００注射した。融合の３日前に、通常の生 理食塩水中のアンジオルエン３０μｇを腹腔的注射して追加免疫させた。

融合の日に、アンジオゲニン食塩水で追加免疫されたマウスを殺し、膵臓を得た 。２２ｒ−ジの針を使用して、血清不含媒体でｎｆｉｌｋ洗浄することにより、 膵臓細胞の懸濁液を得た。牌＠細胞ｔ−Ｉ　Ｑａｇの血清不合媒体で３回洗浄し た。使用さルるＳｐ　２　／　０又はＰ３ｘ　６３　ＡＥ　８．６５３　融合パ ートナ−を髄ａ細胞をも血清不含媒体で６回洗浄した。膵臓細胞を骨髄嘘細胞と 、ｓＩＩ細胞対骨髄値細胞が４＝１の割合で混合した。牌臓−骨髄櫂細胞の混合 物を遠心分離によりペレット化し、３７℃で水浴中に置いた。濾過したポリエチ レングリコール１　ｄ　（ＰＩｌＣＧ、　Ｑ−８３％’／　ＩＬＩ血清不含媒体 ）ｔ−６０秒間隔で、ゆっくりと加えた。細胞とＰＥＧを９０秒秒間中かに混合 した後、５分間で５ｇの血清不含媒体を加え、続いて、１分間で１４ａｌｏａＡ Ｔ媒体を加えた。久に、細胞ｔ−７分間遠心分喉し、上澄み液を捨てた。細胞を マウスの腹腔滲出細胞を含有するＨＡＴ媒体中にＩｔ！！濁させ（Ａ　Ｘ　１０ ６細胞／プレート）、１ウエル当たシ２００μｔで、９６−ウェル組織培養プレ ート中に置い友。融合ｖｋ７日して、ＨＡＴｍ体を除去し、ＨＴＩ体で＃換し元 。ウェル畦、毎日、コロニーの成長に関してチェックした。コロニーの成長を示 すウェルからの上澄み液を、アンジオ−エン結合抗体に関してｇｔ、ｒｓＡで機 定した。アンジオ−エン結合抗体を含有する上澄入液を生成する細胞を、限定希 釈により、２回すデクローンさせた。

部分精製 ハイデリドーマーコンディションド・メディウム又は腹水をホワットマンーが２ ス・ファイバーφフィルターを通す濾過により、清溌化し友。この透明になつた ハイプリドーマ・コンディションド・メディウムに等容すの飽和硫酸アンモニウ ムｔ−滴加し、室温で１時間攪拌した。混合物’ｔ１０分間億心分−ｆｉ（１［ ］、Ｏ’３０ｇ）し、生じたペレットｔｔａ和硫酸アンモニウム中に再懸濁させ 、遠心分離により洗浄した。ペレット化された物質を通常の生理食塩水中に再懸 、１１させ、上述のように通常の生理食１水に対して透析させた。

精製 透明にしたハイデリドーマーコンディションド・メオてバッグ中、４℃で、５０ 容量の０．１モルリン酸緩衝液ｐｔ−ｔ　ｓ、ｏに対して１晩逍析させた。この 物質ｔ−５１！ｊのプロティンＡ−セファロース床に施与した。結合しなかった 物質を０．１モルのリン酸ナトリウム緩衝液−８，０を使用してカラムから洗浄 し、工ｇに富んだ分画をカラムかう０．１モルのクエン酸ナトリウム緩衝液−３ ，５に溶出させ、通常の生理食塩水に対して透析させた。猾元条件下でのビル電 気泳動法において、主要バンドとして、イムノグロブリンの軽鎖及び重鎖のみを 示すことかられかるように、生成分画は高度に精製されてい九〇 実施例４ モノクローナル抗体２６−２　Ｆ　（ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプカルチャー ・コレクション、１２３０１パ−クローン・ドライブ、ロックビル、メリーラン ド、２０８５２］寄託番号ＨＢ９７６＜Ｓ）ｄ、アンジオｒ二ノ免疫化Ｂａ１ｂ 　／　ｃマウスの膵臓細胞とＰ　３　Ｘ　６３−Ａ９　Ｂ、６５３　を植嘘ライ ンとの融合の結果であった。

このモノクローナル抗体１’！、Ｉｇｏｌにである。これは、固相ＥＬＩＳＡ及 び町溶相（ＲＩＡ　）の双方に訃いてアンジオ−エンに強力に結合する。これは 、目−ド化されたアンジオゲニンへの結合に関する可溶比相抑制検定（Ｆｌｏｌ ｕｂｌｅ　ｐｈａｓｅ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　）において、牛、 豚又はウサイのアンジオゲニンと結合しない。この同じ検定において、２６−２ １は、天然のアンジオゲニンに対すると同程度によ＜Ｄ１１６Ａ変異体に結合し 、Ｋ４０Ｑ及びに４０Ｒへの結合は、約２倍だけ減少する。変鴨体を含むＲＮア ーゼ配列の相互作用を試験する際に、２６−２Ｆは、天然アンジオ−エンに対す ると同様に良好に、ＡＲＨ−１、Ａ期−３及びＡＲＨ−４変異体に結合する。し かしながら、抑制ＲＩＡ　において、２６−２Ｔ？はＡＲＭ　−２変鴨体を認識 しない。

実施例５ Ｂａｌｂ　／　Ｃマウスに、アンジオゲニンＱ残基３６−４６に相応する合成ペ プチド５０μ９を含む完全フロインドアジュバントを腹腔内注射した。最初の注 射の後、１か月の間隔で３６〜４６のもの５０μｇを含む不完全７０インドアジ ユバントをさらに２回注射し、続いて、その１ケ月後で融合の３日前に、アンジ オゲニン（１５μｇ）を含む不完全フロインドアジュバントで追加免疫した。

免疫膵臓細胞とＳｐ　２　／　Ｏマウス骨８［−細胞との融合は、本Ｗ的に上述 のように実施した。各ウェルについてコロニーの区長を１ｉｌｔ験し、そして、 成長を示すウェルからの上澄入液を、ラジオイムノアッセイにより、アンジオゲ ニンー結合抗体について検定した。アンジオゲニンー結合抗体を生成する細胞を 、限定希釈によりヤデクローンした。

実施例６ モノクローナル抗体５１　Ｃ９（ＡＴＣＣ寄託番号Ｉ（Ｂ９７６７）ａ、合成ペ プチド３６〜４６で免疫されたＢａ１ｂ　／　ｃマウスからの膵臓細胞とＳｏ　 ２　／　０　＊４Ａ宵ラインとの融合の結果物である。この抗体の特毘性を、欅 々の競合体が５１０９への結合を求めて１２５Ｉ−アンジオゲニンと競合する競 合アッセイを使用して測定した。競合体はペプチド−ＢＥＡ接合体、アンジオＪ ７’エン変異体、種々の種からのアンジオゲニン又はＲＮアーゼＡである。スカ チャード分析（８ｃａｔｃｈａｒｄ　）及び逆転ミカエリス−メンテンプロット （Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ　−Ｍｅｎｔｅｎ　）は、ＫＤ−２，６Ｘ１０−’Ｍであ ることを示す。矢の変１体は天然のヒトアンジオゲニント同等に曵く反応する： Ｒ６１！ＳＡ、２及び６７位でクリップされたアンジｔ　ｒ　二ｙ、Ｄｌ　１　 ／）Ａ、Ｄｌ　１６Ｈ及びＲＮアーゼＡの４個のジスルフィド架橋を有するＡＲ Ｔ（−１゜５１Ｃ９框ペプチド５６−４６−　ＢＳＡ　、　４１−５１−　ＢＳ Ａ　、　８１〜９１−　ＢＳＡと反応するが、１−２１−　ＢＳＡとは反応しな い。加えて、この抗体は豚又は牛アンジオＣエン又はＲＮアー−ｔ／ＡＩ認識せ ず、ウサイのアンジオＹニノ及び変１体に４０Ｑ、に４０Ｑ及びＷ８９Ｍとはわ ずかに反応する。

要約すると％５１Ｃ９は２個の不連続領域に広がる（　５ｐａｎｔ＋ｉｎｇ　） アンジオルエンの領域を認識する。残基８９は、このトリプトファンをメチオニ ンに変えると親和性ｔ３０＠減するので、認識される。残基４０も、また、この リジンをグルタミン又はアルザエンに変えると親和性を２２倍減するので、認識 される。残基３７も重要な残基である。この残基金アルイエンに変えると、豚及 び牛アンジオゲニンにかけるように、５１Ｃ９は大きな親和住金有しない。啄及 び牛の双方ともリジン−４０を有し、十アンジオーエンはトリプトファン−８９ を有しないので、セリン−３７をアルヤエンに変えると、１００倍の親和性の減 少を生ずるかもしれない。最後に、５１０９は４１−５１−　ＢＳＡを認識する ので、これらの残基の少くとも１つは把握される。３Ｄモデル分析によれば、残 基８９，３７及び４０は互に近接して位置する。加えて、残基９０゜３８．３９ 及び４１は５１０９に接触するかもしれない。抗体結合ボケツ）ｕ、３４Ｘ１２ Ｘ７オングストローム、又は、７．９　Ｘ　２．８　Ｘ　１．６アミノ酸と測定 される。これは、これらの７個の残基を収容するのにあ１りあるものである。ハ ーバ−とノざトニーのアクセシピリティモデ／Ｉ／　（ａｃｃｅｓｓｉｈｉｌｉ ｔｙ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　Ｈａｂｅｒ　ａｎｄＮｏｕｏｔｎｙ　）によれば、レ ニンのそれと同様にアンジオｐｆエンに適用すると（Ｅｖｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙｓ　１９８ＥＬ２７．１５６〜１６４）、これらの２個の領域は、 強力な抗原性であると予測される。実際、残基８９と３８はこれらのすべての残 基の中で最もアクセシデルであると予測される。

さらに、５１Ｃ９は、アンジオゲニンと＠盤すボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ ＲＹ　）から形成される連合体を認識しない。これは、５１Ｃ９とＰＦＬＩがア ンジオル二ン分子において、Ｘ榎する領域′ｆｒ：認識することを１！味する。

実施例７ これらの研究において、雄のヌードマウス（５〜７週令）を１ケージ当たり２〜 ４匹で飼った。１０匹のマウスからなる実験群は、実験する前にケージごとに無 作為に形成した。更に、対照及び実験ｖ４製物の注射順序は、各実験ごとに変え 、腫瘍細胞ｙ４製物を注射する人は、細胞と混合された物質の性宵については知 らされなかった。

モノクローナル抗体の治療のために、夷！１１動物に対し開始日に、リン酸緩衝 良塩水（ｐａｓ　）中で抗体と混合されたｌＸ１０’ＨＴ−２９８胞を注入した 。紬＠を注射５分前に、抗体及びＰＢＳとインキュベートし、１０匹から成る一 群のマウスへの注射は、５分以内に完了した。このような操作の後の、細胞の生 存性試験で７１、何らのＶ意の変化も入られなかった。注ｅは左！ｆＩ後方部に 皮下注入してなされ、注射部位はｖｗＲマーク用ペンで印された。抗体及び／又 はＰＢＳの注射は、１４日間毎日行なった。注射ｆ儂、侍瘍を認める迄、前に印 をつけた部位に行ない、気がついた時点で、もし、１瘍が印を付した部位の範囲 外に存在する場合には、視覚しつるＩｌ！！瘍部位に注射を稈した。帽等の大き さは、カリパス（ｃａｌｉｐｅｒ　）　を使用してモニターし、測定値を立方ミ リメートル（没さ×巾×深さ）で示した。１ｌｕ１１定するのには小さすぎる１ 連の存在は、１１°として示した。体重の＆！録及び写真記録を、実験途中にお いて２〜３回行なった。

最初の２回の実験で、８８−０６及び８８−０７において、硫酸アンモニウムで 沈慢され、プロティンＡ−セファロースでクロマトグラフされた、腹水由来の２ ６−２Ｆモノクロ一ナル抗体の２用ｔを与え、Ｐ８８対照と比較した。実験の２ 番目のセットで、８８−０８及び８８−０９において、２個のセットの１０匹の 、ウスに、より低用量の２６−２Ｆｔ与え、Ｐｓｓ対魚群及びサブクラスにマツ チした非ｔ＃異的モノクローナル、ＭＯＰＣ２１（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉ ｋａ　Ｃ０ｒｐ−＊　ｗｅ５１ｔＣｈｏｓｔｅｒ、　ＰＡ　）　’に投与した一 群のマウスと比較した。

添付の＠１表は、４個の実験の結果をｒ！！約している。

鏝も小さなＰＢＳ　（対照）Ｉｔ’ｌｌよりも小さな腫瘍をもつ動物のパーセン トならびに７日１１４日及び２４日目で１瘍が検出できない動物のパーセントが 記載すれている。ＰＢＳとＭＯＰＣ処理のものを比較すると、２６−２Ｆの投与 は、高いパーセントの動物において値瘍の大きさを効果的に嬢少させ、数匹の動 物においては最後に抗体を注射した後食くとも１ケ月の間、腫瘍の増大から完全 に保護する。

ポリクローナル抗体を受は几試験群のマウスにおいて、ｙｙジオｒゲニンＫＬＨ ｃ　５０μ＃　、２５ａｐ）に対して生成された抗体の用量を、ＨＴ−２９細胞 の投与（５Ｘ１０５細胞）の２日前に与え、セして１，４゜６．８，１１日目に 線傷細胞を移植した。同様に、ＰＢＳを１偽装置処置（Ｓｈａｍ　ｔｒｅａｔｍ ｅｎｔ　）として投与した。第２表のデータは、ポリクローナル抗体の治療効果 を示している。この結果は、抗体の６董はすべての群で腫瘍の成長を減すること となること、及び、数匹の動物は１瘍の発嗟から完全に保護され、即ち、０の帽 瘍の大きさであることを示している。抗体の最適讃与量は、単純な冥強により決 定することができる。

第２表　ポリクローナル抗体治療 禮瘍の大きさくｎ３） 処　理　　　　マウスの菌数　　　　４日　　８日　　１３日実施例８ 合成ペプチドを、式ｌのアミノ酸配列：６−２１゜た。各々の場合において、ア ンジオ−二％のｓａ断片に対応するポリペプチドを、重合体ビーで上で固相のメ リーフィールド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅ１４　）により製造し、次に、フッ化水 素酸で遊離させ、仄いで、良く知られた方法である高性ａ液体クロマドグ２フィ ーによシ精製した（　ＢｅｒａｎｙとＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ＊　Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓ、　Ｖｏｌ　２　。

５ｐｅｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　８ｙｎｔｈｅ８１ｓ 、　Ｐａｒｔ　Ａ、　ｐ３、　Ｋｄ　（）ｒｏｓｓとＭｅｉｎｈｏｆｅｒｅ　Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎ、Ｙ。

（１９８０）及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ａｄｖ、　Ｉｌｅｎｚｙｍｏｌｏｇ ｙ、Ｖｏｌ。

３３．２２１〜２９６（１９＜５９）を参照）。

かかる合成ペプチド断片のそれぞれを、慣用の方法によシ、グルタルアルデヒド を介してＫＴＩ、Ｈにカップリングさせ、生成物を生理食塩水に対して透析させ た。

透析された生成物を、１００ｗのペプチドと等価のペプチド／　ＫＬＨ混合物に て毎月皮下投与することによシウサザを免疫するのために使用し、これは、標準 プロトコールに従がって完全及び不完全なフロイトアジュバントを交互に用いて 行なった。血液試料を毎月採取した。

各血液試料から、精製抗体金得るために、ＩｇＧを、硫酸アンそニウム沈澱、プ ロティンＡ−セファクースフ曳マドグラフィー及びＤＥＡｇイオン交換クロマト グラフィーにより免疫血清から分離し念、ペプチド断片に対する、及び、天然全 アンジオゲニンに対する各抗体の免疫反応性を、酵素結合免疫吸着剤検定法（Ｅ ｔ、ＩＳＡ　）によって検定した。３個全部が全アンジオゲニンに対して免疫反 応性であることが見い出された。他の合皮ペプチドが式■の３０−４１　。

３６−４６．４８−６１及び１０８−１２３断片に対応して製造され、そして、 免疫原として使用される。

国際調査報告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．アンジオゲニンと免疫的に反応性の抗体。
2. ２．モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
3. ３．式Ｉのアミノ酸配列を有するアンジオゲニンに先夜的に反応性の抗体。
4. ４．モノクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体。
5. ５．アンジオゲニンに先夜的に反応性の抗体であつて、アンジォゲニルの断片又 は誘導体に対して引き起こされた抗体。
6. ６．モノクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体。
7. ７．薬剤担体中に、請求項１又は２に記載の抗体を治療上有効量含有する医薬組 成物。
8. ８．薬剤担体中に、請求項３又は請求項４に記載の抗体を治療上有効量で含有す る医薬組成物。
9. ９．薬剤担体中に、請求項５又は６に記載の抗体を治療上有効量で含有する医薬 組成物。
10. １０．脈管形成活性を抑制するために、請求項１又は２に記載の抗体又はそのＦ ａｂ又はＦ（ａαｂ１１）２断片の治療上有効量を投与することを特徴とする、 哺乳動物における脈管形成を抑制する方法。
11. １１．脈尿管形成活性を抑制するために、治療上有効量の、請求項３又に請求項 ４に記載の抗体、又はそのＦａｂ又は（Ｆａｂ′）２断片を投与することを特徴 とする、哺乳動物における脈管形成を抑制する方法。
12. １２．脈管形成活性を抑制するために、治療上有効量の、請求項５又４請求項６ に記載の抗体又はそのＦａｂ又はＦ（ａｂ′）２断片を投与することを特徴とす る哺乳動物における脈骨形成を抑制する方法。
13. １３．脈管形成活性を仰制するために、有効量の、請求項１又４２に記載の抗体 又はそのＦａｂ又はＦ（ａｂ′）２断片を投与することを特徴とする、哺乳動物 における腫瘍脈管形成を抑制する方法。
14. １４．脈管形成活性を仰制するために、有効量の、請求項３又は４に記載の抗体 又はそれらのＦａｂ又はＦ（ａｂ′）２断片を投与することを特徴とする、哺乳 動における腫瘍脈管形成を抑制する方法。
15. １５．脈管形成活性を抑制するために、有効量の請求項５又は６に記載の抗体又 はそれらのＦａｂ又はＦ（ａｂ′）２断片を投与することを特徴とする、哺乳動 物における腫瘍脈管形成を抑制する方法。